KR102250231B1 - 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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이정환
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정지원
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Abstract

본 발명은 콜라겐 및 실크 피브로인으로 이루어진 하이드로겔 및 하이드로겔 내부에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 종래 줄기세포의 2차원 단층 배양에 의한 3차원 세포 배양 환경 모사의 문제점을 해결할 뿐만 아니라 저강성의 하이드로겔을 도입하여 인간 혈관내피 세포의 증식, 세포 사멸 저항성, 및 세포 이동능을 효율적으로 향상시킬 수 있어 허혈성 심혈관 질환 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating cardiovascular disease}
본 발명은 콜라겐 및 실크 피브로인으로 이루어진 하이드로겔 및 하이드로겔 내부에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
심혈관 질환은 혈관 손상, 혈관 폐색에 의해 조직 내 세포에 필요한 영양분과 산소 공급 차단, 노폐물 제거율의 저하로 인해 허혈성 조직 괴사가 일어나 병증이 지속될 시 사망에 이르게 하는 질환으로서, 세계 사망률 1위, 국내 사망률 2위에 해당하는 심각한 질환 중 하나이다. 현재, 심혈관 질환 치료 방법으로는 약물 요법과 수술적 요법 (스텐트 삽관)이 시행되고 있으나, 그 적용범위가 제한적이고 병적 진행상황에 따라 그 치료 효능이 낮아짐에 따라, 새로운 재생의료 치료 기술 개발이 시급한 상황이다.
최근, 많은 연구자들과 글로벌 제약회사들이 새로운 재생의료 치료 기술 개발을 위해 줄기세포 기반 치료 기술 개발에 초점을 맞추고 있다. 배아줄기세포의 경우 다분화능, 자가증식능을 가지고 있어 활용적인 측면에서는 광범위 하나, 환자 난자에서 줄기세포를 추출해야 하기 때문에 윤리적인 문제와 세포 공급문제에 있어 상당한 제약이 수반된다. 이에 반해, 성체줄기세포의 경우 환자 자신의 조직, 즉 골수, 지방, 치아, 제대혈 등에서 얻을 수 있고, 자가줄기세포라는 장점이 있어 윤리적인 문제, 자가 면역거부반응 문제로부터 자유로워 많은 연구자들이 성체줄기세포를 이용하여 줄기세포 기반 치료 기술 개발을 시도하고 있다. 이러한 성체줄기세포 중에서도 중간엽줄기세포는 다양한 세포로의 분화능 (지방, 뼈, 연골, 혈관 등)을 가지고 있으며, 이들 세포에서 발현/분비하는 다양한 cytokines와 growth factors들이 높은 세포 증식 유도, 세포 사멸 억제의 효과를 나타내고 있어서, 중간엽줄기세포와 더불어 이들이 분비하는 다양한 발현인자를 이용하여 치료용 조성물 개발이 진행되고 있다.
중간엽 줄기세포는 적은 침습적인 방법을 통해서 체외로 추출할 수 있으며, 체외 증폭 배양 시 각 분화 조건에 맞는 분화 배지에서 배양하게 되면, 쉽게 다양한 세포로 분화가 가능하다. 하지만, 체외 증폭 배양의 경우, 대부분의 연구에서 2차원적 세포 배양기에서 단층 배양 (monolayer culture)을 하기 때문에 3차원적 세포 배양 환경을 모사하기가 어려우며, 체외 증폭을 위해 지속적인 계대 배양을 시행하게 되면서 세포 배양기 탈부착에 의한 세포외기질 (Extracellular matrix; ECM)의 손실이 일어난다. ECM은 인체 내 세포의 구조를 유지시키는 성분 중 하나로서, 세포의 배열, 세포의 형태, 세포의 위치를 조절하는 역할을 함과 동시에, 세포 막에 위치한 세포 접착 단백질 (cell cadherin)과 다양한 인테그린 단백질들 (integrins)과 물리적으로 연결되어 세포 신호 전달, 분화, 증식, 사멸 과정에 관여하게 된다. 특히, ECM이 소실되었을 때, 아노이키스 (anoikis) 현상이 발생하는데 이는 세포와 물리적으로 연결된 ECM이 붕괴되었을 때 일어나는 세포 프로그램화 된 세포 사멸 현상 (programmed cell death)을 말한다. 따라서, 아노이키스 현상을 방지하기 위해서는 중간엽줄기세포를 체외 증폭 배양 시, ECM을 유지시키는 것이 매우 중요하다는 것을 암시한다.
하이드로겔은 인체 내 조직과 유사한 방법으로 세포에게 물리적, 화학적 신호를 유도하는 물질로서, 공유결합, 수소결합, 반데르발스결합, 이황화결합 등과 같은 결합력에 의해 가교되는 친수성 고분자이다. 특히, 하이드로겔에 사용되는 중합체 사슬이 화학적 성질을 나타내는 가교제나 산성도, 온도 변화와 같은 물리적 자극에 의해 3차원 고분자 네트워크 구조를 형성하며 겔화 될 수 있으며, 다량의 물을 내부에 함유할 수 있는 성질이 있어, 하이드로겔 내에서 세포를 캡슐화하여 배양하는데 큰 장점을 가지고 있다. 또한, 하이드로겔에 사용되는 중합체 사슬로서, 천연 유래 물질, 즉 아가로즈, 알지네이트, 키토산, 콜라겐, 히알루론산, 젤라틴, 및 피브린과 같은 물질은 인체 내 생 분해성이 있고 독성을 지니지 않기 때문에 세포 조직 공학 분야와 임상적으로 이식 가능한 의료용 세포 배양 담체로서 그 잠재성이 있다. 하지만, 적절한 강성이 있는 겔화를 위한 조절 능력이 적어 이를 조절할 수 있는 하이드로겔 조성 제조 방법 및 이를 통한 세포 기능 활성 조절을 할 수 있는 최적화 기술이 이들 하이드로겔을 이용한 세포 캡슐화 제조방법의 핵심이다.
