CN113940949B - 一种负载外泌体的GelMA水凝胶微针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种负载外泌体的GelMA水凝胶微针及其制备方法和应用,属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明首次研究并证实采用GelMA水凝胶负载MSC来源的外泌体微针(GelMA‑MNs‑MSC‑Exo)具有缓解SCI并发症,改善预后等作用。具体的,GelMA‑MNs‑MSC‑Exo能够有效改善SCI后神经功能缺损等症状,因此GelMA‑MNs‑MSC‑Exo是一种潜在的治疗方法,可以减轻SCI后的局部微环境,促进神经功能的恢复,具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域,具体涉及一种负载外泌体的 GelMA水凝胶微针及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种高致残率的中枢神经系统损伤性疾病,导致脊髓神经细胞死亡和胶质瘢痕形成,出现运动、感觉及自主神经功能障碍及神经痛。SCI的严重后果可给患者带来巨大的生理和心理压力以及巨大的医疗负担。临床上除了支持性治疗和紧急手术外,没有其他有效的治疗方法,目前可用的治疗脊髓损伤方法并未达到有效的功能恢复,而全面调节局部微环境是治疗SCI的关键。近年来细胞移植在SCI治疗的研究日益深入,显示出良好的应用前景。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一类具有自我更新能力的多潜能干细胞,是目前比较理想的SCI细胞移植的供体细胞,对星形胶质细胞活化具有较强的多靶点调控作用。MSC移植可以调节病变微环境,然而,细胞移植的益处因移植后病变部位内的细胞存活受损而明显受限。而由细胞分泌的外泌体 (Exosomes,Exo)作为胞外囊泡的一种,直径30-150nm,可由多种活细胞分泌,通过其携带的蛋白质、核酸和脂类等调节受体细胞的生物学活性。MSC来源的外泌体(MSC-Exo)不仅能模拟MSC多数的生物学功能,而且与MSC相比, MSC-Exo体积小、不易堵塞微血管、无生长增殖能力、诱发肿瘤的风险低、靶向性穿过质膜及转运效率高,在治疗应用上更具有优势。然而,现有给药方式易造成外泌体给药效率低下且无法实现长期稳定释放,治疗效果不佳。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明提供一种负载外泌体的GelMA水凝胶微针及其制备方法和应用。本发明通过设计制备负载2D及3D-Exo的GelMA水凝胶微针,将微针贴敷于SCI创面,经研究证明,其对减轻脊髓损伤(SCI)后神经炎症反应、细胞凋亡及胶质瘢痕等起到重要作用,有助于缓解SCI并发症,改善预后,因此具有良好的实际应用之价值。
具体的,本发明涉及以下技术方案:
本发明的第一个方面,提供外泌体在制备治疗脊髓损伤(SCI)产品中的应用。
其中,所述外泌体为间充质干细胞来源的外泌体;具体的,所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
所述外泌体直径为30-150nm。
进一步的,所述外泌体为2D培养和/或GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体;进一步优选的,所述外泌体为GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体。采用GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞,可通过可溶性分泌物产生具有增强治疗效力的Exo来调节它们的旁分泌信号,增强了血管生成、神经发生和免疫调节,介导神经功能恢复。此外,通过机械拉伸影响MSC的可溶性因子的分泌,从而显著促进细胞因子的分泌,而3D培养的MSC比2D培养或单一培养的细胞分泌更多的Exo。
所述产品可以为微针(microneedle,MN)。更具体的,所述产品为GelMA水凝胶微针。
本发明的第二个方面,提供一种微针,所述微针为负载外泌体的GelMA水凝胶制备得到。
所述微针作为一组长度约为1mm的小针头,由于微针微小的阵列组微型针头结构,使得其仅刺穿皮肤或组织表层,形成的细微孔洞可以在数小时内自动愈合,不会造成出血和创伤,从而可实现无痛微创给药。本发明中,通过将所述微针贴敷于SCI创面,达到Exo在损伤区域缓慢释放的目的,从而实现治疗脊髓损伤的作用,更具体的,所述微针具有如下任意一种或多种应用:
(a)减轻脊髓损伤导致的神经功能缺损;
(b)减轻脊髓损伤导致的组织损伤;
(c)减少脊髓损伤引发的尼氏小体的丢失;
(d)抑制脊髓损伤诱导的细胞凋亡;
(e)促进脊髓损伤后小胶质细胞由M1表型向M2表型极化;
(f)减少脊髓损伤后GFAP、IL-6的表达,增加IL-10的表达;
(g)促进神经修复蛋白的上调表达;
(h)促进神经修复相关miRNA的上调表达。
其中,所述(e)中,促进脊髓损伤后小胶质细胞由M1表型向M2表型极化具体表现为抑制i-NOS的上调表达;以及促进CD163的上调表达。
本发明的第三个方面,提供上述微针的制备方法,所述制备方法包括:
S1、外泌体的培养制备;
S2、将步骤S1制备得到的外泌体加入到GelMA水凝胶前驱液中,光固化后即得。
本发明的第四个方面,提供上述微针在制备治疗脊髓损伤外用药物中的应用。
本发明的第五个方面,提供一种治疗脊髓损伤的方法,所述方法包括:将上述微针贴敷于受试者脊髓损伤的创面。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果:
上述技术方案首次研究并证实采用GelMA水凝胶负载MSC来源的外泌体微针(GelMA-MNs-MSC-Exo)具有缓解SCI并发症,改善预后等作用。具体的, GelMA-MNs-MSC-Exo能够有效改善SCI后神经功能缺损等症状,因此GelMA-MNs-MSC-Exo是一种潜在的治疗方法,可以减轻SCI后的局部微环境,促进神经功能的恢复,具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明整体研究线路图。
