CN112274691A - 一种包载磁性外泌体的难愈性创面敷料的制备方法及其应用 - Google Patents

一种包载磁性外泌体的难愈性创面敷料的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包载磁性外泌体的难愈性创面敷料的制备方法及其应用，制备方法为首先将壳聚糖溶液与β‑甘油磷酸钠溶液混合，得到混合溶液I；然后向混合溶液I中加入羟乙基纤维素溶液，得到混合溶液II；人间充质干细胞与Fe3O4超顺磁性纳米粒共孵育后提取得到磁性外泌体，并将磁性外泌体加入上述混合溶液II中，制备出一种包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料。该方法制得的水凝胶敷料具有优异的温敏性，可注射给药，同时具备抗菌、促进新生血管生成等作用，该水凝胶敷料在促进难愈性创面修复中具有良好的应用前景。

Description

一种包载磁性外泌体的难愈性创面敷料的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于可降解生物医用材料技术领域，具体而言，涉及一种生物活性的难愈性创面敷料的制备方法及其应用。
背景技术
随着我国社会经济的发展，人口老龄化问题以及人民生活方式的改变，社会慢性病疾病谱也发生了变化，老年疾病和代谢疾病的高发使得慢性难愈创面的发病率逐渐增高。其中，介于20岁至79岁的人群中糖尿病的患病率迅速增长，预计到2030年糖尿病患病率将达到7.7％(约4.39亿)。由糖尿病引发的糖尿病足溃疡是一种典型的糖尿病并发症，其表现为创面部位迁延难愈，最终发展为慢性难愈性创面，严重可导致截肢，甚至危及生命。因此，有效的难愈性创面治疗手段及敷料亟待开发。研究发现，在慢性难愈性创面中，血管新生能力障碍可导致缺血区域的细胞死亡，阻碍创面修复和组织再生，因此，促进新生血管生成是治疗难愈性创面的一个有效途径。
外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成并分泌的直径为40～100nm的纳米级别亚细胞双层膜囊泡，内含蛋白质、miRNAs、lncRNAs等多种生物活性分子，在细胞间物质运输和信号通讯中发挥重要作用。近期大量研究发现，干细胞外泌体可以通过调控炎症反应、促进血管生成和成纤维细胞增殖及再上皮化等多种途径来促进创面的愈合。干细胞外泌体是一种能被大多数干细胞分泌的微小囊泡，由脂质、蛋白质和核酸组成。与干细胞治疗相比，干细胞外泌体可避免免疫排斥、致瘤、栓塞等问题；与单一细胞因子相比，干细胞外泌体具有更丰富的生物活性和更大的组织再生潜能，因此成为近年来再生医学的研究热点和创面修复的明星材料。
本发明通过干细胞与Fe3O4超顺磁性纳米粒共孵育后提取得到磁性外泌体，所制备的磁性外泌体除具备促进骨再生能力外，还具备促进新生血管形成的能力，因此对难愈性创面修复具有重要作用，然而，磁性外泌体体内清除速率快、半衰期短、不能维持游离外泌体活性，极大地阻碍了其在创面修复中的应用，因此开发能有效负载并缓慢释放磁性外泌体的生物活性支架对于难愈性伤口的愈合是至关重要的。进一步，本发明通过将温敏水凝胶和制备得到的磁性外泌体进行结合，得到包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料，经实验验证，发现制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料可以响应环境温度变化而发生溶胶-凝胶的转变，在室温或者低于室温时能够保持液体状态，当温度升高至生理温度(37℃)后形成半固体凝胶，这一特性有利于局部注射治疗，胶凝后的敷料可粘附在创面部位并对创面实行有效封闭，减少接触性细菌感染的机会，温敏水凝胶负载的生物活性因子能够实现驻留和缓释的效果，进一步促进创面修复，加速愈合，是一种有效的新型生物活性敷料，在临床上如糖尿病溃疡等疾病中具有良好的应用前景。但是，目前包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料仍未见报道。
发明内容
