CN115054678A - 一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法及其应用，复合水凝胶在0‑10℃的温度下是流动性的可注射的液态混合物并能在生理温度下固化，制备步骤如下：S1，制备胶原蛋白溶液，并在低温条件下保存备用；S2，培养和扩增间充质干细胞，并收集干细胞培养上清在低温条件下保存备用；S3，通过多次离心分离法提取外泌体制成外泌体溶液；S4，胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备，并置于低温条件下保存，同时还公开了该制剂的应用。该发明的制剂可解决直接使用外泌体留存时间短、留存率低的问题，实现外泌体长效缓释，能有效促进受损子宫内膜的再生和修复，解决因内膜损伤导致的不孕不育、反复流产的问题。

Description

一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂 的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及用于子宫内膜的治疗药剂，尤其是一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法及其应用。
背景技术
子宫内膜损伤是妇产科非常常见的组织病变，一般是由于手术损伤或炎症引起，如刮宫术、流产术、子宫内膜炎症等。子宫内膜损伤常见于宫腔粘连、薄型子宫等妇产科疾病。子宫内膜损伤会导致继发性闭经、不孕、习惯性流产等。据文献报道，人工流产术、刮宫术导致的宫腔粘连的发生率高达25％-30％。且术后再粘连复发的概率非常高。目前国内外宫腔粘连的标准疗法是宫腔镜下粘连分离术联合术后人工周期促进内膜再生。这种治疗方法可以有效恢复宫腔形态，缓解临床症状，但对重度粘连的患者效果有限，而且在术后还会由于子宫内膜再生障碍而导致粘连复发。因此，目前对于重度宫腔粘连和子宫内膜较薄导致的不孕和反复流产治疗是一个非常大的挑战。解决上述问题的关键在于有效防止粘连的同时，还要同时促进受损内膜的再生和修复。
近年来，随着细胞治疗技术的发展，间充质干细胞已被广泛的研究用于子宫内膜的再生和修复，但是多项临床前瞻性研究发现直接移植干细胞存在远期临床效果欠佳的问题，主要考虑是其移植后的留存率低、存活率低导致。另外，直接移植干细胞可能存在成瘤性、致瘤性、微血管栓塞等问题，极大限制其临床的快速推广应用。但是，子宫内膜再生是一个缓慢长期的过程，直接宫腔内注射外泌体在宫腔内的留存时间和留存效率极低，只有数分钟到数小时之久，难以达到有效的促修复效果。因此需要采取一定方式，实现外泌体在宫腔内的持续有效释放，延长其生物活性。
发明内容
针对现有的不足，本发明提供一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，该复合水凝胶在0-10℃的温度下是流动性的可注射的液态混合物并能在生理温度下固化的水凝胶，该液态混合物在使用前24h内制备，制备步骤如下：
S1，制备胶原蛋白溶液，并置于0-10℃条件下保存备用；
S2，培养和扩增间充质干细胞，在培养和扩增完成后收集培养基的上清溶液，并置于0-10℃条件下保存备用；
S3，在0-10℃温度下，将收集的上清溶液通过多次离心分离法提取外泌体制成具有一定浓度的外泌体溶液，并于-80℃的温度下保存备用，且所述外泌体溶液中的外泌体是具有一定粒径并能够进行标志物表达的；
S4，将胶原蛋白溶液与外泌体溶液以体积比1-10:1的比例混合制得胶原外泌体复合水凝胶制剂，并置于0-10℃条件下保存。
作为优选，所述胶原蛋白溶液通过如下步骤制得:
S1a,采集动物身体含有胶原蛋白的组织；
S1b，对采集的动物身体组织依次进行脱脂、酶解、盐析、透析后在酸性条件下溶解，并将其用纯水稀释成重量百分比浓度为1％-4％的溶液；
S1c，将S1b制得的溶液进行pH值的调节，调节其pH值为6.5-7.8。
作为优选，所述间充质干细胞的培养扩增是选用P3-P8代次的间充质干细胞，其培养和扩增步骤如下：
S2a，将选择的间充质干细胞以1-2*106的密度接种于细胞培养瓶中，然后向其中加入DMEM/F12完全培养基，在37℃的温度下，于5％CO2培养箱中进行培养，并周期性进行换液，直到细胞生长融合度达到70-80％时，换为无血清培养基继续培养48h；
