CN115671366B - 促进伤口愈合的复合敷料、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进伤口愈合的复合敷料、其制备方法及应用。其中，该复合敷料为水凝胶预凝胶体系，包括：甲基丙烯酸酯化丝胶、光引发剂和蜂王浆来源的类外泌体囊泡。应用本发明的技术方案，甲基丙烯酸酯化丝胶和蜂王浆来源的类外泌体囊泡形成的复合敷料可有效解决了蜂王浆来源的类外泌体囊泡的持续递送问题，且二者有良好的协同作用可显著提高创面愈合面积百分比，缩短愈合时间，加速创面愈合。

Description

促进伤口愈合的复合敷料、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种促进伤口愈合的复合敷料、其制备方法及应用。

背景技术

皮肤组织是人体最大的器官，具有多种重要功能，包括对病原体和机械应力的保护屏障作用、体温调节以及触觉、压力、振动和疼痛感。然而，由于外伤、烧伤、手术或糖尿病并发症都可能造成皮肤缺损。皮肤伤口愈合是受伤皮肤再生的复杂过程，涉及一系列协调阶段，包括炎症、增殖和重塑阶段，其愈合的过程依赖于残存上皮细胞的迁移和增殖，以及成纤维细胞、炎症细胞、细胞外基质成分的共同参与。无法愈合的伤口通常无法遵循典型的愈合级联，导致慢性炎症停滞并给患者带来巨大的痛苦，同时也带来了巨大的社会经济负担。尽管再生医学取得了许多进展，但伤口感染和有效愈合仍然是一个重要问题，尤其是慢性伤口容易出现许多并发症，例如过度炎症、持续感染、形成耐药微生物生物膜，以及真皮和/或表皮细胞无法对修复性刺激作出反应，会对外科手术的临床结果产生负面影响。

蜂蜜疗法是一种治疗疾病的替代疗法，它使用蜂蜜、蜂王浆、蜂胶、花粉和毒液等蜂制品，引起了现代社会的广泛兴趣。几种蜜蜂产品，例如蜂蜜和蜂王浆 (Royal Jelly )，自古以来就因其抗菌和促再生特性而被用于各种治疗中。在这些天然产品中，蜂王浆（RJ）被认为是一种营养和有价值的食物，具有多种生物学特性，包括抗菌、抗炎、免疫调节、抗氧化、神经保护、促再生和抗癌活性。近年来，蜂王浆（RJ）被证明有助于各种皮肤伤口的愈合，如糖尿病足溃疡和感染/未感染的伤口。临床前研究描述了RJ在多种疾病中的改善作用，例如粘膜炎、结肠炎、骨形成和感染性溃疡或糖尿病足溃疡。在细胞水平上，已发现RJ在牙周膜细胞中诱导成骨并发挥抗炎特性，促进神经干细胞中的神经发生，并增加人真皮成纤维细胞的迁移。许多研究也描述了RJ及其成分的免疫调节特性和其对大肠杆菌、胸腺埃伯氏菌和金黄色葡萄球菌具有杀菌作用。

在过去的几十年中，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）越来越多地用于纳米医学领域，目前该领域的研究主要集中在外泌体(Exosomes)方向。外泌体是直径在30-150nm左右的细胞外囊泡，具有磷脂双分子层结构，呈茶托状或杯状，是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载体。外泌体广泛参与了机体的各种生理/病理性调控，并能够用作多种疾病的诊断、治疗和预后评估。在它们在抗原表达中的作用和转移mRNA/miRNA 的能力等重要发现之后，证明EVs能够在广泛的治疗应用中进行种间和跨界交流，现在已被确定为细胞间通讯的主要因素之一。细胞外囊泡（EVs）可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。作为一种腺体产物，蜂王浆RJ已被研究证明含有大量细胞外囊泡 (EVs)，RJ-EVs 的分子分析证实了其重要的外泌体标记物的存在，例如CD63和syntenin，以及大分子 MRJP1、defensin-1和jellein-3等。RJ-EVs内化分析表明膜融合以及胞饮作用或网格蛋白依赖性内吞作用进入哺乳动物细胞，已证明RJ-EVs可调节MSCs 分化和分泌，并通过阻断MAPK通路来减少LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症。体内研究证实了RJ-EVs强大的抗菌和生物膜抑制特性，并在小鼠背部皮肤全层皮肤缺损模型中证明了通过调节炎症阶段和伤口愈合中的细胞反应来加速伤口愈合，这一特性有利于慢性伤口治疗。然而，RJ-EVs不能长时间的单独保存和持续作用于受损部位，缺乏理想的长效局部递送系统。

甲基丙烯酸酯化丝胶（SerMA），由丝胶与甲基丙烯酸修饰而来，制备简单方便，价格低廉，容易实现工业化生产。甲基丙烯酸酯化丝胶具有良好的黏附性以及生物相容性，多种细胞可在其中生长和培养，本身也具有很多优异的生物特性，已被很多研究应用。已有研究多利用其光敏特性进行3D打印，以及骨损伤方面应用，然而在负载与缓释蜂王浆来源的细胞外囊泡并协同应用于血管新生和伤口愈合与修复的领域尚属空白。

发明内容

本发明旨在提供一种促进伤口愈合的复合敷料、其制备方法及应用，以解决现有技术中蜂王浆来源的类外泌体囊泡的递送效率低的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种促进伤口愈合的复合敷料。该复合敷料为水凝胶预凝胶体系，包括：甲基丙烯酸酯化丝胶、光引发剂和蜂王浆来源的类外泌体囊泡。

进一步地，甲基丙烯酸酯化丝胶为采用蚕茧制备甲基丙烯酸酯化丝胶；优选的，光引发剂为光引发剂LAP或光引发剂2959，更优选为光引发剂LAP。

根据本发明的另一个方面，提供一种促进伤口愈合的复合敷料的制备方法。该制备方法包括以下步骤：S1，制备甲基丙烯酸酯化丝胶；S2，提取蜂王浆来源的类外泌体囊泡；以及S3，将甲基丙烯酸酯化丝胶、光引发剂和蜂王浆来源的类外泌体囊泡混合制备得到复合敷料。