针对目前现有技术中包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料的研究空白和现有的难愈性创面敷料存在的不足，本发明的目的在于提供一种包载磁性外泌体的难愈性创面敷料的制备方法及其应用，该方法制备工艺简单，制得的水凝胶敷料具有优异的温敏性和可注射性，便于临床给药，同时该生物活性水凝胶敷料能有效促进新生血管生成，具有加速慢性难愈性创面修复的作用，可作为临床上如糖尿病溃疡等疾病的新型生物活性敷料。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种包载磁性外泌体的难愈性创面敷料。
进一步，所述敷料包括磁性外泌体、温敏水凝胶。
本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述敷料的制备方法。
进一步，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液混合，得到混合溶液I；
(2)向混合溶液I中加入羟乙基纤维素溶液，得到混合溶液II；
(3)将磁性外泌体加入混合溶液II中搅拌混匀，静置得到包载磁性外泌体的难愈性创面敷料；
进一步，步骤(1)-(3)中所述溶液混合的条件为冰浴。
进一步，所述包载磁性外泌体的难愈性创面敷料在人体生理温度下胶凝，在室温或者低于室温时能够保持液体状态。
进一步，所述壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液的体积比为(4～9):1:2。
进一步，步骤(1)中所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于酸性溶剂中得到的。
进一步，所述酸性溶剂优选为0.1M醋酸溶液。
进一步，所述壳聚糖溶液的浓度为1-5％(w/v)。
进一步，所述壳聚糖溶液的浓度优选为1.5-2.5％(w/v)。
进一步，步骤(1)中所述β-甘油磷酸钠溶液由β-甘油磷酸钠溶解于去离子水中得到的。
进一步，所述β-甘油磷酸钠包括无水β-甘油磷酸钠、β-甘油磷酸钠五水化合物。
进一步，所述β-甘油磷酸钠溶液的浓度为0.1-2g/mL。
进一步，所述β-甘油磷酸钠溶液的浓度优选为0.5-1.0g/mL。
进一步，步骤(2)中所述羟乙基纤维素溶液由羟乙基纤维素溶于去离子水中得到的。
进一步，所述羟乙基纤维素溶液在25℃条件下的平均粘度为100-1000mpa.s。
进一步，所述羟乙基纤维素溶液的浓度为1-100mg/mL。
进一步，所述羟乙基纤维素溶液的浓度优选为10-50mg/mL。
进一步，步骤(3)中所述混合溶液II与磁性外泌体按照体积质量比为100μL:(1～10)μg的比例混合。
进一步，步骤(3)中所述磁性外泌体是通过Fe3O4超顺磁性纳米粒刺激干细胞分泌得到的外泌体。
进一步，所述磁性外泌体的提取过程包括如下步骤：
(1)对数生长期的干细胞中加入Fe3O4超顺磁性纳米粒溶液；
(2)共孵育一段时间后，分离细胞上清并提取磁性外泌体。
进一步，步骤(1)中所述干细胞为人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞或人脂肪间充质干细胞。
进一步，步骤(1)中所述干细胞优选为人骨髓间充质干细胞。
进一步，步骤(1)中所述Fe3O4超顺磁性纳米粒溶液的浓度为0.5-2mg/mL。
进一步，步骤(2)中所述共孵育的时间为72-120h。
本发明制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料中的壳聚糖为天然有机高分子材料，来源广泛，在地球上的含量仅次于纤维素，具有很好的生物相容性、可降解性、抗菌性和无毒性，壳聚糖中含有氨基和羟基，具有止血、消炎和伤口愈合的作用；本发明制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料中的β-甘油磷酸钠为促凝剂，和壳聚糖结合后，可促进温敏水凝胶的形成；本发明制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料中的羟乙基纤维素是一种重要的羟烷基纤维素，具有良好的生物降解性和生物安全性，以羟乙基纤维素为基材制备得到的水凝胶能提高纤维素的生物附加值，并赋予凝胶以天然产物的优点；本发明制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料中的磁性外泌体具备促进骨再生的能力和促进新生血管形成的能力。
本发明制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料中的羟乙基纤维素上的羟基可以和壳聚糖、β-甘油磷酸钠上的氨基及羟基产生氢键作用，此外，大分子链的羟乙基纤维素可以与壳聚糖分子链相互缠绕形成物理缠结，使得制备合成的包载磁性外泌体的水凝胶结构更加稳定。