S2b，收集培养基的上清溶液并在0-10℃的温度条件下保存备用。
作为优选，所述步骤S3的具体步骤如下：
S3a，将收集的培养基的上清溶液在0-10℃的温度条件下进行初次离心，离心条件300g，离心时间10min，收集初次离心的上清液；
S3b，将初次离心的上清液进行第二次离心，离心条件2000g，离心时间 10min，收集第二次离心的上清液；
S3c，将第二次离心的上清液进行第三次离心，离心条件10000g，离心时间30min，弃掉第三次离心的上清液，收集第三次离心的底部沉淀；
S3d，将第三次离心的底部沉淀利用PBS稀释后进行第四次离心，离心条件100000g，离心时间70min，弃掉第四次离心的上清液，收集第四次离心的底部沉淀；
S3e，将第四次离心的底部沉淀用PBS进行重悬形成重悬液，对重悬液进行过滤并收集滤液形成外泌体溶液，在-80℃的温度下保存。
作为优选，还包括步骤：
S3f，对分离出的外泌体进行鉴定，通过western blot和流式细胞术进行表面标志物CD63、CD81的鉴定；通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析检测外泌体在干态和湿态下的尺寸，其粒径应在30-150nm；
S3g，对分离出的外泌体进行定量表征，通过BCA法测定其浓度是否达到规定的浓度。
作为优选，所述步骤S4中将胶原蛋白溶液与外泌体溶液混合前还有对外泌体溶液进行稀释的步骤，所述外泌体溶液稀释至浓度为5-20ug/ml。
作为优选，所述外泌体溶液在4℃温度下离心并在-80℃的温度下保存，所述胶原蛋白溶液、外泌体复合水凝胶制剂均在4℃温度下保存。
作为优选，所述所述外泌体是通过超速离心法从间充质干细胞培养基的上清溶液中提取。
作为优选，所述间充质干细胞是脐带、胎盘、骨髓、脂肪、子宫内膜、羊膜干细胞中的一种或几种。
一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的应用,将前述任意一项所制得的外泌体复合水凝胶制剂在制备后24小时内注射进子宫。
本发明的有益效果在于：该发明将胶原蛋白、外泌体构建成一种温度敏感响应性的凝胶系统，实现应用时的可注射性及注射后的固化，提高了临床操作的方便性，缩短手术时间，同时可固化的特点提高凝胶在内膜损伤部位的留存，起到物理隔离的同时，可实现包载外泌体的长效释放，为子宫内膜修复提供足够的时间，胶原蛋白复合水凝胶制剂植入后可以留存在子宫内膜损伤部位，促进修复的同时避免粘连的再发生，同时无需二次手术取出，克服传统治疗如宫内防止节育器、球囊导管等需多次手术的缺点；胶原蛋白复合水凝胶中富含丰富的支架和干细胞分泌因子，为内膜再生创造了良好的再生微环境，加快内膜再生和微血管的再生，防止子宫内膜的纤维化，可以有效改善和延长宫腔直接注射外泌体的宫腔停留时间，实现外泌体持续释放，延长外泌体的生物活性；同时胶原蛋白高的生物活性为内膜再生提供空间架构，复合的胶原外泌体可以有效促进新血管形成和子宫内膜再生，其中，胶原蛋白经过多重工艺制得，保留了胶原蛋白完整的三螺旋结构和生物活性，同时高度去端肽的特性，使其免疫原性非常低，提高了使用的安全性和有效性，可以为内膜再生提供支架，招募内源性和外源性干细胞的迁移和增殖，促进损伤内膜的修复，外泌体可以克服直接注射外泌体留存时间短、留存率低的问题，实现外泌体的长效缓释功能，延长其生物活性，实现功能最大化，可有效传导内膜再生信号，促进内膜的再生，减少或预防宫腔粘连，恢复子宫内膜着床能力，提高妊娠率。
附图说明
图1是本发明实施例复合水凝胶中外泌体随时间的释放图；
图2是本发明实施例复合水凝胶与不加凝胶对细胞毒性的对比图；
图3是本发明实施例复合水凝胶对大鼠子宫内膜修复的对比图；
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明中，一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，该复合水凝胶在0-10℃的温度下是流动性的可注射的液态混合物并能在生理温度下固化的水凝胶，该液态混合物在使用前24h内制备，制备步骤如下：
