CN117582545A - 一种宫腔修复材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物组织工程技术领域，具体涉及医学材料制备，尤其涉及一种宫腔修复材料及其制备方法和应用。本发明的宫腔修复材料是由动物基底膜基质和透明质酸键合形成的营养、缓释系统以及跨膜运输分子脂质体所组成的复合凝胶材料，其具有可塑性好、生物相容性好、修复周期短、粘附性好的优良特性，同时在创伤表面形成韧性膜层，屏障周围组织的粘附增生，调控创面修复快速再生微环境，促进子宫内膜的修复并改善子宫内膜厚度，使其快速恢复子宫备孕功能，促进软组织缺损的修复重建，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种宫腔修复材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物组织工程技术领域，具体涉及医学材料制备，尤其涉及一种宫腔修复材料及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

近年来，宫腔修复术多从宫腔防粘连角度出发，采用宫腔镜宫腔粘连分离术(TCRA)手术，配合术后追加雌性激素治疗、放置节育器或者其他支撑材料、置入修补材料等手段以防止粘连再形成，但宫腔基底膜修复过程中易引发感染、瘢痕，依然造成孕育功能不足。

目前宫腔修复材料较少，且来源、结构不同，其特性和效果也有较大的差异。宫腔修复补片采用脱细胞羊膜或猪小肠粘膜下层，起到屏障隔离的效果，但临床修补缝合术操作复杂，补片大小受宫腔颈大小的制约，无法保证在月经前(短期内)愈合，对轻中度的宫腔损伤治疗效果显著，但对于重度宫腔粘连(IUA)术后复发率高达62％。另有术后辅以Foley球囊结合交联透明质酸钠凝胶或生物膜等作为宫腔屏障应用较多。但是透明质酸钠凝胶为液态，易流动物质，具有向低处流动特点，在临床实际应用于防粘连时可能会随病人体位改变而流出体外从而影响治疗效果，故临床应用有较大争议。阴道栓剂、灌洗剂、口服片剂等子宫内膜修复制剂无法保证治疗药物与内膜损伤部位紧密接触并维持长时间有效浓度。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种宫腔修复材料及其制备方法和应用。具体的，本发明的宫腔修复材料是由动物基底膜基质和透明质酸键合形成的营养、缓释系统以及跨膜运输分子脂质体所组成的复合凝胶材料，其具有可塑性好、生物相容性好、修复周期短、粘附性好的优良特性，同时在创伤表面形成韧性膜层，屏障周围组织的粘附增生，调控创面修复快速再生微环境，促进子宫内膜的修复并改善子宫内膜厚度，使其快速恢复子宫备孕功能，促进软组织缺损的修复重建。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种宫腔修复材料，所述宫腔修复材料至少包含第一组分和第二组分，所述第一组分可以为基底膜基质温敏凝胶；所述第二组分可以为包裹基底膜基质成分的脂质体-醛基化透明质酸(O-HA)溶液。

采用上述方法获得的基底膜基质温敏凝胶，其溶胶-凝胶相变临界点为35～42℃，从而使其可以以溶液形式注射到需要治疗的区域后，在受试者体温温度刺激下在用药部位发生溶胶-凝胶的相转变。

所述第二组分包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液是由脂质体包裹基底膜基质成分后与O-HA溶液混合均匀后获得。

需要说明的是，第一组分、第二组分使用前为液体状态，当注射到使用部位后，第一组分在使用部位形成原位凝胶，并与第二组分交联，一方面可以根据损伤创面的形状进行重新塑形，填充损伤区域；另一方面其在损伤部位不易滑脱，可以增加在损伤部位的作用时间，提高治疗效果。

本发明的第二个方面，提供上述宫腔修复材料的制备方法，所述制备方法包括：

S1、基底膜基质温敏凝胶制备；

S2、包裹基底膜基质成分的脂质体混悬液制备；

S3、包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液制备。

本发明的第三个方面，提供上述宫腔修复材料在制备宫腔修复凝胶产品中的应用。

所述宫腔修复凝胶产品至少具有如下任意一种或多种用途：

(a)抗炎；

(b)抗瘢痕；

(c)修复宫腔基；

(d)屏障并粘附腔壁；

(e)恢复子宫备孕功能。

本发明的第四个方面，提供一种宫腔修复凝胶产品，所述宫腔修复凝胶产品至少包含上述宫腔修复材料。

进一步的，所述宫腔修复凝胶产品具体可以为医疗器械。

本发明的第五个方面，提供一种宫腔修复方法，所述方法至少包括对受试者施用上述宫腔修复材料或上述宫腔修复凝胶产品。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果如下：