在本发明的实施例中，对制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料进行了一系列的实验验证，其中，包括温敏性能测试、流变性能测试、水凝胶中磁性外泌体的体外释放情况、体外促进血管生成的情况。经实验验证，发现本发明制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料可以响应环境温度变化而发生溶胶-凝胶的转变，在室温或者低于室温时能够保持液体状态，当温度升高至生理温度(37℃)后形成半固体凝胶，这一特性有利于局部注射治疗，胶凝后的敷料可粘附在创面部位并对创面实行有效封闭，减少接触细菌感染的机会，温敏水凝胶负载的生物活性因子能够实现驻留和缓释的效果，进一步促进创面修复，加速愈合。
本发明的第三方面提供了本发明第一方面所述的敷料在促进新生血管生成中的应用。
本发明的第四方面提供了本发明第一方面所述的敷料在制备难愈性皮肤创伤修复药物中的应用。
进一步，所述药物用于难愈性皮肤创伤的修复和治疗，难愈性皮肤创伤包括但不限于糖尿病性溃疡、外伤性溃疡、感染性溃疡、神经营养不良性溃疡、压迫性溃疡、烧伤后瘢痕溃疡、血管性溃疡(动脉闭塞硬化性溃疡、静脉曲张性溃疡)、化学性溃疡、放射性溃疡、毒蛇咬伤性溃疡。
进一步，所述药物还包括药物组合物。
进一步，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的敷料。
进一步，所述药物组合还可以包括有效量的用于难愈性皮肤创伤修复的药物及药学上可接受的药用载体和/或药用辅料。
进一步，本发明第一方面所述的敷料与用于难愈性皮肤创伤修复的药物可以制备成单独的制剂联合应用，也可将两者制备成一种制剂以组合物的形式应用。
进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域技术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物(例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油)，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液，诸如此类的也可加入其中，适合的药学上可接受的载体和/或辅料在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人。
本发明的所述的药物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
除非另有定义，本发明上下文中的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。此外，对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括但不限于治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。
本文中使用的术语“药学上可接受载体和/或辅料”，是指这样的载体和/或辅料，其并不引起对生物体的显著刺激，并且并不废除所给予化合物的生物活性和性质。
本文中使用的术语“赋形剂”，是指惰性物质，其被加入药物组合物用来进一步促进活性成分的给予。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
由于采用了上述方案，本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明制备的水凝胶具有良好的生物相容性和良好的温度响应性，可以在体温环境中胶凝，从而实现了作为一种用于皮肤创面修复的水凝胶所需的可注射性和可降解性。
(2)本发明的原料来源广泛易得，便于工业化生产，此外，本发明的水凝胶制备方法简单可行，具有良好的推广应用价值。
(3)本发明制备的水凝胶所包载的生物活性物质磁性外泌体具有良好的促进新生血管形成的作用，能有效促进慢性难愈性创面的愈合，可作为临床上如糖尿病溃疡等疾病的新型生物活性敷料。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是本发明的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料的制备示意图；
