CN114557956A - 一种负载脐带间充质干细胞的温敏型水凝胶及其制备方法 - Google Patents
一种负载脐带间充质干细胞的温敏型水凝胶及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种负载间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法，其具体过程如下：分离并迭代培养脐带间充质干细胞以获取合格的细胞库细胞，负载所得细胞库细胞于原位温敏生物医用水凝胶之上，于所述温敏型水凝胶中最终细胞浓度为3×106个/mL。本发明采用温敏水凝胶的生物大分子化和非自由基交联机制，制备新型水凝胶制剂；以对干细胞的相容性和相变温度为指标，筛选温敏型原位凝胶处方与工艺。创新性的把间充质干细胞与水凝胶进行结合，制成新型的水凝胶制剂，实现脐带间充质干细胞在创伤部位的滞留，更好的发挥间充质干细胞的损失修复作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种负载脐带间充质干细胞的温敏型水凝胶及其制备方法。
背景技术
宫腔粘连(intrauterine adhesions，IUA)是由于宫腔手术操作、感染等因素导致子宫内膜基底层损伤，宫腔部分或全部闭塞，继而引起月经过少、闭经、不孕或反复流产等症状的妇科疾病，严重影响女性的生殖健康。
目前临床上治疗IUA的首选方法是宫腔镜下粘连分离术(TCRA)。TCRA术后子宫腔内存在分离创面，容易出现再次粘连的风险，发生率为62.5％。故临床上提出使用宫内屏障来隔离创面，起到预防再粘的作用。目前临床上用于TCRA术后的宫内屏障包括宫内节育器(IUD)或Foley球囊、生物胶类、羊膜等。
IUD用于宫腔粘连分离术后防止复发已有多年历史，但IUD具有以下缺点：含铜节育器能加重分离面的炎症、接触面积较小、可引起异常子宫出血、感染，严重者可导致子宫穿孔。Foley导管球囊相对IUD来说，不含金属成分，且其表面积大，但其也存在异物不适感、感染、压迫宫腔导致子宫内膜缺血坏死、子宫穿孔等风险。随着医用生物材料技术的发展，各种生物胶类如含有几丁糖、透明质酸钠等的水凝胶用于TCRA术后防粘连的效果令人满意，负载药物的水凝胶具有良好的生物相容性和生物安全性、能促进伤口的愈合、有一定的抑菌作用以及抑制瘢痕的作用，能有效减少组织粘连的发生。
近年来有关间充质干细胞在子宫内膜损伤修复的报道逐渐增多，这为IUA的临床治疗提供了新的治疗思路。大量的研究报道间充质干细胞可以促进子宫内膜再生和修复，减少子宫内膜纤维化，可以释放营养因子和生长因子并具有抗炎，免疫调节作用。由于宫腔和阴道相连，因此注入的干细胞具有外流的可能，将影响治疗效果。为此，实现脐带间充质干细胞在创伤部位的滞留是提高脐带间充质干细胞临床疗效的重要途经。水凝胶是当前最为接近人体软组织的生物医用材料，无论是作为创面封闭还是药物载体或细胞支架都具有重大的临床应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种负载间充质干细胞的温敏型水凝胶及其制备方法，由可降解胶原和多糖生物支架支撑的温度敏感型原位水凝胶被移植到患者的子宫腔中，修复和再生受损组织。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种负载间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法，其具体过程如下：分离并迭代培养脐带间充质干细胞以获取合格的细胞库细胞，负载所得细胞库细胞于原位温敏生物医用水凝胶之上，于所述温敏型水凝胶中最终细胞浓度为3×106个/mL。
进一步地，构建所述原位温敏生物医用水凝胶包括如下步骤：
S1、纤维蛋白凝胶制剂：溶解冻干的人纤维蛋白原于氯化钠溶液中，溶解凝血酶于氯化钙溶液之中，等体积混合上述溶液并于37℃环境下振荡过夜形成溶液A；
S2、分别溶解海藻酸钠以及Ⅰ型胶原蛋白于去离子水中，生成浓度为2％的海藻酸钠溶液以及浓度为1％的Ⅰ型胶原蛋白溶液，等体积混合上述溶液形成溶液B；