(1)上述技术方案采用动物基底膜基质材料，在相变条件下自组装成凝胶，其内部呈现三维网络结构和固有的力学性能，模拟机体(如人体)宫腔基底膜细胞再生的营养环境，可为细胞生长和组织再生创造良好的微环境，促进受损组织修复。

(2)上述技术方案采用脂质体包裹基底膜基质成分，促进创伤部位对基底膜基质成分的吸收，发挥脂质体在创面快速愈合方面的优势。

(3)上述技术方案采用包裹基底膜基质成分的脂质体与O-HA溶液混合，再与基底膜基质温敏凝胶复合，O-HA可以与宫腔壁、基底膜基质发生席夫碱反应，增加了材料与宫腔壁的粘附力，避免靶向脂质体在损伤部位快速流失，延长其滞留时间；同时降低炎症和瘢痕发生的风险。

(4)上述技术方案制备的宫腔修复凝胶具备自组装和覆膜粘附特性，可塑性强，对于不规则组织损伤的修复具有独特的优势。第一组分、第二组分使用前为液体状态，当注射到使用部位后，第一组分在使用部位形成原位凝胶，并与第二组分交联，一方面可以根据损伤创面的形状进行重新塑形，填充损伤区域。另一方面其在损伤部位不易滑脱，可以增加在损伤部位的作用时间。

(5)上述技术方案通过构建SD大鼠宫腔软组织缺损模型，HE染色观察受损组织的再生效果，证实材料具有促再生、降低炎症和瘢痕发生的作用，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1制备的第一组分扫描电镜图片。

图2为本发明实施例1制备的脂质体图片。

图3为本发明实施例2三组样品流变力学分析，其中，A为a、b组样品的弹性模量G'和粘性模量G"，B为c组样品的弹性模量G'和粘性模量G"。

图4为本发明实施例3中各实验组细胞相对增殖率。

图5为本发明HE染色观察受损组织的再生效果；其中，A为实验组3HE染色，100×；B为实验组3HE染色，400×；C为实验组4HE染色，100×；D为实验组4HE染色，400×。

图6为本发明实施例4中实验组2、实验组3修复后2天、4天、6天的大鼠子宫内膜组织白细胞介素-22(IL-22)的相对含量。

图7为本发明实施例4中实验组2、实验组3修复后2天、4天、6天的大鼠子宫内膜组织血管内皮生长因子(VEGF)的相对含量。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

如前所述，宫腔修复材料较少，且来源、结构不同，其特性和效果也有较大的差异。

发明人经研究发现，外泌体活性成分中的脂质体发挥大分子跨膜运输作用，是伤口快速愈合再生的关键原因之一。脂质体作为载体具有其独特优势：(1)脂质体的主要组成为磷脂和胆固醇，与细胞膜的组成类似，可以通过与细胞膜融合或内吞的方式入胞，转染效率较高；(2)脂质体的结构为球形的囊泡，可以将要递送的材料包裹于其中，能够抵御核酸酶的消化作用。然而，普通脂质体不能粘附在组织上，不能滞留在靶组织中。天然聚合物水凝胶通常含有羧基和氨基，可能与脂质体表面形成化学键，从而实现脂质体交联到水凝胶里。

同时进一步研究表明基底膜在创伤性、感染性、化学性和外科损伤引起的角膜纤维化中发挥重要作用，而促进纤维化及去纤维化机制可能在整个生物体中普遍使用。将脂质体包裹基底膜基质成分后与醛基化透明质酸溶液混合均匀，再与动物基底膜脱细胞基质交联制备得到复合修复材料，可集合脂质体、动物基底膜脱细胞基质、透明质酸的优点于一身，使宫腔修复材料更加稳定，更快发挥功效。

