CN111701082B - 载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架的制备方法，将人羊膜细胞外基质与PLGA雌二醇微球相结合，构建具生物活性的宫腔药物缓释支架。通过调节PLGA聚合物的分子量和羊膜支架的基质浓度，使雌二醇在21天内完全释放，实现与女性生理周期中雌激素水平波动同步。本发明提供的载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架可用于宫腔镜下粘连分离术后预防粘连复发，以及用于宫腔操作术后预防宫腔粘连和促进子宫内膜修复。本发明提供的宫腔支架不仅能有效的提供宫腔屏障支撑作用，同时还能提高宫腔雌二醇浓度，有效促进子宫内膜再生。本宫腔支架制备工艺简单，易于放大生产，有望成为宫腔粘连预防与治疗的新型药物制剂。

Description

载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架的制备方法
技术领域
本发明属于生物医用设备的制备领域，涉及一种载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架的制备方法，可在修复子宫内膜，防治宫腔粘连中的应用。
背景技术
宫腔粘连(intrauterine adhesions，IUA)又称Asherman综合征，是指因创伤或感染等原因导致子宫内膜基底层损伤，引起宫腔壁和(或)宫颈管的全部或部分闭锁，子宫失去原有生理功能的一种疾病。目前，IUA在我国的发病率居高不下，并且随着宫腔手术的增加呈逐年增长的趋势。IUA发病的危险因素包括：生殖系统感染，机体低雌激素环境以及宫腔操作史如流产清宫术、剖宫产术和宫腔镜手术等，多次人工流产、清宫术所致的IUA发生率高达25％-30％，已成为育龄期妇女继发不孕、月经量减少、闭经的常见原因，对女性生殖及身心健康造成了严重危害。随着2015年国家“二孩”政策的落地，改善妇女生殖健康，促成家庭生育愿望是妇产科等相关领域的攻关重点。因此构建一种能够高效且安全的治疗宫腔粘连的药物制剂是十分具有临床应用价值的。
羊膜细胞外基质是一种天然高分子生物材料，由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白质和多糖类大分子物质构成，在促进上皮细胞的增殖、分化、抑制炎性反应等方面起着重要作用。同时还具备良好的力学特性、细胞相容性及生物降解性。因此，羊膜细胞外基质在组织工程中是理想的生物材料。
发明内容
本发明目的是针对目前临床对宫腔粘连的治疗效果不佳，复发率高等不足，提供一种载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架的制备方法，是一种载雌二醇聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球的脱细胞羊膜宫腔支架的制备方法，所述支架可以恢复宫腔形态，有效修复子宫内膜，降低药物不良反应，实现宫腔内精准递药。本发明旨在促进具生物活性的宫腔支架开发。本发明制备步骤如下：
A.脱细胞羊膜基质的制备：
(1)取羊膜组织：无菌条件下取乙肝、丙肝、艾滋、梅毒均阴性的胎盘，钝性分离羊膜约10cm×10cm，去除绒毛膜组织，用含有50mg/ml青霉素、50mg/ml链霉素的磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)洗涤后保存。
(2)脱细胞羊膜基质的制备：羊膜经生理盐水反复冲洗后浸泡于体积分数0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)溶液中，置于37℃恒温培养箱中震荡过夜，取出后用生理盐水漂洗干净，加入25g/L胰蛋白酶和0.2g/L乙二胺四乙酸(EDTA)，充分振荡，37℃孵育4h。取出后用生理盐水反复漂洗，再将羊膜组织置于8.8％氯化钠溶液，室温孵育4h，取出后用0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)反复漂洗并冻干保存。
B.脱细胞羊膜凝胶支架的制备：
(1)冻干的脱细胞羊膜在低温下剪碎，称重，加入含0.5-1.5mg/ml胃蛋白酶的盐酸溶液，室温下消化72h后，加入0.1M NaOH将溶液pH调至7.4，使胃蛋白酶失活，终止消化。取一定体积溶液，通过加入不同比例0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)制备浓度为1-10mg/ml的羊膜细胞外基质凝胶溶液。
(2)脱细胞羊膜凝胶溶液在37℃下孵育35-50分钟，固化成胶后冷冻干燥。
C.雌二醇PLGA微球的制备：