S1，制备胶原蛋白溶液，并置于0-10℃条件下保存备用；在此步骤中，首先采集动物身体含有胶原蛋白的组织，可以是猪皮、牛肌腱等，将采集的动物身体组织经过脱脂、酶解、盐析、透析步骤后制得初步的胶原蛋白溶液，然后将该溶液在酸性条件下溶解，随后用纯水将其稀释到1％-4％的浓度，最后用适宜浓度的碱液调节其pH为6.5-7.8，置于4℃条件下保存备用，脱脂可以采用碱溶液或酸溶液浸泡实现；胶原蛋白为细胞增殖、迁移、分化和组织再生提供支架，将其制成凝胶结构就实现载体缓释功能。
S2，培养和扩增间充质干细胞，在培养和扩增完成后收集培养基的上清溶液，并置于0-10℃条件下保存备用；采用间充质干细胞为P3-P8代次中任意一代次的间充质干细胞，可以是脐带、胎盘、脂肪、骨髓、子宫内膜干细胞的一种或几种，将选择的间充质干细胞以1-2*106的密度接种于细胞培养瓶中，然后向其中加入15-20ml DMEM/F12完全培养基，在37℃的温度下，于5％CO2培养箱中进行培养，每2-3天换液一次，直到细胞生长融合度达到70-80％时，换为无血清培养基继续培养48h；之后收集培养基的上清溶液并在0-10℃的温度条件下保存备用，用于后续的外泌体提取。
S3，首先将收集的培养基的上清溶液在4℃的温度条件下进行初次离心，离心条件300g，离心时间10min，收集初次离心的上清液；然后，将初次离心的上清液进行第二次离心，离心条件2000g，离心时间10min，收集第二次离心的上清液；接着，将第二次离心的上清液进行第三次离心，离心条件10000g，离心时间30min，弃掉第三次离心的上清液，收集第三次离心的底部沉淀；再接着，将第三次离心的底部沉淀利用PBS稀释后进行第四次离心，离心条件100000g，离心时间70min，弃掉第四次离心的上清液，收集第四次离心的底部沉淀；最后，将第四次离心的底部沉淀用PBS进行重悬形成重悬液，对重悬液进行过滤并收集滤液形成外泌体溶液，在-20℃至-80℃的温度下保存，优选保存在-80℃的温度下；此时制得的外泌体溶液中的外泌体是具有一定粒径并能够进行标志物表达的。干细胞外泌体是干细胞分泌的一种直径在30-150nm 的盘状囊泡，其中富含蛋白质、RNA、脂质等活性成分，在细胞间信号传导方面发挥重要作用，有多项研究表明，干细胞主要是通过旁分泌作用发挥其组织修复和抑制纤维化的作用，而外泌体是旁分泌中的高度活性成分，外泌体作为子宫内膜再生的介质就可以通过向近端或远端细胞传递蛋白质、mRNA、miRNA 和其他分子，有效传导细胞诱导的再生信号，同时外泌体可以规避直接细胞移植可能引起的免疫排斥反应。在制得外泌体溶液后，接下来就要对其进行鉴定，通过western blot和流式细胞术进行表面标志物CD63、CD81的鉴定，表明其有相关标志物的表达能力时符合使用要求；通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析检测外泌体在干态和湿态下的尺寸，如粒径大小，颗粒数等，在其粒径在30-150nm之间时符合使用要求，同时对分离出的外泌体进行定量表征，通过 BCA法测定其浓度是否达到规定的浓度，看是否达到与胶原蛋白溶液混合形成温敏型复合水凝胶的条件。
S4，将胶原蛋白溶液与外泌体溶液以体积比1-10:1的比例混合制得胶原外泌体复合水凝胶制剂，并置于0-10℃条件下保存，在将胶原蛋白溶液和外泌体溶液混合前，需要对外泌体溶液进行稀释，将其稀释至浓度为5-20ug/ml，在将外泌体溶液稀释完成后，如稀释至10ug/ml，将两者按相应的体积比混合均匀制成外泌体复合水凝胶，然后在4℃的温度下保存，这样制得的复合水凝胶在低温下(0-10℃)呈液态，生理温度下可快速固化，负载的外泌体就可以实现长效缓释功能，可有效促进子宫内膜的修复，促进内膜再生、微血管再生，用于治疗宫腔粘连，薄型子宫等子宫内膜损伤类疾病，改善不孕不育、反复流产等。
一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的应用,将前述所制得的外泌体复合水凝胶制剂在制备后24小时内注射进子宫，注射后可快速固化，提高临床操作的可行性，缩短手术时间。
实施例的具体制备步骤如下：
(1)将猪皮肤组织进行清洗，然后经过脱脂、酶解、盐析、透析等步骤获得胶原蛋白溶液，最终将其溶解在酸溶液中，用纯水将其稀释到1％-4％的浓度，最后用适宜浓度的碱液调节其pH为6.5-7.8。
(2)将脐带间充质干细胞复苏后接种于75cm2的培养瓶中，用DMEM/F12全培养基进行培养，达到70-80％的融合度后用无血清培养基继续培养48h,然后收集上清液；