현재, 하이드로겔 조성을 위해, 인체 유래 단백질인 콜라겐과 자연유래 생물학적 단백질인 실크 파이브로인이 하이드로겔 제조를 위해 사용되고 있다. 콜라겐은 혈관, 근육, 뼈, 피부 등에서 가장 많은 부분을 차지하는 ECM으로서, 다양한 세포 기능 조절에 핵심 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 화학적 가교 없이는 매우 낮은 강성 수준을 나타내어 세포 캡슐화가 어려운 한계가 있다. 실크 피브로인 단백질은 높은 기계적 특성을 나타내는 천연 중합체로서 넓은 범위의 kPa에서 강성을 나타내어 하이드로겔 조성에 강점이 있지만 인테그린(integrin)과 접합할 수 있는 RGD 펩티드 서열이 결핍되어 세포 캡슐화에 어려움이 있다. 이를 해결하기 위해 다양한 연구자들은 실크 피브로인과 콜라겐 하이드로겔을 제작하고 세포 캡슐화에 성공을 하였지만, 제작된 실크 피브로인과 콜라겐 하이드로겔의 강성 차이에 따른 중간엽줄기세포의 기능조절에 대한 연구는 실시되어 있지 않아, 중간엽줄기세포 캡슐화 및 특정 질환 타겟 및 치료를 위한 세포 기능성 최적화를 위한 연구는 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고, 심혈관 질환 치료 보조용 조성물을 제작하기 위하여 실크 피브로인과 콜라겐 하이드로겔 내에 중간엽줄기세포 캡슐화 연구를 수행한 결과, 하이드로겔의 강성화 정도 차이에 따라 중간엽줄기세포의 신생혈관 인자 분비뿐만 아니라 염증반응 억제 인자 분비를 조절할 수 있음을 확인하였다.
대한민국 등록특허 제10-2101384호
본 발명자들은 종래 줄기세포의 2차원 단층 배양에 의한 세포 기능 저하 문제를 해결하고 인간 혈관 내피 세포의 증식능과 튜브 형성능을 효율적으로 향상시킬 수 있는 인간 유래 중간엽 줄기세포가 캡슐화된 하이드로겔을 예의 연구 노력한 결과, 3차원 네트워크 구조를 갖는 하이드로겔의 강성화 정도 차이에 따라 인간 유래 중간엽 줄기세포의 신생혈관 인자 분비 뿐만 아니라 염증반응 억제 인자 분비를 조절할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 하이드로겔 및 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하이드로겔 및 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 허혈성 심혈관 질환 치료 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간을 제외한 포유 동물의 허혈성 조직에 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 심혈관 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하이드로겔 및 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 콜라겐 및 실크 피브로인이 얼기 설기 얽힌 3차원 네트워크 구조를 갖는 하이드로겔 내에 캡슐화된 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 보조제로서, 저강성의 하이드로겔을 이용하면 심혈관 치료 유도 인자 발현 조절이 월등히 향상됨에 특징이 있다.
본 발명의 제1 양태는 콜라겐 및 실크 피브로인으로 이루어진 하이드로겔; 및 상기 하이드로겔 내부에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하고 상기 하이드로겔은 상대적으로 낮은 강성 (0.3 kPa ~ 2 kPa의 탄성계수)과 빠른 물리적 감음성을 가진 것이 특징인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 용어, "하이드로겔"은 공유 결합, 수소 결합, 반데르 발스 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질이다.
본 발명의 하이드로겔은 생체 적합성 고분자를 포함하는 것일 수 있다 구체적으로 아가로스(agarose), 펙틴(pectin), 카라기난(carrageenan), 실크피브로인(silk fibroin 키토산(chitosan), 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(colagen) 및 콘드로이틴설페이트(chondroitin sulfate) 등이 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 하이드로겔은 콜라겐 및 실크피브로인을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 콜라겐은 피부, 뼈, 힘줄, 인대, 근육 및 혈관과 같은 많은 조직의 ECM에서 가장 풍부한 단백질 성분이다.　 본 발명의 하이드로겔의　콜라겐　성분은 세포 부착 부위를 제공하여 세포 부착 모티프가 결여된 실크 겔과 관련하여 세포 정착 및 확산을 촉진할 수 있다.　 본 발명의 상기 콜라겐은 α-나선 구조의 콜라겐일 수 있다.
본 발명의 용어 실크　피브로인은 좋은 생체 적합성과 높은 기계적 특성으로 인해 유망한 단백질 천연 중합체로 간주되고 있다. 본 발명의 상기 실크 피브로인은 β-시트 구조의 실크 피브로인일 수 있다.
본 발명의 용어 "강성(stiffness)"은 외부의 변형력에 저항하는 물체의 성질을 의미하는 것이다. 본 발명의 하이드로겔은 콜라겐 및 실크 피브로인 함량을 조절하여 다양한 강성을 가질 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 일 실시 예에서 저강성의 하이드로겔을 적용하였다.