进一步地，S1包括：采用蚕茧制备甲基丙烯酸酯化丝胶；优选的，S1包括：S11，将蚕茧脱胶，得到丝胶；S12，将丝胶溶于缓冲液中，制得丝胶溶液；S13，将甲基丙烯酸酐MA加入缓冲液中，然后逐滴加入丝胶溶液；S14，将丝胶溶液室温搅拌过夜后，用超纯水透析，通过冷冻干燥得到改性丝胶即为甲基丙烯酸酯化丝胶；更优选的，S11中蚕茧通过水浴煮沸脱胶、碳酸钠脱胶、中性皂脱胶、高温高压脱胶及酶脱胶中的一种或多种进行脱胶；进一步优选的，S11包括将蚕茧浸泡在Na₂CO₃溶液中煮沸，去除不溶性残留物和Na₂CO₃，然后冷冻干燥得到丝胶；更优选的，S12中，缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液、无机碳酸氢盐缓冲液或磷酸缓冲盐溶液，进一步优选为磷酸缓冲盐溶液。

进一步地，S11中，蚕茧放入Na₂CO₃溶液前采用超纯水洗涤；优选的，Na₂CO₃溶液中Na₂CO₃的摩尔浓度为0.005M~0.1M，更优选为0.02 M；优选的，每克蚕茧加入35~45mLNa₂CO₃溶液，优选40mL；优选的，煮沸的时间为0.5~2小时，更优选为1小时；优选的，去除不溶性残留物和Na₂CO₃包括：通过离心去除不溶性残留物，得到蚕丝溶液，然后将蚕丝溶液采用相对分子质量为3.5 kDa的透析袋放于超纯水中进行透析2~4天，优选3天，除去Na₂CO₃；更优选的，S11中，通过4000 rpm离心10分钟去除不溶性残留物。

进一步地，S12中，PBS缓冲液的pH为8.5；优选的，每克丝胶与溶于34~45mL缓冲液，优选40mL；优选的，S13中，2.90~2.95g甲基丙烯酸酐MA与溶于50ML缓冲液。

进一步地，S2包括：S21，将蜂王浆加入冰的PBS缓冲液在冰面上研磨，溶解并释放蜂王浆中的有效成分，得到含有类外泌体囊泡的蜂王浆溶液；S22，过滤、离心去除蜂王浆PBS溶液中的杂质，得到类外泌体囊泡。

进一步地，S21中蜂王浆与PBS缓冲液的质量比为1:4~1:8；优选的，S21和S22步骤之间还包括将蜂王浆溶液置于4℃冰箱过夜保存；优选的，S22中的过滤、离心包括采用医用无菌纱布初步过滤掉蜂王浆PBS溶液中的杂质；离心条件设置为：4℃，500 g，10 min；4℃，2000 g，20 min；4℃，10000 g，40 min；离心后取上清液，弃沉淀，然后将上清液采用0.22um的滤膜进行过滤，转入超离管中进行超速离心，超速冰冻离心机4℃，110000 g，离心120min，离心后弃上清液，得沉淀，用冰的PBS缓冲液重悬，然后将重悬液于4℃，110000g超速离心120min，离心结束后收集离心管中的沉淀，用1-3ml 冰PBS溶液重悬沉淀，得到类外泌体囊泡；更优选的，重悬沉淀后得到的类外泌体囊泡的浓度是25μg/mL。

进一步地，S3中，光引发剂为光引发剂LAP或光引发剂2959，优选为光引发剂LAP；优选的，S3中，光引发剂LAP的浓度为4.8~5.2 mg/mL，优选5mg/mL。

根据本发明的再一个方面，提供一种促进伤口愈合的系统。该系统包括上述任一种促进伤口愈合的复合敷料和激光照射器件。

进一步地，激光照射器件发射405 nm激光，设置照射时间为10~50秒。

根据本发明的又一方面，提供了一种促进伤口愈合的复合敷料在制备促进皮肤创伤愈合的产品中的应用；可选的，皮肤创伤包括擦伤、皮肤破损、烧伤、皮肤创面感染和慢性难愈合创面损伤。

应用本发明的技术方案，甲基丙烯酸酯化丝胶和蜂王浆来源的类外泌体囊泡形成的复合敷料可有效解决了蜂王浆来源的类外泌体囊泡的持续递送问题，且二者有良好的协同作用可显著提高创面愈合面积百分比，缩短愈合时间，加速创面愈合。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明中的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）的制备流程图；

图2A为RJ-EVs的TEM图，图2B为马尔文纳米粒子跟踪分析图；

图3为甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料的SEM图；

图4为细胞水平上蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）给药后的CCK-8细胞毒性和增殖结果图；

图5A为细胞水平上蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）的划痕实验效果图；图5B为细胞迁徙率示意图；

图6A为炎症因子TNF-αELISA检测图；图6B为炎症因子IL-6ELISA检测图；图6C为抗炎因子IL-10 ELISA检测图；图6D为抗炎因子TGF-β1 ELISA检测图;

图7A为各组小鼠创面不同时期愈合过程外观对比分析图，图7B为数据量化示意图；

图8为各组小鼠背部全层皮肤损伤模型的HE染色图；

图9为各组小鼠不同时期皮肤组织免疫荧光染色分析图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

现有技术中蜂王浆来源的类外泌体囊泡存在递送效率低、作用时间短、难以长时间保存等问题，为了解决这些技术问题，本发明提出了下列技术方案。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种促进伤口愈合的复合敷料。该复合敷料为水凝胶预凝胶体系，包括：甲基丙烯酸酯化丝胶、光引发剂和蜂王浆来源的类外泌体囊泡。

应用本发明的技术方案，甲基丙烯酸酯化丝胶和蜂王浆来源的类外泌体囊泡形成的复合敷料可有效解决了蜂王浆来源的类外泌体囊泡的持续递送问题，且二者有良好的协同作用可显著提高创面愈合面积百分比，缩短愈合时间，加速创面愈合。

