CN116688138A - 阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法 - Google Patents
阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法,首先称取来源于兰科植物白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.的质量合格的药材饮片或块茎,药材经过破碎后加入纯化水,进行动态热浸渍提取,提取液经过冷藏静置、减压浓缩、一次醇沉、离心分离,再经过复溶、脱蛋白、脱色、二次醇沉、离心分离、干燥与粉碎,得到具有白色疏松孔隙结构的白及葡配甘露聚糖,其纯度较高(含量≥95%)、易溶于水、水溶液黏度高、生物黏附性好与可生物降解;可制备成阴道给药系统新剂型如水凝胶、微球、泡沫剂、膜剂与海绵剂等,且制剂成型性、载药性、生物相容性与释药性能优良本发明简单易行、成本低廉的制备方法,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法。
背景技术
阴道给药系统具有可避免口服给药的首过效应和血药浓度峰谷现象导致的不良反应;可避免药物对于胃肠道的刺激与肝肾损伤;局部靶向作用强,生物利用度高,药效显著;还具有能将药物高效传递到子宫循环系统的“第一子宫传递效应”等优点,因此,阴道给药系统已成为临床上治疗女性妇科疾病的重要手段。目前,阴道给药系统的常用剂型有水凝胶、微球、泡沫剂、膜剂与海绵剂等,其制剂性能与释药行为取决于载体材料。功能性辅料对于阴道给药系统的性能提升具有十分重要的促进作用,其可以与药物之间发挥协同作用而提高疗效降低不良反应、可以延长药物在阴道内的滞留时间而减少给药次数提高患者的依从性、可以降低药物对阴道黏膜的刺激性,同时,材料自身可以生物降解而避免传统惰性材料由于无法降解而存在的诱发黏膜刺激性与易排出体外而污染衣物等弊端。因此,功能性载体材料已成为阴道给药系统领域研发的热点和主流趋势。
白及葡配甘露聚糖是兰科药用植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的主要活性成分,其具有广泛而显著的药理活性如抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、止血、抑菌、促进创面愈合与抑制血管新生等;同时,该聚糖高分子水溶性好,溶于水后可形成分子内氢键而其水溶液具有较高的黏稠度和生物黏附性,在体内可生物降解,对人体安全无毒。由于白及葡配甘露聚糖主要是由甘露糖和葡萄糖组成的一种中性多糖,且二者通过β型糖苷键聚合可形成稳定的空间螺旋结构,因此,对大多数药物具有良好的相容性和包载性。基于上述优点,白及葡配甘露聚糖具有作为一种新型功能性医用辅料的巨大潜力,可广泛用作新型给药系统如水凝胶、微球、纳米粒、伤口敷料与体内支架或植入剂等的载体材料。
本发明以白及干燥块茎为原料,提供了一种简单、低廉而普适的方法制备白及葡配甘露聚糖;并系统考察了白及葡配甘露聚糖制备阴道给药系统各剂型的成型性、生物黏附性、可降解性、刺激性、释药性能以及对阴道黏膜的修复保护作用,从而为阴道给药系统的研究开发提供了一种功能性辅料-白及葡配甘露聚糖。因此,本发明具有较大临床应用价值,其社会意义巨大、应用前景广阔。
发明内容
本发明的目的是提供一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法,可简单、高效与低成本的制备性能优良的白及葡配甘露聚糖,并系统考察了白及葡配甘露聚糖制备阴道给药各剂型的制剂成型性、释药性能、生物黏附性、可降解性、刺激性以及对阴道黏膜的修复保护等作用,提供了白及葡配甘露聚糖作为阴道给药系统功能性辅料的依据和基础,为有效避免传统惰性材料制备阴道给药系统存在的与药物之间无疗效的协同作用、易诱发黏膜刺激性、无黏膜修复保护作用与由于无法降解而易排出体外污染衣物而降低患者依从性等弊端提供了可靠的解决方案。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案为:一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖,所述白及葡配甘露聚糖的原材料为兰科植物白及的干燥块茎。
本发明所采用的另一种技术方案为:一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法,具体步骤如下:
步骤一:根据制剂需要,称取白及药材饮片质量份5份,粗碎后加入其质量份15~20倍量的纯化水,浸泡120~180min,于85~90℃搅拌下进行多次动态热浸渍提取,将多次的提取液合并冷却至室温后,置于4℃的环境中静置12h,吸取A上清液,备用,将沉淀层弃掉;
步骤二:将步骤一所得的A上清液进行减压浓缩得到A浓缩物,将A浓缩物处于室温环境中加入95%乙醇使其含醇量达到50~55%,间隔1~2h后,继续添加95%乙醇使其最终含醇量达到75~80%,阴凉处静置24h,经离心分离,得到湿白及葡配甘露聚糖粗品,将其置于洁净的医用塑料包装袋,扎口密闭,置于冷库存放,备用;
步骤三:称取步骤二所得湿白及葡配甘露聚糖粗品,加入60~65%的纯化水,通过均质机或胶体磨使其溶解完全并达到浓度为35~40%,然后加入其总体积15~20%的沉淀剂,搅拌至混匀,静置12h,吸取B上清液,弃掉沉淀层,在B上清液中继续加入总体积15~20%的沉淀剂,搅拌至混匀,静置24h,吸取C上清液,备用,弃掉沉淀层;