图2是本发明的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料的扫描电镜图；
图3是本发明的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料的温敏性能测试结果图，其中，A图：4℃时凝胶形态，B图：37℃时凝胶形态；
图4是本发明的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料的流变性能测试结果图；
图5是本发明的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料的外泌体释放曲线图；
图6是本发明的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料的体外促血管生成作用的结果图，其中，A图：对照组，B图：M-Exo@CS/β-GP/HEC。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
糖尿病溃疡等难愈性创面面临的问题是创面迁延难愈、易反复感染，因此，理想的难愈性创面敷料应具备湿性环境、可粘附性、抗菌性、生物相容性、可加速创面愈合等特征。本发明中申请人采用基于壳聚糖的温敏水凝胶包载磁性外泌体，制备出可用于难愈性创面修复的生物活性水凝胶敷料。在该敷料中，壳聚糖具有粘附、止血、抗菌等功能，且壳聚糖、β-甘油磷酸钠、羟乙基纤维素组成的水凝胶体系具有良好的温度敏感性和生物相容性。温度敏感性使得水凝胶在常温状态下呈液态，可方便注射给药并完整包覆创口，体温条件下数分钟内胶凝成固态水凝胶。固态水凝胶可封闭从而保护创口，且其形成的固态三维结构可使得包覆其中的磁性外泌体实现缓释，延长生物活性因子作用时间从而进一步促进创面修复。敷料中包载的磁性外泌体与普通干细胞外泌体相比具有更好的促新生血管形成能力，对血管生成不良的难愈性创面具有特效。因此，本发明制备的包载磁性外泌体的温敏水凝胶敷料用于难愈性创面修复具有良好的应用前景。
实施例1包载磁性外泌体的温敏水凝胶的制备
按壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液的体积比为4:1:2制备包载磁性外泌体的温敏水凝胶，制备过程示意图见图1。
1、磁性外泌体(M-Exo)的制备
(1)人骨髓间充质干细胞培养至80％融合时，更换为不含外泌体的培养基；
(2)加入Fe3O4超顺磁性纳米粒，使得纳米粒的终浓度为0.5mg/mL，继续培养；
(3)培养72h后，收集细胞上清液，2000×g离心10分钟去除死细胞和杂质；
(4)取上清10000×g离心10分钟去除细胞碎片；
(5)继续取上清100000×g超速离心70分钟，沉淀即得磁性外泌体；
(6)PBS重悬后，-80℃保存备用。
2、水凝胶(CS/β-GP/HEC)的制备
(1)称取2g壳聚糖(CS)，边搅拌边加入至100mL 0.1M醋酸溶液中，超声10min加速溶解，过滤除去不溶性颗粒后得到2％(w/v)壳聚糖溶液；
(2)称取6gβ-甘油磷酸钠(β-GP)，加入10mL去离子水中，溶解得到0.6g/mLβ-甘油磷酸钠溶液；
(3)称取2.5g羟乙基纤维素(HEC)，加入100mL去离子水中，40℃条件下搅拌溶解，得浓度为25mg/mL羟乙基纤维素溶液；
(4)步骤(1)～(3)制备得到的三种溶液于4℃环境中放置1h后，冰浴条件下，取1mLβ-甘油磷酸钠溶液加入至4mL壳聚糖溶液中，立即搅拌混匀得到混合溶液I(CS/β-GP)；
(5)冰浴下，向混合溶液I中加入2mL羟乙基纤维素溶液，立即搅拌混匀得混合溶液II(CS/β-GP/HEC)。其中，壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液体积比为4:1:2。
3、包载磁性外泌体的温敏水凝胶(M-Exo@CS/β-GP/HEC)的制备
(1)冰浴条件下，向本实例的上述混合溶液II(CS/β-GP/HEC)中加入磁性外泌体(M-Exo)，其中水凝胶溶液与磁性外泌体体积质量比为100μL:10μg；
(2)搅拌均匀后继续于冰浴中孵育30分钟，即得包载磁性外泌体的水凝胶溶液。将该水凝胶溶液至于37℃水浴中，数分钟内胶凝成固体水凝胶，既得包载磁性外泌体的温敏水凝胶(M-Exo@CS/β-GP/HEC)，瓶体分装，即为成品，保存备用。
