TWI656877B

TWI656877B - 含臍帶間質幹細胞培養液或由其製得之產物之用於治療皮膚創傷之醫藥組合物

Info

Publication number: TWI656877B
Application number: TW101109147A
Authority: TW
Inventors: 傅毓秀
Original assignee: 傅毓秀; 施養性
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2019-04-21
Also published as: CN103301153B; TW201338783A; CN103301153A

Abstract

本發明提供一種用於治療皮膚創傷之醫藥組合物，其包括臍帶間質幹細胞培養液或由其製得之產物，其中該培養液不含細胞。

Description

含臍帶間質幹細胞培養液或由其製得之產物之用於治療皮膚創傷之醫藥組合物

本發明係關於皮膚創傷治療之技術領域。具體而言，本發明係關於一種臍帶間質幹細胞培養液或由其製得之產物之用於製備治療皮膚創傷之醫藥之用途，其中該培養液不含細胞。

皮膚創傷為日常生活中普遍之意外傷害。當受傷面積過大，如燒燙傷，或是傷及真皮層時，照顧不當容易感染發炎，若未及時處理，嚴重者甚至可能危害生命。當前臨床上用以輔助皮膚傷口癒合主要是以人工皮膚及組織移植為主，然而其要價昂貴且耗時費工。

皮膚創傷的癒合主要必須歷經發炎反應、表皮再生、肉芽組織(granulation tissue)生成、血管增生，創傷收縮以及細胞外基質重新建構等過程，才能幫助創傷後再生的皮膚組織。近年來隨著幹細胞研究的興起，研究人員使用不同來源的幹細胞給予創傷皮膚治療，期望幹細胞能夠在各方面幫助整個皮膚創傷的再生與重建，且已達不錯成效(Yaojiong et al.,Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Stem Cells,25(10)：2648-59,2007)。

惟大部分幹細胞來源不易取得或有道德上的疑慮，且含有活體細胞之製劑不但儲存困難，更有許多安全上的顧慮，在臨床應用上仍有許多問題待解決。因此針對皮膚創傷癒合以開發不含細胞或幹細胞之治療藥劑或敷料為先。

本發明首次提出臍帶間質幹細胞經培養繼而移除細胞後之培養液具有優異的治療皮膚創傷之功效，例如，促進纖維母細胞的活性、加速皮膚創傷之癒合、縮小傷口體積、幫助皮膚創傷癒合過程中毛囊的生長及膠原蛋白之建構、增加嗜中性白血球和巨噬細胞之聚集、以及促進傷口區域內的血管增生等。本發明之臍帶間質幹細胞培養液不含細胞，可直接冷凍或簡單濃縮乾燥成粉末狀，長期保存，且無活細胞可能產生的安全顧慮，或與其他皮膚傷口癒合例如植皮技術等一起使用，具有極佳的臨床應用潛力。

因此，在一方面，本發明提供一種用於治療皮膚創傷之醫藥組合物，其包括臍帶間質幹細胞培養液或由其製得之產物，其中該培養液產物不含細胞。

在另一方面，本發明提供前述不含細胞之臍帶間質幹細胞培養液或由其製得之產物之用途，其可用於製備供治療皮膚創傷之醫藥或敷料，或於其他皮膚創傷治療法合用。

在一具體實例中，根據本發明之由該培養液製得之產物係呈液狀或粉末狀。

具體而言，根據本發明之培養液係經由將該臍帶間質幹細胞培養於一液狀培養基中，再經分離移除該臍帶間質幹細胞後取得上清液而獲得。其中，該上清液係可進一步經乾燥而呈粉末狀。

在一具體實例中，根據本發明之臍帶間質幹細胞係培養於含氧濃度為約20%或以下之條件。

在一具體實例中，根據本發明之臍帶間質幹細胞係培養於正常含氧條件下。

在一具體實例中，根據本發明之臍帶間質幹細胞係培養於低氧條件下。

本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。

無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明之用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容。