步骤四:在步骤三所得C上清液中,加入总体积5~7%的医用双氧水,搅拌混合均匀,用氨水调节体系的pH=7.0±0.2,静置1.5~2.5h,进行真空浓缩,浓缩至无明显的溶剂冷凝析出,得到B浓缩物,待其冷却至室温后,加入95%乙醇使含醇量达到80~85%,静置12h,经离心甩干,得到精制的白及葡配甘露聚糖湿样品,再于65~70℃鼓风干燥,得到白色干燥物,备用;
步骤五:将步骤四得到的白色干燥物进行粉碎、质检,得到白色粉末状白及葡配甘露聚糖,密闭包装,阴凉干燥处存放,即得到阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖。
作为本发明的一种优选技术方案,所述步骤一中动态热浸渍提取次数为3次,且每次提取时间为60min。
作为本发明的一种优选技术方案,所述步骤二中减压浓缩的真空度为:
-0.08~-0.1MPa。
作为本发明的一种优选技术方案,所述步骤二中A浓缩物1mL等于原药材1g。
作为本发明的一种优选技术方案,所述步骤三中沉淀剂为体积比为4:1的二氯甲烷与正丁醇的混合物。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明采用动态热水浸渍法提取白及葡配甘露聚糖,可提高聚糖高分子在热水中的扩散速度和药材内外的浓度梯度,进而提高提取效率,避免了传统静态浸渍法由于无法维持较高的浓度梯度而提取效率低下,也避免了沸水煎煮法提取时由于过度加热致使杂质含量较多、后续纯化困难与部分产物降解损失的弊端;将白及提取液进行冷藏静置,利用自然沉降原理使不溶性杂质沉淀、析出、结饼而易于除掉,减少杂质含量、提高产品纯度和色泽;将提取液浓缩后进行分步梯度醇沉,可避免聚糖高分子形成沉淀不充分的包埋团块而造成除杂质不充分;通过离心分离出白及葡配甘露聚糖粗品,以湿状态置于冷库存放,由于湿的聚糖高分子具有絮状孔道结构且该结构中含有高浓度乙醇,因此不腐败而利于存放,也能有效保持这种絮状孔道结构而易溶于水,避免了传统需要烘干存放与烘干后复溶困难而不利于加工处理的问题。
2、本发明采用连续两步法除蛋白,是将粗品聚糖高分子复溶于纯化水后通过连续的两步法加入沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V)可充分除掉蛋白类杂质(蛋白类杂质是导致聚糖高分子韧性增强与溶解困难的主要原因),再通过双氧水脱色,即可保障产品的色泽和纯度,避免了传统单次加入沉淀剂无法充分除掉蛋白而引起的产品在干燥过程发黄变色与溶解困难的弊端;通过真空浓缩,除掉沉淀剂,再进行第二次醇沉,以进一步除掉聚糖高分子上残留的沉淀剂,同时,通过二次醇沉可使聚糖高分子形成特殊的疏松多孔的絮状沉淀,这种疏松多孔的独特结构利于湿聚糖干燥过程易于挥发除掉溶剂而干燥,并得到具有微孔结构和脆性较强的白色干燥物,因此干燥物易溶于水、易于粉碎加工,避免了传统真空浓缩后直接干燥存在的有机溶剂残留与干燥物复溶困难的弊端,避免了使用冷冻干燥法周期长、成本高、产量低的弊端,也避免了传统工艺制备多糖存在的烘干后干燥物韧性大而难于粉碎加工的弊端。
3、采用本发明方法制备的白及葡配甘露聚糖,为白色块状或粉末(粉碎后),纯度高(纯度≥95%),粉末不易吸潮流动性好、易溶于水;该聚糖高分子能够促进阴道黏膜细胞增殖、促进组织中胶原蛋白表达而对黏膜起到修复保护作用,同时具有良好的抗炎作用,能够生物降解而对黏膜无刺激性;可制备成如水凝胶、微球、泡沫剂、膜剂与海绵剂等阴道给药系统制剂,且成型性、载药性与释药行为优良。因此,白及葡配甘露聚糖可作为一种用于阴道给药系统的功能性辅料而具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖对人体阴道上皮细胞相对生长率对照图;
图2为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖对人体阴道上皮细胞作用后的形态与生长对照图;
图3为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖对阴道组织胶原蛋白表达对照图;
图4为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖在阴道模拟液中的降解情况对照图;
图5为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖对阴道黏膜的刺激性对照图;
图6为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖对药物的包载性能对照图;
图7为以采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖制备的阴道给药系统各剂型示意图;
图8为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖制备的各剂型给药系统的释药对照图;
图9为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖的外观示意图与扫描电镜图;
图10为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖的XRD图谱;