实施例2包载磁性外泌体的温敏水凝胶的制备
按壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液的体积比为6:1:2制备包载磁性外泌体的温敏水凝胶，制备过程示意图见图1。
1、磁性外泌体(M-Exo)的制备
(1)人骨髓间充质干细胞培养至80％融合时，更换为不含外泌体的培养基；
(2)加入Fe3O4超顺磁性纳米粒，使得纳米粒的终浓度为0.5mg/mL，继续培养；
(3)培养72h后，收集细胞上清液，2000×g离心10分钟去除死细胞和杂质；
(4)取上清10000×g离心10分钟去除细胞碎片；
(5)继续取上清100000×g超速离心70分钟，沉淀即得磁性外泌体；
(6)PBS重悬后，-80℃保存备用。
2、水凝胶(CS/β-GP/HEC)的制备
(1)称取2g壳聚糖(CS)，边搅拌边加入至100mL 0.1M醋酸溶液中，超声10min加速溶解，过滤除去不溶性颗粒后得到2％(w/v)壳聚糖溶液；
(2)称取6gβ-甘油磷酸钠(β-GP)，加入10mL去离子水中，溶解得到0.6g/mLβ-甘油磷酸钠溶液；
(3)称取2.5g羟乙基纤维素(HEC)，加入100mL去离子水中，40℃条件下搅拌溶解，得浓度为25mg/mL羟乙基纤维素溶液；
(4)步骤(1)～(3)制备得到的三种溶液于4℃环境中放置1h后，冰浴条件下，取1mLβ-甘油磷酸钠溶液加入至6mL壳聚糖溶液中，立即搅拌混匀得到混合溶液I(CS/β-GP)；
(5)冰浴下，向混合溶液I中加入2mL羟乙基纤维素溶液，立即搅拌混匀得混合溶液II(CS/β-GP/HEC)。其中，壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液体积比为6:1:2。
3、包载磁性外泌体的温敏水凝胶(M-Exo@CS/β-GP/HEC)的制备
(1)冰浴条件下，向本实例的上述混合溶液II(CS/β-GP/HEC)中加入磁性外泌体(M-Exo)，其中水凝胶溶液与磁性外泌体体积质量比为100μL:10μg；
(2)搅拌均匀后继续于冰浴中孵育30分钟，即得包载磁性外泌体的水凝胶溶液。将该水凝胶溶液至于37℃水浴中，数分钟内胶凝成固体水凝胶，既得包载磁性外泌体的温敏水凝胶(M-Exo@CS/β-GP/HEC)，瓶体分装，即为成品，保存备用。
实施例3包载磁性外泌体的温敏水凝胶的制备
按壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液的体积比为7:1:2制备包载磁性外泌体的温敏水凝胶，制备过程示意图见图1。
1、磁性外泌体(M-Exo)的制备
(1)人骨髓间充质干细胞培养至80％融合时，更换为不含外泌体的培养基；
(2)加入Fe3O4超顺磁性纳米粒，使得纳米粒的终浓度为0.5mg/mL，继续培养；
(3)培养72h后，收集细胞上清液，2000×g离心10分钟去除死细胞和杂质；
(4)取上清10000×g离心10分钟去除细胞碎片；
(5)继续取上清100000×g超速离心70分钟，沉淀即得磁性外泌体；
(6)PBS重悬后，-80℃保存备用。
2、水凝胶(CS/β-GP/HEC)的制备
(1)称取2g壳聚糖(CS)，边搅拌边加入至100mL 0.1M醋酸溶液中，超声10min加速溶解，过滤除去不溶性颗粒后得到2％(w/v)壳聚糖溶液；
(2)称取6gβ-甘油磷酸钠(β-GP)，加入10mL去离子水中，溶解得到0.6g/mLβ-甘油磷酸钠溶液；
(3)称取2.5g羟乙基纤维素(HEC)，加入100mL去离子水中，40℃条件下搅拌溶解，得浓度为25mg/mL羟乙基纤维素溶液；
(4)步骤(1)～(3)制备得到的三种溶液于4℃环境中放置1h后，冰浴条件下，取1mLβ-甘油磷酸钠溶液加入至7mL壳聚糖溶液中，立即搅拌混匀得到混合溶液I(CS/β-GP)；
(5)冰浴下，向混合溶液I中加入2mL羟乙基纤维素溶液，立即搅拌混匀得混合溶液II(CS/β-GP/HEC)。其中，壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液体积比为7:1:2。
3、包载磁性外泌体的温敏水凝胶(M-Exo@CS/β-GP/HEC)的制备
(1)冰浴条件下，向本实例的上述混合溶液II(CS/β-GP/HEC)中加入磁性外泌体(M-Exo)，其中水凝胶溶液与磁性外泌体体积质量比为100μL:10μg；