优选的，甲基丙烯酸酯化丝胶为采用蚕茧制备甲基丙烯酸酯化丝胶，其来源天然，容易获取，且安全性高。光引发剂可以为光引发剂LAP或光引发剂2959，更优选为光引发剂LAP，安全性更好。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述促进伤口愈合的复合敷料的制备方法。该制备方法包括以下步骤：S1，制备甲基丙烯酸酯化丝胶；S2，提取蜂王浆来源的类外泌体囊泡；以及S3，将甲基丙烯酸酯化丝胶、光引发剂和蜂王浆来源的类外泌体囊泡混合制备得到复合敷料。

优选的，甲基丙烯酸酯化丝胶为采用蚕茧制备甲基丙烯酸酯化丝胶。

根据本发明一种优选的实施方式，S1包括：S11，将蚕茧脱胶，得到丝胶；S12，将丝胶溶于缓冲液中，制得丝胶溶液；S13，将甲基丙烯酸酐MA加入缓冲液中，然后逐滴加入丝胶溶液；S14，将丝胶溶液室温搅拌过夜后，用超纯水透析，通过冷冻干燥得到改性丝胶即为甲基丙烯酸酯化丝胶。通过如此步骤制得的甲基丙烯酸酯化丝胶具有良好黏附性与机械强度，可降解并具有缓释作用，水凝胶作为载体可长期控释蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）并维持其生物活性，使其对皮肤创面能够持续改善修复，且在体外实验中，具有的良好的黏附能力和生物相容性。

S11中，蚕茧可以通过水浴煮沸脱胶、碳酸钠脱胶、中性皂脱胶、高温高压脱胶及酶脱胶中的一种或多种进行脱胶；优选的，S11包括将蚕茧浸泡在Na₂CO₃溶液中煮沸，去除不溶性残留物和Na₂CO₃，然后冷冻干燥得到丝胶。丝胶的等电点在酸性侧，碱能使丝胶偏离等电点,有效地促进丝胶的膨润和溶解，碱法脱胶的精炼工艺比其他方法更加快捷、方便、简单和高效。温度能促进水分子向丝胶内部的扩散和丝胶的运动，且丝胶蛋白分子量随着处理温度和压力的增大而下降，提高精炼液温度（煮沸）有力于脱胶。更优选的，S11中，通过4000rpm离心10分钟去除不溶性残留物。

为了充分高效的脱胶，优选的，Na₂CO₃溶液中Na₂CO₃的摩尔浓度为0.005M~0.1M，更优选为0.02 M；每克蚕茧加入35~45mLNa₂CO₃溶液，可以是35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45mL，优选40mL；煮沸的时间为0.5~2小时，更优选为1小时。

根据本发明一种优选的实施方式，去除不溶性残留物和Na₂CO₃包括：通过离心去除不溶性残留物，得到蚕丝溶液，然后将蚕丝溶液采用相对分子质量为3.5 kDa的透析袋放于超纯水中进行透析2~4天，优选3天，除去Na₂CO₃。由此得到的丝胶更加纯净。为了进一步提高蚕茧的纯净度，提高后续产品的安全性，S11中，蚕茧放入Na₂CO₃溶液前采用超纯水洗涤。

现有技术中存在的缓冲液通常包括磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris(三羟甲基氨基甲烷) 缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl缓冲液、3-吗啉丙磺酸MOPS缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸Tricine缓冲液等等，其中，硼酸盐缓冲液中硼酸盐与许多化合物会形成复盐、如蔗糖；柠檬酸盐缓冲液中柠檬酸盐离子容易与钙结合，存在有钙离子的情况下不能使用；三羟甲基氨基甲烷缓冲液的主要缺点是温度效应，在室温pH是7.8的Tris缓冲液，4℃时是8.4，37℃时是7.4，在pH7.5以下，其缓冲能力极为不理想，Tris缓冲液容易吸收空气中的二氧化碳，储存时需要密封；三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl缓冲液是Tris的盐酸盐形式，其溶液呈酸性，不适合用于本发明；3-吗啉丙磺酸MOPS缓冲液的有效pH缓冲范围为 6.5-7.9，MOPS会干扰蛋白分析，含葡萄糖的MOPS溶液经高压灭菌会导致其部分失活，且MOPS缓冲液保质期短，用前需要用0.2μm滤膜过滤除菌，使用即为不便。而4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES，PH缓冲范围为6.8-8.2，是可满足于所有生物学研究的最佳缓冲液之一， HEPES缓冲液常用于细胞培养的缓冲体系，常用工作浓度为10-25mM；在组织或者器官培养中表现出更好的pH控制能力，但HEPES缓冲液运输时需要加冰袋，但储存时避免冷冻，否则会有盐类物质析出，其价格昂贵，使用率低。N-三(羟甲基)甲基甘氨酸Tricine缓冲液，常用做电泳缓冲液，以及用来重悬细胞沉淀；Tricine缓冲液用前需过滤除菌，使用时要考虑某些潜在的离子反应，价格昂贵，使用率低。PBS是磷酸缓冲盐溶液的简称，它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，是生物化学研究中使用最为广泛的一种无菌缓冲液，便宜易得，储存方便，使用率高。因此，在本发明一实施方式中，S12中，缓冲液可以为4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液、无机碳酸氢盐缓冲液或磷酸缓冲盐溶液，进一步优选为磷酸缓冲盐溶液。

优选的，S12中，PBS缓冲液的pH为8.5；每克丝胶与溶于34~45mL（可以是35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45mL）缓冲液，优选40mL；S13中，2.90g~2.95g （优选2.93g）甲基丙烯酸酐MA与溶于50ML缓冲液。

根据本发明一种优选的实施方式，S2包括：S21，将蜂王浆加入冰的PBS缓冲液在冰面上研磨，溶解并释放蜂王浆中的有效成分，得到含有类外泌体囊泡的蜂王浆溶液；S22，过滤、离心去除蜂王浆PBS溶液中的杂质，得到类外泌体囊泡。本发明的提取方法能更高效的使蜂王浆中的有效成分析出，能够大大提高纯度和获得率。

优选的，S21中蜂王浆与PBS缓冲液的质量比为1:4~1:8，例如可以是1:4、1:5、1:6、1:7或1:8；以便于更充分地溶解和释放蜂王浆中的有效成分。优选的，S21和S22步骤之间还包括将蜂王浆溶液置于4℃冰箱过夜保存，以便于蜂王浆中的有效成分充分溶解在PBS中。