溶剂挥发法制备雌二醇PLGA微球：油相为含10％(g/ml)PLGA的乙酸乙酯溶液，内水相为用乙酸乙酯饱和的含1.5％(g/ml)聚乙烯醇水溶液，油/内水相的体积比为1：10，雌二醇/PLGA的投料比为1：10，内水相/外水相体积比为1:15，其加水萃取的速度为250rpm，室温下溶剂挥发过夜，蒸馏水离心洗涤3次后收集微球，冻干保存。
D.载雌二醇聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球的脱细胞羊膜支架的制备：
(1)冻干的脱细胞羊膜剪碎，称重，加入含0.5-1.5mg/ml胃蛋白酶的盐酸溶液，室温下消化72h后，加入0.1M NaOH将溶液pH调至7.4，使胃蛋白酶失活，终止消化。取一定体积溶液，通过加入不同比例0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)制备浓度为1-10mg/ml的羊膜细胞外基质凝胶溶液。
(2)在脱细胞羊膜凝胶溶液中加入质量分数为15％-40％的雌二醇PLGA微球冻干粉末，充分混合均匀后在37℃下孵育35-50分钟，固化成胶后冷冻干燥。最终制得载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架。
步骤A、B、C、D所述的冻干条件为：在冻干物品中加入质量体积百分浓度为5％的甘露醇后程序降温，并冷冻干燥72h。
宫腔粘连(IUAs)目前主要采用宫腔镜下粘连分离术(TCRA)联合术后管理的综合治疗方案，但粘连复发率很高。其主要原因是缺乏有效的宫腔物理屏障和安全的雌激素治疗方案。目前临床上采用术后放置宫内节育器(IUD)或宫腔支撑球囊隔离宫腔创面，减少再粘连形成，但作为宫腔异物，可能造成过度的炎症反应以及增加发生异常子宫出血、宫腔感染、嵌顿及子宫穿孔的风险；而且需再次手术取出、增加住院次数，患者顺应性差。此外，长期大剂量口服雌二醇影响肝内蛋白质代谢，增加肝脏毒性，可能引起胃肠不适、心血管或血栓栓塞性意外、乳腺囊性结节增大、乳腺癌等。
本发明从解决上述TCRA术后宫腔物理屏障作用差，雌激素疗效不佳且不良反应多的问题出发，提出基于脱细胞羊膜的生物活性支架的宫腔药物缓释系统：首先提取人羊膜细胞外基质，制备多孔海绵状可降解支架，作为宫内安全有效的物理屏障；支架内负载不同比例的雌二醇聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球，构建具缓控释功能的载药宫腔复合支架，雌二醇在21天内从复合支架缓慢释放进入宫腔，释放时间与女性生理周期中雌激素水平波动同步，可有效修复子宫内膜，实现宫内精准递药。本发明提供载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架可用于宫腔镜下粘连分离术(TCRA)后预防粘连的复发；本发明提供载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架亦用于宫腔操作术后预防宫腔粘连和促进子宫内膜修复。本发明研究发现，宫腔支架不仅提供了长期有效的宫腔屏障支撑作用，同时缓慢释放雌二醇，提高宫腔药物浓度，降低药物不良反应，促进子宫内膜再生。载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架制备工艺简单，易于放大生产，有望成为宫腔粘连预防与治疗的新型药物制剂。
附图说明
图1为实施例1中脱细胞处理前的完整羊膜组织与脱细胞处理后的羊膜组织的HE染色切片图。
图2为实施例1中完整羊膜和去细胞羊膜基质中糖胺聚糖、可溶性胶原的含量对比图。
图3为实施例1中制备的脱细胞羊膜水凝胶在室温(A)下状态和37℃时固化交联的状态(B)图。
图4为实施例1中制备的不同浓度的脱细胞羊膜水凝胶(8mg/ml与5mg/ml)成胶时间曲线。
图5为实施例1中制备的载雌二醇PLGA微球的脱细胞羊膜支架及雌二醇PLGA微球在PBS(pH7.4)环境中的体外释放曲线。
图6为实施例1中制备的载雌二醇PLGA微球的脱细胞羊膜支架、空白脱细胞羊膜支架及雌二醇PLGA微球的细胞毒性实验。
图7为实施例1中制备的雌二醇PLGA微球、不同基质浓度(8mg/ml与5mg/ml)的空白脱细胞羊膜支架及载雌二醇PLGA微球的的脱细胞羊膜支架的扫描电镜图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例进一步说明本发明的内容，但是不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，都属于本发明的范畴。
实施例1
A.脱细胞羊膜基质的制备：
(1)取羊膜组织：无菌条件下取乙肝、丙肝、艾滋、梅毒均阴性的胎盘，钝性分离羊膜约10cm×10cm，去除绒毛膜组织，用含有50mg/ml青霉素、50mg/ml链霉素的磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)洗涤后保存。