S3、混合50mM的CaCO3溶液以及150mM葡萄糖酸-δ-内酯溶液，形成溶液C；
S4、等体积比混合溶液A、溶液B以及溶液C，反应15min获得质量分数为0.25％Col：0.5％SA的水凝胶溶液。
进一步地，所述脐带间充质干细胞的培养过程具体如下：扩增培养脐带间充质干细胞从P0至P3代建立细胞库并进行细胞库检测获取合格的细胞库细胞，传代至P5后进行中间体冷冻存储。
进一步地，所述脐带间间充质干细胞以外植体培养方法于24h内有计划性剖宫产妊娠脐带中分离所得。
进一步地，所述检测方法包括细胞品质鉴别、生物安全性检测以及残留检查；
所述细胞品质鉴别角度包括细胞大小、细胞活率、STR图谱以及细胞表面标志物；
所述生物安全型检测角度包括无菌检查、内毒素检查以及病毒检查；
所述残留检查角度为总蛋白残留。
进一步地，所述间充质干细胞经PBS缓冲液漂洗后，以胰蛋白酶消化，计数，离心，弃上清，并将细胞重悬于水凝胶溶液中，形成每毫升包载3×106个脐带间充质干细胞，质量分数为0.25％Col：0.5％SA的Col/SA的复合水凝胶。
一种富含间充质干细胞的温敏型水凝胶的应用，将负载有间充质干细胞的温敏型水凝胶作用于宫腔创面，用于预防子宫宫腔粘连、促进子宫内膜再生修复，防止宫腔粘连。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
1)突破传统凝胶制备技术，采用温敏水凝胶的生物大分子化和非自由基交联机制，制备新型水凝胶制剂；
2)以对干细胞的相容性和相变温度为指标，筛选温敏型原位凝胶处方与工艺。创新性的把间充质干细胞与水凝胶进行结合，制成新型的水凝胶制剂，实现脐带间充质干细胞在创伤部位的滞留，更好的发挥间充质干细胞的损失修复作用；
3)可以分隔宫腔创面，具有预防子宫宫腔粘连、促进子宫内膜再生修复的作用。水凝胶在宫腔内转变为凝胶相后可紧密粘附在内膜上持续释放，可以达到长效修复内膜损伤，并且可以预防感染。经过动物实验证实，富含脐带间充质干细胞的温敏型水凝胶能促进IUA大鼠子宫受损子宫内膜的结构重建及功能恢复。
附图说明
参照附图来说明本发明的公开内容。应当了解，附图仅仅用于说明目的，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。在附图中，相同的附图标记用于指代相同的部件。其中：
图1示意性显示了负载间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备过程；
图2为倒置显微镜下的脐带间充质干细胞在正常条件中以及在Col/SA水凝胶溶液中生长状况；
图3为包载干细胞的Col/SA复合水凝胶在不同温度间的形态转换；
图4为场发射扫描电镜观察水凝胶内部结构图；
图5为Col/SA复合水凝胶弹性模量和溶胀能力检测数据图；
图6为CCK-8检测表明脐带间充质干细胞在Col/SA复合水凝胶内增殖情况；
图7为SD大鼠宫腔粘连模型治疗中各组子宫组织切片的H&E染色切片结果(40x)。
具体实施方式
容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式以及附图仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。
一种负载间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法，其具体过程如下：分离并迭代培养脐带间充质干细胞以获取合格的细胞库细胞，负载所得细胞库细胞于原位温敏生物医用水凝胶之上，于上述温敏型水凝胶中最终细胞浓度为3×106个/mL；其具体步骤如下：
(1)临床级别脐带间充质干细胞分离和培养：
hUC-MSC将会被用外植体培养方法从24小时内的计划性剖宫产妊娠脐带中分离出来；扩增培养从P0代至P3代建立细胞库，并进行细胞库检测，项目为细胞品质鉴别(细胞大小、细胞活率、STR图谱和细胞表面标志物)、生物安全性检测(无菌检查、内毒素检查、病毒检查)和残留检查(总蛋白残留)；取检测合格的细胞库细胞，传代至P5后进行中间体冷冻存储(如图1所示)；
(2)构建原位温敏生物医用水凝胶：