상기 저강성의 하이드로겔은 상기 콜라겐은 기준 0.05 %(w/v) 내지 0.1 %(w/v) 포함하고, 상기 실크 피브로인은 기준 0.5 %(w/v) 내지 0.7 %(w/v) 포함하는 것을 의미한다. 상기 범위로 콜라겐 및 실크 피브로인을 혼합할 경우 겔화 과정이 가속되고 단백질간 분자 상호작용에 의해 균일도 높은 네트워크가 형성될 수 있다. 상기 콜라겐은 0.4 %(w/v)를 초과하면 강성 수준이 매우 낮아지는 문제가 있고, 상기 실크 피브로인을 2.8 %(w/v) 초과하면 강성이 너무 높은 문제가 있다.
본 발명의 용어, "중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells; MSC)"는 자기재생능력(self-renewal)과 줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하고 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 인간 유래 중간엽 줄기세포(hnman Mesenchymal Stem Cells; hMSC)에는 골수, 지방, 제대혈, 태반, 양수, 및 치아로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상인 것으로부터 유래된 것이다. 중간엽 줄기세포의 분리는 통상의 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명은 상기 인간 유래 중간엽 줄기세포는 상기 하이드로겔에 의해 캡슐화된 형태로 제공될 수 있다. 상기 "캡슐화"는 상기 하이드로겔이 인간 유래 중간엽 줄기세포 외막을 둘러서 감싼 3차원 구조를 의미할 수 있다.
상기 인간 유래 중간엽 줄기세포를 5x104 내지 5x106 세포수로 포함하는 것일 수 있다. 세포수가 5x104 미만일 경우 세포 확산 거동이 저하되는 문제가 있고, 세포수가 5x106 초과일 경우 세포 확산 속도가 포화되어 비효율적이다.
본 발명의 용어, "허혈성 심혈관 질환"은 심장관련 혈관에 혈액이 정상적으로 공급되지 않아 발생되는 질환을 의미한다. 예를 들어 허혈성 심근증, 심근경색증, 협심증 및 폐색성 동맥 경화증 중 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 허혈성 심혈관 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 허혈성 심근증, 심근경색증, 협심증 및 폐색성 동맥 경화증으로 이루어진 군에서 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 하이드로겔은 콜라겐 및 실크 피브로인이 얼기 설기 얽힌 3차원 네트워크 구조를 갖는 것을 확인할 수 있다. 이러한 3차원 구조는 종래 2차원 단층 배양이 3차원적 세포 배양 환경을 모사하기 어려워 계대 배양시 세포외 기질 (Extracellular matrix; ECM)의 손실을 일으키는 문제를 해결할 수 있다.
콜라겐과 실크 피브로인 간에는 두 단백질의 아미노산 잔기의 수소결합에 의한 상호침투 네트워크(interpenetrating network; IPN)가 형성될 수 있다. 상기 네트워크란 공유결합 형태가 아닌, 분자 단위에서 부분적으로 엇갈려서 생긴 둘 이상의 네트워크를 의미한다.
상기 저강성 하이드로겔 3차원 네트워크 구조 내 기공이 균일도가 높고, 상기 기공의 평균 지름(입경)은 구체적으로 0.1 내지 5 μm 인 것일 수 있다.
조직은 다른 구성 및 구조의 세포외 기질(ECM), 및 줄기 세포에 증식하고 계보 세포로 적절히 분화하도록 지시할 수 있는 강성을 갖는다. 예를 들어, 연조직(예: 뇌)은 약 0.1-1kPa의 강성을 갖고, 근육과 같은 약간 뻣뻣한 조직의 세포는 5-10 kPa를 선호하고, 콜라겐 뼈 매트릭스의 강성은 25 kPa 이상이다. 세포는 ECM 접착 단백질(라미닌, 콜라겐, 및 피브로넥틴)에서 유발된 외부 기계적 힘을 감지할 수 있는데, 감지된 외부 기계적 힘은 접착 복합체, 주로 세포막에 위치한 인테그린(integrins)을 통해 세포 골격 액틴 필라멘트에 물리적으로 연결된다. 세포 골격은 핵막에서 단백질을 통해 핵과 물리적으로 결합되기 때문에 ECM 신호는 핵 분자쪽으로 세포 골격 네트워크를 통해 물리적으로 전달되어, 생체 신호로 번역되어, 궁극적으로는 증식, 이동 및/또는 분화를 포함한 세포 반응을 상향/하향 조절할 수 있다. 이에 따라, 본 발명자들은 혈관형성 유도 인자 발현을 우수하게 증가시킬 수 있는 강성 범위를 찾고자 하기와 같이 비교 실험하였다.
본 발명의 용어 "혈관 형성 유도 인자"는 혈관 신생 촉진하거나 억제 할 수 있는 조절 단백질로 혈관신생 유도인자들이 혈관내피세포의 수용체에 결합하면 수용체가 활성화되면서 혈관신생이 시작된다. 상기 혈관 형성 유도 인자는 예를 들어 혈관 내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor; VEGF), 상피세포 성장인자 (epidermal growth factor; EGF), 섬유상세포 성장인자 (fibroblast growth factor; FGF), 콜로니 형성 유도인자 (G-colony stimulating factor; G-CSF), 대식세포 형성 유도인자 (Macrophage colony-stimulating factor; M-CSF),　암 괴사인자 (tumor necrosis factor- ; TNF- ), 간장세포 성장인자 (hepatocyte growth factor; HGF), 혈소판유래 성장인자 (platelet-derived growth factor; PDGF), 안지오제닌(angiogenin), 인터루킨(interluekin 8; IL-8) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 본 발명의 상기 혈관형성 유도 인자는 안지오제닌(angiogenin), 간장세포 성장인자 (hepatocyte growth factor; HGF), 및 대식세포 형성 유도인자 (Macrophage colony-stimulating factor; M-CSF)　로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상인 것일 수 있다.
