CN112220759A - 一种抗菌水凝胶载药微球的制备及其在细胞扩增中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗菌水凝胶载药微球的制备及其在细胞扩增中的应用，利用不同纳米尺寸的二氧化硅粒子，通过微流控装置，获得光子晶体微球。通过分步水分蒸发，分步高温煅烧，得到光子晶体微球；配制水凝胶溶液，灌注到光子晶体微球中，紫外固化后形成光子晶体水凝胶微球中间体；通过氢氟酸的蚀刻，最终得到水凝胶微球；最后将水凝胶微球再次浸泡于另一水凝胶溶液中，实现二次灌胶载药。本发明制备的水凝胶微球能够在肿瘤部位缓释药物，释放出内部装载的免疫刺激型抗体，可用于肿瘤患者免疫细胞的激活和自体免疫细胞抗肿瘤治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种抗菌水凝胶载药微球的制备及其在细胞扩增中的应用。
背景技术
随着人口老龄化和生存环境的恶化，肿瘤已经成为危害人类健康的重大疾病之一。通常的肿瘤治疗方案有外科手术切除、放疗和化疗等，这些治疗手段存在着创伤大、容易复发等问题。随着对肿瘤发生和发展机制的深入研究，各种新的肿瘤治疗方案已经进入临床。其中，肿瘤免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗方案，是通过激活肿瘤患者自身免疫系统增强自身抗肿瘤能力的一种强有力的肿瘤杀伤治疗手段，具有副作用小、适应症广等优势。然而，肿瘤患者体内的肿瘤免疫抑制微环境总是削弱T细胞对肿瘤的杀伤过程。癌症削弱了机体的免疫系统，这使得肿瘤患者更容易发生感染。感染是造成恶性肿瘤患者恶病质和死亡的主要原因之一。因此，选择有效的策略来抵消肿瘤免疫抑制微环境、实现肿瘤部位抗菌，增强人体内源性免疫细胞的肿瘤杀伤活力具有重要意义。
常见的临床给药方式为静脉注射和口服给药，这些给药途径依赖重复多次给药，对病人的身心健康有很大的威胁。微载体药物释放系统，可用于药物的持续释放并维持血药浓度基本不变。通过水凝胶包裹药物，通过自由扩散的方式穿过水凝胶材料内部交联的网络结构来释放的，达到长期释放的效果。因此，通过构建药物缓释微载体，作为肿瘤免疫治疗的载药平台，具有增强内源性免疫细胞能力的智能药物缓释微载体在肿瘤免疫治疗中具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗菌水凝胶载药微球的制备及其在细胞扩增中的应用。本发明基于微载体药物释放系统，通过反蛋白石负刻和水凝胶二次灌胶，生成具有均一尺寸的抗菌水凝胶载药微球。本发明制备的水凝胶微球能够在肿瘤部位缓释药物，释放出内部装载的免疫刺激型抗体，可用于肿瘤患者免疫细胞的激活和自体免疫细胞抗肿瘤治疗。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种抗菌水凝胶载药微球，其制备方法包括以下步骤：
(1)利用不同纳米尺寸的二氧化硅粒子，通过微流控装置，获得二氧化硅液滴；然后通过分步水分蒸发法使二氧化硅液滴中的水分完全蒸发，接着采用分步高温煅烧的方法，制备得到二氧化硅光子晶体微球；
(2)配制水凝胶溶液，以步骤(1)制备的二氧化硅光子晶体微球为模版，将水凝胶溶液灌注到二氧化硅光子晶体微球中，利用紫外光固化，形成光子晶体水凝胶微球中间体；将光子晶体水凝胶微球中间体采用氢氟酸蚀刻，制备得到反蛋白石结构的水凝胶微球；
(3)将步骤(2)制备所得的反蛋白石结构的水凝胶微球再次浸泡于另一预混有药物的水凝胶溶液中，利用紫外光固化水凝胶溶液并剥离，实现二次灌胶载药，得到抗菌水凝胶载药微球。
步骤(2)所述的水凝胶溶液为壳聚糖、明胶中的一种或两种以上材料的混合，并且在所述的水凝胶溶液中混合有一定量的光引发剂。
所述的水凝胶溶液中，壳聚糖的浓度为0.5％-10％v/v。
步骤(1)中，采用微流控芯片和蠕动泵以硅油为流动相制备二氧化硅液滴。
步骤(1)中，获得二氧化硅液滴后，将收集有二氧化硅液滴的器皿静置于烘箱，确保二氧化硅液滴中的水分完全蒸发；二氧化硅液滴中的水分完全蒸发后，从烘箱中取出收集有二氧化硅液滴的器皿，弃去上层的硅油，然后使用正己烷收集并清洗微球。
步骤(1)中，分步高温煅烧的具体方法为30度升温至800度，175分钟；800度维持480分钟；800度降至室温，121分钟；
步骤(2)中，紫外光固化的条件为：405nm,5cm,30sec，氢氟酸的浓度为4％。
步骤(3)中，紫外光固化的条件为：405nm，5cm，30sec。