因此，针对临床宫腔瘢痕增生、宫腔腔壁粘连的临床症状，本发明克服了当前屏障作用不充分、修复周期较长、材料与子宫内膜粘附性差、临床操作繁琐等临床痛点，通过优化上述原料制备工艺并进行有机结合，模拟人体组织再生微环境，保留基底膜组织活性物质，制备出既能快速修复宫腔创面组织，又能促进受损宫腔重建孕育功能的创新材料。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种宫腔修复材料，所述宫腔修复材料至少包含第一组分和第二组分，所述第一组分可以为基底膜基质温敏凝胶；所述第二组分可以为包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液。

其中，所述第一组分基底膜基质温敏凝胶具体可采用非人哺乳动物的基底膜基质经酶解、无菌过滤后获得。

所述非人哺乳动物的基底膜基质中，所述非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物；进一步优选为猪。

所述基底膜基质包括但不限于非人哺乳动物的腹膜、肌腱、松质骨膜、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜和脏器膜中的至少一种；进一步优选为腹膜。

采用上述方法获得的基底膜基质温敏凝胶，其溶胶-凝胶相变临界点为35～42℃，从而使其可以以溶液形式注射到需要治疗的区域后，在体温温度刺激下可以在原位发生溶胶-凝胶的相转变。

所述第二组分包裹基底膜凝胶的脂质体-O-HA溶液是由脂质体包裹基底膜基质成分后与醛基化透明质酸混合均匀后获得。

第一组分、第二组分使用前为液体状态，当注射到使用部位后，第一组分在使用部位形成原位凝胶，并与第二组分交联，一方面可以根据损伤创面的形状进行重新塑形，填充损伤区域；另一方面其在损伤部位不易滑脱，可以增加在损伤部位的作用时间。第一组分与第二组分体积比为1～10:1，如1:1、3:1、5:1、7.5:1、10:1等。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述宫腔修复材料的制备方法，所述制备方法包括：

S1、基底膜基质温敏凝胶制备；

S2、包裹基底膜基质成分的脂质体混悬液制备；

S3、包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液制备。

其中，

所述步骤S1中，所述基底膜基质温敏凝胶制备的具体方法包括：对非人哺乳动物的基底膜基质进行酶解以及无菌过滤。

所述酶解可以采用胃蛋白酶溶液进行，具体的，所述胃蛋白酶溶液为含量为0.05％-0.5％(优选为0.1％)的酸性胃蛋白酶溶液，其pH小于6，进一步的，所述胃蛋白酶溶液的pH为3。

所述酶解及无菌过滤的具体过程包括：在室温条件(如20℃)下采用前述胃蛋白酶溶液对非人哺乳动物的基底膜基质进行酶解处理48-96h(优选为72h)后，依次通过0.45μm、0.22μm滤膜，获得基底膜基质温敏凝胶。

所述非人哺乳动物的基底膜基质中，所述非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物；进一步优选为猪。

所述基底膜基质包括但不限于非人哺乳动物的腹膜、肌腱、松质骨膜、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜和脏器膜中的至少一种；进一步优选为腹膜。

所述步骤S2的具体制备方法包括：

S2.1、基底膜基质成分制备

将步骤S1制得的基底膜基质温敏凝胶经冻干、辐照处理后溶于溶剂中，再经过超滤离心，获得分子量小于3kD的基底膜基质成分。

其中，所述辐照处理辐照灭菌剂量为15-35kGy，所述溶剂可以为水、等渗液(如PBS缓冲液、生理盐水等)或营养液，在此不做具体限定。

S2.2、包裹基底膜基质成分的脂质体混悬液制备

可采用薄膜水化法制备脂质体，具体的，采用步骤S2.1制备的基底膜基质成分水化脂质体膜，经超声处理、低温静置后形成脂质体。

具体的，所述基底膜基质成分为质量浓度为0.5％～15％(优选为10％)的基底膜基质成分溶液。基底膜基质成分与空脂质体质量比为1:1～20。

所述脂质体膜可以选用制备脂质体的常用膜材，如磷脂和胆固醇，所述磷脂为大豆磷脂，所述大豆磷脂与胆固醇的质量比为2～10:1，优选为6:1。

超声处理具体条件为：超声功率设置为200-500W(优选为350W)，超声处理时间2～5min(超声处理3min)。

需要说明的是，上述虽然以薄膜水化法为例，介绍了包裹基底膜基质成分的脂质体的制备，但是对脂质体的来源并没有特殊限制，可以采用市售产品，也可以采用本领域已知的其他脂质体制备方法自行制备，在此不做具体限定。