도 4의 (a) 내지 도 4의 (d)를 참조하면 본 발명에 적용하는 하이드로겔의 강성을 다양하게 조정하여 저강성의 하이드로겔에 의해 캡슐화된 인간 유래 중간엽 줄기세포 조성물을 배양한 결과 세포 증식 및 튜브 형성 효과가 월등히 향상됨을 확인하고, 이에 따라 저강성의 하이드로겔을 적용한 결과, 도 6의 (a) 내지 (c)에서 나타낸 바와 같이, 신생혈관 유도 인자인 안지오제닌(angiogenin), 간장세포 성장인자 (hepatocyte growth factor; HGF), 및 대식세포 형성 유도인자 (Macrophage colony-stimulating factor; M-CSF)　의 발현이 증가함을 알 수 있었다. 이에 따라, 본 발명은 상기 인간 유래 중간엽 줄기세포를 저강성의 하이드로겔에 캡슐화한 형태로 제공된다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 상기 약학 조성물의 투여에 의해 허혈성 심혈관 질환을 억제하거나 또는 지연시키게 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 상기 약학 조성물의 투여에 의해 허혈성 심혈관 질환의 증세가 호전되거나 또는 이롭게 변경되게 하는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"란, 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로 또는 투여 방식 은 정맥 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 기관내 주사 및 피부 국소 도포 중 적어도 하나의 방법으로 투여되는 형태일 수 있다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물의 제형은 이에 제한되는 것은 아니며, 목적하는 해당 부위에 세포 치료제 조성물들이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따라 다양한 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 제2 양태는 콜라겐 및 실크 피브로인으로 이루어진 하이드로겔; 및 상기 하이드로겔 내부에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하고, 상기 하이드로겔은 0.3 내지 2 kPa 인 것인 허혈성 심혈관 질환 치료 보조제를 제공하는 것이다.
상기 용어 "콜라겐", "실크 피브로인", "하이드로겔", 인간 유래 중간엽 줄기세포" 및 "허혈성 심혈관 질환"은 상기에서 전술한 바와 같다.
상기 허혈성 심혈관 질환 치료 보조제는 당업계에서 일반적으로 사용되는 허혈성 심혈관 질환 치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제재를 말하며, 본 발명의 보조제를 사용함으로써 혈관내피 세포의 증식, 세포 사멸 저항성, 및 세포 이동능을 촉진하여 치료제의 효과를 향상시킬 수 있다.
상기 보조제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인간을 제외한 개체에 투여될 수 있다.
비경구 투여, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 보조제는 또한 활성 물질이 목적 조직으로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 심혈관 질환 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.
본 발명의 제3 양태는 인간을 제외한 개체의 허혈성 조직에 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 심혈관 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 용어 "본 발명의 약학 조성물", "허혈성 심혈관 질환", "예방", 및 "치료"는 상기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명의 허혈성 심혈관 질환의 치료 방법에서 상기 약학적 조성물은 허혈성 심근증, 심근경색증, 하지허혈증, 말초동맥허혈증, 협심증 및 폐색성 동맥 경화증에서 선택된 질환을 갖는 숙주에 적용될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 약학 조성물의 투여에 의해 허혈성 심혈관 질환이 예방 또는 치료되는 개체는 제한없이 포함한다.
본 발명의 제4 양태는 도 9를 참조하면 콜라겐과 실크 피브로인을 혼합하여 겔화된 제1 혼합체를 제공하는 제1 단계(S100); 상기 제1 혼합체에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 투입하여 제2 혼합체를 제공하는 제2 단계(S200); 및 상기 제2 혼합체를 배양하여 인간 유래 중간엽 줄기세포가 캡슐화된 하이드로겔 조성물을 제공하는 제3 단계(S300)를 포함하고, 상기 콜라겐은 기준 0.05 %(w/v) 내지 0.1 %(w/v) 포함하고, 상기 실크 피브로인은 기준 0.5 %(w/v) 내지 0.7 %(w/v) 포함하고, 상기 인간 유래 중간엽 줄기세포는 5x104 내지 5x106 세포수로 포함하는 것인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 용어 "겔화(gelation)"는 분자간 가교결합에 의하여 생성된 고분자가 3차원적 네트워크 구조를 취하여 용매에 녹지 않게 되는 현상을 의미하는 것으로, 공지된 방법을 제한없이 이용하여 겔화시킬 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 제1 단계 이전에 콜라겐을 중화처리하여 특정 구조의 콜라겐으로 자기조립하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 용어 "자기조립 (self-assembly)"은 자발적인 상호작용으로 분자들이 조립되는 현상을 의미한다.
상기 콜라겐은 산성용액에 용해된 상태에서 제공되어 이를 NaOH로 중화시키면 콜라겐 네트워크를 형성할 수 있어 특정 구조의 콜라겐으로 자기조립이 가능한 상태를 제공한다. 상기 특정 구조는 예를 들어, α-나선 구조의 콜라겐을 의미할 수 있다. α-나선 구조의 콜라겐은 세 가닥의 폴리펩티드 사슬이 왼쪽으로 감겨지는 좌선회 나선을 감아가면서 꼬아진 삼중나선 구조를 갖는다.
