CN111420117A - 一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法。该方法包括以下步骤：1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养：1.1)人脐带间充质干细胞的原代提取；1.2)传代培养；1.3)培养上清收集；2)人脐带间充质干细胞外泌体提取：2.1)初次离心；2.2)二次离心；2.3)去除细胞器离心；2.4)外泌体粗提；2.5)外泌体终提；3)凝胶材料制备：3.1)壳聚糖制备；3.2)β‑GP配置；3.3)凝胶材料制备；4)凝胶负载外泌体。本发明可促进皮肤创面修复，缩短伤口愈合时间及减少瘢痕形成。

Description

一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法及其应用。
背景技术
皮肤软组织创面的修复是一个涉及炎症，增殖和组织重塑等因素的多阶段过程，且各个阶段截然不同又彼此重叠。参与此过程的生长因子，细胞因子，趋化因子和各种细胞以复杂精密的方式相互作用。然而，这些阶段和因素中任何一项失衡都可能引起正常伤口愈合过程的协调性被破坏，最终导致慢性不愈伤口的转归和异常疤痕的形成。例如在糖尿病、感染或辐射暴露等情况下，人体细胞和分子信号的破坏都可能会引发创面迁延不愈或慢性愈合。
虽然皮肤软组织创伤很普遍，但是迁延不愈的慢性伤口，如大面积损伤、糖尿病等慢性病引起较严重的皮肤溃疡等情况，更可能造成疤痕形成或愈合质量差强人意的结局，不仅后期会导致组织功能的障碍，还会影响患者的心理健康。因此，在皮肤软组织创伤恢复中，如何缩短愈合时间并减少疤痕形成，是近年临床应用中较为迫切的需求。现阶段针对皮肤创伤修复的主要手段包括植皮、激光治疗、生长因子或细胞因子的应用以及基因治疗等。但是这些方法都有导致萎缩性瘢痕、色素异常、皮肤坏死和其他不良后果的可能性。另外，局部注射因子很容易被体液降解，并且其在损伤部位的剂量和浓度高度易变。因此，有必要寻找一种新型稳定，有效和安全的治疗方法来促进软组织创面的愈合。
间充质干细胞能促进组织修复和再生，改善创面愈合，一度是当下的热门研究领域之一。近期研究发现，间充质干细胞的疗效主要来源于其旁分泌的产物----外泌体(exosomes，EXOs)。间充质干细胞来源的外泌体能够避免干细胞治疗过程中的免疫原性、致瘤性、阻塞血管管腔等风险，且具有性质稳定，剂量和浓度易控制，具有生物归巢作用，易于储存等优势，成为近年研究的热点方向。外泌体是一种直径30-100nm的膜性脂质小囊泡，除了富含蛋白质、mRNA及miRNA外，还含有大量细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶和磷脂酰丝氨酸等。其中间充质干细胞所分泌的外泌体包含的蛋白或RNA成分与受损细胞进行信息交流，可对靶细胞进行生物学功能调控，有效地修复如心肌缺血再灌注损伤、肝纤维化、急性肾损伤以及调节皮肤创面的愈合等。特别在调节皮肤创面愈合方面，间充质干细胞外泌体对皮肤成纤维细胞的调控功能具有促进伤口愈合与抑制瘢痕形成的双向调节作用。即在伤口愈合的早期通过促进胶原的合成来提高修复速度，晚期则减少胶原的合成而抑制瘢痕组织的形成，提升修复效果。
考虑到慢性伤口的炎性环境可能会阻碍活性物质促进创伤愈合的进程，已有研究者着力于适合的生物材料开发，将生物材料作为递送系统，携带活性物质促进皮肤伤口的愈合。因此基于开发可行和有效的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法及其应用，是本发明探索和期望解决的主要问题。
通过对含干细胞外泌体的凝胶和皮肤创伤修复方向的专利检索和调研发现，2018年9月，章云童等人申请了有关专利(中国专利申请号201811038381.7)，该发明应用人干细胞来源外泌体接种于外源性透明质酸形成的复合物来修复全层皮肤缺损的创面。但发明人所选用的递送系统为透明质酸，透明质酸具有结构和空间填充特性，还具有润滑以及水合能力。作为一种用于伤口处理的生物材料，虽然它可以促进间充质细胞和上皮细胞的迁移和分化，但是由天然材料制成的透明质酸通常机械性较弱，这限制了其在医学方面的应用。因此，有必要开发一种改善机械性能的同时保留生物活性的可医用材料。2019年12月，张伟等人申请了相关专利(中国专利申请号201911382525.5)，发明人通过将脂肪干细胞外泌体负载于胶原蛋白，得到脂肪干细胞外泌体的无菌胶原液，用于皮肤损伤修复以及创面修复。胶原蛋白是人胞外基质的主要成分之一，通常被认为是伤口敷料的理想生物材料，但胶原蛋白加工工艺较为繁复且难以控制其降解速率，给临床规模应用带来一定限制。