所述步骤S3的具体制备方法包括：取O-HA溶于PBS中，质量浓度为0.1％～5％(优选为2％)，4℃条件下放置10-20h(优选为18h)使其充分膨胀，4℃水浴作用下，将S2.2制备的包裹基底膜基质成分的脂质体悬浊液加入上述溶液中温和混匀，调节pH为酸性(pH为4.5)，即得包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液。包裹基底膜基质成分的脂质体与醛基化透明质酸的质量比为1～10:1，O-HA在第二组分中质量比为0.1％～5％。

其中，所述醛基化透明质酸可采用现有市售产品，或者自行制备获得。在本发明的一个具体实施方式中，所述醛基化透明质酸采用如下方法制备得到：透明质酸与高碘酸钠溶于水中，避光冰浴1～3h；加入乙二醇处理后，反应停止；再加入无水乙醇后，形成的醛基化透明质酸立即析出，经纯化后即得；

透明质酸与高碘酸钠的质量比为1～5:1，优选为2:1。在本发明的一个具体实施方式中，透明质酸重均分子量为1.0×10⁴～5.0×10⁵。

所述纯化步骤包括：通过1500～2500rpm离心10～30min得到O-HA，在水中重新溶解，然后用水进行透析48～96h，透析液冻干，即得到白色蓬松的O-HA。在本发明的一个具体实施方式中，所述O-HA氧化度为0.1～0.4。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述宫腔修复材料在制备宫腔修复凝胶产品中的应用。

所述宫腔修复凝胶产品至少具有如下任意一种或多种用途：

(a)抗炎；

(b)抗瘢痕；

(c)修复宫腔基；

(d)屏障并粘附腔壁；

(e)恢复子宫备孕功能。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种宫腔修复凝胶产品，所述宫腔修复凝胶产品至少包含上述宫腔修复材料。

本发明的又一具体实施方式中，所述宫腔修复凝胶产品可以为医疗器械。进一步的，当所述产品为医疗器械时，可以是药械组合产品，所述药械组合产品系指由药品与医疗器械共同组成，并作为一个单一实体生产的产品。所述药械组合产品的一个具体实施方式可以为含有上述宫腔修复材料，以及所述宫腔修复材料还可以负载药物。

所述药物其活性成分可以是核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、肽、蛋白质、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合，从而发挥抗炎、抗瘢痕、修复宫腔基、屏障并粘附腔壁以及恢复子宫备孕功能中的至少一种作用。

进一步的，所述药物还可以包含至少一种非药物活性成分，所述非药物活性成分可以包括药学上可接受的湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，在此不做具体限定。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种宫腔修复方法，所述方法至少包括对受试者施用上述宫腔修复材料或上述宫腔修复凝胶产品。

如本文所使用的，术语“受试者”是指人或任何非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在许多实施方式中，受试者是人类，特别是实施宫腔镜宫腔粘连分离术(TCRA)手术后的患者。更具体的，在本发明的一个具体实施方式中，对受试者可以先行施用第二组分，然后施用第一组分进行交联获得本发明的凝胶修复产品。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

步骤1：基底膜基质温敏凝胶制备

在20℃下，用0.001mol/L的盐酸溶液1000mL溶解1g胃蛋白酶制成pH值为3的0.1％胃蛋白酶溶液。取冻干的猪源腹膜组织细胞外基质10g，用上述配制好的胃蛋白酶溶液20℃下酶解72h后，依次通过0.45μm、0.22μm滤膜，获得室温下的无菌基质温敏凝胶预凝胶(第一组分)。过滤后的料液在20℃下真空浓缩72h后进行冷冻干燥72h(扫描电镜图片见图1)。以上步骤的具体操作方法均为本领域常规的实验方法。上述获得的基底膜脱细胞基质温敏凝胶的溶胶-凝胶相变临界点为35～42℃，从而使其可以以溶液形式注射到需要治疗的区域后，在体温温度刺激下可以在原位发生溶胶-凝胶的相转变。