(2)脱细胞羊膜基质的制备：羊膜经生理盐水反复冲洗后浸泡于体积分数聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)溶液中，置于37℃恒温培养箱中震荡过夜，取出后用生理盐水漂洗干净，加入25g/L胰蛋白酶和0.2g/L乙二胺四乙酸(EDTA)，充分振荡，37℃孵育4h。取出后用生理盐水反复漂洗，再将羊膜组织置于8.8％氯化钠溶液，室温孵育4h，取出后用0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)反复漂洗，并冻干保存，冻干的程序降温具体为：加入质量体积百分浓度为5％的甘露醇，充分混匀后，4℃环境中放置4h，再置于-20℃环境12h，最后置于冻干机内冷冻干燥72h。
(3)为了检测羊膜的去细胞化程度，取一定数量新鲜羊膜和去细胞羊膜样本，经4％多聚甲醛中固定后，包埋切片，由苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学分析。结果见图1。
B.脱细胞羊膜凝胶支架的制备：
(1)冻干的脱细胞羊膜在低温下剪碎，称重，加入含1.0mg/ml胃蛋白酶的盐酸溶液，室温下消化72h后，加入0.1M氢氧化钠将溶液pH调至7.4，使胃蛋白酶失活，终止消化。取一定体积溶液，通过加入不同比例0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)制备浓度为5mg/ml的羊膜细胞外基质凝胶溶液。
(2)脱细胞羊膜凝胶溶液在37℃下孵育40分钟，固化成胶后冷冻干燥。
(3)采用硫酸化糖胺聚糖检测试剂盒测量完整羊膜和HAECM水凝胶(5mg/ml)中硫酸化糖胺聚糖(GAGs)的浓度。采用可溶性胶原蛋白检测试剂盒测量完整羊膜和脱细胞羊膜基质水凝胶(5mg/ml)的可溶性胶原蛋白(I型至V型)的浓度。每次分析取三个样本。结果见图2。
(4)采用浊度滴定法考察脱细胞羊膜基质水凝胶的凝胶动力学，在96孔板中加入150μl/孔的羊膜细胞外基质水凝胶。设定吸收波长550nm，采用酶标仪在37℃环境中测量水凝胶的浊度变化，共持续60分钟。结果见图3。
C.雌二醇PLGA微球的制备
(1)采用剂挥发法制备雌二醇PLGA微球：精密称取0.75g聚乙烯醇，溶于50ml含10％乙酸乙酯的水溶液，成为内水相；分别精密称取0.3g PLGA(
Figure BDA0002592157810000041
RG 502H，L:G50:50，粘度0.16-0.24dl/L，分子量7,000-17,000)和30mg雌二醇，加入5ml乙酸乙酯，成为油相；将油相滴入内水相并高速搅拌，乳化3分钟后加入750ml外水相，萃取的速度为250rpm，室温下溶剂挥发过夜，蒸馏水离心洗涤3次后收集微球，冻干保存。
(2)微球载药量与包封率的测定：采用高效液相色谱法(HPLC)测定了PLGA微球中雌二醇的含量。检测波长为280nm；分析柱为C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相由甲醇和水(65:35)组成，流速为1.0ml/min。制做标准曲线对雌二醇进行定量，并将峰面积转换为浓度。称取10mg冻干微球溶解于1ml二氯甲烷，然后用甲醇将所得溶液稀释至10ml，并涡旋混合5min。取1ml溶液以8000rpm的速率离心10min。取上清液进行HPLC分析，测定雌二醇的浓度。载药效率和包封效率按下式计算：(计算载药量与包封率结果详见表1)
载药量％＝(微球中药物含量/PLGA微球总质量)*100
包封率％＝(微球中药物质量/总药物质量)*100
表1
聚合物 载药量(％) 包封率(％)
PLGA(502H) 8.18±0.17 89.90±6.61
D.载雌二醇PLGA微球的脱细胞羊膜支架的制备：
(1)冻干的脱细胞羊膜剪碎，称重，加入含1.0mg/ml胃蛋白酶的盐酸溶液，室温下消化72h后，加入0.1M氢氧化钠将溶液pH调至7.4，使胃蛋白酶失活，终止消化。取一定体积溶液，通过加入不同比例0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)制备浓度为5mg/ml的羊膜细胞外基质凝胶溶液。
(2)在脱细胞羊膜凝胶溶液中加入质量分数为20％的雌二醇PLGA微球冻干粉末，充分混合均匀后在37℃下孵育40分钟，固化成胶后冷冻干燥。最终制得载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架。
E.雌二醇PLGA微球、脱细胞羊膜宫腔支架的外观表征
采用扫描电子显微镜对雌二醇PLGA微球、脱细胞羊膜宫腔支架和微球状的形态和内部结构进行分析观察。结果见图7。