除非另外定義，本文中所用之所有技術及科學辭彙具有熟習本文所屬技藝者所通常明瞭之相同意義。

在本文中，冠詞「一」係指一個或一個以上(亦即，至少一個)之該冠詞之文法客體。舉例而言，「一元件」意謂一個元件或一個以上之元件。

在一方面，本發明提供一種用於治療皮膚創傷之醫藥組合物，其包括臍帶間質幹細胞培養液或由其製得之產物，其中該培養液產物不含細胞。在另一方面，本發明提供所述不含細胞之臍帶間質幹細胞培養液或由其製得之產物之用途，其可用於製備供治療治療皮膚創傷之醫藥。

本文所使用的「臍帶間質幹細胞(umbilical mesenchymal stem cells)」乙詞係指位於哺乳類動物臍帶，較佳為人類臍帶間質組織中之幹細胞，可為未經純化的細胞培養物或純化後的細胞。以下實例說明從個體組織取得臍帶間質幹細胞之流程。臍帶為生產後廢棄物，來源取得容易，沒有道德顧慮，處理方式簡單，數量極多、繁殖快速。且本實驗室先前發現，移植人類臍帶間質幹細胞，不會引起宿主產生免疫排斥反應。所以人類臍帶間質幹細胞為一種適合用來進行異體移植的良好幹細胞來源。

本文所使用的「臍帶間質幹細胞培養液(umbilical mesenchymal stem cell culture fluid)」是指臍帶間質幹細胞經培養後，繼而經分離移除細胞後的培養液體。用於培養臍帶間質幹細胞之培養基可為任何習知的基本培養基，其可自商業上購得或依需要調製而成。商業上可購得之培養基包括DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、MEM(Minimal Essential Medium)或RPMI等。此等培養基可進一步添加適當含量之血清蛋白，例如，1-20%的牛血清蛋白，特定為1-5%的牛血清蛋白，更特定為2%的牛血清蛋白。

根據本發明，臍帶間質幹細胞可培養於正常氧(約20% O₂)之條件下或低於正常氧之低氧條件下；其中低氧環境是指培養環境中的氧氣百分比低於約20%，特定而言，係低於約10%，更特定而言，係低於約5%。在一特定實例中，臍帶間質幹細胞係培養於約1%之低氧條件。

培養一段時間後，例如，一天或二天以上，離心移除細胞，以取得不含細胞之臍帶間質幹細胞培養液，其經證實具有優異的治療皮膚創傷之功效(請參以下實例)。本發明之臍帶間質幹細胞培養液可以冷凍保存，或可經濃縮，或以冷凍乾燥形成粉末，長期儲存。使用前，可將粉末溶於無菌水，再經過濾除菌處理。

為有利於輸送，根據本發明之臍帶間質幹細胞培養液或由其製得之產物可進一步配製成含有適當醫藥可接受之載劑的醫藥組合物。

本文所使用的「醫藥組合物」是指一種作為醫藥之混合物，其通常含有載體，諸如，醫藥可接受之載體或賦形劑，其係技藝中所習知且適合投藥至對象中，以作為治療性、診斷性或預防性之目的。此處「醫藥上可接受」係指該載劑可與本發明組合物內所含的有效成分相容，其較佳為能穩定該活性成分並且對被治療的個體無害。醫藥組合物之形式可為溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊或粉末，其給藥方式較佳為局部敷用。

本文所使用的「醫藥可接受之載體」係指任何習知類型之無毒固體、半固體或液體之填充劑、稀釋劑、包膠囊材料、調配物輔助劑或賦形劑。醫藥可接受之載體係在所用之劑量及濃度下，對接受者無毒性，且可與該調配物之其他成分相容。醫藥可接受之載體一般均可由公眾輕易取得。此外，醫藥可接受之輔助物質，諸如，pH調節及緩衝劑、滲透壓調節劑、安定劑、溼潤劑及類似物，亦皆可由公眾取得。

適當之載體包括，但不限於，水、葡萄糖、甘油、鹽水、乙醇及其組合。載體可含有額外之試劑，諸如，溼潤及乳化劑、pH緩衝劑或是佐劑，其可增強該調配物之有效性。局部性載體包括液體石油、棕櫚酸異丙酯、聚乙二醇、乙醇(95%)、溶於水中的聚氧乙烯單月桂酸酯(5%)或是溶於水中的十二烷基硫酸鈉(5%)。可視需要加入其他材料，諸如，抗氧化劑、保濕劑、黏度穩定劑及類似試劑。