(2)搅拌均匀后继续于冰浴中孵育30分钟，即得包载磁性外泌体的水凝胶溶液。将该水凝胶溶液至于37℃水浴中，数分钟内胶凝成固体水凝胶，既得包载磁性外泌体的温敏水凝胶(M-Exo@CS/β-GP/HEC)，瓶体分装，即为成品，保存备用。
实施例4包载磁性外泌体的温敏水凝胶的制备
按壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液的体积比为9:1:2制备包载磁性外泌体的温敏水凝胶，制备过程示意图见图1。
1、磁性外泌体(M-Exo)的制备
(1)人骨髓间充质干细胞培养至80％融合时，更换为不含外泌体的培养基；
(2)加入Fe3O4超顺磁性纳米粒，使得纳米粒的终浓度为0.5mg/mL，继续培养；(3)培养72h后，收集细胞上清液，2000×g离心10分钟去除死细胞和杂质；(4)取上清10000×g离心10分钟去除细胞碎片；
(5)继续取上清100000×g超速离心70分钟，沉淀即得磁性外泌体；
(6)PBS重悬后，-80℃保存备用。
2、水凝胶(CS/β-GP/HEC)的制备
(1)称取2g壳聚糖(CS)，边搅拌边加入至100mL 0.1M醋酸溶液中，超声10min加速溶解，过滤除去不溶性颗粒后得到2％(w/v)壳聚糖溶液；
(2)称取6gβ-甘油磷酸钠(β-GP)，加入10mL去离子水中，溶解得到0.6g/mLβ-甘油磷酸钠溶液；
(3)称取2.5g羟乙基纤维素(HEC)，加入100mL去离子水中，40℃条件下搅拌溶解，得浓度为25mg/mL羟乙基纤维素溶液；
(4)步骤(1)～(3)制备得到的三种溶液于4℃环境中放置1h后，冰浴条件下，取1mLβ-甘油磷酸钠溶液加入至9mL壳聚糖溶液中，立即搅拌混匀得到混合溶液I(CS/β-GP)；
(5)冰浴下，向混合溶液I中加入2mL羟乙基纤维素溶液，立即搅拌混匀得混合溶液II(CS/β-GP/HEC)。其中，壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液体积比为9:1:2。
3、包载磁性外泌体的温敏水凝胶(M-Exo@CS/β-GP/HEC)的制备
(1)冰浴条件下，向本实例的上述混合溶液II(CS/β-GP/HEC)中加入磁性外泌体(M-Exo)，其中水凝胶溶液与磁性外泌体体积质量比为100μL:10μg；
(2)搅拌均匀后继续于冰浴中孵育30分钟，即得包载磁性外泌体的水凝胶溶液。将该水凝胶溶液至于37℃水浴中，数分钟内胶凝成固体水凝胶，既得包载磁性外泌体的温敏水凝胶(M-Exo@CS/β-GP/HEC)，瓶体分装，即为成品，保存备用。
4、M-Exo@CS/β-GP/HEC的微观形貌观察
M-Exo@CS/β-GP/HEC(壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液体积比为9:1:2)冻干后扫描电镜下观察可见水凝胶为三维网状多孔结构(见图2)，这种三维网状结构能够将磁性外泌体包覆其中，能够延长外泌体的体外生物活性和实现外泌体的创面局部缓释。
实施例5包载磁性外泌体的温敏水凝胶的温敏性能和流变性能的测试
以实施例4制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶为例进行测试分析。
1、包载磁性外泌体的温敏水凝胶的温敏性能的测试
将制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶分别放置于室温条件下和37℃的条件下孵育5min，观察水凝胶的状态。
2、包载磁性外泌体的温敏水凝胶的流变性能的测试
利用流变仪测试制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶的流变性能，实验设置的温度变化范围为4～37℃线性升高，记录水凝胶的储能模量和损耗模量随温度变化的结果图。
3、实验结果
包载磁性外泌体的温敏水凝胶的温敏性能测试结果图见图3，结果显示，室温条件下，水凝胶呈溶液状(见图3A)，便于临床上注射给药，37℃条件下孵育5min后，水凝胶胶凝固化(见图3B)，使得敷料能粘附于创面上，并实现磁性外泌体在创面部位的缓释；包载磁性外泌体的温敏水凝胶的流变性能的测试结果图见图4，结果显示，随着温度逐渐从4℃上升至37℃，水凝胶的储存模量(G’)逐渐高于损耗模量(G”)，即水凝胶逐渐从溶液状态转变为凝胶状态，表明该水凝胶具有良好的温度敏感性。