因此，针对目前已有技术的缺陷，需要进一步改良现有用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的生物材料制备体系，开发更安全、高效及可推广应用的含干细胞外泌体的凝胶制备工艺。
发明内容
为解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，通过培养干细胞，提取干细胞所分泌外泌体，制备适合递送外泌体的凝胶材料，最终获得可促进皮肤创面修复，缩短伤口愈合时间及减少瘢痕形成的含干细胞外泌体的凝胶。
本发明的技术解决方案是：本发明为一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特殊之处在于：该方法包括以下步骤：
1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养：
1.1)人脐带间充质干细胞的原代提取：脐带组织取自足月健康新生儿，组织于75％酒精消毒30s后，剥离华通氏胶并剪切成0.5cm3大小的组织块，离心后，于培养基中在37℃、5％CO2的培养箱中常规培养；每隔3d小心更换培养基，约12～14d后去除脐带组织，贴壁细胞常规培养；
1.2)传代培养：贴壁细胞融合度到达80％时使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞并传代培养；
1.3)培养上清收集：取适合代次细胞，细胞培养至50％-70％融合度时，弃去培养基，用无菌生理盐水清洗3遍，更换为无血清培养基培养，收集培养上清液；
2)人脐带间充质干细胞外泌体提取：
2.1)初次离心：无菌条件下，将收集的上清液离心，去除死细胞和体积较大的细胞碎片；
2.2)二次离心：通过离心去除死细胞和细胞碎片；
2.3)去除细胞器离心：通过离心去除细胞器及小颗粒，并于0.22μm滤器过滤；
2.4)外泌体粗提：滤过后液体转移至超速离心管中，离心后去除上清液，获得粗提外泌体；
2.5)外泌体终提：用1ml生理盐水重悬沉淀，离心后弃上清，生理盐水溶解沉淀，即得到人脐带间充质干细胞外泌体，置于-80℃保存待用；
3)凝胶材料制备：
3.1)壳聚糖制备：取医用级壳聚糖粉末,加入乙酸中，磁力搅拌器搅拌后，4℃放置保存；
3.2)β-甘油磷酸钠(Beta-glycerol phosphate,β-GP)配置：β-GP溶解于无菌注射用水中，震荡搅拌，通过0.22μm滤器过滤，配置好溶液4℃放置保存；
3.3)凝胶材料制备：将配置好的壳聚糖和β-GP从4℃环境取出，于冰上将β-GP溶液逐步滴加至壳聚糖溶液，持续搅拌8-10min，即得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶材料；
4)凝胶负载外泌体：将干细胞外泌体和壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶以1:3比例混合并搅拌均匀；外泌体负载完成后，将负载干细胞外泌体的凝胶置于4℃保存待用。
优选的，步骤1.1)中，离心条件为室温，200-300g转速离心5-8min。
优选的，步骤1)中，原代和传代细胞培养基为含体积分数5-15％胎牛血清的α-MEM培养基。
优选的，步骤1.3)中，培养上清收集所需适合代次细胞为P3-P6,培养上清收集所更换的培养基为无血清培养基MSC Xeno-Free SFM,更换培养基后细胞再培养24～72h后收集培养上清液。
优选的，步骤2.1)中，初次离心条件为4℃，200-300g，5-15min；步骤2.2)中，二次离心条件为4℃，1500-2500g，5-10min；步骤2.3)中，去除细胞器离心条件为4℃，8000-12000g，20-40min。
优选的，步骤2.4)中，外泌体粗提离心条件为4℃，80000-150000g，离心60-100min，步骤2.5)中，外泌体终提离心条件为4℃，80000-150000g，离心60-100min；溶解条件为，50-150μL生理盐水溶解。