实施例2
A.脱细胞羊膜基质的制备：
(1)取羊膜组织：无菌条件下取乙肝、丙肝、艾滋、梅毒均阴性的胎盘，钝性分离羊膜约10cm×10cm，去除绒毛膜组织，用含有50mg/ml青霉素、50mg/ml链霉素的磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)洗涤后保存。
(2)脱细胞羊膜基质的制备：羊膜经生理盐水反复冲洗后浸泡于体积分数0.1％TritonX-100溶液中，置于37℃恒温培养箱中震荡过夜，取出后用生理盐水漂洗干净，加入25g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA，充分振荡，37℃孵育4h。取出后用生理盐水反复漂洗，再将羊膜组织置于8.8％氯化钠溶液，室温孵育4h，取出后用0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)反复漂洗并冻干保存。
B.脱细胞羊膜凝胶支架的制备：
(1)冻干的脱细胞羊膜在低温下剪碎，称重，加入含1.0mg/ml胃蛋白酶的盐酸溶液，室温下消化72h后，加入0.1M氢氧化钠将溶液pH调至7.4，使胃蛋白酶失活，终止消化。取一定体积溶液，通过加入不同比例0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)制备浓度为8mg/ml的羊膜细胞外基质凝胶溶液。
(2)脱细胞羊膜凝胶溶液在37℃下孵育35分钟，固化成胶后冷冻干燥。
C.雌二醇PLGA微球的制备：
(1)采用剂挥发法制备雌二醇PLGA微球：精密称取0.75g PVA，溶于50ml含10％乙酸乙酯的水溶液，成为内水相；分别精密称取0.3g PLGA(
Figure BDA0002592157810000061
RG 503H，L:G 50:50，粘度0.32-0.44dl/l，分子量2,4000-3,8000)和30mg雌二醇，加入5ml乙酸乙酯，成为油相；将油相滴入内水相并高速搅拌，乳化3分钟后加入750ml外水相，萃取的速度为250rpm，室温下溶剂挥发过夜，蒸馏水离心洗涤3次后收集微球，冻干保存。
(2)微球载药量与包封率的测定：采用高效液相色谱法(HPLC)测定了PLGA微球中雌二醇的含量。检测波长为280nm；分析柱为C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相由甲醇和水(65:35)组成，流速为1.0ml/min。制做标准曲线对雌二醇进行定量，并将峰面积转换为浓度。称取10mg冻干微球溶解于1ml二氯甲烷，然后用甲醇将所得溶液稀释至10ml，并涡旋混合5min。取1ml溶液以8000rpm的速率离心10min。取上清液进行HPLC分析，测定雌二醇的浓度。载药效率和包封效率按下式计算：(计算载药量与包封率结果详见表2)
载药量％＝(微球中药物含量/PLGA微球总质量)*100
包封率％＝(微球中药物质量/总药物质量)*100
表2
聚合物 载药量(％) 包封率(％)
PLGA(503H) 7.73±0.14 85.1±7.83
D.载雌二醇PLGA微球的脱细胞羊膜支架的制备：
(1)冻干的脱细胞羊膜剪碎，称重，加入含1.0mg/ml胃蛋白酶的盐酸溶液，室温下消化72h后，加入0.1M氢氧化钠将溶液pH调至7.4，使胃蛋白酶失活，终止消化。取一定体积溶液，通过加入不同比例0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)制备浓度为8mg/ml的羊膜细胞外基质凝胶溶液。
(2)在脱细胞羊膜凝胶溶液中加入质量分数为25％的雌二醇PLGA微球冻干粉末，充分混合均匀后在37℃下孵育35分钟，固化成胶后冷冻干燥。最终制得载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架。
E.药物体外释放度实验
(1)雌二醇PLGA微球的体外释放度实验：采用透析膜法进行微球体外释药实验。透析袋(截留分子量8000-14000)在使用前在去离子水中浸泡12h。将约20mg雌二醇PLGA微球(包括PLGA(502H)和PLGA(503H))置于含有1.5ml PBS(pH 7.4)的透析袋中，并将其浸入装有40ml PBS(pH 7.4)的烧瓶中，以60rpm的转速摇动。在固定时间点，提取2ml释放介质，并向烧瓶中添加等量的PBS溶液，以保持恒定的体积。用高效液相色谱法分析上清液中的雌二醇的含量。体外释放度实验共持续600h。
(2)采用超滤法测定冻干支架的体外药物释放。取200mg载有30％雌二醇PLGA(502H)微球的支架(5mg/ml和8mg/ml两种不同浓度)置于超滤离心管(截留分子量为10000)，加入10ml PBS(pH 7.4)。在室温下以60转/分的速度摇晃试管。在特定时间点，取出所有PBS溶液并用10ml新的PBS溶液代替。用高效液相色谱法分析上清液中的雌二醇含量。体外释放度实验共持续600h。