更优选的，S22中的过滤、离心包括采用医用无菌纱布初步过滤掉蜂王浆PBS溶液中的杂质；离心条件设置为：4℃，500 g，10 min；4℃，2000 g，20 min；4℃，10000 g，40min；离心后取上清液，弃沉淀，然后将上清液采用0.22um的滤膜进行过滤，转入超离管中进行超速离心，超速冰冻离心机4℃，110000 g，离心120min，离心后弃上清液，得沉淀，用冰的PBS缓冲液重悬，然后将重悬液于4℃，110000g超速离心120min，离心结束后收集离心管中的沉淀，用1-3ml 冰PBS溶液重悬沉淀，得到类外泌体囊泡。

根据本发明一种优选的实施方式，S3中，光引发剂为光引发剂LAP或光引发剂2959，优选为光引发剂LAP；S3中，光引发剂LAP的浓度为5mg/mL。光引发剂LAP可采用405 nm激光引发，安全性好。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种促进伤口愈合的系统。该系统包括促进伤口愈合的复合敷料和激光照射器件。激光照射器件发射的光的波长可以根据光引发剂进行选择，优选的，本发明中光引发剂LAP，对应的，激光照射器件发射405 nm激光，设置照射时间为1-50秒，例如，可以是10、15、20、25或30秒。

根据本发明一种典型的实施方式，提供上述促进伤口愈合的复合敷料在制备促进皮肤创伤愈合的产品中的应用；可选的，皮肤创伤包括擦伤、皮肤破损、烧伤、皮肤创面感染和慢性难愈合创面损伤。

在本申请一种典型的实施方式中，一种缓释蜂王浆来源的细胞外囊泡促进伤口愈合的复合敷料及制备方法，包括以下步骤：

S1. 甲基丙烯酸酯化丝胶(SerMA)的制备

用超纯水（ddH₂O）洗涤天然来源的10克蚕茧，然后，将蚕茧浸泡在0.02 M Na₂CO₃溶液(400 mL)中煮沸1小时，然后通过离心(4000 rpm，10min)去除不溶性残留物，然后将其用相对分子质量3.5 kDa的透析袋放于ddH₂O中进行透析1天，除去Na₂CO₃，然后通过冷冻干燥得到丝胶。将丝胶(10克)溶于40 mL PBS (pH=8.5)中3小时得到丝胶溶液，然后将甲基丙烯酸酐MA (2.93克)加入PBS (100 mL)中，逐滴缓慢加入丝胶溶液中。室温搅拌过夜（例如10~14小时）后，用超纯水（ddH₂O）透析3天，通过冷冻干燥得到改性丝胶即为甲基丙烯酸酯化丝胶(SerMA)。

S2. 蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）的提取

购买农家采集的新鲜油菜花蜂王浆，全程低温运输，储存于-80℃冰箱可长期保存，用之前要于4℃冰箱回温。取适量克数的蜂王浆于研钵中，加入冰的PBS磷酸缓冲液（1：6稀释）在冰面上研磨30min，以便于更充分地溶解和释放蜂王浆中的有效成分。再装入已经洗干净的离心瓶中放到4℃冰箱里面过夜保存，以便于蜂王浆中的有效成分充分溶解在PBS中。再用细密的医用无菌纱布初步过滤掉蜂王浆PBS溶液中的大杂质，再装到已经洗干净的离心瓶中。将溶液连续离心，离心条件设置为：4℃，500 g，10 min；4℃，2000 g，20 min；4℃，10000 g，40 min；离心后取上清，弃沉淀，然后将上清液采用0.22um的滤膜进行过滤，转入超离管中进行超速离心，超速冰冻离心机4℃，110000 g，离心120min，离心后弃上清，得沉淀，用适量冰的PBS缓冲液重悬。然后将重悬液于4℃，110000g超速离心120min，离心结束后收集离心管中的沉淀，用1-3ml 冰PBS溶液重悬沉淀（根据不同的要求浓度加入不同量的冰PBS），再储存于-80℃冰箱中可长期保存。

S3. 甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料的制备

优选的，所述S1通过离心(4000 rpm，10分钟)去除不溶性残留物。

优选的，所述S1中的改性丝胶加入含有光引发剂LAP和蜂王浆来源的类外泌体囊泡的PBS中制备预凝胶溶液，光交联时间为10-100秒。

优选的，所述S2中的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）的浓度是25μg/mL。

在本发明中，将提取到的甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料作为治疗皮肤全层损伤小鼠模型的实验组药物，以单独使用甲基丙烯酸酯化丝胶（SerMA）、单独使用蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）、仅涂抹PBS组作为对照组，观察甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料对小鼠背部皮肤创面促进愈合的疗效。实验显示使用甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料相较于单独使用具有明显的协同作用效果，相对于仅涂抹PBS组有更显著的修复作用。主要体现在：1、在细胞水平上蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）能被L929细胞、NIH3T3细胞有效摄取，在划痕实验中可有效的促进L929细胞、NIH3T3细胞增殖和迁移，且无细胞毒性。2、在细胞水平上蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）与加入LPS刺激后的RAW264.7细胞共孵育可使得促炎因子IL-6，TNF-α分泌减少，抗炎因子TGF-β1，IL-10的表达增加，可以在伤口的炎症期显著抗炎、抗菌、抗感染，快速的抑制炎症，促进皮肤细胞增殖、高效促进皮肤损伤愈合和修复。3、在动物水平上甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料相对于仅涂抹蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）组，能有更明显的促进创面愈合的效果。是因为甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料有很好的生物相容性和黏附性，能更稳定地贴合在皮肤表面，持久而缓慢地释放蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs），可获得更好的作用效果。甲基丙烯酸酯化丝胶（SerMA）不仅是蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）良好的递送载体，而且两者形成的复合敷料所产生的协同作用也使得伤口愈合效果更好。4、在动物水平上复合敷料实验组皮肤组织的CD31、VEGF、α-SMA等促进组织愈合与再生的标志性标记物表达量更显著。复合敷料实验组皮肤组织的新生血管标记物CD31、CD34表达前期与其余组基本相似，但后期表达量多于其他组，表明后期皮肤内新生血管的生长，各组织的修复，与HE染色结果相同。