本發明之醫藥組合物可用於治療皮膚創傷，個體較佳為哺乳動物，更佳為人類。在一具體實例中，所述醫藥組合物可植入皮膚創傷，或置於皮膚創傷周圍，或皮膚創傷上。或施加於敷料在置於皮膚創傷上。

本發明組合物的劑量可視各種因素而變動，例如，投藥途徑、接受該藥劑之個體的體重和品種，以及投藥目的。技藝人士可根據此處的揭示及此技藝已建立的方法依經驗決定每一個別案例的劑量。

現參考以下具體實施例更明確地描述本發明，其目的係用以說明而非作為限制。

實例 實例1：人類臍帶間葉幹細胞之製備

本實驗室採用人類分娩後的臍帶，以無菌操作方式保存在4℃的HBSS(Biochrom L201-10)中，24小時內進行臍帶間質幹細胞分離操作。實驗器械皆需經過高溫高壓滅菌，分離操作中全程以75%酒精消毒，並於使用前過火。於無菌操作台中取出臍帶，並以酒精消毒後置於無鈣及無鎂離子之緩衝溶液(CMF,Gibco 14185-052)。接著，以器械將臍帶縱切，剝離其動脈與靜脈後，收集臍帶間質組織，瓦頓氏凝膠(Wharton’s Jelly)，並切成0.5立方公分之小塊，以4000rpm離心5分鐘。去除上清液後，加入適量無血清DMEM培養液(Gibco 12100-046)以4000rpm離心5分鐘，清洗沉澱物二次。將間質組織在37℃下以膠原酵素(collagenase)反應14至18小時，再以2.5%之胰蛋白酵素(trypsin)於37℃震盪下作用30分鐘，然後加入FBS(Hyclone SH30071.03)終止胰蛋白酵素反應。最後，計數分離出來的人類臍帶間質細胞(human umbilical mesenchymal stem cell；簡稱HUMSCs)，並進行體外培養。

實例2：人類臍帶間葉幹細胞培養液之製備(正常氧濃度及低氧濃度)

取人類臍帶間質幹細胞進行體外培養，待24小時細胞完全貼附後，再換成含有2% BSA(Albumin,bovine serum,Sigma A4503)之DMEM培養液，個別置於正常培養箱(Normoxia；20% O₂、5% CO₂)、或低氧培養箱(Hypoxia；1% O₂、5% CO₂)中，培養1天、或2天以上，收集幹細胞條件培養液，分別稱為正常氧1天、正常氧2天、低氧1天、和低氧2天HUMSCs條件培養液(簡稱Normoxia 1D、Normoxia 2D、Hypoxia 1D、和Hypoxia 2D)，以1200 rpm離心5分鐘，分離細胞與培養液，吸取上清液，置於-80℃冷凍保存。冷凍後的培養基經由冷凍乾燥機(VIRTIS BENCHTOP 2K)成粉末，可長期保存。於使用前，以無菌三次水溶解粉末，再以0.45μm孔徑大之濾膜過濾，方可使用。

實例3：正常氧濃度及低氧環境不影響人類臍帶間質幹細胞之增生能力

經由正常氧濃度、或低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞，以0.05%胰蛋白酶(Biochrom L2153)處理三分鐘後分別收集細胞液，並加入等量10% FBS DMEM培養液中和並均勻打散，吸取適量細胞液至於細胞計數器計數，比較正常、或低氧環境培養下，人類臍帶間質幹細胞的生長速度是否有受到影響(圖1)。

結果顯示，正常氧濃度培養1天(正常氧Normoxia 1D組)之人類臍帶間質幹細胞，其數目為4.9±0.29(x 105)；低氧環境下培養1天(Hypoxia 1D組)之人類臍帶間質幹細胞數，其數目為4.87±0.29(x 105)；正常氧濃度培養2天(正常氧Normoxia 2D組)之人類臍帶間質幹細胞，其數目為12.8±0.8(x 105)；低氧環境培養2天(低氧Hypoxia 2D組)之人類臍帶間質幹細胞，其數目為11.77±0.59(x 105)。結果顯示，在正常氧濃度、及低氧環境下培養，人類臍帶間質幹細胞，皆有增生情形；但在正常氧濃度、及低氧環境下培養，細胞數目並沒有統計差異(圖1)。因此，正常氧濃度及低氧環境不影響人類臍帶間質幹細胞之增生能力。