图2为本发明实施例中GelMA-MNs-MSC-Exo设计及制作线路图。为本发明实施例中负载2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo的GelMA水凝胶微针制作过程。制作简要步骤如下:a):将100ug外泌体悬液加入到提前配置好的5%(w/v) GelMA-60水凝胶前驱液中;b):将前驱液滴加入提前备好的模具中并在50℃水浴加热除泡(重复2-3次);c):30-35℃烘箱加热,多次加热浓缩;d):UV405nm光固化20s;e):制作复合基底膜,滴加20%(w/v)PVA溶液;f):30-35℃加热烘干>12 h;g):微针脱模完成制作。注:实验过程中所使用的便携式固化光源(产品厂家及型号:苏州永沁泉智能设备有限公司,EFL-LS-1601-505)。实验过程中所使用的模具(产品厂家及型号:苏州永沁泉智能设备有限公司,EFL-MMN-600)。
图3为本发明实施例中GelMA-MNs-MSC-Exo的表征分析。(A)不同放大倍数下GelMA-MNs-MSC-Exo的电镜拍摄图片。(B)GelMA-MNs-MSC-Exo针尖俯视电镜拍摄图片。(C)GelMA-MNs-MSC-Exo针尖侧面电镜拍摄图片。(D)各组GelMA-MNs-MSC-Exo近红外光谱分析。
图4为本发明实施例中普通2D培养、GelMA水凝胶3D培养的MSC、 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo的显微镜拍摄及其他表征图像。(A)普通倒置显微镜下显示2D-MSC(P5)呈长梭形、并有分支,排列紧密,细胞间相互紧密贴附生长,沿胞体长轴有序排列,3D-MSC(P5)呈梭形或多角形,细胞数量明显增多,细胞体积较小。图片刻度尺均为100μm。(B)共聚焦显微镜下2D-MSC的活死细胞染色。采用钙黄绿素-AM和碘化丙啶试剂对细胞进行荧光染色,其中绿色荧光指示活细胞,红色荧光指示死细胞。图片刻度尺均为250μm。(C)共聚焦显微镜下3D-MSC的活-死细胞染色染色的底面及上面观。染色方法同上,指示活细胞的绿色荧光细胞团在水凝胶中均匀分布,指示死细胞的红色荧光基本观察不到,表明对MSC的细胞毒性很低,具有良好的细胞相容性。图片刻度尺均为200 μm。(D)qNano检测2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo粒径分布图。2D-MSC-Exo粒径平均为129.2nm,3D-MSC-Exo粒径平均为117.1nm。(E)透射电镜下观测外泌体形态。标尺=100nm。(F)Western blot检测2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo表面标志物TSG101、CD63、CD9及阴性标志物Calnexin的表达情况。
图5为本发明实施例中正常状态下BV2细胞吞噬2D-MSC-Exo及 3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(A)正常状态下BV2细胞吞噬 2D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(B)正常状态下BV2细胞吞噬 3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。细胞膜染料PKH-67标记的MSC-Exo 呈绿色荧光,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记的细胞核呈蓝色荧光,鬼笔环肽标记的细胞骨架呈红色荧光。将PKH-67标记的MSC-Exo与BV2细胞共孵育24 h,共聚焦显微镜下拍摄观察到绿色荧光颗粒散在分布于细胞质,提示MSC-Exo 被BV2吞噬。图片刻度尺均为20μm。
图6为本发明实施例中正常状态下AST细胞吞噬2D-MSC-Exo及 3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(A)正常状态下AST细胞吞噬 2D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(B)正常状态下AST细胞吞噬 3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。染色及拍摄过程同上。图片刻度尺均为20μm。
图7为本发明实施例中LPS刺激后BV2细胞吞噬2D-MSC-Exo及 3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(A)LPS刺激后BV2细胞吞噬 2D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(B)LPS刺激后BV2细胞吞噬 3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。染色及拍摄过程同上,LPS刺激BV2 细胞24h,LPS浓度为1μg/mL。图片刻度尺均为20μm。
图8为本发明实施例中LPS刺激后Ast细胞吞噬2D-MSC-Exo及 3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(A)LPS刺激后Ast细胞吞噬 2D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(B)LPS刺激后Ast细胞吞噬 3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。染色及拍摄过程同上,LPS刺激Ast 细胞24h,LPS浓度为1μg/mL。图片刻度尺均为20μm。
图9为本发明实施例中2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo对LPS刺激BV2细胞后IL-6及IL-10表达量的影响。(A)IL-6、IL-10及β-actin的Western blot分析和目标蛋白在BV2细胞匀浆中的相对表达。(B)GFAP及β-actin的Western blot和目标蛋白在BV2细胞匀浆中的相对表达。(C-D)IL-10、IL-6蛋白相对表达量的定量分析。(E)GFAP蛋白相对表达量的定量分析。Value=mean±SD,N=3/组。**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。
图10为本发明实施例中2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo对大鼠SCI后神经保护作用动物实验及行为学评分图。(A)钳夹法制作大鼠SCI手术图,黑色箭头显示为脊髓钳夹损伤处,黑色星号显示为植入脊髓损伤处的GelMA-MN-Exo。(B) 术后1d、7d、14d、21d、28d大鼠BBB评分。Value=mean±SD,N=5/组。 **p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。数据使用单因素方差分析并用 Bonferroni校正。