优选的，步骤2)中，严格控制所收集上清细胞的培养条件，保证培养条件一致性；每次收集600-800ml干细胞上清液，将获得的干细胞上清按照以上步骤进行干细胞外泌体的提取。
优选的，步骤3.1)中，壳聚糖配置条件为，质量150-350g医用级壳聚糖粉末溶解至体积7.5-10.5ml，浓度0.05-0.2M，PH 3.5-4.5的乙酸中，磁力搅拌器搅拌1-3h；为防止医用级壳聚糖粉末结块，需在15min内将医用级壳聚糖粉末逐步添加到溶剂中。
优选的，步骤3.2)中β-GP配置条件为，质量为0.45-0.65gβ-GP溶解于体积为1.5-2.5ml的无菌注射用水中，震荡搅拌3-6min。
优选的，步骤3.3)中凝胶材料制备的壳聚糖和β-GP的混合体积比为9:1。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)为了提高含干细胞外泌体凝胶的应用安全性和减少生产成本，本发明在初期干细胞原代和传代培养阶段使用普通含胎牛血清的α-MEM培养基，目的是为了降低生产成本，待干细胞扩增至一定数量，可用于培养上清收集前，更换培养基为无血清培养体系MSCXeno-Free SFM，目的是减少血清带来的外源性外泌体，保证干细胞所分泌外泌体的纯度。且MSC Xeno-Free SFM培养基化学成分明确，不含有其他任何人源以外成分，且不含酚红和抗生素，可保证和提高所获得的干细胞外泌体的临床应用安全性。
2)干细胞外泌体的功能和特性与细胞接种密度、老化程度、增殖代数等均有密切关系，如细胞接种密度过大，会产生接触抑制；长期体外培养会加速MSC的老化，从而影响其可塑性和遗传稳定性，并反映在外泌体的内容物上；细胞分化的不同阶段分离出来的外泌体的miRNA的表达水平也不同。因此为了尽可能缩小每批次干细胞外泌体的功能和特性，本发明严格控制所收集上清细胞的培养条件，保证培养条件一致性，并控制培养上清收集所需的代次细胞为P3-P6，尽可能从外泌体产生源头控制外泌体质量。
3)细胞上清液内除了外泌体外还存在多种物质，包括死细胞、细胞碎片、微泡、凋亡小体等，因此本发明为了提高外泌体的提取纯度，在超高速离心阶段采取二次离心提取，即首次为外泌体的粗提，二次为终提，目的是减少杂蛋白，提高提取纯度。
4)考虑到皮肤创面愈合的病理和生理过程，本发明从物理、化学、机械性能、生物特性以及对创伤愈合影响等方面进行伤口敷料的选择。壳聚糖/β-GP凝胶材料是一种温敏凝胶，无抗原性、无毒，具备良好的生物相容性，能够在一定温度下以液态形式负载融合干细胞外泌体并控释、缓释和靶向其释放于皮肤创伤部位。本发明选择壳聚糖/β-GP凝胶递送干细胞外泌体的益处是，一方面壳聚糖/β-GP凝胶37℃时可形成半固体凝胶，提供组织创伤部位的空间维持，保护创面；另一方面可控制干细胞外泌体在创伤部位的释放速度，延长释放时间。以上优势最终达到的效果是保护创面，吸收渗出液，缩短创面愈合时间，并且通过延长外泌体释放时间，加快创面血管生成和上皮再生，并能充分发挥间充质干细胞外泌体对皮肤的双向调节作用。即在伤口愈合的早期通过促进胶原的合成来提高修复速度，晚期则减少胶原的合成而抑制瘢痕组织的形成，提升修复效果，满足人们对美学的需求。
附图说明
图1为脐带间充质干细胞原代提取及传代后图片；
图2为人脐带间充质干细胞成脂诱导图；
图3为脐带间充质干细胞所分泌外泌体的透射电镜图；
图4为人脐带间充质干细胞来源外泌体特异标记蛋白表达情况；。
图5为连续使用干细胞外泌体凝胶1个月的男性痤疮患者。
具体实施方式
本发明的具体实施例的步骤如下：
1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养：
1.1)人脐带间充质干细胞的原代提取：脐带组织取自足月健康新生儿，组织于75％酒精消毒30s后，剥离华通氏胶并剪切成0.5cm3大小的组织块，离心条件为室温，200-300g转速离心5-8min，离心后，于培养基中在37℃、5％CO2的培养箱中常规培养；每隔3d小心更换培养基，约12～14d后去除脐带组织，贴壁细胞常规培养；
1.2)传代培养：贴壁细胞融合度到达80％时使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞并传代培养；
原代和传代细胞培养基为含体积分数5-15％胎牛血清的α-MEM培养基；