(3)体外释放度结果详见图5。
F.体外细胞增殖实验
(1)为了评价Ishikawa细胞对不同浓度雌二醇的增殖反应，将104个细胞接种在96孔板上培养24h，用不同浓度的雌二醇(0、10、100、1000和10000nM)进行处理。分别于培养24h、48h和72h后，用MTT还原法检测细胞增殖情况。筛选出对Ishikawa细胞增殖敏感度最高的雌二醇浓度。
(2)考察雌二醇PLGA微球、空白支架和微球-脱细胞羊膜复合支架对Ishikawa细胞的增殖作用，在6孔板上每个孔中加入适量的PLGA微球或对应支架。培养24h、48h、72h后，MTT染色4h，用MTT还原法检测细胞增殖情况。
(3)细胞增殖实验结果详见图6。
实施例3
A.脱细胞羊膜基质的制备：
(1)取羊膜组织：无菌条件下取乙肝、丙肝、艾滋、梅毒均阴性的胎盘，钝性分离羊膜约10cm×10cm，去除绒毛膜组织，用含有50mg/ml青霉素、50mg/ml链霉素的磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)洗涤后保存。
(2)脱细胞羊膜基质的制备：羊膜经生理盐水反复冲洗后浸泡于体积分数0.1％TritonX-100溶液中，置于37℃恒温培养箱中震荡过夜，取出后用生理盐水漂洗干净，加入25g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA，充分振荡，37℃孵育4h。取出后用生理盐水反复漂洗，再将羊膜组织置于8.8％氯化钠溶液，室温孵育4h，取出后用0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.2-7.4)反复漂洗并冻干保存。
B.脱细胞羊膜凝胶支架的制备：
(1)冻干的脱细胞羊膜在低温下剪碎，称重，加入含1.0mg/ml胃蛋白酶的盐酸溶液，室温下消化72h后，加入0.1M氢氧化钠将溶液pH调至7.4，使胃蛋白酶失活，终止消化。取一定体积溶液，通过加入不同比例0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH7.2-7.4)制备浓度为8mg/ml的羊膜细胞外基质凝胶溶液。
(2)脱细胞羊膜凝胶溶液在37℃下孵育35分钟，固化成胶后冷冻干燥。
C.雌二醇PLGA微球的制备：
采用剂挥发法制备雌二醇PLGA微球：精密称取0.75g PVA，溶于50ml含10％乙酸乙酯的水溶液，成为内水相；分别精密称取0.3g PLGA(
Figure BDA0002592157810000081
RG 502H，L:G 50:50，粘度0.16-0.24dl/L，分子量7,000-17,000)和30mg雌二醇，加入5ml乙酸乙酯，成为油相；将油相滴入内水相并高速搅拌，乳化3分钟后加入750ml外水相，萃取的速度为250rpm，室温下溶剂挥发过夜，蒸馏水离心洗涤3次后收集微球，冻干保存。
D.载雌二醇PLGA微球的脱细胞羊膜支架的制备：
(1)冻干的脱细胞羊膜剪碎，称重，加入含1.0mg/ml胃蛋白酶的盐酸溶液，室温下消化72h后，加入0.1M氢氧化钠将溶液pH调至7.4，使胃蛋白酶失活，终止消化。取一定体积溶液，通过加入不同比例0.01M磷酸缓冲盐溶液(pH7.2-7.4)制备浓度为8mg/ml的羊膜细胞外基质凝胶溶液。
(2)在脱细胞羊膜凝胶溶液中加入质量分数为30％的雌二醇PLGA微球冻干粉末，充分混合均匀后在37℃下孵育35分钟，固化成胶后冷冻干燥。最终制得载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架。

Claims (3)

1.一种载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
A.脱细胞羊膜基质的制备：
（1）取羊膜组织：无菌条件下取乙肝、丙肝、艾滋、梅毒均阴性的胎盘，钝性分离羊膜10cm×10 cm，去除绒毛膜组织，用含有50 mg/ml青霉素、50 mg/ml链霉素的pH 7.2-7.4的磷酸缓冲盐溶液洗涤后保存；
（2）脱细胞羊膜基质的制备：羊膜经生理盐水反复冲洗后浸泡于体积分数0.1%聚乙二醇辛基苯基醚溶液中，置于37℃恒温培养箱中震荡过夜，取出后用生理盐水漂洗干净，加入25 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L 乙二胺四乙酸，充分振荡，37℃孵育4 h，取出后用生理盐水反复漂洗，再将羊膜组织置于8.8%氯化钠溶液，室温孵育4 h，取出后用0.01 M pH 7.2-7.4的磷酸缓冲盐溶液反复漂洗并冻干保存；