图11为本发明实施例中2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo对SCI后组织病理的影响。(A)HE染色显示各组脊髓损伤后组织病理学改变。(B)各组HE染色片中脊髓空腔统计柱状图。Value=mean±SD,N=5/组。****p<0.0001。数据使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。
图12为本发明实施例中2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo对脊髓损伤后尼氏小体丢失的影响。Sham组尼氏小体排列整齐、均匀紧密、染色较深。SCI组及 SCI+GelMA组尼氏小体分解成细颗粒状,尼氏小体着色的神经元数量显著减少,相比于SCI组及SCI+GelMA组,GelMA-MSC-Exo组中尼氏小体着色的神经元数量显著增多。
图13为本发明实施例中2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo对脊髓损伤后细胞凋亡相对数量的影响。(A)TUNEL染色显示各组脊髓损伤后相对细胞凋亡数的影响。(B)各组细胞凋亡数统计柱状图。Value=mean±SD,N=5/组。***p<0.001, ****p<0.0001。数据使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。
图14为本发明实施例中2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo对脊髓损伤后胶质瘢痕标记物星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)相对表达量的影响。 DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光,GFAP标记呈红色荧光。图片刻度尺均为100 μm。
图15为本发明实施例中2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo对脊髓损伤后小胶质细胞极化标志物M1(i-NOS)及M2(CD163)相对表达量的影响。DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光,i-NOS标记呈绿色荧光,CD163标记呈红色荧光。图片刻度尺均为100μm。
图16为本发明实施例中2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo对脊髓损伤后GFAP、 IL-6及IL-10相对表达量的影响。(A)GFAP、IL-6、IL-10及β-actin的Western blot 分析和目标蛋白在脊髓损伤后组织匀浆中的相对表达。(B-D)IL-6、IL-10、GFAP 蛋白相对表达量的定量分析。Value=mean±SD(n=3/组)。***p<0.001,****p<0.0001根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。
图17为本发明实施例中提取的2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo蛋白组学及转录组学测序样品质量分析。(A)2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo各3份样品的皮尔森相关性分析。(B)2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo四维蛋白质谱测序显示差异蛋白变化。
图18为本发明实施例中提取的2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo内容物四维蛋白质谱分析结果。(A)2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo中差异蛋白热图分析。 (B)2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo中差异蛋白GO分析。
图19为本发明实施例中提取的2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo内容物miRNA 分析结果。(A)2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo中差异蛋白热图分析。 (B)2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo中差异蛋白GO分析。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法,通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件,这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人,《分子克隆:实验手册》中所述的技术和条件,或按照制造厂商所建议的条件。
结合具体实例对本发明作进一步的说明,以下实例仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件,通常按照常规条件,或按照销售公司所推荐的条件;实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可通过商业途径购买得到。
如前所述,针对间充质干细胞中提取的外泌体对脊髓损伤后导致的生理病理性变化能否发挥作用及相关作用机制尚缺乏研究。
水凝胶作为一种具有高亲水性的高分子材料,为SCI药物输送和治疗带来了新的见解,其生物可降解性和良好的生物相容性在医学领域发挥着重要作用,特别是在干细胞研究、癌症生物学和细胞形态发生方面。此外,将药物包裹进入水凝胶可使其达到稳定的释放效果及增加局部药物浓度而无任何副作用。由于水凝胶具有原位胶凝及自愈的优点,可在深部和封闭的解剖部位进行微创手术。在 SCI治疗中,良好的水凝胶需要在具有良好生物相容性的前提下持续释放“货物”。