상기 제1 단계는 저강성의 하이드로겔(제1 혼합체)을 제조하는 단계를 의미할 수 있다. 구체적으로, 콜라겐과 실크 피브로인을 혼합하면 상호침투 네트워크 형성이 진행된다.
상기 제2 단계는 인간 유래 중간엽 줄기세포를 상기 하이드로겔(제1 혼합체) 내부에 캡슐화 시키는 단계를 의미할 수 있다. 상기 제1 혼합체는 3차원 네트워크 구조를 가져 균일한 기공 내에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 캡슐화할 수 있다.
상기 용어 "캡슐화"는 상기 하이드로겔이 인간 유래 중간엽 줄기세포 외막을 둘러서 감싼 3차원 구조를 형성하는 것을 의미한다. 상기 3차원 구조의 표면은 상기 하이드로겔 특성상 균일한 기공을 가진다.
상기 제2 단계에서 인간 유래 중간엽 줄기세포를 투입한 후 0℃ 내지 15℃
구체적으로 0℃내지 10℃, 보다 구체적으로 0℃ 내지 5℃에서 혼합을 수행한다.
그 후 20℃ 내지 40℃ 구체적으로 25℃ 내지 38℃에서 겔화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 종래 줄기세포의 2차원 단층 배양에 의한 3차원 세포 배양 환경 모사의 문제점을 해결할 뿐만 아니라 저강성의 하이드로겔을 도입하여 인간 혈관내피 세포의 증식, 세포 사멸 저항성, 및 세포 이동능을 효율적으로 향상시킬 수 있어 허혈성 심혈관 질환 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 α-나선 구조의 콜라겐 및 β-시트 구조의 실크 피브로인으로 이루어진 하이드로겔 및 상기 하이드로겔 내부에 인간 유래 중간엽 줄기세포(hMSC)를 캡슐화하는 과정을 간략하게 나타낸 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 α-나선 구조의 콜라겐 및 β-시트 구조의 실크 피브로인으로 이루어진 하이드로겔의 강성에 따른 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM) 사진이다.
도 3의 (a)는 상기 하이드로겔의 강성에 따른 육안 사진이다. 도 3의 (b)는 강성에 따른 하이드로겔의 압축강도(compressive strength)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3의 (c)는 강성에 따른 하이드로겔의 탄성계수(elestic modulus)를 나타낸 그래프이다.
도 4의 (a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 저강성 하이드로겔 내 캡슐화된 인간 유래 중간엽 줄기세포 (Soft+hMSCs), 중강성 하이드로겔 내 캡슐화된 hMSC (Intermediate+hMSCs), 고강성 하이드로겔 내 캡슐화된 hMSC (Hard+hMSCs)의 리브/데드 세포 분석(live/dead cell analysis) (리브 세포: 초록색; 데드 세포: 빨간색)을 배양 1일차, 3일차에 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 도 4의 (b)는 도 4의 (a)의 결과를 바탕으로 초록색을 증식하는 세포로 판단하여 세포 증식을 정량한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4의 (c)는 세포 배양 원액 배지 (control), 저강성 하이드로겔 배양 배지 (Soft), 중강성 하이드로겔 배양 배지 (Intermediate), 고강성 하이드로겔 배양 배지 (Hard), 저강성 하이드로겔 내 캡슐화된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (Soft+hMSCs), 중강성 하이드로겔 내 캡슐화된 hMSC 배양 배지 (Intermediate+hMSCs), 고강성 하이드로겔 내 캡슐화된 hMSC 배양 배지 (Hard+hMSCs)를 수득한 후, 각각의 배지를 인간 혈관내피세포(HUVEC) 배양 배지와 1:1로 섞은 후, 튜브 형성능을 12시간 뒤에 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 도 4의 (d)는 상기 도 4의 (c)의 각각의 배양 배지에 의한 인간 혈관내피세포의 튜브 형성능을 정량화한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5의 (a)는 저강성 하이드로겔만 있는 배양 배지 (Hydrogel), 2D 배양기에서 단층 배양 (monolayer culture)한 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (hMSCs), 저강성 하이드로겔 내 캡슐화된 hMSC 배양 배지 (Hydrogel+hMSCs)를 상기 도 4의 (c)와 같은 방법으로 수득한 후, 인간 혈관내피세포 (HUVEC)에 상기의 Hydrogel+hMSCs 배양 배지와 1:1로 섞은 후, 증식능을 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 도 5의 (b)는 산화성 스트레스 환경을 조성하기 위하여 과산화수소 (H2O2)를 다양한 농도 (0, 100, 200, 300, 500 μM)로 Hydrogel+hMSCs 배양 배지에 6시간 처리 후, 생존능을 확인한 결과이다. 도 5의 (c)는 상기 Hydrogel, hMSCs, Hydrogel+hMSCs 배양 배지를 인간 혈관내피세포(HUVEC)에 전처리 후, 200 μM의 과산화수소를 처리하여 세포 생존능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5의 (d)는 HUVEC의 이동능을 확인하기 위해 스크래치된 상처 치유 분석(scratched wound healing assay)을 수행하고, 상기 Hydrogel, hMSCs, Hydrogel+hMSCs 배지 처리 6시간 후 세포 이동능을 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 도 5의 (e)는 상기 도 5의 (d)에서 이동한 세포 수를 정량화한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6의 (a) 내지 도 6의 (c)는 저강성 하이드로겔만 있는 배양 배지 (Hydrogel), 2D 배양기에서 단층 배양 (monolayer culture)한 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (hMSCs), 저강성 하이드로겔 내 캡슐화된 hMSC 배양 배지 (Hydrogel+hMSCs)에 함유되어 있는 신생혈관 유도 인자 발현을 멀티플렉스 마그네틱 루미넥스 스크리닝 분석(Multiplex Magnetic Luminex Screening Assay)을 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 신생혈관 유도 인자로서 angiogenin (도 6의 (a)), HGF (도 6의 (b)), M-CSF (도 6 의(c))를 확인하였다. 상대적인 정량값은 hMSC 배양 배지 내에 함유하고 있는 각각의 인자를 1으로 기준하여 정량하였다.