步骤2：包裹基底膜基质成分的脂质体混悬液制备

(1)基底膜基质成分制备

将3.5mg步骤1制备的冻干的第一组分经过γCo₆₀ 25kGy辐照后，溶于PBS缓冲液，再经过millipore超滤管[3kD]4000×g，持续约20min超滤离心，获得分子量小于3kD的质量浓度为10％的基底膜基质成分溶液。

(2)包裹基底膜基质成分的脂质体混悬液制备

精密称取30mg大豆磷脂与5mg胆固醇溶于12mL氯仿中，然后减压蒸发除去氯仿，将所得薄膜置于真空干燥箱中去除残存的氯仿。用35mg质量浓度10％基底膜基质成分溶液水化上述脂质体膜，通过超声波细胞粉碎仪探头超声处理3min，功率设置为350W，接着在4℃静置5min以形成完整的脂质体，如此反复10次，然后先后用装有0.45μm和0.22μm滤膜的手推式注射器挤出上述所得的溶液，往复15次。得到粒径均一的包裹基质凝胶的纳米脂质体混悬液(图2所示)。

步骤3：O-HA制备

将1g透明质酸(HA，重均分子量为1.5×10⁵)和0.5g高碘酸钠的混合物溶于双蒸水中，避光冰浴2.5h。加入1mL的乙二醇30min后，反应停止。再加入1mL无水乙醇后，形成的O-HA立即析出。然后，通过2000rpm离心20min得到O-HA，在MQ H₂O中重新溶解，然后用MQ H₂O进行透析72h。最后，透析液冻干，得到白色蓬松的O-HA。O-HA氧化度为0.21。

步骤4：包裹基底膜凝胶的脂质体-O-HA溶液制备

取步骤3制备的O-HA 0.3g溶于15mL PBS中，配置为质量浓度为2％的溶液，4℃条件下放置18h使其充分膨胀，4℃水浴作用下，将步骤2制备的脂质体悬浊液0.6g加入上述溶液中温和混匀，调节pH为4.5，即得包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液(第二组分)。

将制备好的包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液每2mL均匀分布在西林瓶底部，4℃保存。

使用方法：先将步骤4制备的第二组分均匀喷涂到宫腔，半小时后，再将步骤1制备的第一组分注射到宫腔，在体温条件下形成包裹基底膜基质成分脂质体的O-HA-基底膜基质复合凝胶。第一组分与第二组分体积比为1～10:1。

实施例2力学性能评价

宫腔修复材料的力学性能可以通过流变学测试来研究，将实施例1制备的第一组分和第二组分按照体积比3:1、5:1、15:1混合，37℃保持10min，分别得到a、b、c三组样品，如图3所示，在实验频率扫描中a、b均显示为弹性模量G'大于粘性模量G"，表现出固体的特性，稳定性好，而c会随着频率增大转变为液态。说明比例范围内的宫腔修复材料的应变曲线表现出宫腔修复材料好的稳定性和粘弹性，在大的弯曲和拉伸下不会破裂，该凝胶可以适应宫缩，而不会破裂从宫腔滑脱。

实施例3凝胶化评价

实验1：将实施例1制备的第一组分、第二组分按照体积比1:1、3:1、5:1、7.5:1、10:1混合于西林瓶中，垂直放入37℃±1℃的环境中，保温，保温结束后将西林瓶轻轻取出，缓缓倒转180℃，观察其是否凝胶化(不从管壁滑脱为凝胶化)，观察凝胶化时间。结果：10min内均实现凝胶化。

实验2：在西林瓶内加入第一组分温敏凝胶，垂直放入37℃±1℃的环境中，保温，保温结束后将西林瓶轻轻取出，缓缓倒转180℃，观察其是否凝胶化(不从管壁滑脱为凝胶化)，观察凝胶化时间。结果：10min内实现凝胶化。

说明：本实验中，第二组分的存在情况下，不影响第一组分凝胶化。

实施例4细胞增殖实验

细胞铺板培养：分别用实施例1制备的第一组分、第二组分、第一组分+第二组分(体积比为3:1)包被96孔细胞培养板，接种处于对数增殖期的大鼠宫腔基底膜细胞，接种密度1000个/孔左右，设置5个平行孔，同时以不含细胞的DMEM培养基作为空白对照组。放置培养箱(37℃、5％ CO₂)培养，每两天换液。