为解决SCI后Exo到达靶区效率低下问题,本发明设计了一种负载MSC-Exo 的GelMA水凝胶微针(GelMA hydrogel microneedles loaded with MSC-Exo, GelMA-MNs-MSC-Exo),通过负载2D及3D-Exo,将微针贴敷于SCI创面,达到Exo在损伤区域缓慢释放的目的。微针(microneedle,MN)作为一组长度约为1 mm的小针头,在水凝胶中可混合不同的大分子物质而不会造成组织损伤;这些大分子包括基因、蛋白质以及外泌体形式的核酸。通过MN给药可保证药物的精确高效和均匀分布,成为治疗SCI的一种有前途的新给药方法。由于微针微小的阵列组微型针头结构,使得其仅刺穿皮肤或组织表层,形成的细微孔洞可以在数小时内自动愈合,不会造成出血和创伤,从而可实现无痛微创给药。与传统的金属、硅基微针相比,基于水凝胶等生物材料的微针具备以下优点:(1)、载药量大和可控的药物控释;(2)针体材料由高分子生物材料组成,生物相容性良好,避免针尖断裂对皮肤或组织造成潜在损伤;(3)采用交联的高分子生物材料制备的微针可实现微针在皮下溶胀而不溶解,进而增加了微针的载药量。在本研究中,本发明成功制备GelMA-MNs-MSC-Exo并用于大鼠SCI模型中,从而实现药物在SCI损伤组织中的均匀分布。因此,GelMA-MNs-MSC-Exo是一种潜在的治疗方法,可以减轻SCI后的局部微环境,促进神经功能的恢复。
有鉴于此,本发明的一个典型具体实施方式中,提供外泌体在制备治疗脊髓损伤(SCI)产品中的应用。
本发明的又一具体实施方式中,所述外泌体为间充质干细胞来源的外泌体;具体的,所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
本发明的又一具体实施方式中,所述外泌体直径为30-150nm。
本发明的又一具体实施方式中,所述外泌体为2D培养和/或GelMA水凝胶 3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体;进一步优选的,所述外泌体为GelMA 水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体。采用GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞,可通过可溶性分泌物产生具有增强治疗效力的Exo来调节它们的旁分泌信号,增强了血管生成、神经发生和免疫调节,介导神经功能恢复。此外,通过机械拉伸影响MSC的可溶性因子的分泌,从而显著促进细胞因子的分泌,而3D培养的MSC比2D培养或单一培养的细胞分泌更多的Exo。
本发明的又一具体实施方式中,所述产品可以为微针(microneedle,MN)。更具体的,所述产品为GelMA水凝胶微针。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种微针,所述微针为负载外泌体的 GelMA水凝胶制备得到。
所述微针作为一组长度约为1mm的小针头,由于微针微小的阵列组微型针头结构,使得其仅刺穿皮肤或组织表层,形成的细微孔洞可以在数小时内自动愈合,不会造成出血和创伤,从而可实现无痛微创给药。本发明中,通过将所述微针贴敷于SCI创面,达到Exo在损伤区域缓慢释放的目的,从而实现治疗脊髓损伤的作用,更具体的,所述微针具有如下任意一种或多种应用:
(a)减轻脊髓损伤导致的神经功能缺损;
(b)减轻脊髓损伤导致的组织损伤;
(c)减少脊髓损伤引发的尼氏小体的丢失;
(d)抑制脊髓损伤诱导的细胞凋亡;
(e)促进脊髓损伤后小胶质细胞由M1表型向M2表型极化;
(f)减少脊髓损伤后GFAP、IL-6的表达,增加IL-10的表达;
(g)促进神经修复蛋白的上调表达;
(h)促进神经修复相关miRNA的上调表达。
本发明的又一具体实施方式中,所述(e)中,促进脊髓损伤后小胶质细胞由 M1表型向M2表型极化具体表现为抑制i-NOS的上调表达;以及,促进CD163 的上调表达。
本发明的又一具体实施方式中,提供上述微针的制备方法,所述制备方法包括:
S1、外泌体的培养制备;
S2、将步骤S1制备得到的外泌体加入GelMA水凝胶前驱液中,光固化后即得。
其中,所述步骤S1中,外泌体具体培养制备方法包括:
将间充质干细胞进行2D或3D培养,采用离心法收集间充质干细胞所分泌的外泌体。
本发明的又一具体实施方式中,所述3D培养具体包括:将间充质干细胞加入GelMA前驱液中,将细胞溶液加入固化环中,经光固化后加入完全培养基,短时间(如1-10min,优选为5min)培养后去除培养基,再加入全新的培养基后继续培养。
本发明的又一具体实施方式中,所述GelMA前驱液浓度控制为1-10%,优选为5%,其是将甲基丙烯酸酯化明胶(methacrylated gelatin,GelMA)溶于含有光引发剂的缓冲液中获得。
本发明的又一具体实施方式中,所述光引发剂可以为苯基锂-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐(LAP)。
本发明的又一具体实施方式中,所述光固化具体为:采用蓝光光源固化1-20 s,优选为20s。
本发明中使用的甲基丙烯酸酯化明胶作为一种光敏性的生物材料,配合光引发剂使用时可在蓝光或紫外光下迅速交联固化,形成具有一定强度的3D结构,具有细胞黏附位点及基质金属蛋白酶水解位点,可良好支持细胞的增殖及迁移,可负载多种细胞或其分泌的生物活性物质。通过改变GelMA的浓度可调整交联后其力学性能。同时,上述制备方法中,结合蓝光固化技术,可使GelMA迅速固化成型,相对于紫外光容易引起染色体变异和高细胞毒性,蓝光固化对细胞低毒性,且对人体皮肤和眼睛损伤更小。GelMA水凝胶生物降解速率缓慢,其机械性能可通过调节水凝胶浓度、交联度和凝胶时间来改变,从而更好的适应脊髓微环境。与此同时,GelMA水凝胶杨氏模量较低,为神经元细胞提供了良好的生存和代谢环境。其化学组成适于整合ECM分子以及其他黏附蛋白,能够有效支持和引导轴突再生,因此是生物材料中用于SCI修复的极佳选择。
本发明的又一具体实施方式中,所述步骤S2具体方法包括:
将步骤S1制得的外泌体加入GelMA水凝胶前驱液中,将混合液加入微针制作模具中水浴负压除泡,加热浓缩后进行光固化;复合基底膜,加入PVA溶液,低温干燥后脱模即得。
本发明的又一具体实施方式中,所述GelMA水凝胶前驱液中GelMA氨基取代度为30-90%,优选为60%,该条件下最终固化得到的GelMA水凝胶的强度适宜,非常适合作为微针使用。
光固化具体条件为:可采用在紫外辐照(如UV405nm)下光固化1-60s,优选固化20s。
其中,所述PVA溶液浓度控制为10-30%(w/v),优选为20%。
所述低温干燥具体条件为在30-35℃加热干燥不小于12h。