實例4：大白鼠真皮纖維母細胞(Rat dermal fibroblasts)之體外培養及移行能力測試

本實驗使用陽明大學實驗動物中心所繁殖之Spraque-Dawley(S.D.)種系出生三天內新生幼鼠。幼鼠經腹腔注射麻醉，進行纖維母細胞分離操作。實驗器械皆需經過高溫高壓滅菌，分離操作中全程以75%酒精消毒，並於使用前過火。麻醉後幼鼠浸泡於75%酒精消毒，以器械取下幼鼠軀幹皮膚後，加入胰蛋白酵素於4℃作用12小時以弱化表皮與真皮之連結。接著去除表皮後，真皮組織置於37℃膠原酵素下反應30分鐘，然後加入FBS終止酵素反應，並加入DMEM清洗沉澱物二次，最後計數分離出來的大鼠纖維母細胞進行體外培養。本研究以繼代2-3次之大鼠纖維母細胞進行實驗。為了定量真皮纖維母細胞的活性，我们將培養中的真皮纖維母細胞刮出一道刮痕(gap)，再計算刮痕內，除掉移行過來的細胞數目後的空白面積，空白面積越大表示移行的細胞越小，以此作為真皮纖維母細胞的活性指數。以2% BSA DMEM培養液、或低氧Hypoxia 2D條件培養液培養的大鼠真皮纖維母細胞，當細胞形成單層後，於培養的真皮纖維母細胞，刮出一道寬度固定的區域，並用倒立式光學顯微鏡確認區域內的細胞完全被刮除。接著，持續培養細胞，分別於0小時、12小時、18小時、24小時，計算沒有纖維母細胞存在的空白區域面積。

顯微鏡下觀察顯示，被刮除的區域形成一道沒有細胞的空白區域。之後，於第12小時、第18小時、第24小時進行觀察，隨著時間增加可見細胞朝刮除區移動，而刮除區域面積逐漸減少。我們以第0小時刮除之空白區域面積為100%，觀察在第12、第18、和第24小時後，所剩刮除空白區域面積占第0小時刮除之空白區域面積的百分比，來表示纖維母細胞爬行的速度，即代表纖維母細胞的活性。

從統計結果顯示，經低氧環境培養2天以上的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠真皮纖維母細胞，在第12、18及24小時後，其刮除區域面積大小與同時間的控制組相比，有明顯縮小的情形(P<0.05，圖2)。結果顯示，經低氧環境培養的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠真皮纖維母細胞，可促進纖維母細胞的移行能力。

實例4：動物實驗 4.1　材料方法 4.1.1　實驗動物

本實驗所用的SD(Sprague-Dawley)種系六週大白鼠購自陽明大學實驗動物中心，每日人工照明12小時，恆溫控制於22±2℃，充分供應飲水與食物。

4.1.2　大白鼠背部皮膚創傷的建立

S.D.大白鼠(雄性，250-300g)注射麻醉劑後，剃除背部毛髮，以酒精消毒背部皮膚，利用直徑8mm之組織鑽孔組織切割器(biopsy punch)完整去除同大小的表皮與真皮，形成圓形背部皮膚創傷。再以防水透氣敷料(Tegaderm，3M,London ON,Canada)覆蓋於傷口上，避免抓傷。

4.1.3　實驗分組

實驗動物分成三組：

第一組為控制組，即大白鼠背部創傷建立後，注射10倍濃縮之2% BSA DMEM培養液200μl。

第二組為正常氧Normoxia組，即大白鼠背部創傷建立後，注射10倍濃縮之正常氧濃度培養兩天以上的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液200μl。

第三組為低氧Hypoxia組，即大白鼠背部創傷建立後，注射10倍濃縮之低氧環境下培養兩天以上的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液200μl。

4 .1.4　人類臍帶間質幹細胞之條件培養液的處理步驟

大白鼠背部創傷建立後，立即給予濃縮之人類臍帶間質幹細胞培養基治療200μl。將培養基由微注射針注入傷口周圍的真皮組織中(intradermal)，四個注射點，每點約50μl培養液，總計體積200μl。