도 7의 (a) 내지 도 7의 (g)는 저강성 하이드로겔만 있는 배양 배지 (Hydrogel), 2D 배양기에서 단층 배양 (monolayer culture)한 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (hMSCs), 저강성 하이드로겔 내 캡슐화된 hMSCs 배양 배지 (Hydrogel+hMSCs)에 함유되어 있는 염증반응 유도 인자 발현을 멀티플렉스 마그네틱 루미넥스 스크리닝 분석(Multiplex Magnetic Luminex Screening Assay)을 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 염증반응 유도 인자로서 CCL3 (도 7의 (a)), CXCL1 (도 7의 (b)), CXCL10 (도 7의 (c)), G-CSF (도 7의 (d)), IL-2 (도 7의 (e)), IL-4 (도 7의 (f)), IL-8 (도 7의 (g))를 각각 확인하였다. 상대적인 정량값은 hMSC 배양 배지 내에 함유하고 있는 각각의 인자를 1로 기준하여 정량하였다.
도 8은 PBS, 저강성 하이드로겔 (Hydrogel), 2D 배양기에서 단층 배양 (monolayer culture)한 인간 유래 중간엽 줄기세포 (hMSCs), 저강성 하이드로겔 내 캡슐화된 hMSC 구조물 (Hydrogel+hMSCs)을 허혈성 조직 내에 이식 3일 후에 적출된 상기 허혈성 조직을 증식 표지자인 PCNA (빨간색), 세포 사멸 표지자인 cleaved caspase-3 (빨간색), 대식세포 표지자인 F4/80 (초록색)으로 형광염색 하여 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 본 발명의 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 유래 중간엽 줄기세포가 캡슐화된 하이드로겔의 제조
콜라겐 및 실크 피브린의 전처리
콜라겐을 0.02 N 아세트산으로 농도를 조절하여 pH를 색의 변화로 확인하기 위한 용도로 DMEM 20X를 부가적으로 넣어주었다. 그 용액에 pH를 중성으로 맞추고, α-나선 구조로 자기조립을 수행하기 위해 37℃에서 1 N NaOH 첨가하였다. 그 결과, 콜라겐은 α-나선 구조로 자기조립되어 α-나선 구조의 콜라겐 용액을 완성하였다. 실크 피브로인의 농도는 상기 α-나선 구조의 콜라겐 용액과 섞었을 때 최종적으로 희석되게 하기 위하여 원하는 값의 농도의 2배가 되도록 증류수로 조절하였다. 상기 실크 피브로인을 37℃, 20% 진폭에서 10초 이상 초음파 처리하였다. 그 결과, β-시트 구조로 자기조립되어 β-시트 구조의 실크 피브로인 용액을 수득하였다.
강성에 따른 하이드로겔의 제조
α-나선 구조의 콜라겐 β-시트 구조의 실크 피브로인
저강성(soft) 1 mg/0.5ml 1.4 %(w/v)/0.5 ml
중강성(intermediate) 2 mg/0.5ml 2.8 %(w/v)/0.5ml
고강성(hard) 3.5 mg/0.5ml 3.5 %(w/v)/0.5ml
상기 표 1에 기재된 α-나선 구조의 콜라겐 β-시트 구조의 실크 피브로인의 농도에 따라 강성이 조절된 하이드로겔을 제조하였다.
상기 표 1의 농도 계산의 기준인 0.5 ml의 α-나선 구조의 콜라겐 용액은 농도 및 pH가 중성으로 맞춰진 콜라겐 용액의 부피를 의미한다. 또한, 0.5 ml의 실크 피브로인 용액은 1.4 mg 실크 피브로인/1 ml 증류수에 녹아져 있는 용액을 의미한다. 상기 β-시트 구조의 실크 피브로인 용액과 α-나선 구조의 콜라겐 용액을 부피비 1:1 로 혼합하여 겔화를 유도하였다. 강성에 따라 37℃에서 최소 15분부터 30분 안에 겔화가 형성되었다. 상기 제조된 각각의 하이드로겔에 인간 유래 중간엽 줄기세포 5Х105 세포수를 4℃에서 혼합 후, 37℃에서 캡슐화를 유도하였다.
실험예 1. 강성에 따른 하이드로겔 물리적 특성 평가
하이드로겔의 강성에 따른 인간 유래 중간엽 줄기세포의 세포 생물활성 변화를 확인하기 위하여 α-나선 구조를 갖는 콜라겐과 β-시트 구조를 갖는 실크 피브로인의 양에 따른 저강성 (Soft), 중강성 (Intermediate), 고강성 (Hard) 하이드로 겔을 제작하고 이의 각각의 특성을 확인하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이 강성에 따른 하이드로겔의 SEM 이미지에서 저강성 하이드로겔 기공의 균일도가 가장 높음을 확인하였다.