下面将结合试验数据进一步说明本发明的有益效果。在下述实施例中如果没有详细描述的步骤或试剂均可采用本领域的常规方法或试剂完成。

实施例1

如图1所示为甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料的制备流程如下：

S1. 甲基丙烯酸酯化丝胶（SerMA）的制备

用超纯水（ddH₂O）洗涤天然来源的10克蚕茧，然后，将蚕茧浸泡在0.02 M Na₂CO₃溶液(400 mL)中煮沸1小时，然后通过离心(4000 rpm，10min)去除不溶性残留物，然后将其用相对分子质量3.5 kDa的透析袋放于ddH₂O中进行透析1天，除去Na₂CO₃，然后通过冷冻干燥得到丝胶。将丝胶(10克)溶于40 mL PBS (pH=8.5)中3小时得到丝胶溶液，然后将甲基丙烯酸酐MA (2.93克)加入PBS (100 mL)中，逐滴缓慢加入丝胶溶液中。室温搅拌过夜后，用超纯水（ddH₂O）透析3天，通过冷冻干燥得到改性丝胶即为甲基丙烯酸酯化丝胶（SerMA）。

S2. 蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）的提取

购买农家采集的新鲜油菜花蜂王浆，全程低温运输，储存于-80℃冰箱可长期保存，用之前要于4℃冰箱回温。取适量克数的蜂王浆于研钵中，加入冰的PBS磷酸缓冲液（1:4稀释，质量比）在冰面上研磨30min，以便于更充分地溶解和释放蜂王浆中的有效成分。再装入已经洗干净的离心瓶中放到4℃冰箱里面过夜保存，以便于蜂王浆中的有效成分充分溶解在PBS中。再用细密的医用无菌纱布初步过滤掉蜂王浆PBS溶液中的大杂质，再装到已经洗干净的离心瓶中。将溶液连续离心，离心条件设置为：4℃，500 g，10 min；4℃，2000 g，20min；4℃，10000 g，40 min；离心后取上清，弃沉淀，然后将上清液采用0.22um的滤膜进行过滤，转入超离管中进行超速离心，超速冰冻离心机4℃，110000 g，离心120min，离心后弃上清，得沉淀，用适量冰的PBS缓冲液重悬。然后将重悬液于4℃，110000g超速离心120min，离心结束后收集离心管中的沉淀，用1-3ml 冰PBS溶液重悬沉淀（根据不同的要求浓度加入不同量的冰PBS），再储存于-80℃冰箱中可长期保存。

S3. 甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料的制备

精确称取所述S1中的光引发剂LAP共5 mg，将其加入到1mL浓度为25μg/mL的类外泌体囊泡（RJ-EVs）PBS溶液中吹打混匀充分溶解，然后再精确称取所述S1中冷冻干燥得到的改性丝胶150 mg，将已经配好的混合溶液加入到150mg的改性丝胶中，可看到改性丝胶迅速溶解为均一的水凝胶预凝胶体系，在4℃、避光的条件下可保存。将取100uL已经制备好的水凝胶预凝胶体系滴于皮肤创伤处，再立刻采用405 nm激光照射30秒，即可获得良好贴合于创面的甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料，从而持久发挥促进伤口愈合与修复的功效。

将制备完成的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）取10uL滴于镀有碳膜的铜网上，之后用醋酸双氧铀进行复染，用透射电子显微镜（TEM）观察。如图2A所示，RJ-EVs的TEM图显示其呈标准的外泌体茶托状结构，如图2B所示，用马尔文纳米粒子跟踪分析(NTA)分析得到的粒径大小平均为100nm左右。图3是甲基丙烯酸酯化丝胶（SerMA）和甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡复合敷料（SerMA/RJ-EVs）的SEM图。

实施例2

如图4所示，对实施例1所制得的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）进行对大鼠皮肤成纤维细胞L929细胞增殖的影响的研究，其实验研究过程如下：

将大鼠皮肤成纤维细胞L929培养至P5代时进行实验，分为两组，即对照组和实验组。对照组采用含10%血清的DMEM培养基培养；实验组在含10%血清的DMEM培养基中添加实施例1所制得的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs），浓度设置为10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。两组大鼠皮肤成纤维细胞L929细胞接种于以5×10³/孔的密度种在96孔板上，每组设置5个孔，每孔加入含10%血清的DMEM培养液100μL，在周围的边缘孔加入PBS缓冲液减少蒸发带来的影响，然后将细胞置于37℃ 5%CO₂细胞培养箱中培养24小时，向96孔板中的实验组中加入不同浓度的RJ-EVs，放入细胞培养箱中孵育12小时后，吸出培养液，PBS洗两次，将培养液更换为含有10%CCK-8的DMEM培养液100μL，并孵育1小时。用酶标仪检测每个孔在450nm处吸光度值并绘制计算细胞增殖百分率。图4为实施例1所得的RJ-EVs对大鼠皮肤成纤维细胞增殖影响的柱状图，数据统计分析使用SPSS 19.0，以均数±标准差(x±s)表示计量资料，正态资料应用两组对比t检验方法，P<0.05表示为差异显著有统计学意义。

由图4所示，本发明的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）组的细胞存活率均大于空白对照组，且成浓度依赖性，由此可知，本发明提供的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）生物相容性好，无细胞毒性且可加快大鼠皮肤成纤维细胞的增殖，从而达到促进修复损伤组织的作用。

实施例3

如图5A和图5B所示，对实施例1所制得的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）进行对小鼠皮肤成纤维细胞NIH3T3细胞增殖和迁移的影响的研究

将小鼠皮肤成纤维细胞NIH3T3细胞铺在6孔板中，长到60％左右，利用200μL的枪头比着直尺，枪头垂直划痕，用PBS洗三次，去掉划下的细胞，再加入2mL无血清DMEM培养基以及含有不同浓度（10 μg/mL、25 μg/mL）的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）的DMEM培养基共培养,每个组都设置5个复孔便于统计，并在0h、12h、24h用显微镜进行划痕处的定点拍照观察其细胞愈合情况，如图5A所示。计算细胞迁徙率＝(0h划痕面积-24划痕面积)/0h划痕面积x 100％，如图5B所示，观察到蜂王浆来源的类外泌体囊（RJ-EVs）能够有效促进细胞的迁移和增殖，且成浓度依赖性增加。以上数据统计分析使用SPSS 19.0，以均数±标准差(x±s)表示计量资料，正态资料应用两组对比t检验方法，P<0.05表示为差异显著有统计学意义。