本发明的又一具体实施方式中,提供上述微针在制备治疗脊髓损伤外用药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种治疗脊髓损伤的方法,所述方法包括:将上述微针贴敷于受试者脊髓损伤的创面。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1.实验动物:选取体重280-320g的成年雄性SPF级SD大鼠用于本研究,实验动物购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。饲养于山东第一医科大学第一附属医院动物中心SPF级动物饲养房,温度20±2℃,以自然光/暗(≈12h-12h)循环。动物实验方案由山东第一医科大学动物护理与使用委员会根据动物护理与使用指南中概述的原则批准。研究动物模型的人员按照机构动物护理和使用委员会指南 (IACUC)的规定接受系统培训。
2.大鼠SCI模型建立:采用钳夹法建立脊髓损伤模型,具体方法为:所有大鼠术前空腹6h,采用异氟烷麻醉,异氟醚剂量采用R500通用小动物麻醉控制。将背部备皮后将动物俯卧位固定于显微镜解剖台板。定位后以T10为中心行后正中切口,剥离两侧椎旁肌,显露T9-11椎板,交替应用Allis钳和蚊式血管钳切除T10椎板至椎弓根,修整椎板边界并清晰显露硬膜两侧缘。止血满意后,持针器持夹三角针(1/2,6×14),将其钝性端从硬膜与其前方的椎体之间钝性穿至对侧,此过程中尽量避免对脊髓的扰动及牵拉,从而在两者之间形成一通道,以容动脉瘤夹通过。用持夹器将动脉瘤夹(标定力为30g)经通道穿至对侧,并直视下确保动脉瘤夹完全跨过硬膜,其后瞬间释放动脉瘤夹以完全钳夹脊髓,维持1 min后小心撤去动脉瘤夹,并可见钳夹处硬膜有一明显血肿印记。彻底止血后用碘伏涂擦伤口并冲洗伤口,用4-0缝线逐层关闭切口。上述全部操作均满足无菌要求。术中及术后烤灯取暖,至实验大鼠苏醒。假手术(Sham)组:同法切除T10 椎板并显露硬膜,并同样以三角针穿过形成通道,但不穿过动脉瘤夹,关闭切口。术后护理:术后大鼠以单笼饲养,维持正常昼夜节律,并充足供应食物和水。术后每天2次进行膀胱按摩,直至恢复正常排尿。每天更换垫料,保持肢体干燥。对于发生皮肤压疮的大鼠,每日以庆大霉素溶液擦拭褥疮部位,并肌注青霉素 20万U/d,持续3d。
3.实验设计:在这项研究中,大鼠被随机分为5组:(1)Sham组,(2)SCI组, (3)SCI+GelMA组,(4)SCI+GelMA+2D-Exo组,SCI+GelMA+3D-Exo组,5只/ 组。
4.MSC 2D培养:随机处死1只新生SD乳鼠,浸泡于体积分数75%乙醇内消毒12min。无菌条件下分离股骨与两侧胫骨,剪除骨端,用无菌PBS冲洗骨髓腔, 70μm细胞滤网过滤后离心。取沉淀,用含l0%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的 DMEM培养基重悬后接种于细胞培养瓶内,72h后换液去除未贴壁细胞。待细胞长至80%融合时,以1:3的比例传代培养。取第3代(P3)后的MSC用于本研究。
5.MSC 3D培养:将冻干的GelMA-60溶于含有光引发剂苯基锂-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐(LAP)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,配成5%浓度的GelMA溶液。收集上述MSC细胞并用5%浓度的GelMA溶液重悬细胞以形成生物墨水,细胞密度约1.5*106/mL,将细胞溶液加入到固化环中。通过定时蓝光光源固化10s后加入完全培养基,在37℃细胞培养箱中培养5min后倒掉培养基,加入全新培养基继续培养。
6.MSC-Exo的收集:取第3~5代MSC,待细胞融合至80%时,无菌PBS冲洗 2次后用不含血清的DMEM培养基继续培养48h。当细胞密度达到70-80%时,收集培养基。4℃、2000g离心5min;离心后取上清,将上清置于另一个离心管中,在4℃、3500g离心15min后继续取上清,将上清置于新的离心管中,4℃、 10000g离心30min后取上清,吸取上清后移至超高速离心管中,用移液枪在能精确到0.001g的天平上用1×PBS缓冲液配平,放入超高速离心机中,4℃,120000 g超高速离心140min后将上清弃去,用1×PBS缓冲液将沉淀重悬后经0.22um无菌滤器过滤后再次吸入超速离心机配套的离心管中,4℃、120000g超高速离心70min后弃上清得到离心管底部外泌体,用100uL的1×PBS液小心吹打离心管底部,吸入到0.5mL离心管中,使用移液枪轻轻吹打,使其完全溶解,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白法测定外泌体浓度,-80℃保存备用。 3D-MSC-Exo的收集方法同上,注意收集上清时,用滤网将水凝胶去除。
7.MSC-Exo电镜鉴定:利用透射电镜鉴定形态,取8μL MSC-Exo悬液滴至载体铜网(220目)上,静置2min,滤纸吸干周围后在铜网上滴入8μL 1%的磷钨酸负染液,室温复染2min,铜网放置白炽灯下烤干约10min。利用透射电镜下分别观察2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo并拍照。
8.MSC-Exo表面标志物鉴定:利用Western blot检测MSC-Exo表面特异性阳性标志蛋白,将新鲜MSC-Exo加入RIPA裂解后利用BCA法蛋白浓度定量,常规 Western blot检测CD63、CD9和TSG101的表达。阴性标志物用Calnexin定量。
9.MSC-Exo粒径分析:利用qNano仪器鉴定MSC-Exo粒径,将MSC-Exo用PBS 按1:100稀释,取40μL加入到上样槽中,加压至700Pa,每次样本测试结束后,在上样槽中加入已知浓度和大小的标准样品CPC100和样本进行校准比对获得结果。qNano仪器参数如下:0.76V电压,125nA电流,纳米孔臂直接的距离设定为47.12mm。利用软件ICS.3.3.2.2000进行校准处理。
10.GelMA-MNs-MSC-Exo微针制作:第1步,将100ug的2D-MSC-Exo及 3D-MSC-Exo悬液分别加入到提前配置好的5%(w/v)GelMA-60水凝胶前驱液中;第2步,将混合液滴加于模具中并在50℃水浴负压加热除泡(重复2-3次);第3步,30-35℃烘箱加热,多次加热浓缩;第4步,UV405nm光固化20s;第5步,复合基底膜,滴加20%(w/v)PVA溶液;第6步,30-35℃加热烘干>12h;第7步,微针脱模。单独GelMA光固化微针制作不添加外泌体悬液,其他步骤相同。