1.纤维蛋白凝胶制剂：将冻干的人纤维蛋白原溶解在生理盐水/氯化钠溶液(0.9％)中，然后将凝血酶溶解在氯化钙溶液(40ml/L)中。随后，将纤维蛋白原溶液(10ml/L)与凝血酶溶液(50国际单位/ml)以等体积比混合。将混合物置于37℃振荡过夜，形成溶液A。
2.将海藻酸钠(SA)和Ⅰ型胶原蛋白(Col)分别溶解在去离子水中，生成2％的海藻酸钠和1％的Ⅰ型胶原蛋白，然后将两种不同的等体积溶液混合，形成溶液B。
3.将50mM的CaCO3溶液与150mM的葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)溶液混合，形成溶液C。
4.最后，将溶液A，B，C各组分以等体积比混合，反应15分钟得到水凝胶溶液D。
(3)温敏水凝胶负载脐带间充质干细胞：
将生长情况良好脐带间充质干细胞经PBS漂洗后，胰蛋白酶消化，计数，离心，弃上清，并将细胞重悬于水凝胶溶液D中，最终细胞浓度为3x106个/ml。制得0.25％Col：0.5％SA的负载间充质干细胞Col/SA的复合温敏水凝胶，脐带间充质干细胞在Col/SA水凝胶溶液中生长态势如图2所示，脐带间充质干细胞在Col/SA水凝胶溶液中生长良好。
负载间充质干细胞温敏水凝胶性能检测：
1.水凝胶的形态观察和扫描电镜表征检测；
①负载干细胞的温敏水凝胶溶液在常温下稳定性良好，放置24h后仍能保持相同的流动性能；混合后若置于37℃水浴锅中，溶液的流动性逐渐降低，10min后失去流动性形成凝胶，水凝胶的强度在后续5min内逐渐增强，最终形成半透明的具有一定强度凝胶(如图3所示)。
②取一定量水凝胶溶液，并加入0.05％(v/v)光引发剂Ingacure 2959，60℃磁力搅拌10min使其充分溶解。将此溶液加入至PMMA模具中，制备盘状水凝胶(直径d＝10mm，厚度h＝2mm)。而后移入冻干机内冻干一周取出，导电胶带贴于铝台，真空喷砂90s，而后应用S-4800场发射扫描电镜(FE-SEM)观察材料表面形貌，并计算相应孔隙率及孔径，如图4所示，水凝胶内部呈三维多孔网络结构，孔隙分布均匀。
2.流变学性能表征分析测试；
通过流变学分析测试凝胶：粘度、频率扫描速度(可注射性)、储存模量随着温度的变化。
3.水凝胶弹性模量和溶胀能力测试；
制备盘状水凝胶(直径d＝10mm，厚度h＝2mm)，而后将其浸泡于37℃PBS溶液中，24h后小心吸取表面多余液体并称重，应用Instron拉力试验机检测其弹性模量；而后将凝胶圆盘于冻干机内冻干72h后取出，再次称重测定水凝胶溶胀能力，材料的溶胀比＝浸泡于PBS溶液24h或48h后的质量/冻干后质量，Col/SA复合水凝胶弹性模量和溶胀能力如图5所示。
4.干细胞在水凝胶内的存活率与增殖率检测；
负载有脐带间充质干细胞的Col/SA水凝胶固化成型后，转移至12孔板中，加入适宜体积的基础培养基后，在37℃、5％CO2、95％饱和湿度的培养箱中培养，每隔一天换液一次。培养至特定时间，考察脐带间充质干细胞在水凝胶内的存活与增殖情况。
①收集水凝胶与DMEM培养基孵育24小时后收集的混合溶液上清液。将收集的提取液以与人脐带间充质干细胞孵育48h，孵育后，培养板的每个孔中加入CCK-8，培养箱中再孵育4小时。最后，立即使用酶标仪测量450纳米处的吸光度，结果如图6所示，表明脐带间充质干细胞在Col/SA复合水凝胶内增殖良好。
②为了进一步研究细胞的生存能力，在37℃下用吖啶橙(AO，绿色)和碘化丙啶(PI，红色)溶液(AO:DMEM/F12:PI＝1:50:1)将水凝胶中负载的人脐带间充质干细胞染色15分钟，然后用荧光显微镜观察。
5.SD大鼠宫腔粘连模型验证干细胞复核水凝胶治疗作用
①SD大鼠宫腔粘连模型的建立：选取体重范围(180-220g)健康动情期的雌性SD大鼠。待完全麻醉后，解剖，使用微型子宫刮匙对宫腔内部进行搔刮，直至子宫充血肿胀。之后将预先于浸泡10mg/mL的脂多糖生理盐水溶液中的棉质缝合线置于宫腔内，缝合子宫壁及腹腔。术后大鼠均给予20万单位/日青霉素腹腔注射，连续3天正常饮食。其中对照组仅进行开关腹操作。