所述的水凝胶溶液含有药物，所述的药物为单克隆抗体，选自anti-CD3和anti-CD28中的一种或多种，抗体的浓度为10-100ng/ml。
本发明还保护所述的抗菌水凝胶载药微球在制备细胞扩增药物中的应用，通过在水凝胶微球中负载抗体药物，在肿瘤部位的原位注射、静脉注射、口服、灌注等方式用于肿瘤患者免疫细胞的激活和自体免疫细胞抗肿瘤治疗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种基于壳聚糖和明胶构建的反蛋白石水凝胶载药微球，其具有制作工艺简单，原料易得，可分别从动物和植物组织中大量提取获得。本发明所制备的水凝胶载药微球，与现有材料的性能相比较，具有协同抗菌杀肿瘤的特点。本发明所制备的抗菌水凝胶载药微球具有生物相容性好、负载药物多、智能可控释放等优点。此外，释放的抗体还可以激活T细胞，使其浸润到肿瘤中，促进肿瘤细胞的清除。
附图说明
图1：水凝胶微球的制备示意图。
图2：水凝胶微球的抗菌性能检测。
图3：抗菌水凝胶微球的药物装载，荧光显微镜观察水凝胶微球的荧光药物分布图。
图4：抗菌水凝胶载药微球对T细胞的扩增，将抗菌水凝胶载药微球与T细胞共培养，对T细胞进行流式分析观察T细胞的生长情况。
图5：抗菌水凝胶载药微球扩增后T细胞对乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤检测，活死细胞染色法检测MDA-MB-231细胞的杀伤情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：二氧化硅光子晶体微球的制备
二氧化硅光子晶体微球的制备，主要分为五步：(1)微流控芯片的制作及微流控平台的搭建；(2)单分散液滴的制备；(3)液滴干燥固化；(4)正己烧清洗硅油；(5)高温锻烧。
采用微流控芯片和蠕动泵以硅油为流动相制备二氧化硅液滴，将收集了液滴模版的器皿静置于75℃烘箱中12小时，液滴从乳白色渐渐变为透明。为确保液滴中的水分完全蒸发，将烘箱温度升高至95℃并保持2小时。从烘箱中取出收集器皿，待冷却后回收上层的硅油，然后使用正己烷缓慢冲洗直到微球滚动到收集器皿底部，再用胶头滴管将微球转移到称量瓶内，用正己烷清洗，每隔30分钟清洗1次，共清洗3次，以确保微球中的硅油被去除干净。将微球转移坩埚内，待多余的正己烷溶液挥发干净后，放入马弗炉：30度升温至800度，175分钟；800度维持480分钟；800度降至室温，121分钟。
实施例2：反蛋白石结构水凝胶微球的制备
为了使水凝胶预聚溶液能够充分填充到光子晶体微球二氧化硅粒子之间的孔隙内，微球需要用酒精脱水并在烘箱中干燥。干燥后的光子晶体微球呈现出乳白色，将其浸泡在壳聚糖水凝胶预聚溶液中。当微球颜色由乳白色转变为亮丽的结构色后，表明水凝胶预聚溶液己经充分填充到纳米粒子的空隙中。然后将含有胶体晶体微球的预聚溶液通过紫外光照射15秒使水凝胶完全固化。
将固化后含有水凝胶微球的胶体浸泡于超纯水中，通过小心揉搓可使微球从胶体中脱落，获取光子晶体水凝胶微球，再用乙醇和超纯水依次反复清洗微球。最终将洗净的光子晶体水凝胶微球浸泡于4％的氢氟酸溶液中2小时，去除二氧化硅粒子模板，获得反蛋白石结构的水凝胶微球，示意图如图1所示。
实施例3：反蛋白石水凝胶微球的抗菌检测
为了验证反蛋白石水凝胶微球的抗菌性能，我们将反蛋白石水凝胶微球(0.5mg/ml)加入至金黄色葡萄细菌培养液中，通过细菌活死染色试剂盒来观察细菌的或许。我们的结果显示，增加反蛋白石水凝胶微球后，细菌的活性降低，死亡的数量增加(图2)。
实施例4：反蛋白石水凝胶微球的药物装载
将制备好的水凝胶微球浸泡含有在1mg/ml FITC荧光染料溶液或抗体的明胶溶液中6小时。浸泡结束后，用紫外光固化水凝胶，将水凝胶微球剥离。每个浓度的水凝胶微球分别取10个平行样品，然后将它们分散在1.5ml的PBS缓冲液中，置于黑暗的室温状态下，每隔1小时利用正置荧光显微镜拍摄荧光图片，通过读取微球的荧光值来表征微载体中包埋的药物分子的剩余量，以研究微球在自然条件下药物的释放情况。由于FITC呈绿色荧光，通过读取微球的荧光值来表征微载体中包埋的药物分子的剩余量。每次检测完后用1ml新鲜的PBS缓冲液置换微球的缓冲液，持续检测至少一周时间，以研究微球在自然条件下药物的释放情况。结果显示，FITC模拟的药物能够被均匀装载在水凝胶微球内部，如图2所示。
实施例5：外周血来源的T细胞的提取和培养