11.大鼠BBB评分:全部的实验动物均在术后1d、5d、7d、28d进行BBB评分(Basso,Beattie and Bresnahan score),评分采用双人双盲独立观察,对大鼠进行运动功能评价,观察记录人员为熟悉评分规则的非本组实验人员,最后结果为两位观察员的平均记录分数。评分在开放环境中进行,每次均在上午评分,评分前排空膀胱,观察期为4min,BBB评分细则主要是依据动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况进行评分。该评分的完成是由一位不知情者独立完成。
12.大鼠脊髓标本提取:全部实验大鼠均在脊髓损伤后28d处死。大鼠麻醉后,将其胸腔敞开并显露心脏,20号穿刺针插入左心室并指向升主动脉弓方向,先快速灌注生理盐水250ml,并在右心耳剪一小口,使得稀释的血液由此流出。再缓慢灌注4%多聚甲醛,约20min后大鼠的胸骨及肝脏逐渐变白,且肢体僵硬后,打开原手术切口,将约5cm的完整脊髓标本(以损伤部位为中心)取出。浸泡在新鲜的甲醛溶液中,固定48h后送病理科行石蜡包埋及切片,所有切片均为脊髓损伤部位的横截面及纵切面,切片厚度为5μm。切片行HE染色,镜下观察脊髓损伤情况。
13.苏木精-伊红(HE)染色:脊髓组织经40g/L多聚甲醛溶液固定24h后,梯度脱水,石蜡包埋固定,利用切片机切片,厚度为5-10μm,切片保持和脊髓长轴垂直。切片常规脱蜡、复水,苏木精染色5min,经0.5%盐酸乙醇分色、水洗蓝化后,伊红染色30s,二甲苯透明,中性树胶封固,在显微镜下观察脊髓组织形态并拍照。
14.尼氏染色:石蜡切片脱蜡后逐级酒精脱脂后至蒸馏水清洗。入1%焦油紫水溶液中染色,37℃温箱中染色20min后用蒸馏水速洗,95%酒精分色,镜检至神经元尼氏体清晰。无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
15.TUNEL染色:石蜡切片脱蜡后滴加20μg/mL不含DNase的蛋白酶K,37℃放置30min,PBS洗涤3min/次×3次,3%H2O2室温孵育20min,PBS洗涤3min/次×3 次,滴加50μLTUNEL检测液,37℃湿盒避光孵育90min,PBS洗涤3min,滴加标记反应终止液,室温湿盒孵育10min,PBS洗3min/次×3次,滴加DAB显色液室温孵育10min,PBS洗3min/次×3次,苏木素复染,PBS洗3min/次×3次,树胶加盖片封片。荧光显微镜及照相系统下分析结果并拍照,以细胞核内出现棕黄色颗粒为TUNEL阳性标记细胞,对每张切片取5个视野,分别计数外核层凋亡阳性细胞及细胞总数,以凋亡指数反映细胞凋亡的情况。
16.统计分析:数据分析采用MATLAB/GraphPad Prism软件(版本为8.3)。数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析评估组间差异,采用Bonferroni检验进行事后比较。统计学显著性标准设定为p<0.05(*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001、和****p<0.0001)。
实验结果:
1.负载2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo的GelMA水凝胶微针在脊髓损伤中的神经保护作用研究线路图
2.GelMA-MNs-MSC-Exo设计及制作线路图
制作简要步骤如下:a):将100ug外泌体悬液加入到提前配置好的10%(w/v)GelMA-60水凝胶溶液中;b):将混合溶液滴加入提前备好的模具中并在50℃水浴加热除泡(重复2-3次);c):30-35℃烘箱加热,多次加热浓缩;d):UV405nm光固化20s;e):制作复合基底膜,滴加20%(w/v)PVA溶液;f):30-35℃加热烘干>12h;g):微针脱模完成制作。注:实验过程中所使用的便携式固化光源(产品厂家及型号:苏州永沁泉智能设备有限公司,EFL-LS-1601-505)。实验过程中所使用的模具(产品厂家及型号:苏州永沁泉智能设备有限公司,EFL-MMN-600)。
3.GelMA-MNs-MSC-Exo表征分析
(A)不同放大倍数下GelMA-MNs-MSC-Exo的电镜拍摄图片。 (B)GelMA-MNs-MSC-Exo针尖俯视电镜拍摄图片。(C)GelMA-MNs-MSC-Exo针尖侧面电镜拍摄图片。(D)各组GelMA-MNs-MSC-Exo近红外光谱分析。
4.普通2D培养及GelMA水凝胶3D培养的MSC及MSC-Exo的显微镜及相关鉴定图
(A)普通倒置显微镜下显示2D-MSC(P5)呈长梭形、并有分支,排列紧密,细胞间相互紧密贴附生长,沿胞体长轴有序排列,3D-MSC(P5)呈梭形或多角形,细胞数量明显增多,细胞体积较小。图片刻度尺均为100μm。(B)共聚焦显微镜下2D-MSC的活-死细胞染色。采用钙黄绿素-AM和碘化丙啶试剂对细胞进行荧光染色,其中绿色荧光指示活细胞,红色荧光指示死细胞。图片刻度尺均为250 μm。(C)共聚焦显微镜下3D-MSC的活-死细胞染色染色的底面及上面观。染色方法同上,指示活细胞的绿色荧光细胞团在水凝胶中均匀分布,指示死细胞的红色荧光基本观察不到,表明对MSC的细胞毒性很低,具有良好的细胞相容性。图片刻度尺均为200μm。(D)qNano检测2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo粒径分布图。2D-MSC-Exo粒径平均为129.2nm,3D-MSC-Exo粒径平均为117.1nm。(E) 透射电镜下观测外泌体形态。标尺=100nm。(F)Western blot检测2D-MSC-Exo 及3D-MSC-Exo表面标志物TSG101、CD63、CD9及阴性标志物Calnexin的表达情况。
5.正常状态下BV2细胞吞噬2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片
(A)正常状态下BV2细胞吞噬2D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(B) 正常状态下BV2细胞吞噬3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。细胞膜染料PKH-67标记的MSC-Exo呈绿色荧光,DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光,鬼笔环肽标记的细胞骨架呈红色荧光。将PKH-67标记的MSC-Exo与BV2细胞共孵育24h,共聚焦显微镜下拍摄观察到绿色荧光颗粒散在分布于细胞质,提示 MSC-Exo被BV2吞噬。图片刻度尺均为20μm。