测定细胞增殖：在培养的第3、5和7天，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃培养箱孵育3h后，吸取80μL液体加入新的96孔板内，使用酶标仪在450nm波长下检测吸光度值，计算细胞相对增殖率(RGR)。

由图4可知，实施例1制备的第一组分、第二组分及第一组分+第二组分复合凝胶在第3、5、7天时均促进细胞增殖，第一组分+第二组分复合凝胶促进作用较单独使用第一组分、第二组分更显著(P<0.05)。

实施例5大鼠子宫内膜深度损伤修复

选用性成熟未交配雌性sd大鼠，随机分为4组，每组5只，禁食12小时，麻醉后备皮、碘伏消毒，从尿道口处正中纵向切开皮肤，逐层分离进入腹腔，暴露子宫并采用手术刀片刀刃处刮5下，其中以相同的力度和搔刮次数分别对各个大鼠两侧子宫进行损伤，缝合伤口。

造模7天后，实验组1采用0.2mL基底膜基质温敏凝胶(第一组分)注射到损伤腔壁修复大鼠两侧子宫，现场观察基质不渗漏流出；实验组2采用实施例1中2％的醛基化透明质酸溶液0.05mL均匀喷涂到损伤的大鼠两侧子宫内，半小时后将0.15mL第一组分注射到宫腔，在体温条件下交联形成透明质酸-基底膜基质复合凝胶；实验组3按照实施例1中的使用方法，先将实施例1制备的包裹基底膜基质成分的脂质体-醛基化透明质酸溶液(第二组分)0.05mL均匀喷涂到宫腔，半小时后再将0.15mL实施例1制备的第一组分注射到宫腔；实验组4为模型组，正常麻醉，暴露子宫，损伤后缝合，7天后注射0.2mL的PBS。采用以上方式对比分析不同材料的修复性能。

效果验证1：大体观察

各实验组修复材料植入2天后，各实验组的精神状态、饮食、饮水、活动正常，实验组1的基底膜基质温敏凝胶部分从大鼠体内滑脱。修复术后6天实验组2暂无内腺体分泌，切口未完全愈合，无感染情况；实验组3内腺体分泌、粪便性状、切口愈合均正常，无感染情况。

效果验证2：子宫组织石蜡切片HE染色

取大鼠宫腔修复术8天后的各实验组的子宫，甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，进行HE染色。实验组4模型组与实验组3比较，如图5所示，内膜上皮较扁平(黑色箭头)，固有层疏松(白色箭头)，有少量色素沉着，肌层薄。

显微镜下观察计算各组子宫内膜的厚度和子宫腺体数目(见表1)，结果显示实验组3的子宫内膜厚度、单位面积腺体数目均与实验组4模型组相比，有显著性差异(P>0.05)，且优于实验组1和实验组2，满足备孕条件。

表1子宫内膜的厚度和子宫腺体数目

效果验证3：白细胞介素-22(IL-22)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量分析。

分别取各实验组修复后2天、4天、6天的大鼠子宫内膜组织，用预冷的PBS冲洗组织，称重后将组织剪碎用ELISA检测试剂盒分别测定组织中的IL-22、VEGF的含量。结果如图6、图7所示，发现实验组3在修复术后第2天就启动了IL-22蛋白表达，在修复术后第4天和第6天IL-22、VEGF表达较实验组1、实验组2蛋白表达量显著提高，可能是因为被包裹的基底膜基质成分在脂质体的穿透作用下，为深度损伤组织更早的提供了抗炎和再生营养环境，诱导了IL-22和VEGF表达，进而促进了局部组织血运功能和增殖修复。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种宫腔修复材料，其特征在于，所述宫腔修复材料至少包含第一组分和第二组分，所述第一组分为基底膜基质温敏凝胶；所述第二组分为包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液；