도 3의 (a)를 통해 하이드로겔 강성에 따라 육안으로도 차이를 확인할 수 있었다. 또한, 도 3의 (b) 및 도 3의 (c)를 통해 저강성 (Soft), 중강성 (Intermediate), 고강성 (Hard)의 압축강도(compressive stress)와 탄성계수(elastic modulus)가 강성이 높아질수록 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 2: 다양한 강성의 하이드로겔에 의한 인간 유래 중간엽 줄기세포의 생존능 및 증식능 평가
도 4의 (a)에 나타낸 바와 같이 저강성 (Soft), 중강성 (Intermediate), 고강성 (Hard) 하이드로겔 내 인간 유래 중간엽 줄기세포를 캡슐화 한 뒤, 리브/데드 분석(live/dead assay)을 통해 세포 생존능 및 증식능을 확인하였다. 도 4의 (a)에서 리브 세포는 초록색, 데드 세포는 빨간색을 의미하는 것이다.
도 4의 (b)에 나타낸 바와 같이, 각각의 하이드로겔 내 세포 캡슐화 1일, 3일 후, live/dead assay 결과 세포 캡슐화에 의한 세포 사멸은 확인되지 않았지만 각각의 그룹에 따라 리브 세포(live cell)의 수를 정량한 결과, 저강성 (Soft) 하이드로겔 내 인간 유래 중간엽 줄기세포의 세포 양이 타 그룹에 비해 1일, 3일차에서 유의적으로 증가함을 확인하였다.
실험예 3: 다양한 강성의 하이드로겔에 의한 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 의한 인간 혈관내피세포(HUVEC)의 튜브 형성능 평가
도 4의 (c)에 나타낸 바와 같이, 다양한 강성의 하이드로겔에 의해 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포가 혈관신생능에 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 먼저, 세포 배양 원액 배지 (Control), 저강성 하이드로겔만 있는 상황에서의 배양 배지 (Soft), 중강성 하이드로겔만 있는 상황에서의 배양 배지 (Intermediate), 고강성 하이드로겔만 있는 상황에서의 배양 배지 (Hard), 저강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (Soft+hMSCs), 중강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (Intermediate+hMSCs), 고강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (Hard+hMSCs)를 수득하였다. 수득 방법은 하이드로겔 내 캡슐화 인간 유래 중간엽 줄기세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 3일간 배양 후, 배양액을 전체 교체 후, 1일간 재배양 한 배양 배지를 사용하였다. 그 후, 각각의 배양 배지가 인간 혈관내피 세포의 혈관 형성능 향상에 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여, 각각의 배지를 인간 혈관내피세포 배양 배지와 1:1로 섞은 후, 매트리젤(Martrigel) 위에 인간 혈관내피세포를 투여한 다음 12시간 뒤에 튜브 형성능을 확인하였다. 그 결과, Soft+hMSCs의 배양 배지에서 배양된 인간 혈관내피세포의 튜브 형성능이 타 그룹과 비교하여 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 4의 (c)). 이와 같은 결과는 저강성 하이드로겔의 강성이 인간 유래 중간엽 줄기세포의 혈관형성능 유도에 가장 적합한 조건임을 확인하는 것이다. 이후 실험을 저강성 하이드로겔 내 인간 유래 중간엽 줄기세포를 캡슐화 하여 실험을 진행하였다.
도 4의 (d)는 상기 도 4의 (c)의 각각의 배양 배지에 의한 인간 혈관내피세포의 튜브 형성능을 정량화한 결과를 나타낸 그래프로서 저강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (Soft+hMSCs)가 현저한 튜브 형성능을 가짐을 확인하였다.
실험예 4: 저강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 의한 인간 혈관내피세포의 증식능, 산화성 스트레스 저항능, 세포 이동능 평가
허혈성 조직 내 신생혈관 형성 및 재생을 위해서는 혈관내피세포의 증식, 산화성 스트레스 환경에의 저항능 및 허혈성 조직으로의 혈관내피세포의 이동능이 가장 중요하다. 따라서, 이를 확인하기 위하여, 저강성 하이드로겔만 있는 상황에서의 배양 배지 (Hydrogel), 2D 배양기에서 단층 배양 (monolayer culture)한 인간 유래 중간엽 줄기세포 유래 배양 배지 (hMSCs), 저강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (Hydrogel+hMSCs)를 상기 실험예 3과 같은 방법으로 수득 후, 첫번째로 인간 혈관내피세포의 증식능을 확인하였다. 인간 혈관내피세포 (HUVEC)에 인간 혈관내피세포 배양 배지와 상기 배양 배지를 1:1로 섞은 후, 증식능을 확인하였다.
도 5의 (a)에 나타낸 바와 같이, Hydrogel+hMSCs 배양 배지를 처리한 그룹에서 세포 증식능이 유의적으로 증가함을 확인하였다.
도 5의 (b)는 산화성 스트레스 환경을 조성하기 위하여 과산화수소 (H2O2)를 다양한 농도 (0, 100, 200, 300, 500 μM)로 Hydrogel+hMSCs 배양 배지에 6시간 처리 후, 생존능을 확인한 결과이다. 이를 통해,
도 5의 (c)에 나타낸 바와 같이, 200 μM의 과산화수소가 처리된 산화적 스트레스 환경에서도 Hydrogel+hMSCs 배양 배지를 처리한 그룹에서 세포 생존능이 유의적으로 증가함을 확인하였다.