1.3)培养上清收集：取适合代次细胞，细胞培养至50％-70％融合度时，弃去培养基，用无菌生理盐水清洗3遍，更换为无血清培养基培养，收集培养上清液；培养上清收集所需适合代次细胞为P3-P6,培养上清收集所更换的培养基为无血清培养基MSC Xeno-FreeSFM,更换培养基后细胞再培养24～72h后收集培养上清液；
2)人脐带间充质干细胞外泌体提取：
2.1)初次离心：无菌条件下，将收集的上清液离心，去除死细胞和体积较大的细胞碎片；初次离心条件为4℃，200-300g，5-15min；
2.2)二次离心：通过离心去除死细胞和细胞碎片；二次离心条件为4℃，1500-2500g，5-10min；
2.3)去除细胞器离心：通过离心去除细胞器及小颗粒，并于0.22μm滤器过滤；去除细胞器离心条件为4℃，8000-12000g，20-40min；
2.4)外泌体粗提：滤过后液体转移至超速离心管中，离心后去除上清液，获得粗提外泌体；外泌体粗提离心条件为4℃，80000-150000g离心60-100min；
2.5)外泌体终提：用1ml生理盐水重悬沉淀，离心后弃上清，生理盐水溶解沉淀，即得到人脐带间充质干细胞外泌体，置于-80℃保存待用；外泌体终提离心条件为4℃，80000-150000g离心60-100min；溶解条件为，50-150μL生理盐水溶解；
严格控制所收集上清细胞的培养条件，保证培养条件一致性；每次收集600-800ml干细胞上清液，将获得的干细胞上清按照以上步骤进行干细胞外泌体的提取；
3)凝胶材料制备：
3.1)壳聚糖制备：取医用级壳聚糖粉末,加入乙酸中，磁力搅拌器搅拌后，4℃放置保存；壳聚糖配置条件为，质量150-350g医用级壳聚糖粉末溶解至体积7.5-10.5ml，浓度0.05-0.2M，PH 3.5-4.5的乙酸中，磁力搅拌器搅拌1-3h；为防止医用级壳聚糖粉末结块，需在15min内将医用级壳聚糖粉末逐步添加到溶剂中；
3.2)β-甘油磷酸钠(Beta-glycerol phosphate,β-GP)配置：β-GP溶解于无菌注射用水中，震荡搅拌，通过0.22μm滤器过滤，配置好溶液4℃放置保存；β-GP配置条件为，质量为0.45-0.65gβ-GP溶解于体积为1.5-2.5ml的无菌注射用水中，震荡搅拌3-6min；
3.3)凝胶材料制备：将配置好的壳聚糖和β-GP从4℃环境取出，于冰上将β-GP溶液逐步滴加至壳聚糖溶液，持续搅拌8-10min，即得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶材料；凝胶材料制备的壳聚糖和β-GP的混合体积比为9:1；
4)凝胶负载外泌体：将干细胞外泌体和壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶以1:3比例混合并搅拌均匀；外泌体负载完成后，将负载干细胞外泌体的凝胶置于4℃保存待用。
本发明一个具体应用实施例及其实验结果如下：
1)人脐带间充质干细胞原代提取和传代培养：
1.1)人脐带间充质干细胞的提取：脐带组织取自足月健康新生儿，组织于75％酒精消毒30s后，剥离华通氏胶并剪切成0.5cm3大小的组织块，在室温，250g转速条件下离心5min，于含体积分数10％胎牛血清的α-MEM培养基中，在37℃、5％CO2的培养箱中常规培养。每隔3d小心更换培养基，约12～14d后去除脐带组织，贴壁细胞常规培养。
1.2)贴壁细胞融合度到达80％时使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞并传代。
1.3)取P3-P6代细胞，细胞培养至50％-70％融合度时，弃去原培养基，用无菌生理盐水清洗3遍，更换为无血清培养基MSC Xeno-Free SFM(Corning Cat.No 88-600-CV)，培养24～72h后收集培养上清液。
实验结果：参见图1，可见脐带组织块在培养7d后，细胞围绕脐带组织集落式生长，细胞排列紧密，胞体呈梭形；原代细胞传代培养后，细胞呈长梭形，旋涡状排列，细胞状态良好。
人脐带间充质干细胞成脂诱导：
配置成脂诱导培养基：在α-MEM基础培养基中添加体积分数为10％胎牛血清、5mg/L胰岛素、1mmol/L地塞米松、50mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、40mmol/L吲哚美辛，4℃保存。
人脐带间充质干细胞成脂诱导：取对数生长期P3代细胞，于成脂诱导培养基连续培养14-21天。