实施例4

ELISA检测蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）对炎症因子水平的调控

应用ELISA试剂盒检测小鼠来源的RAW264.7细胞经过LPS刺激后再加入不同浓度（10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、）的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）对促炎症因子IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10、TGF-β1的表达的影响。收集细胞上清液，先用离心机在4℃、3000rpm离心10min以除掉杂质和死细胞，再收集上清液。具体操作步骤依据说明书：实验前30min取出反应板和各种试剂组分平衡放至室温，将所有的样品稀释到1倍后再使用，按照说明书的要求配置洗涤液、标准样品梯度稀释液、生物素标记抗体工作液、HRP标记链霉素工作液等。在反应板中先加入100μL梯度稀释的标准品以及各组细胞上清样本(经稀释后)，封板后，置于37℃孵育2h（加样要迅速）；用洗涤液洗板5次，甩干后向每个孔中加入l00μL生物素标记抗体工作液 ，封板，置于37℃孵育60min；用洗涤液洗板5次，甩干后向每个孔中加入l00μL HRP标记工作液，封板，置于37℃孵育30min；用洗涤液洗板5次,后加90μL显色液，封板，15min避光显色；最后加入终止液50μL，利用酶标仪读取450nm 、570nm测OD值；绘制标准曲线，以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制出曲线方程并计算r值(相关系数)，根据曲线方程求出样品所对应的浓度值，再作图。

图6A-图6D为细胞水平上蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）对LPS脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用，结果如图6A：炎症因子IL-6减少；图6B：炎症因子TNF-α减少；图6C：检测到抗炎因子IL-10增加；图6D：检测到抗炎因子TGF-β1增加。LPS刺激可激活炎性小体，结果表示蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）可有效抑制炎症小体信号通路，进而抑制伤口炎症反应，调控免疫反应，促进伤口修复，显著下调LPS诱导的炎症因子的表达水平(P<0.05)且呈现浓度依赖性，*表示P＜0.05。

实施例5

甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料在治疗小鼠背部全层皮肤缺损模型中皮肤组织修复中的作用

实验动物为健康的6周的小鼠(BALB/c,雌性)40只，体重为25g左右，全部在深圳湾实验室实验动物中心饲养。动物在领回后在实验动物中心恒温（22±4℃）饲养，实验前适应性饲养一周。 后面进行以下操作：

（1）小鼠领回适应性饲养一周后，在做创伤模型的前一天进行脱毛处理。用动物麻醉机将小鼠麻醉后固定于操作台上，先用推毛剪去除小鼠背部大部分毛发，随后用棉签浸湿并蘸上脱毛膏擦拭剪毛区域，放置几分钟，而后用棉球擦去多余的脱毛膏，并用干净的棉球蘸取0.9%的生理盐水擦拭脱毛处皮肤，擦洗净皮肤上残留的脱毛膏，防止对皮肤产生灼伤。擦拭完后用洁净棉球擦干脱毛处皮肤。

（2）建立小鼠背部全层皮肤创伤模型：用动物麻醉机将已经脱毛完的小鼠麻醉后固定于操作台上，用酒精消毒皮肤后，用无菌手术器械造面积为1×1cm的圆形背部全皮层切除伤口，随机分为以下4组：

空白对照组1（Control组）：在皮肤创面滴加100μL的无菌PBS,再用医用无菌透明固定胶带固定伤口边缘；

蜂王浆来源的类外泌体囊泡组2（RJ-EVs组）：将100μL浓度为25μg/mL的RJ-EVs缓慢滴加在伤口上，再用医用无菌透明固定胶带固定伤口边缘；

甲基丙烯酸酯化丝胶组3（SerMA组）：将单独未有任何负载的甲基丙烯酸酯化丝胶（SerMA）水凝胶预凝胶体系100μL滴于皮肤创伤处，再立刻采用405 nm激光照射30秒，水凝胶黏附于创面，并用医用无菌透明固定胶带固定伤口边缘；

甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡复合敷料组4（SerMA/RJ-EVs组）：将负载25μg/mL的RJ-EVs的甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）水凝胶预凝胶体系100μL滴在伤口上，再立刻采用405 nm激光照射30秒,复合敷料良好地黏附于创面，并用医用无菌透明固定胶带固定伤口边缘，最后按小动物福利要求分笼饲养。

在第1，4，7，14天用异氟烷将小鼠麻醉，对伤口拍照用以计算面积。计算创面的愈合率时，需要在各时间点对背部创面拍照，利用ImageJ软件计算其面积，并按照公式计算创面愈合率。

创面愈合率＝(原始创面面积-当前测量面积)/原始创面面积*100％。

下述数据统计分析使用SPSS 19.0，以均数±标准差(x±s)表示计量资料，正态资料应用两组对比t检验方法，P<0.05表示为差异显著有统计学意义。

图7A为实施例5所得的4种不同处理的组在不同时间点对促创面愈合的实验结果，经复合敷料处理后的（SerMA/RJ-EVs）组4的创面愈合率最高，明显高于空白对照组和其它SerMA组、RJ-EVs组，由此可知，实施例1所得的甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料可以有效地促进创面愈合。图7B的统计结果显示，在经处理3天、7天、14天后，甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料组的皮肤伤口面积从100％降低至3％左右，与另外三组比较具有统计学差异，与Control组相比具有显著性差异，复合敷料组的伤口愈合速度明显更快,说明本发明的包载RJ-EVs的复合水凝胶敷料具有良好的促愈合性能。

实施例6

1.皮肤组织切片检查：在皮肤缺损模型建立的第10天，每组分别取3只大鼠，麻醉后固定在操作台上，剪取各组大鼠背部损伤处皮肤组织，用生理盐水冲洗后，分别放入盛有4%多聚甲醛溶液的EP管中固定，放置于4℃冰箱中保存。皮肤组织经4%多聚甲醛固定24h后，用镊子夹取依次放置于15%、30%的蔗糖溶液中沉糖脱水24h，放置于4℃冰箱中保存待用。