6.正常状态下AST细胞吞噬2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片
(A)正常状态下AST细胞吞噬2D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。(B) 正常状态下AST细胞吞噬3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。染色及拍摄过程同上。图片刻度尺均为20μm。
7.LPS刺激后BV2细胞对2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo的摄取
(A)LPS刺激后BV2细胞吞噬2D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。 (B)LPS刺激后BV2细胞吞噬3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。染色及拍摄过程同上,LPS刺激BV2细胞24h,LPS浓度为1μg/mL。图片刻度尺均为 20μm。
8.LPS刺激后Ast细胞对2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo的摄取
(A)LPS刺激后Ast细胞吞噬2D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。 (B)LPS刺激后Ast细胞吞噬3D-MSC-Exo的共聚焦显微镜下拍摄图片。染色及拍摄过程同上,LPS刺激Ast细胞24h,LPS浓度为1μg/mL。图片刻度尺均为 20μm。
9. 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo显著建设LPS刺激BV2细胞后IL-6及IL-10 的表达
(A)IL-6、IL-10及β-actin的Western blot分析和目标蛋白在BV2细胞匀浆中的相对表达。(B)GFAP及β-actin的Western blot和目标蛋白在BV2细胞匀浆中的相对表达。(C)IL-6、IL-10蛋白相对表达量的定量分析。(D)GFAP蛋白相对表达量的定量分析。数据表示为mean±SD(n=3)。**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001根据ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。
10. 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo发挥对大鼠SCI后神经保护作用
采用钳夹法(30g动脉瘤夹夹闭T10脊髓30s)制作脊髓损伤模型。(A)钳夹法制作大鼠SCI手术图,黑色箭头显示为脊髓钳夹损伤处,黑色星号显示为植入脊髓损伤处的GelMA-MN-Exo。(B)术后1d、7d、14d、21d、28d大鼠BBB评分。 Value=mean±SD,N=5/组。**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。数据使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。
11. 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo减轻脊髓损伤后组织病理损伤程度
Sham组大鼠脊髓组织结构完整,无明显炎症细胞浸润现象。SCI组大鼠脊髓组织结构明显损伤,出现脊髓充血、水肿等现象,侧索、背侧及中央灰质脊髓空洞增大,炎症细胞浸润增多。(A)HE染色显示各组脊髓损伤后组织病理学改变。(B)各组HE染色片中脊髓空腔统计柱状图。Value=mean±SD,N=5/组。****p<0.0001。数据使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。
12. 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo减轻脊髓损伤后尼氏小体丢失数量
Sham组尼氏小体排列整齐、均匀紧密、染色较深。SCI组及SCI+GelMA组尼氏小体分解成细颗粒状,尼氏小体着色的神经元数量显著减少,相比于SCI 组及SCI+GelMA组,GelMA-MSC-Exo组中尼氏小体着色的神经元数量显著增多。
13. 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo显著减少脊髓损伤后细胞凋亡数量
Sham组表现为极少量的凋亡细胞,SCI组及SCI+GelMA组均出现神经元和神经胶质细胞调亡,细胞核呈深蓝色,神经元呈圆形或三角形,主要分布于前角和中央管周围,部分细胞可见核固缩,深染,位于细胞一侧;神经胶质细胞的凋亡分布广泛,但主要位于邻近灰质的白质部分。(A)TUNEL染色显示各组脊髓损伤后相对细胞凋亡数的影响。(B)各组细胞凋亡数统计柱状图。Value=mean±SD, N=5/组。***p<0.001,****p<0.0001。数据使用单因素方差分析并用Bonferroni 校正。
14. 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo显著减少脊髓损伤后胶质瘢痕标记物星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记的细胞核呈蓝色荧光,GFAP标记呈红色荧光。相比于SCI组,2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo显著减少脊髓损伤后GFAP 的表达。图片刻度尺均为100μm。
15. 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo可显著促进脊髓损伤后小胶质细胞由M1表型向M2表型极化
DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光,i-NOS标记呈绿色荧光,CD163标记呈红色荧光。相比于SCI组,应用2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo后,i-NOS标记的小胶质细胞数量显著减少,CD163标记的小胶质细胞数量显著增多。表明, 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo可显著促进脊髓损伤后小胶质细胞由M1表型向 M2表型极化,发挥神经保护作用,其中3D-MSC-Exo作用效果更加显著。图片刻度尺均为100μm。