收集志愿者外周血10ml，用等体积的生理盐水稀释外周血，将稀释好的外周血缓慢的加入装有5ml淋巴细胞分离液的离心管中，400g离心20min。离心结束后，吸取中间白膜层，加入生理盐水至10ml，300g离心5min，弃去上清。细胞沉淀中加入洗涤buffer，并细胞计数，按1×106/ml的细胞密度加入T细胞培养液(含IL-2)，每隔3天补充新鲜的培养液。从图3中可以看出水凝胶微球能够很好的促进T细胞的成熟，细胞纯度达到了95.7％。
实施例6：T细胞的体外杀伤实验
将乳腺癌细胞株MDA-MB-231按照每孔1.5×105细胞接种到6孔板中，不同浓度的反蛋白石水凝胶微球处理后的T细胞按照不同比例加入，E:T从1:5到5:1。阴性对照组只有肿瘤细胞，不加T细胞。在37℃，5％CO2培养箱中孵育6小时。孵育结束后，收集贴壁的肿瘤细胞，使用Calcein-AM/PI双染法标记不同效靶比下被T细胞杀伤的肿瘤细胞，通过荧光显微镜观察被PI标记的肿瘤细胞的数量，评估肿瘤细胞的杀伤效果。如图4结果所示，活死细胞染色表明水凝胶微球扩增的T细胞具有更强的肿瘤杀伤能力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗菌水凝胶载药微球，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
(1)利用不同纳米尺寸的二氧化硅粒子，通过微流控装置，获得二氧化硅液滴；然后通过分步水分蒸发法使二氧化硅液滴中的水分完全蒸发，接着采用分步高温煅烧的方法，制备得到二氧化硅光子晶体微球；
(2)配制水凝胶溶液，以步骤(1)制备的二氧化硅光子晶体微球为模版，将水凝胶溶液灌注到二氧化硅光子晶体微球中，利用紫外光固化，形成光子晶体水凝胶微球中间体；将光子晶体水凝胶微球中间体采用氢氟酸蚀刻，制备得到反蛋白石结构的水凝胶微球；
(3)将步骤(2)制备所得的反蛋白石结构的水凝胶微球再次浸泡于另一预混有药物的水凝胶溶液中，利用紫外光固化水凝胶溶液并剥离，实现二次灌胶载药，得到抗菌水凝胶载药微球。
2.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶载药微球，其特征在于：步骤(2)所述的水凝胶溶液为壳聚糖、明胶中的一种或两种以上材料的混合，并且在所述的水凝胶溶液中混合有一定量的光引发剂。
3.根据权利要求2所述的抗菌水凝胶载药微球，其特征在于：所述的水凝胶溶液中，壳聚糖的浓度为0.5％-10％v/v。
4.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶载药微球，其特征在于：步骤(1)中，采用微流控芯片和蠕动泵以硅油为流动相制备二氧化硅液滴。
5.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶载药微球，其特征在于：步骤(1)中，获得二氧化硅液滴后，将收集有二氧化硅液滴的器皿静置于烘箱，确保二氧化硅液滴中的水分完全蒸发；二氧化硅液滴中的水分完全蒸发后，从烘箱中取出收集有二氧化硅液滴的器皿，弃去上层的硅油，然后使用正己烷收集并清洗微球。
6.根据权利要求5所述的抗菌水凝胶载药微球，其特征在于：步骤(1)中，分步高温煅烧的具体方法为30度升温至800度，175分钟；800度维持480分钟；800度降至室温，121分钟。
7.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶载药微球，其特征在于：步骤(2)中，紫外光固化的条件为：405nm,5cm,30sec，氢氟酸的浓度为4％。
8.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶载药微球，其特征在于：步骤(3)中，紫外光固化的条件为：405nm，5cm，30sec。
9.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶载药微球，其特征在于：所述的水凝胶溶液含有药物，所述的药物为单克隆抗体，选自anti-CD3和anti-CD28中的一种或多种，抗体的浓度为10-100ng/ml。
10.权利要求1所述的抗菌水凝胶载药微球在制备细胞扩增药物中的应用，其特征在于：通过在水凝胶微球中负载抗体药物，在肿瘤部位的原位注射、静脉注射、口服、灌注等方式用于肿瘤患者免疫细胞的激活和自体免疫细胞抗肿瘤治疗。
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