实施例6包载磁性外泌体的温敏水凝胶的体外释放和体外促进血管生成的情况
以实施例4制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶为例进行测试分析。
1、包载磁性外泌体的温敏水凝胶的体外释放情况
将制备得到的包载磁性外泌体的温敏水凝胶浸泡于PBS溶液中，37℃条件下孵育，不同时间点抽取上清检测其中外泌体含量，并记录实验结果。
2、包载磁性外泌体的温敏水凝胶的体外促进血管生成的情况
取包载磁性外泌体的温敏水凝胶并置于96孔板中，37℃培养箱中放置待其胶凝，加入人脐静脉内皮细胞(HUVEC)悬液后放入培养箱中孵育，每隔4h显微镜下观察细胞成管情况并拍照记录。
3、实验结果
结果显示磁性外泌体在凝胶中缓慢释放，10天后释放累积量达40％以上(见图5)；本发明制备的包载磁性外泌体的温敏水凝胶的体外促进血管生成作用的结果图见图6，与对照组(见图6A)相比，包载磁性外泌体水凝胶能够促进HUVECs更快更多的形成脉管网络状结构(见图6B)，具有显著的促新生血管生成的作用，有利于难愈性创面中新生血管的形成，从而促进创面的修复，加速慢性难愈性创面的愈合，可作为临床上如糖尿病溃疡等疾病的新型生物活性敷料。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种包载磁性外泌体的难愈性创面敷料，其特征在于，所述敷料包括磁性外泌体、温敏水凝胶。
2.一种权利要求1所述的敷料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液混合，得到混合溶液I；
(2)向混合溶液I中加入羟乙基纤维素溶液，得到混合溶液II；
(3)将磁性外泌体加入混合溶液II中搅拌混匀，静置得到包载磁性外泌体的难愈性创面敷料；
优选地，步骤(1)-(3)中所述溶液混合的条件为冰浴；
优选地，所述包载磁性外泌体的难愈性创面敷料在人体生理温度下胶凝；
优选地，所述壳聚糖溶液：β-甘油磷酸钠溶液：羟乙基纤维素溶液的体积比为(4～9):1:2。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于酸性溶剂中得到的；
优选地，所述酸性溶剂为0.1M醋酸溶液；
优选地，所述壳聚糖溶液的浓度为1-5％(w/v)；
更优选地，所述壳聚糖溶液的浓度为1.5-2.5％(w/v)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述β-甘油磷酸钠溶液由β-甘油磷酸钠溶解于去离子水中得到的；
优选地，所述β-甘油磷酸钠包括无水β-甘油磷酸钠、β-甘油磷酸钠五水化合物；
优选地，所述β-甘油磷酸钠溶液的浓度为0.1-2g/mL；
更优选地，所述β-甘油磷酸钠溶液的浓度为0.5-1.0g/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述羟乙基纤维素溶液由羟乙基纤维素溶于去离子水中得到的；
优选地，所述羟乙基纤维素溶液在25℃条件下的平均粘度为100-1000mpa.s；
优选地，所述羟乙基纤维素溶液的浓度为1-100mg/mL；
更优选地，所述羟乙基纤维素溶液的浓度为10-50mg/mL。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述混合溶液II与磁性外泌体按照体积质量比为100μL:(1～10)μg的比例混合。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述磁性外泌体是通过Fe3O4超顺磁性纳米粒刺激干细胞分泌得到的外泌体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述磁性外泌体的提取过程包括如下步骤：
(1)对数生长期的干细胞中加入Fe3O4超顺磁性纳米粒溶液；
(2)共孵育一段时间后，分离细胞上清并提取磁性外泌体；
优选地，步骤(1)中所述干细胞为人骨髓间充质干细胞；
优选地，步骤(1)中所述Fe3O4超顺磁性纳米粒溶液的浓度为0.5-2mg/mL；
优选地，步骤(2)中所述共孵育的时间为72-120h。
9.权利要求1所述的敷料在促进新生血管生成中的应用。
10.权利要求1所述的敷料在制备难愈性皮肤创伤修复药物中的应用。
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