16. 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo均可减少脊髓损伤后GFAP、IL-6的表达,增加IL-10的表达
(A)GFAP、IL-6、IL-10及β-actin的Western blot分析和目标蛋白在脊髓损伤后组织匀浆中的相对表达。(B-D)IL-6、IL-10、GFAP蛋白相对表达量的定量分析。结果表明:2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo均可减少脊髓损伤后GFAP、IL-6 的表达,增加IL-10的表达,进而发挥神经保护作用,其中3D-MSC-Exo作用效果更加显著。数据表示为mean±SD(n=3)。***p<0.001,****p<0.0001根据 ANOVA和Bonferroni检验进行事后比较。
17.送检测序的2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo蛋白组学及转录组学样品质量分析
(A)2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo各3份样品的皮尔森相关性分析。(B) 2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo四维蛋白质谱测序显示差异蛋白变化。结果表明, 3份样品稳定,组间差异小,符合生物学重复标准。
18. 3D-MSC-Exo内发挥脊髓损伤后神经保护作用蛋白质含量上升
(A)2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo中差异蛋白热图分析。(B)2D-MSC-Exo及 3D-MSC-Exo中差异蛋白GO分析。结果表明:3D-MSC-Exo内发挥脊髓损伤后神经保护作用蛋白质含量上升,GO分析通路富集分析显示3D-MSC-Exo中差异蛋白主要发挥神经保护作用信号通路。
19. 3D-MSC-Exo内发挥脊髓损伤后神经保护作用miRNA含量上升
(A)2D-MSC-Exo及3D-MSC-Exo中差异蛋白热图分析。(B)2D-MSC-Exo及 3D-MSC-Exo中差异蛋白GO分析。结果表明:3D-MSC-Exo内发挥脊髓损伤后神经保护作用miRNA含量上升,抑制脊髓损伤后神经保护作用miRNA含量下降。GO分析通路富集分析显示3D-MSC-Exo中差异miRNA主要发挥神经保护作用信号通路。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (16)
1.外泌体在制备治疗脊髓损伤产品中的应用;所述外泌体为GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体。
2.如权利要求1所述应用,其特征在于,所述产品为微针。
3.如权利要求2所述应用,其特征在于,所述产品为GelMA水凝胶微针。
4.微针在制备治疗脊髓损伤外用药物中的应用,所述微针为负载外泌体的GelMA水凝胶制备得到;其中,所述外泌体为GelMA水凝胶3D培养骨髓间充质干细胞来源的外泌体。
5.如权利要求4所述应用,其特征在于,所述微针具有如下任意一种或多种应用:
(a)减轻脊髓损伤导致的神经功能缺损;
(b)减轻脊髓损伤导致的组织损伤;
(c)减少脊髓损伤引发的尼氏小体的丢失;
(d)抑制脊髓损伤诱导的细胞凋亡;
(e)促进脊髓损伤后小胶质细胞由M1表型向M2表型极化;
(f)减少脊髓损伤后GFAP、IL-6的表达,增加IL-10的表达;
(g)促进神经修复蛋白的上调表达;
(h)促进神经修复相关miRNA的上调表达。
6.如权利要求5所述应用,其特征在于,所述(e)中,促进脊髓损伤后小胶质细胞由M1表型向M2表型极化具体表现为抑制i-NOS的上调表达;以及,促进CD163的上调表达。
7.如权利要求4-6任一项应用,其特征在于,所述微针的制备方法,包括:
S1、外泌体的培养制备;
S2、将步骤S1制备得到的外泌体加入GelMA水凝胶前驱液中,光固化后即得。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述步骤S1中,外泌体具体培养制备方法包括:
将间充质干细胞进行3D培养,采用离心法收集间充质干细胞所分泌的外泌体。
9.如权利要求8所述应用,其特征在于,所述3D培养具体包括:将间充质干细胞加入GelMA溶液中,将细胞溶液加入固化环中,经光固化后加入完全培养基,短时间培养后去除培养基,再加入全新的培养基后继续培养;
所述GelMA溶液浓度控制为1-10%,其是将甲基丙烯酸酯化明胶溶于含有光引发剂的缓冲液中获得;
所述光引发剂包括苯基锂-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐;
所述光固化具体为:采用蓝光光源固化1-20s。
10.如权利要求9所述应用,其特征在于,所述GelMA溶液浓度控制为5%。
11.如权利要求9所述应用,其特征在于,所述光固化具体为:采用蓝光光源固化20s。
12.如权利要求7所述应用,其特征在于,所述步骤S2具体方法包括:
将步骤S1制得的外泌体加入GelMA水凝胶前驱液中,将混合液加入微针制作模具中水浴负压除泡,加热浓缩后进行光固化;复合基底膜,加入PVA溶液,低温干燥后脱模即得。
13.如权利要求12所述应用,其特征在于,所述GelMA水凝胶前驱液中GelMA氨基取代度为30-90%;
光固化具体条件为:采用在紫外辐照下光固化1-60s;
所述PVA溶液浓度控制为10-30%,w/v;
所述低温干燥具体条件为在30-35℃加热干燥不小于12h。
14.如权利要求12所述应用,其特征在于,所述GelMA水凝胶前驱液中GelMA氨基取代度为60%。
15.如权利要求12所述应用,其特征在于,所述光固化具体条件为:采用在紫外辐照下光固化20s;
所述紫外辐照波长为UV405nm。
16.如权利要求12所述应用,其特征在于,所述PVA溶液浓度控制为20%,w/v。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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