4.1.5　定量傷口的變化：

為了定量傷口修復的情形，將大白鼠麻醉後，使用OxyLab LDF^TM進行拍攝，用來記錄創傷癒合的過程中，傷口大小的變化。背部創傷建立為第0天，之後每隔兩天拍照一次，一直拍攝到第14天。

4.1.6　傷口微觀組織型態觀察 4.1.6.1　實驗動物犧牲、灌流固定及冷凍切片

麻醉之大白鼠以4%三聚甲醛(paraformaldehyde，Sigma 16005)，7.5%苦味酸(picric acid，Sigma P6744 in 0.1MPB)之固定液灌流固定。將皮膚組織取出，依序浸泡於固定液、30%蔗糖(sucrose in 0.1M PB)，待組織脫水沈底後，進行冷凍切片，將皮膚組織切成厚度為20μm的連續組織片，以進行接下來的組織免疫染色(圖3)。

4.1.6.2　蘇木精及伊紅染色

將組織切片置於蘇木精(Hematoxylin)溶液中(J.T.Baker 3870)染色30分鐘，經二次水清洗，再以伊紅溶液(Eosin Y solution)(J.T.Baker 3874)染色2分鐘。接著將切片浸泡於濃度遞增的酒精內進行脫水(50%、70%、80、90%、95%、100% 2次)，最後再浸泡於100% xylene(J.T.Baker 94943-14)中2次，每次5分鐘。完成後以片膠(permount，Fisher Scientific SP15-500)封片，進行光學顯微鏡觀察，並擷取影像，定量組織內傷口的總體積(圖4和圖10)，與測量出創傷區域範圍內的毛囊數目(圖5)，即可知道傷口復原的狀況。

4 .1.6.3　天狼猩紅染色

為了探究傷口癒合過程中，膠原纖維堆積的狀況，因此以天狼猩紅(sirus red)染劑標定膠原纖維成紅色，並定量膠原纖維的量。將組織切片置於0.1%天狼猩紅(Sigma Direct Red 80)於苦味酸(picric acid)中染色7分鐘，二次水清洗二次，接著將切片浸泡於濃度遞增的酒精內進行脫水(50%、70%、80、90%、95%、100% 2次)，最後再浸泡於100% xylene 2次，每次5分鐘。完成後以片膠封片，進行光學顯微鏡觀察，並擷取影像，進行定量(圖6)。

4 .1.6.4　組織免疫染色

免疫染色法是藉由抗原抗體結合的原理，標定出細胞內特定蛋白質所在位置的方法。

將組織切片先以0.1M PBS(磷酸緩衝液鹽水)清洗5分鐘3次，再浸泡於0.5%過氧化氫溶液中20分鐘，以去除組織中的內生性過氧化氫酵素活性，之後以0.1M PBS清洗5分鐘3次。以阻斷溶液(3%牛血清蛋白BSA、1% Triton X-100、5%胎牛血清FBS)室溫下反應60分鐘，用以去除之後初次抗體作用所可能產生的非特異性抗體結合。加入初級抗體小鼠抗ED1抗體(Mouse anti-ED1antibody，MAB1435,1:500針對單球細胞或巨噬細胞(圖8和圖12))、兔抗骨髓過氧化酶(Rabbit anti-myeloperoxidase antibody，簡稱anti-MPO,RB-373-A,1:100針對嗜中性球細胞(圖7和圖11))，於4℃下反應12至16小時。

以0.1M PBS清洗5分鐘3次，接著與次級抗體(Goat anti mouse IgG biotin,1:250)(Goat anti rabbit IgG biotin,1:250)於室溫下反應60分鐘，同樣以0.1 MPBS清洗5分鐘3次。接著以親和素-生物素辣根過氧化酶複合物(Avidin-biotinylated-horseradish peroxidase complex，ABC Kit,Vector)室溫下反應60分鐘，以0.1M PBS清洗5分鐘3次，最後以DAB呈色。

完成後，將玻片浸泡至濃度遞增的酒精內進行脫水(50%、70%、80、90%、95%、100%2次)，再以浸泡於100%二甲苯(xylene)2次，每次5分鐘。完成後以片膠封片，進行光學顯微鏡觀察，並擷取影像，進行定量。