B.雌二醇聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的制备：
溶剂挥发法制备雌二醇聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球：油相为含质量体积比10%聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙酸乙酯溶液，内水相为用乙酸乙酯饱和的含质量体积比1.5%聚乙烯醇水溶液，油/内水相的体积比为1：10，雌二醇/PLGA的投料比为1：10，内水相/外水相体积比为1:15，其加水萃取的速度为250 rpm，室温下溶剂挥发过夜，蒸馏水离心洗涤3次后收集微球，冻干保存；
C.载雌二醇聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的脱细胞羊膜支架的制备：
（1）冻干的脱细胞羊膜基质剪碎，称重，加入含0.5-1.5 mg/ml胃蛋白酶的盐酸溶液，室温下消化72 h后成凝胶溶液，加入0.1 M 氢氧化钠将溶液pH调至7.4，使胃蛋白酶失活，终止消化，取一定体积溶液，通过加入不同比例0.01 M pH 7.2-7.4的磷酸缓冲盐溶液制备成1-10 mg/ml的羊膜细胞外基质凝胶溶液；
（2）在羊膜细胞外基质凝胶溶液中加入一定质量的雌二醇聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球冻干粉末，充分混合均匀后在37℃下孵育35-50分钟，固化成胶后冻干，制得载雌二醇微球的脱细胞羊膜宫腔支架，加入的微球冻干粉末的质量比例为15%-40%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤A、B、C所述的冻干条件为：在冻干物品中加入质量体积百分浓度为5%的甘露醇后程序降温，并冷冻干燥72 h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤B所述加入的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的材料特征为聚乳酸-羟基乙酸共聚物Resomer® RG 502 H ：L:G 50:50，粘度0.16-0.24 dl/L，分子量7,000-17,000和聚乳酸-羟基乙酸共聚物Resomer® RG 503 H：L:G 50:50，粘度0.32-0.44 dl/l，分子量2,4000-3,8000。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103751122A (zh) * 2014-01-10 2014-04-30 中南大学 17β-雌二醇/PLGA缓释微球及其制备方法
CN107233623A (zh) * 2017-07-07 2017-10-10 广州润虹医药科技股份有限公司 一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法
CN107635567A (zh) * 2015-04-17 2018-01-26 加利福利亚大学董事会 用于细胞输送、细胞培养和炎症预防的脱细胞化的人羊膜
WO2019241197A1 (en) * 2018-06-11 2019-12-19 University Of Connecticut Injectable amnion hydrogel as a cell delivery system
CN111363716A (zh) * 2018-12-26 2020-07-03 谭小军 去细胞羊膜载体复合自体子宫内膜干细胞的制备

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103751122A (zh) * 2014-01-10 2014-04-30 中南大学 17β-雌二醇/PLGA缓释微球及其制备方法
CN107635567A (zh) * 2015-04-17 2018-01-26 加利福利亚大学董事会 用于细胞输送、细胞培养和炎症预防的脱细胞化的人羊膜
CN107233623A (zh) * 2017-07-07 2017-10-10 广州润虹医药科技股份有限公司 一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法
WO2019241197A1 (en) * 2018-06-11 2019-12-19 University Of Connecticut Injectable amnion hydrogel as a cell delivery system
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