油红O检测：细胞出现较大脂滴后，PBS清洗2次，4％福尔马林固定，取0.5％油红按照3:2比例用水稀释，0.45um滤膜过滤后加入细胞中孵育1h，清洗2遍后观察。
实验结果：参见图2，人脐带间充质干细胞成脂诱导14天后，镜下可观察到细胞中出现葡萄串珠状，折光性强的脂滴结构，该结构在油红O作用下可被染成红色，镜下可见胞浆中充满红色油滴结构。说明所得细胞具有成脂分化的能力，具有间充质干细胞的分化潜能。
2)人脐带间充质干细胞外泌体提取：
2.1)无菌条件下，将收集的上清液于300g，10min离心，去除死细胞和体积较大的细胞碎片；
2.2)于2000g，10min离心条件下去除死细胞和细胞碎片；
2.3)于10000g，30min离心去除细胞器及小颗粒，
2.4)于0.22μm滤器过滤，滤过后液体转移至超速离心管中，100000g离心70min，去除上清液，获得粗提外泌体，
2.5)用1ml生理盐水重悬后，在100000g，70min离心，弃上清，100μL生理盐水溶解沉淀，即得到人脐带间充质干细胞外泌体，置于-80℃保存待用。
实验结果：参见图3，镜下可见脐带间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形态，囊状结构。
人脐带间充质干细胞外泌体的鉴定：
取分离纯化外泌体沉淀，BCA试剂盒蛋白定量，10％SDS-PAGE胶电泳离，转印PVDF膜后，5％脱脂牛奶封闭2h，分别加入外泌体标志分子抗体anti-CD9(1:1000浓度稀释)、anti-CD81(1:1000浓度稀释)，4℃孵育过夜，二抗室温避光孵育1h，1×TBST清洗，加入化学发光底物并凝胶成像。
实验结果：参见图4，通过免疫印迹法检测外泌体特异标记蛋白CD9和CD81，可见所分离的外泌体表达CD9和CD81，说明成功分离人脐带间充质干细胞来源外泌体。
3)凝胶材料制备：
3.1)壳聚糖制备：取200g医用级壳聚糖粉末,加入9ml浓度O.1M，PH4.0的乙酸中，磁力搅拌器搅拌2h，配置好溶液4℃放置保存。
在15分钟内将壳聚糖粉末逐步添加到溶剂中，以防止粉末结块，室温下连续磁力搅拌2小时以使其完全溶解。
3.2)β-甘油磷酸钠(Beta-glycerol phosphate,β-GP)配置：取0.56gβ-GP溶解于2ml无菌注射用水中，震荡搅拌5min，通过0.22μm滤器过滤，配置好溶液4℃放置保存。
3.3)凝胶材料制备：将配置好的壳聚糖和β-GP从4℃环境取出，于冰上将1ml的β-GP溶液逐步滴加至9ml壳聚糖溶液，持续搅拌10min，即得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶材料。
4)凝胶负载外泌体：将干细胞外泌体和壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶以体积比1:3混合并搅拌均匀。外泌体负载完成后凝胶置于4℃保存。
干细胞外泌体凝胶临床观察：
选择因面部痤疮造成感染、皮损的患者，面部清洁后，将干细胞外泌体凝胶外涂患处，2-3次/周，直至皮损痊愈。
实验结果：参见图5，患者使用期间可明显改善痤疮带来的面部不适感，痤疮愈合后无明显色素沉着斑及疤痕，患者使用期间未出现不良反应，因此说明本发明在临床应用中的安全性和有效性。以上结果证明，干细胞外泌体凝胶除有直接促进创面修复和愈合的作用外，还具有抑制疼痛及不适感，减少色素沉着和疤痕。
以上，仅为本发明公开的具体实施方式，但本发明公开的保护范围并不局限于此，本发明公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养：
1.1)人脐带间充质干细胞的原代提取：脐带组织取自足月健康新生儿，组织于75％酒精消毒30s后，剥离华通氏胶并剪切成0.5cm3大小的组织块，离心后，于培养基中在37℃、5％CO2的培养箱中常规培养；每隔3d小心更换培养基，约12～14d后去除脐带组织，贴壁细胞常规培养；
1.2)传代培养：贴壁细胞融合度到达80％时使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞并传代培养；
1.3)培养上清收集：取适合代次细胞，细胞培养至50％-70％融合度时，弃去培养基，用无菌生理盐水清洗3遍，更换为无血清培养基培养，收集培养上清液；
2)人脐带间充质干细胞外泌体提取：
2.1)初次离心：无菌条件下，将收集的上清液离心，去除死细胞和体积较大的细胞碎片；