4 .1.6.5　背部皮膚血管測量

20μm厚度的組織切片，以加纳谷物1-凝集素(Griffonia simplicifomia 1-lectin，簡稱GS1-lectin，Vector Laboratories)來標定周邊血管與微血管的綠色螢光染劑(Hansen-Smith,Egginton et al. 1998)。將組織切片浸泡於最終濃度25μg/ml的GS1-lectin溶液中，避光染色60分鐘後，以0.1M PB清洗5分鐘3次，封片後以螢光顯微鏡觀察，並擷取影像，進行定量(圖9和圖13)。

4.2　結果 4.2.1　以低氧環境培養下獲得之人類臍帶間質幹細胞之條件培養液之治療皮膚創傷效果 4 .2.1.1　皮膚創傷癒合

如前述，大白鼠背部皮膚以組織鑽孔組織切割器造成一個直徑約8mm的傷口，此時為第0天，每兩天巨觀拍照一次，從第0天持續觀察到第14天。我們以各組第0天的傷口面積為100%，來計算往後傷口面積與第0天相比的百分比。結果顯示Hypoxia組別，在第二天傷口已降為71.31±1.63%，明顯小於控制組(P<0.05，圖3)，此現象一直維持到第14天(P<0.05，圖3)。由統計結果可見，以低氧環境培養的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠的背部傷口，有加速皮膚創傷之癒合(P<0.05，圖3)。

4 .2.1.2　傷口體積較小

接下來，在我們進一步利用連續的皮膚組織切片，進行H&E染色觀察，在創傷後第2天，低氧Hypoxia組的傷口體積為44.82±1.05 mm³，明顯小於控制組的傷口體積(65.14±4.44mm3)(P<0.05，圖4)。此明顯的差異，也出現在創傷後第4天與第14天(P<0.05，圖4)。

4 .2.1.3　毛囊生長效果

在創傷後第8天，傷口組織建構已漸趨完整，此時表皮幾乎已完全覆蓋於傷口上方，毛囊也從傷口周邊開始新生。經過統計分析，以低氧環境培養的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠的背部傷口(低氧Hypoxia組)，其單位長度下毛囊的數目為為1.94±0.11個/mm，顯著高於控制組1.48±0.15個(P<0.05，圖5)。到第14天，低氧Hypoxia組的皮膚上毛囊數目，仍然較控制組來得多(P<0.05，圖5)。因此推論，以低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之培養基，處理大白鼠的背部傷口，有助於皮膚創傷癒合過程中毛囊的生長。

4.2.1.4　膠原蛋白之建構效果

以天狼猩紅標識創傷皮膚中的膠原蛋白，從染色結果顯示，在創傷後第2天，肉芽組織(granulation tissue)尚未形成，細胞外膠原蛋白的堆積鬆散。第4天，細胞外膠原蛋白正要開始堆積，膠原蛋白分布的情形也都有提高。到了第8天，此時傷口建構穩定，膠原蛋白則大量表現。由統計結果發現，以低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之培養基，處理大白鼠傷口(即低氧Hypoxia組)，在第2天、第4、及第8天，創傷區域內膠原蛋白所佔面積明顯高於控制組(P<0.05，圖6)。

4.2.1.5　嗜中性白血球和巨噬細胞之聚集效果

先前研究已得知，在傷口癒合初期，嗜中性白血球(neutrophil)會率先浸潤到創傷區域清除壞死組織，同時，釋放細胞激素吸引巨噬細胞(macrophage)到創傷部位，幫助傷口重建與癒合。因此在傷口修復初期，嗜中性白血球(neutrophil)和巨噬細胞(macrophage)扮演著加速傷口癒合重要角色。

如前述的抗骨髓過氧化酶抗體(簡稱anti-MPO)標定嗜中性白血球，分別觀察創傷後第2天、第4天、第8天、及第14天，在創傷組織中表現情形。切片結果顯示，在創傷第2天，兩組均可觀察到有嗜中性白血球浸潤於傷口下方；在創傷後第4天，嗜中性白血球的表現量更是達到高峰；第8天，隨著傷口逐漸癒合穩定，浸潤的現象趨緩，整體細胞數量皆有減少的趨勢。根據統計結果顯示，而以低氧環境培養下之人類臍帶間質幹細胞的條件培養液，處理大白鼠的背部傷口(即低氧Hypoxia組)，顯示浸潤到皮膚創傷區域內的嗜中性白血球，不論在第2天、第4天、與第8天，控制組相比，均有明顯增加的現象(P<0.05，圖7)。