（1）冰冻切片的制作

夹取沉糖后的皮肤组织，修剪成适当的大小，竖立于载物板上，滴加包埋剂将皮肤组织包埋，冰冻后固定于冰冻切片机上。调整切片厚度为20μm。蘸取少量PBS涂抹于载玻片上，部分切片组织直接贴片，编号，干后待用；剩余放置于甘油和PBS各50%的混合溶液中，于-20℃保存，方便后续贴片。

（2）HE染色HE皮肤组织染色步骤详细如下：

①苏木素染色5-10min；②蒸馏水冲洗；③PBS冲洗30s；④1%盐酸-乙醇分化30s；⑤弱碱水冲洗1min返蓝；⑥95%酒精20s；⑦蒸馏水冲洗；⑧伊红染色30-45 s；⑨蒸馏水冲洗；⑩待载玻片干后，滴取适量的中性树脂，盖上盖玻片，封片。⑪置于光学显微镜下观察，拍照记录镜下结构。

石蜡包埋、切片、HE染色后的结果如图8所示。甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料治疗后的皮肤样本中胶原排列整齐，皮肤附属器生成非常明显，且表皮结构和正常皮肤组织相似，整个皮肤组织形态基本与正常组织类似。将Control组、RJ-EVs组、SerMA组、SerMA/RJ-EVs组的小鼠经过14天的观察后，由于通过该水凝胶复合敷料黏附于小鼠的皮肤创伤处，复合敷料的抗菌性与RJ-EVs在凝胶中表现出的缓释作用，使得受损处皮肤具有较高的恢复效率，故通过光学显微镜可以看出HE组的皮肤伤口愈合效果最好，可见成纤维细胞及结缔组织、毛囊结构有生长趋势，皮下各层组织结构排列整齐、层次清晰，细胞完整。

2.各组小鼠在第10天时组织免疫荧光染色结果

皮肤组织免疫荧光染色步骤详细如下：（1）取出待用贴片，置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中进行抗原修复。（2）用PBS冲洗贴片3遍，5min/遍，而后滴加3％BSA均匀覆盖组织贴片，封闭1h。（3）轻轻甩掉封闭液，将封闭后的贴片冲洗3遍，5min/遍，滴加一抗（CD31是1:500稀释），4℃孵育过夜。（4）孵育过夜后取出，复温20min，PBS洗三遍，5min/遍。以下操作均避光进行：（5）滴加与一抗相应种属的荧光二抗（CD31均是1:500稀释）覆盖组织，室温孵育1h。（6）PBS洗三遍，5min/遍。（7）DAPI核染液染色，室温孵育15min。（8）PBS洗三遍，5min/遍，加入PBS浸润（9）切片于共聚焦显微镜下观察并采集图像,拍照记录观察结果。血小板-内皮细胞黏附分子1(PECAM-1）又称CD31，主要存在于血管内皮组织，参与维持血管壁屏障的完整性，且是血管内皮分化的标志，CD31在创面修复过程中能客观、直接地反映创面血管生成及愈合程度。对新生血管标记CD31的表达检测发现，SerMA/RJ-EVs组对于促进损伤组织新生血管生长，效果比较显著，血管生长情况好于另外Control组、RJ-EVs组、SerMA组；RJ-EVs组、SerMA组的效果均好于Control组，见图9（免疫组织化学的代表性图像，其在Ki67、CD31、CD34、VEGF、血管平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。比例尺＝50μm）。如图9中左图所示，复合敷料组（SerMA/RJ-EVs组）的皮肤组织切片中，绿色荧光高度表达，且成圆形，可见大量的血管的分布，证明复合敷料可以在体内，有效的促进伤口处血管新生。实验组皮肤组织的CD31表达前期与其余组基本相似，但后期表达量多于其他组，有利于后期皮肤内新生血管的生长，各组织的修复，与HE结果相同，图9中右图的数据量化分析也验证了这一点。Ki67指标的操作同上。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

1）本发明的提取方法能更高效的使蜂王浆中的有效成分析出，能够大大提高纯度和获得率；

2）所得的甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料可有效解决了蜂王浆来源的类外泌体囊泡的持续递送问题，且二者有良好的协同作用可显著提高创面愈合面积百分比，缩短愈合时间，加速创面愈合；

3）本发明制备的光交联凝胶，具有良好黏附性与机械强度，可降解并具有缓释作用，水凝胶作为载体可长期控释蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）并维持其生物活性，使其对皮肤创面能够持续改善修复，且在体外实验中，具有的良好的黏附能力和生物相容性；

4）本发明制备的蜂王浆来源的类外泌体囊泡，来源于天然营养物质蜂王浆，来源天然而安全且疗效显著，制备容易，产量高，适用范围广，生产成本低；

5）本发明制备的复合敷料，可以也可在伤口处负载释放其他类外泌体囊泡与细胞因子。所述操作简单方便，交联迅速，并可有效诱导进血管内皮细胞和皮肤纤维细胞向伤口处迁移，从而促进血管再生、胶原合成，促进伤口愈合和修复损伤的组织，是良好的药物递送载体。

6）本发明的所有材料来源广泛、质量可控并且可体外大量收集，具有广大的医用以及商用前景。

7）蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）的最终浓度可以根据实际需求而调整，其调整方法可根据现有技术来实现，其中可调整所述蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）的加入量来改变伤口敷料的作用效果。

综上所述，本发明甲基丙烯酸酯化丝胶/蜂王浆来源的类外泌体囊泡（SerMA/RJ-EVs）复合敷料可很好地贴附与创伤皮肤表面，持续释放有效的蜂王浆来源的类外泌体囊泡（RJ-EVs）以促进皮肤生长相关细胞的增殖和迁移，可使促炎因子IL-6，TNF-α分泌减少，使抗炎因子TGF-β1，IL-10、和VEGF等生长因子的表达增加，两者的相互协同作用能够加快伤口修复的速度，对损伤组织的有调控免疫反应的作用，是可以治疗慢性溃疡和炎症性皮肤损伤和修复等疾病的制剂，具有较大的医学应用前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种促进伤口愈合的复合敷料，其特征在于，所述复合敷料为水凝胶预凝胶体系，包括：甲基丙烯酸酯化丝胶、光引发剂和蜂王浆来源的类外泌体囊泡；