도 5의 (d)에 나타낸 바와 같이, 스크래치된 상처 치유 분석(scratched wound healing assay)를 통한 세포 이동능을 확인한 결과에서도 Hydrogel+hMSCs 배양 배지를 처리한 그룹에서 인간 혈관내피세포 이동능이 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 이들 결과를 통해, 3차원 세포 배양 환경인 저강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물이 인간 혈관내피세포의 신생혈관 형성 및 재생능 향상에 효능이 있음을 나타낸다.
실험예 5: 저강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 내 혈관신생 관련 분비인자 및 염증관련 분비 인자 평가
도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 저강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 내 어떠한 혈관신생 관련 분비인자와 염증관련 분비 인자가 존재하는 지를 확인하기 위하여, 다양한 인자 분비 정도를 멀티플렉스 마그네틱 루미넥스 스크리닝 분석(iplex Magnetic Luminex Screening Assay)을 통해 확인하였다. 그 결과, 2D 배양기에서 단층 배양 (monolayer culture)한 인간 유래 중간엽 줄기세포 유래 배양 배지 (hMSCs)와 비교하여 저강성 하이드로겔 내 캡슐화 된 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지 (Hydrogel+hMSCs)에 함유되어 있는 신생혈관 유도 인자인 angiogenin(도 6의 (a)), HGF(도 6의 (b)), M-CSF(도 6의 (c)) 의 발현이 유의적으로 증가하였으며, 염증반응 유도 인자인 CCL3 (도 7의 (a)), CXCL1 (도 7의 (b)), CXCL10 (도 7의 (c)), G-CSF (도 7의 (d)), IL-2 (도 7의 (e)), IL-4 (도 7의 (f)), IL-8 (도 7의 (g))의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다. 이러한 결과는, 저강성 하이드로겔 내 3차원 배양을 통해 인간 유래 중간엽 줄기세포가 혈관 신생 유도인자의 발현을 높이고, 면역유도 인자의 발현을 억제함을 나타내는 것이다.

Claims (13)

  1. 콜라겐 및 실크 피브로인으로 이루어진 하이드로겔; 및
    상기 하이드로겔 내부에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하고,
    상기 하이드로겔은 0.3 kPa 내지 2 kPa의 탄성계수인 것이 특징인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 콜라겐은 0.05 %(w/v) 내지 0.1 %(w/v)의 농도비로 포함되고,
    상기 실크 피브로인은 0.5 %(w/v) 내지 0.7 %(w/v)의 농도비로 포함되는 것인,
    허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 허혈성 심혈관 질환은 허혈성 심근증, 심근경색증, 하지허혈증, 말초동맥허혈증, 협심증 및 폐색성 동맥 경화증으로 이루어진 군에서 적어도 하나를 포함하는 것인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인간 유래 중간엽 줄기세포를 5x104 내지 5x106 세포수로 포함하는 것인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 인간 유래 중간엽 줄기세포는 골수, 지방, 제대혈, 태반, 양수, 및 치아로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상으로부터 유래된 것인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 콜라겐 및 실크 피브로인이 얼기 설기 얽힌 3차원 네트워크 구조를 가지고,
    상기 네트워크 내 기공의 평균 지름(입경)이 0.1 μm 내지 5 μm 인 것인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 혈관형성 유도 인자 발현을 조절하고,
    상기 혈관형성 유도 인자는 안지오제닌(angiogenin), HGF(hepatocyte growth factor), 및 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상인 것인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 기관내 주사 및 피부 국소 도포 중 적어도 하나의 방법으로 투여되는 형태인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 콜라겐 및 실크 피브로인으로 이루어진 하이드로겔; 및 상기 하이드로겔 내부에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하고,
    상기 하이드로겔은 0.3 kPa 내지 2 kPa의 탄성계수인 것이 특징인, 허혈성 심혈관 질환 치료 보조제.
  10. 인간을 제외한 포유동물의 허혈성 조직에 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 심혈관 질환의 치료 방법.
  11. 콜라겐과 실크 피브로인을 혼합하여 겔화된 제1 혼합체를 제공하는 제1 단계;
    상기 제1 혼합체에 인간 유래 중간엽 줄기세포를 투입하여 제2 혼합체를 제공하는 제2 단계; 및
    상기 제2 혼합체를 배양하여 인간 유래 중간엽 줄기세포가 캡슐화된 하이드로겔 조성물을 제공하는 제3 단계를 포함하고,
    상기 콜라겐은 0.05 %(w/v) 내지 0.1 %(w/v)의 농도비로 포함되고,
    상기 실크 피브로인은 0.5 %(w/v) 내지 0.7 %(w/v)의 농도비로 포함되는 것인,
    상기 인간 유래 중간엽 줄기세포는 5x104 내지 5x106 세포수로 포함하는 것인, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제1단계 이전에 콜라겐을 염기로 중화처리하는 단계를 추가로 포함하는, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 제1단계 이전에 실크 피브로인을 20% 진폭에서 10초 내지 60초 초음파 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법.


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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108619573A (zh) * 2018-04-17 2018-10-09 广东医科大学 一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法
KR20190048133A (ko) * 2017-10-30 2019-05-09 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔 및 이의 제조방법
KR102101384B1 (ko) 2017-11-02 2020-04-16 연세대학교 산학협력단 허혈성 심혈관 질환의 치료용 또는 예방용 약학 조성물

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