②将建模大鼠随机分为3组，模型组：仅给予开关腹治疗；单纯水凝胶治疗组：结扎子宫角两端，每侧宫角注射100μL Col/SA的水凝胶；负载MSC复合Col/SA的水凝胶治疗组：结扎子宫角两端，每侧宫角注射100μL负载间充质干细胞Col/SA的复合温敏水凝胶。治疗后第七天处死大鼠，收集双侧子宫。分离部分组织用于制备石蜡切片以进行病理形态观察、H&E染色，结果如图7所示；
组织学检测结果显示负载MSC的Col/SA水凝胶治疗组在SD大鼠宫腔粘连模型实验中表现出更好的改善子宫内膜的形态作用，更有利于促进腺体和血管结构的恢复。干细胞加水凝胶复合组子宫内膜与正常对照组子宫内膜形态上无显著差异。该结果表明负载脐带间充质干细胞的温敏型水凝胶能促进IUA大鼠子宫受损子宫内膜的结构重建及功能恢复。
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种负载间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，其具体过程如下：分离并迭代培养脐带间充质干细胞以获取合格的细胞库细胞，负载所得细胞库细胞于原位温敏生物医用水凝胶之上，于所述温敏型水凝胶中最终细胞浓度为3×106个/mL。
2.根据权利要求1所述的负载间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，构建所述原位温敏生物医用水凝胶包括如下步骤：
S1、纤维蛋白凝胶制剂：溶解冻干的人纤维蛋白原于氯化钠溶液中，溶解凝血酶于氯化钙溶液之中，等体积混合上述溶液并于37℃环境下振荡过夜形成溶液A；
S2、分别溶解海藻酸钠和Ⅰ型胶原蛋白于去离子水中，生成浓度为2％的海藻酸钠溶液以及浓度为1％的Ⅰ型胶原蛋白溶液，等体积混合上述溶液形成溶液B；
S3、混合50mM的CaCO3溶液以及150mM葡萄糖酸-δ-内酯溶液，形成溶液C；
S4、等体积比混合溶液A、溶液B以及溶液C，反应15min获得质量分数为0.25％Col：0.5％SA的水凝胶溶液。
3.根据权利要求1所述的富含间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的培养过程具体如下：扩增培养脐带间充质干细胞从P0至P3代建立细胞库并进行细胞库检测获取合格的细胞库细胞，传代至P5后进行中间体冷冻存储。
4.根据权利要求3所述的富含间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述脐带间间充质干细胞以外植体培养方法于24h内有计划性剖宫产妊娠脐带中分离所得。
5.根据权利要求3所述的富含间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述检测方法包括细胞品质鉴别、生物安全性检测以及残留检查；
所述细胞品质鉴别角度包括细胞大小、细胞活率、STR图谱以及细胞表面标志物；
所述生物安全型检测角度包括无菌检查、内毒素检查以及病毒检查；
所述残留检查角度为总蛋白残留。
6.根据权利要求1所述的负载间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞经PBS缓冲液漂洗后，以胰蛋白酶消化，计数，离心，弃上清，并将细胞重悬于水凝胶溶液中，形成每毫升包载3×106个脐带间充质干细胞，质量分数为0.25％Col：0.5％SA的Col/SA的复合水凝胶。
7.一种如权利要求1-6任一所述的负载间充质干细胞的温敏型水凝胶的制备方法所制得的负载间充质干细胞的温敏型水凝胶的应用，其特征在于，将负载有间充质干细胞的温敏型水凝胶作用于宫腔创面，用于预防子宫宫腔粘连、促进子宫内膜再生修复，防止宫腔粘连。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN117653718A (zh) * | 2022-08-25 | 2024-03-08 | 河北医科大学第二医院 | 纤维蛋白-人脐带间充质干细胞条件培养液凝胶及其制备方法和应用 |
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