所述蜂王浆来源的类外泌体囊通过以下步骤制备得到：

S21，将蜂王浆加入冰的PBS缓冲液在冰面上研磨，溶解并释放所述蜂王浆中的有效成分，得到含有类外泌体囊泡的蜂王浆溶液；

S22，过滤、离心去除所述蜂王浆PBS溶液中的杂质，得到所述类外泌体囊泡；

所述S21中蜂王浆与PBS缓冲液的质量比为1:4~1:8；

所述S21和S22步骤之间还包括将所述蜂王浆溶液置于4℃冰箱过夜保存；

所述S22中的过滤、离心包括采用医用无菌纱布初步过滤掉所述蜂王浆PBS溶液中的杂质；离心条件设置为：4℃，500 g，10 min；4℃，2000 g，20 min；4℃，10000 g，40 min；离心后取上清液，弃沉淀，然后将所述上清液采用0.22um的滤膜进行过滤，转入超离管中进行超速离心，超速冰冻离心机4℃，110000 g，离心120min，离心后弃上清液，得沉淀，用冰的PBS缓冲液重悬，然后将重悬液于4℃，110000g超速离心120min，离心结束后收集离心管中的沉淀，用1-3ml 冰PBS溶液重悬沉淀，得到所述类外泌体囊泡。

2.根据权利要求1所述的复合敷料，其特征在于，所述甲基丙烯酸酯化丝胶为采用蚕茧制备的甲基丙烯酸酯化丝胶。

3.根据权利要求1或2所述的复合敷料，其特征在于，所述光引发剂为光引发剂LAP或光引发剂2959。

4.一种如权利要求1至3中任一项所述的促进伤口愈合的复合敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，制备甲基丙烯酸酯化丝胶；

S2，提取蜂王浆来源的类外泌体囊泡；以及

S3，将所述甲基丙烯酸酯化丝胶、光引发剂和所述蜂王浆来源的类外泌体囊泡混合制备得到所述复合敷料；

所述S2包括：

S21，将蜂王浆加入冰的PBS缓冲液在冰面上研磨，溶解并释放所述蜂王浆中的有效成分，得到含有类外泌体囊泡的蜂王浆溶液；

S22，过滤、离心去除所述蜂王浆PBS溶液中的杂质，得到所述类外泌体囊泡；

所述S21中蜂王浆与PBS缓冲液的质量比为1:4~1:8；

所述S21和S22步骤之间还包括将所述蜂王浆溶液置于4℃冰箱过夜保存；

所述S22中的过滤、离心包括采用医用无菌纱布初步过滤掉所述蜂王浆PBS溶液中的杂质；离心条件设置为：4℃，500 g，10 min；4℃，2000 g，20 min；4℃，10000 g，40 min；离心后取上清液，弃沉淀，然后将所述上清液采用0.22um的滤膜进行过滤，转入超离管中进行超速离心，超速冰冻离心机4℃，110000 g，离心120min，离心后弃上清液，得沉淀，用冰的PBS缓冲液重悬，然后将重悬液于4℃，110000g超速离心120min，离心结束后收集离心管中的沉淀，用1-3ml 冰PBS溶液重悬沉淀，得到所述类外泌体囊泡。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S1包括：采用蚕茧制备甲基丙烯酸酯化丝胶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述S1包括：

S11，将蚕茧脱胶，得到丝胶；

S12，将所述丝胶溶于缓冲液中，制得丝胶溶液；

S13，将甲基丙烯酸酐MA加入所述缓冲液中，然后逐滴加入所述丝胶溶液；

S14，将所述丝胶溶液室温搅拌过夜后，用超纯水透析，通过冷冻干燥得到改性丝胶，即所述甲基丙烯酸酯化丝胶。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述S11中蚕茧通过水浴煮沸脱胶、碳酸钠脱胶、中性皂脱胶、高温高压脱胶及酶脱胶中的一种或多种进行脱胶。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述S11包括将蚕茧浸泡在Na₂CO₃溶液中煮沸，去除不溶性残留物和Na₂CO₃，然后冷冻干燥得到所述丝胶；

所述S12中，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液、无机碳酸氢盐缓冲液或磷酸缓冲盐溶液。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述S12中，所述缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述S11中，所述蚕茧放入Na₂CO₃溶液前采用超纯水洗涤；所述Na₂CO₃溶液中Na₂CO₃的摩尔浓度为0.005M~0.1M；

每克所述蚕茧加入35~45mL所述Na₂CO₃溶液；

所述煮沸的时间为0.5~2小时；

所述去除不溶性残留物和Na₂CO₃包括：通过离心去除不溶性残留物，得到蚕丝溶液，然后将所述蚕丝溶液采用相对分子质量为3.5 kDa的透析袋放于超纯水中进行透析2~4天，除去Na₂CO₃。

11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述S12中，PBS缓冲液的pH为8.5；

每克所述丝胶溶于34~45mL所述缓冲液；

所述S13中，2.90~2.95g所述甲基丙烯酸酐MA溶于50ML所述缓冲液。

12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，重悬沉淀后得到的所述类外泌体囊泡的浓度是25μg/mL。

13.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S3中，所述光引发剂为光引发剂LAP或光引发剂2959。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述S3中，所述光引发剂LAP的浓度为4.8~5.2 mg/mL。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述S3中，所述光引发剂LAP的浓度为5mg/mL。

16.一种促进伤口愈合的系统，其特征在于，包括如权利要求1至3中任一项所述的促进伤口愈合的复合敷料和激光照射器件。

17.根据权利要求16所述的系统，其特征在于，所述激光照射器件发射405 nm激光，设置照射时间为10~50秒。

18.如权利要求1至3中任一项所述的促进伤口愈合的复合敷料在制备促进皮肤创伤愈合的产品中的应用。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述皮肤创伤包括擦伤、皮肤破损、烧伤、皮肤创面感染和慢性难愈合创面损伤。

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