(3)将上述培养基上清在4℃条件下通过超速离心法制备外泌体，具体步骤如下：在4℃条件下以300g离心10分钟，收取上清液；然后以2000g二次离心10分钟，收取上清液，随后以10000g,离心30分钟，收取上清液；然后在以100000g离心70分钟，小心弃掉上清液，收集底部沉淀；将底部沉淀用PBS 稀释后，再次100000g离心70min，弃上清液，并用适量PBS重悬；然后用 0.22um滤头过滤，制得的外泌体于-80℃冻存备用；
(4)外泌体的鉴定：通过BCA法测定上述外泌体的浓度，并通过western blot 和流式细胞术进行表面标志物CD63、CD81的鉴定，结果表明制备的外泌体有相关标志物的表达，随后通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析检测外泌体在干态和湿态下的粒径大小，颗粒数等，结果表明其粒径均在30-150nm之间，符合外泌体的尺寸要求；根据浓度测定结果将外泌体稀释至10ug/ml进行使用；
(5)用1ml注射器小心吸取上述(1)中制备的胶原蛋白溶液，浓度3％，体积0.4ml,同时用另一只1ml注射器吸取(3)中制备的外泌体溶液，胶原蛋白溶液和外泌体溶液制成几种具有同不同体积比的混合溶液，然后通过三通装置将两者反复推注数次直至混合均匀后转移到1ml注射器中，体积混合比例为1： 1，2：1，3：1，4：1，然后置于4℃的温度下备用；
(6)胶原外泌体温敏成胶性探究：①将上述溶液混合均匀后取1ml加入到西林瓶中，然后置于37℃水浴锅加热，不定时观察成胶情况，每种体积比的混合溶液分别进行相应的操作；②每隔1分钟倒置西林瓶，观察溶液流动和成胶情况；约3min后即可观察到以2：1，3：1；4：1比例混合的成胶性良好，1： 1混合的部分成胶，稍有流动；
(7)胶原外泌体释放行为探究：①称取上述胶原外泌体复合水凝胶0.5ml,然后置于37℃成胶固化，成胶后，向其中加入5ml PBS,并在37℃150rpm条件下搅拌孵育，每隔一定时间(1，3，5，7，9)取出0.5ml溶液，测量其中外泌体的释放量，结果见图1，胶原外泌体复合水凝胶呈现累计缓释行为，证明胶原凝胶可以极大程度提高外泌体的留存时间，实现缓释功能；
(8)胶原外泌体复合水凝胶细胞毒性实验研究：将脐带间充质干细胞以5000/ 孔密度接种于96孔板中，待其融合度达到90％以上时，将胶原外泌体复合水凝胶加入其中进行共培养24h,以不加凝胶的作为对照，评估胶原外泌体对于干细胞的细胞毒性，实验结果见图2，结果表明，水凝胶的加入未对细胞活性产生明显影响，和对照组相比无统计学差异。
(9)胶原外泌体复合水凝胶对人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移行为研究：
①通过transwell(孔径8um)共培养系统探究复合水凝胶对人脐静脉内皮细胞增殖行为影响。下腔加入HUVECs4*104,上腔加入复合水凝胶200ul或外泌体进行增殖实验探究。通过CCK8染色确定不同共培养体系中HUVECS细胞增殖行为影响。实验结果显示胶原外泌体复合水凝胶可以有效促进HUVEC的增殖。
②通过免疫荧光染色评价HUVEC的活性增殖。细胞先用4％PFA固定，然后用0.1％Triton X-100渗透，随后用Ki67染色，并用荧光二抗进行检测，用 DAPI进行核复染，随后通过免疫荧光观察KI67阳性细胞数量。实验结果证明胶原外泌体复合水凝胶组表现出最多KI67阳性细胞数。
③将HUVECs 4*104添加到transwell的上室，然后将复合水凝胶加入到下室，在37℃条件下培养20h,之后将上室膜上的细胞固定，用0.5％结晶紫染色，然后通过显微镜定量。分析胶原复合水凝胶对于HUVEC的迁移行为影响，实验结果显示胶原外泌体复合水凝胶可以促进细胞的迁移行为。
(10)构建大鼠宫腔粘连子宫损伤模型，然后向损伤子宫内注入200ul胶原外泌体复合水凝胶，观察大鼠子宫内膜修复情况和怀孕情况，结果显示胶原外泌体组表现出了更好的子宫内膜修复和防粘连效果，如图3中所示。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:该复合水凝胶在0-10℃的温度下是流动性的可注射的液态混合物并能在生理温度下固化的水凝胶，该液态混合物在使用前24h内制备，制备步骤如下：
S1，制备胶原蛋白溶液，并置于0-10℃条件下保存备用；