2.2)二次离心：通过离心去除死细胞和细胞碎片；
2.3)去除细胞器离心：通过离心去除细胞器及小颗粒，并于0.22μm滤器过滤；
2.4)外泌体粗提：滤过后液体转移至超速离心管中，离心后去除上清液，获得粗提外泌体；
2.5)外泌体终提：用1ml生理盐水重悬沉淀，离心后弃上清，生理盐水溶解沉淀，即得到人脐带间充质干细胞外泌体，置于-80℃保存待用；
3)凝胶材料制备：
3.1)壳聚糖制备：取医用级壳聚糖粉末,加入乙酸中，磁力搅拌器搅拌后，4℃放置保存；
3.2)β-GP配置：β-GP溶解于无菌注射用水中，震荡搅拌，通过0.22μm滤器过滤，配置好溶液4℃放置保存；
3.3)凝胶材料制备：将配置好的壳聚糖和β-GP从4℃环境取出，于冰上将β-GP溶液逐步滴加至壳聚糖溶液，持续搅拌8-10min，即得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶材料；
4)凝胶负载外泌体：将干细胞外泌体和壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶以1:3比例混合并搅拌均匀；外泌体负载完成后，将负载干细胞外泌体的凝胶置于4℃保存待用。
2.根据权利要求1所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤1.1)中，离心条件为室温，200-300g转速离心5-8min。
3.根据权利要求2所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，原代和传代细胞培养基为含体积分数5-15％胎牛血清的α-MEM培养基。
4.根据权利要求3所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤1.3)中，培养上清收集所需适合代次细胞为P3-P6,培养上清收集所更换的培养基为无血清培养基MSC Xeno-Free SFM,更换培养基后细胞再培养24～72h后收集培养上清液。
5.根据权利要求4所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤2.1)中，初次离心条件为4℃，200-300g，5-15min；所述步骤2.2)中，二次离心条件为4℃，1500-2500g，5-10min；所述步骤2.3)中，去除细胞器离心条件为4℃，8000-12000g，20-40min。
6.根据权利要求5所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤2.4)中，外泌体粗提离心条件为4℃，80000-150000g，离心60-100min，所述步骤2.5)中，外泌体终提离心条件为4℃，80000-150000g，离心60-100min；溶解条件为，50-150μL生理盐水溶解。
7.根据权利要求6所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，严格控制所收集上清细胞的培养条件，保证培养条件一致性；每次收集600-800ml干细胞上清液，将获得的干细胞上清按照以上步骤进行干细胞外泌体的提取。
8.根据权利要求1至7任一权利要求所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤3.1)中，壳聚糖配置条件为，质量150-350g医用级壳聚糖粉末溶解至体积7.5-10.5ml，浓度0.05-0.2M，PH 3.5-4.5的乙酸中，磁力搅拌器搅拌1-3h；为防止医用级壳聚糖粉末结块，需在15min内将医用级壳聚糖粉末逐步添加到溶剂中。
9.根据权利要求8所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤3.2)中β-GP配置条件为，质量为0.45-0.65gβ-GP溶解于体积为1.5-2.5ml的无菌注射用水中，震荡搅拌3-6min。
10.根据权利要求9所述的用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，其特征在于：所述步骤3.3)中凝胶材料制备的壳聚糖和β-GP的混合体积比为9:1。
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