其中，所述第一组分基底膜基质温敏凝胶具体采用非人哺乳动物的基底膜基质经酶解、无菌过滤后获得；

所述第二组分包裹基底膜凝胶的脂质体-O-HA溶液是由脂质体包裹基底膜基质成分后与醛基化透明质酸混合均匀后获得。

2.如权利要求1所述的宫腔修复材料，其特征在于，所述非人哺乳动物的基底膜基质中，所述非人哺乳动物包括猪、牛、狗、羊、兔和鼠；进一步为猪；

所述基底膜基质包括非人哺乳动物的腹膜、肌腱、松质骨膜、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜和脏器膜中的至少一种；进一步为腹膜。

3.权利要求1或2所述宫腔修复材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

S1、基底膜基质温敏凝胶制备；

S2、包裹基底膜基质成分的脂质体混悬液制备；

S3、包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液制备。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述基底膜基质温敏凝胶制备的具体方法包括：对非人哺乳动物的基底膜基质进行酶解以及无菌过滤；

所述酶解采用胃蛋白酶溶液进行，具体的，所述胃蛋白酶溶液为含量为0.05％～0.5％的酸性胃蛋白酶溶液，其pH小于6，进一步的，所述胃蛋白酶溶液的pH为3；

所述酶解及无菌过滤的具体过程包括：在室温条件下采用前述胃蛋白酶溶液对非人哺乳动物的基底膜基质进行酶解处理48～96h后，依次通过0.45μm、0.22μm滤膜，获得基底膜基质温敏凝胶。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的具体制备方法包括：

S2.1、基底膜基质成分制备；

S2.2、包裹基底膜基质成分的脂质体混悬液制备。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤S2.1中，将步骤S1制得的基底膜基质温敏凝胶经冻干、辐照处理后溶于溶剂中，再经过超滤离心，获得分子量小于3kD的基底膜基质成分；

其中，所述辐照处理辐照灭菌剂量为15～35kGy，所述溶剂为水、等渗液(包括PBS缓冲液、生理盐水)或营养液；

所述步骤S2.2中，采用薄膜水化法制备脂质体，具体的，采用步骤S2.1制备的基底膜基质成分水化脂质体膜，经超声处理、低温静置后形成脂质体；

进一步的，所述基底膜基质成分为质量浓度为0.5％～15％的基底膜基质成分溶液；

所述脂质体膜选用制备脂质体的常用膜材，包括磷脂和胆固醇，所述磷脂为大豆磷脂，所述大豆磷脂与胆固醇的质量比为2～10:1；

超声处理具体条件为：超声功率设置为200～500W，超声处理时间2～5min。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的具体制备方法包括：将质量浓度为0.1％～5％的醛基化透明质酸溶液在低温条件下放置10～20h，低温水浴作用下，将所述包裹基底膜基质成分的脂质体混悬液与前述放置10～20h后的醛基化透明质酸溶液混匀，调节pH为酸性，即得包裹基底膜基质成分的脂质体-O-HA溶液。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述醛基化透明质酸采用如下方法制备得到：透明质酸与高碘酸钠溶于水中，避光冰浴1～3h；加入乙二醇处理后，反应停止；再加入等量无水乙醇后，形成的醛基化透明质酸立即析出，经纯化后即得；

透明质酸与高碘酸钠的质量比为1～5:1；进一步的，透明质酸重均分子量为1.0×10⁴～5.0×10⁵；

所述纯化步骤包括：通过1500～2500rpm离心10～30min得到O-HA，在水中重新溶解，然后用水进行透析48～96h，透析液冻干，即得到白色蓬松的O-HA；进一步的，所述O-HA氧化度为0.1～0.4。

9.权利要求1或2所述宫腔修复材料或权利要求3～8任一项所述制备方法制得的宫腔修复材料在制备宫腔修复凝胶产品中的应用；

进一步的，所述宫腔修复凝胶产品至少具有如下任意一种或多种用途：

(a)抗炎；

(b)抗瘢痕；

(c)修复宫腔基；

(d)屏障并粘附腔壁；

(e)恢复子宫备孕功能。

10.一种宫腔修复凝胶产品，其特征在于，所述宫腔修复凝胶产品至少包含权利要求1或2所述宫腔修复材料或权利要求3～8任一项所述制备方法制得的宫腔修复材料；

进一步的，所述宫腔修复凝胶产品为医疗器械。