S2，培养和扩增间充质干细胞，在培养和扩增完成后收集培养基的上清溶液，并置于0-10℃条件下保存备用；
S3，在0-10℃温度下，将收集的上清溶液通过多次离心分离法提取外泌体制成具有一定浓度的外泌体溶液，并于-80℃的温度下保存备用，且所述外泌体溶液中的外泌体是具有一定粒径并能够进行标志物表达的；
S4，将胶原蛋白溶液与外泌体溶液以体积比1-10:1的比例混合制得胶原外泌体复合水凝胶制剂，并置于0-10℃条件下保存。
2.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述胶原蛋白溶液通过如下步骤制得:
S1a,采集动物身体含有胶原蛋白的组织；
S1b，对采集的动物身体组织依次进行脱脂、酶解、盐析、透析后在酸性条件下溶解，并将其用纯水稀释成重量百分比浓度为1％-4％的溶液；
S1c，将S1b制得的溶液进行pH值的调节，调节其pH值为6.5-7.8。
3.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述间充质干细胞的培养扩增是选用P3-P8代次的间充质干细胞，其培养和扩增步骤如下：
S2a，将选择的间充质干细胞以1-2*106的密度接种于细胞培养瓶中，然后向其中加入DMEM/F12完全培养基，在37℃的温度下，于5％CO2培养箱中进行培养，并周期性进行换液，直到细胞生长融合度达到70-80％时，换为无血清培养基继续培养48h；
S2b，收集培养基的上清溶液并在0-10℃的温度条件下保存备用。
4.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤S3的具体步骤如下：
S3a，将收集的培养基的上清溶液在0-10℃的温度条件下进行初次离心，离心条件300g，离心时间10min，收集初次离心的上清液；
S3b，将初次离心的上清液进行第二次离心，离心条件2000g，离心时间10min，收集第二次离心的上清液；
S3c，将第二次离心的上清液进行第三次离心，离心条件10000g，离心时间30min，弃掉第三次离心的上清液，收集第三次离心的底部沉淀；
S3d，将第三次离心的底部沉淀利用PBS稀释后进行第四次离心，离心条件100000g，离心时间70min，弃掉第四次离心的上清液，收集第四次离心的底部沉淀；
S3e，将第四次离心的底部沉淀用PBS进行重悬形成重悬液，对重悬液进行过滤并收集滤液形成外泌体溶液，在-80℃的温度下保存。
5.根据权利要求4所述用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:还包括步骤：
S3f，对分离出的外泌体进行鉴定，通过western blot和流式细胞术进行表面标志物CD63、CD81的鉴定；通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析检测外泌体在干态和湿态下的尺寸，其粒径应在30-150nm；
S3g，对分离出的外泌体进行定量表征，通过BCA法测定其浓度是否达到规定的浓度。
6.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤S4中将胶原蛋白溶液与外泌体溶液混合前还有对外泌体溶液进行稀释的步骤，所述外泌体溶液稀释至浓度为5-20ug/ml。
7.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述外泌体溶液在4℃温度下离心并在-80℃的温度下保存，所述胶原蛋白溶液、外泌体复合水凝胶制剂均在4℃温度下保存。
8.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法，其特征在于:所述外泌体是通过超速离心法从间充质干细胞培养基的上清溶液中提取。
9.根据权利要求1所述用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的制备方法,其特征在于:所述间充质干细胞是脐带、胎盘、骨髓、脂肪、子宫内膜、羊膜干细胞中的一种或几种。
10.一种用于子宫内膜修复的温敏型胶原外泌体复合水凝胶制剂的应用,其特征在于:将权利要求1至9任意一项所制得的外泌体复合水凝胶制剂在制备后24小时内注射进子宫。
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