接著以抗ED1抗體標定巨噬細胞，分別觀察創傷後第2天、與第4天，在創傷組織中的表現情形。切片結果顯示，在創傷第2天與第4天，兩組均可觀察到有巨噬細胞浸潤於傷口下方。根據統計結果顯示，而以低氧環境培養下之人類臍帶間質幹細胞的條件培養液，處理大白鼠的背部傷口(即低氧Hypoxia組)，顯示浸潤到皮膚創傷區域內的巨噬細胞，不論在第2天、和第4天，控制組相比，均有明顯增加的現象(P<0.05，圖8)。

4.2.1.6　傷口區域內的血管增生

為了探討以低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，對大鼠皮膚損傷處血管密度的影響，我們以GS1-lectin標定皮膚內的血管與微血管。定量結果顯示，在第2天，各組皆有被螢光標定之物質，其形態尚未形成管狀，低氧Hypoxia組所標定到之物質明顯多於控制組。第4天及第8天時，GS1-lectin標定到的血管型態非常清楚，並觀察到低氧Hypoxia組的血管分布明顯多於控制組。到了第14天，各組傷口的重建修復已近完整，血管密度也漸趨回復。統計分析，Hypoxia組在第2天、第4、第8、及第14天，創傷區域內血管密度明顯高於控制組(P<0.05，圖9)，即代表以低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠傷口，有助於促進傷口區域內的血管增生。

4.2.2　以正常氧濃度培養下獲得之人類臍帶間質幹細胞之條件培養液之治療皮膚創傷效果 4.2.2.1　皮膚創傷癒合

如前述，大白鼠背部皮膚以組織鑽孔組織切割器造成一個直徑約8mm的傷口，此時取正常氧濃度培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠的背部傷口(即為正常氧Normoxia組)，我們利用連續的皮膚組織切片，進行H&E染色定量，在創傷後第2天，正常氧Normoxia組的傷口體積為54.95±3.35 mm3，明顯小於控制組的傷口體積(65.14±4.44mm3)(P<0.05，圖10)。

4.2.2.2　嗜中性白血球和巨噬細胞之聚集效果

進一步，以抗骨髓過氧化酶抗體(簡稱anti-MPO)標定嗜中性白血球，分別觀察創傷後第4天、及第8天，在創傷組織中表現情形。切片結果顯示，在創傷後第4天，嗜中性白血球大量的表現；第8天，隨著傷口逐漸癒合穩定，浸潤的現象趨緩，整體細胞數量皆有減少的趨勢。根據統計結果顯示，而以正常氧濃度培養下之人類臍帶間質幹細胞的條件培養液，處理大白鼠的背部傷口(即正常氧Normoxia組)，顯示浸潤到皮膚創傷區域內的嗜中性白血球，不論在第4天、與第8天，控制組相比，均有明顯增加的現象(P<0.05，圖11)。

接著以抗ED1抗體標定巨噬細胞，分別觀察第4天，在創傷組織中的表現情形。切片結果顯示，在創傷第4天，兩組均可觀察到有巨噬細胞浸潤於傷口下方。根據統計結果顯示，而以正常氧濃度培養下之人類臍帶間質幹細胞的條件培養液，處理大白鼠的背部傷口(即正常氧Normoxia組)，顯示浸潤到皮膚創傷區域內的巨噬細胞，在第4天，控制組相比，均有明顯增加的現象(P<0.05，圖12)。

4.2.2.3　傷口區域內的血管增生

為了探討以正常氧濃度培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，對大鼠皮膚損傷處血管密度的影響，我們以GS1-lectin標定皮膚內的血管與微血管。定量結果顯示，第4天時，GS1-lectin標定到的血管型態非常清楚，並觀察到正常氧Normoxia組的血管分布明顯多於控制組(P<0.05，圖13)，即代表以正常氧濃度培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠傷口，有助於促進傷口區域內的血管增生。

圖1顯示低氧下培養的人類臍帶間質幹細胞，無論經過1天、或2天，其增生能力與正常培養下相當。*為和同條件下培養1天的組別相比。有統計差異者，P<0.05。

圖2顯示以低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理培養中之纖維母細胞，在12小時、18小時及24小時，其剩餘面積比率與正常組相比，有顯著的減少情形，即代表有較多的纖維母細胞移行至刮除區域內，導致空白面積減少。*剩餘面積比率和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖3顯示處理低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，有助於傷口之癒合。*面積百分比和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖4顯示給予低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，大白鼠傷口在第2天、第4天、及第14天時的創傷體積與控制組相比，有明顯的減少情形。*傷口體積和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖5顯示給予低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，大白鼠傷口在第8天、及第14天，單位長度下傷口周邊毛囊的數目明顯多於控制組。*周邊毛囊的數目和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖6顯示以低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠傷口，在第2天、第4、及第8天，創傷區域內膠原蛋白所佔面積明顯高於控制組。*膠原蛋白面積百分比和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖7顯示以低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠傷口，在第2天、第4天、及第8天，創傷區域內嗜中性白血球之細胞數明顯高於控制組。*呈色細胞數和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖8顯示以低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠傷口，在第2天、及第4天，創傷區域內吞噬性白血球之細胞數明顯高於控制組。*呈色細胞數和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖9顯示以低氧環境培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠傷口，在第2天、第4、第8、及第14天，創傷區域內血管密度明顯高於控制組。*血管百分比和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖10顯示給予正常氧濃度培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，大白鼠傷口在第2天時的創傷體積與控制組相比，有明顯的減少情形。*傷口體積和同一時間的控制組組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖11顯示以正常氧濃度培養的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠傷口，在第4、及第8天，創傷區域內嗜中性白血球的數目明顯高於控制組。*呈色細胞數和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖12顯示以正常氧濃度培養的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠傷口，在第4天，創傷區域內巨噬細胞的數目明顯高於控制組。*呈色細胞數和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

圖13顯示以正常氧濃度培養下的人類臍帶間質幹細胞之條件培養液，處理大白鼠傷口，在第4天，創傷區域內血管密度明顯高於控制組。*血管百分比和同一時間的控制組相比。有統計差異者，P<0.05。

Claims

一種用於治療皮膚創傷之醫藥組合物，其主要係由以下列方法製得但不含細胞之臍帶間質幹細胞培養液以及醫藥可接受之載體組成，其中該臍帶間質幹細胞培養液係以收集人類臍帶間質組織中之瓦頓氏凝膠(Wharton’s Jelly)，切成小塊，以一培養液清洗並以膠原酵素(collagenase)及胰蛋白酵素(trypsin)處理，然後終止胰蛋白酵素反應，分離出人類臍帶間質細胞於含氧濃度為約20%或以下之條件液狀培養基中培養臍帶間質幹細胞，再經分離移除該臍帶間質幹細胞後取得上清液製得；其中該液狀培養基為一般商業上購得用於培養臍帶間質幹細胞的液狀基本培養基。
根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其可促進創傷癒合。
根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中由該培養液製得之產物係呈液狀或粉末狀。
根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該上清液係進一步經乾燥而呈粉末狀。
根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該臍帶間質幹細胞係培養於正常含氧條件。
根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中該臍帶間質幹細胞係培養於低氧條件。
一種製備治療皮膚創傷之醫藥組合物之方法，其包含：(1)收集人類臍帶間質組織中之瓦頓氏凝膠(Wharton’s Jelly)，切成小塊，以培養液清洗並以膠原酵素(collagenase)及胰蛋白酵素(trypsin)處理，然後終止胰蛋白酵素反應，分離出人類臍帶間質細胞；(2)將上述經分離出之人類臍帶間質細胞於含氧濃度為約20%或以下之條件液狀培養基中培養臍帶間質幹細胞，其中該液狀培養基為一般商業上購得用於培養臍帶間質幹細胞的液狀基本培養基；(3)再將該液狀培養基經分離移除該臍帶間質幹細胞後取得上清液製得，其中該培養液不含細胞。
根據申請專利範圍第7項之方法，其中該醫藥組合物可促進創傷癒合。
根據申請專利範圍第7項之方法，其中由該培養液製得之產物係呈液狀或粉末狀。
根據申請專利範圍第7項之方法，其中該臍帶間質幹細胞係培養於正常含氧條件。
根據申請專利範圍第7項之方法，其中該臍帶間質幹細胞係培養於低氧條件。