图11为采用本发明的制备方法的白及葡配甘露聚糖的不同剂量的生物粘附性对照图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解,从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖,所述白及葡配甘露聚糖的原材料为兰科植物白及的干燥块茎。
一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法,具体步骤如下:
步骤一:根据制剂需要,称取白及药材饮片质量份5份,粗碎后加入其质量份15~20倍量的纯化水,浸泡120~180min,于85~90℃搅拌下进行3次动态热浸渍提取,且每次提取时间为60min,将3次的提取液合并冷却至室温后,置于4℃的环境中静置12h,吸取A上清液,备用,将沉淀层弃掉;
步骤二:将步骤一所得的A上清液在真空度为:-0.08~-0.1MPa的环境下进行减压浓缩得到A浓缩物,且A浓缩物1mL等于原药材1g,将A浓缩物处于室温环境中加入95%乙醇使其含醇量达到50~55%,间隔1~2h后,继续添加95%乙醇使其最终含醇量达到75~80%,阴凉处静置24h,经离心分离,得到湿白及葡配甘露聚糖粗品,将其置于洁净的医用塑料包装袋,扎口密闭,置于冷库存放,备用;
步骤三:称取步骤二所得湿白及葡配甘露聚糖粗品,加入60~65%的纯化水,通过均质机或胶体磨使其溶解完全并达到浓度为35~40%,然后加入其总体积15~20%的沉淀剂,所述沉淀剂为体积比为4:1的二氯甲烷与正丁醇的混合物,搅拌至混匀,静置12h,吸取B上清液,弃掉沉淀层,在B上清液中继续加入总体积15~20%的沉淀剂,搅拌至混匀,静置24h,吸取C上清液,备用,弃掉沉淀层;
步骤四:在步骤三所得C上清液中,加入总体积5~7%的医用双氧水,搅拌混合均匀,用氨水调节体系的pH=7.0±0.2,静置1.5~2.5h,进行真空浓缩,浓缩至无明显的溶剂冷凝析出,得到B浓缩物,待其冷却至室温后,加入95%乙醇使含醇量达到80~85%,静置12h,经离心甩干,得到精制的白及葡配甘露聚糖湿样品,再于65~70℃鼓风干燥,得到白色干燥物,备用;
步骤五:将步骤四得到的白色干燥物进行粉碎、质检,得到白色粉末状白及葡配甘露聚糖,密闭包装,阴凉干燥处存放,即得到阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖。
本发明所制备白及葡配甘露聚糖,可以制备成阴道给药系统的相关剂型如水凝胶、微球、泡沫剂、膜剂与海绵剂,其制剂成型性、载药性与释药行为优良;此外,白及葡配甘露聚糖生物黏附性高、可生物降解而与阴道组织具有良好的生物相容性,同时,该聚糖能够促进阴道黏膜细胞增殖、促进组织中胶原蛋白表达与具有良好的抗炎作用,因此,可作为一种用于阴道给药系统的功能性辅料。
以下通过对本发明的制备方法制备的白及葡配甘露聚糖,进行药学相关实验进一步说明本发明所产生的有益效果:
(一)对大鼠阴道炎的抗炎作用
1.1、实验方法
将大鼠随机分为空白组、模型组、白及葡配甘露聚糖(简称葡甘露聚糖)凝胶高、中、低剂量组(1.2、0.6、0.3g/kg)、复方甲硝唑组(0.4g/kg)、凝胶基质组,每组各10只。选用白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌建立大鼠混合感染性阴道炎模型,观察葡甘露聚糖凝胶对阴道炎的局部治疗作用,空白组不做处理。造模结束后开始局部给药治疗,治疗结束后,酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL-1β、IL-6、IL-8)、表皮生长因子(EGFR)的含量;苏木精-伊红(HE)染色法观察阴道黏膜组织病理形态学变化。
1.2、实验结果
模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8大于空白组大鼠,差异有统计学意义(P<0.01),模型组血清中EGFR含量明显小于空白组大鼠,差异有统计学意义(P<0.01);给药后,葡甘露聚糖凝胶各剂量组、复方甲硝唑组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8均小于模型组大鼠,差异有统计学意义(P<0.01),EGFR含量均大于模型组大鼠,差异有统计学意义(P<0.01);结果表明,白及葡配甘露聚糖可通过降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的含量、升高EGFR的含量而对阴道炎具有明显的抗炎作用。
(二)对人体阴道上皮细胞VK2/E6E7(ATCC-CRL2616)的影响
2.1、实验方法
将人体阴道上皮细胞VK2/E6E7(ATCC-CRL2616)以传代的方式制成单细胞悬液,用吸管轻轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液(6μL左右),在技术版上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。在倒置显微镜下,用10X物镜观察技术版四角大方格中的细胞数。细胞计数后,将细胞稀释成100μL 5000个细胞的单细胞悬液,种于96孔板中,每孔100μL细胞悬液。设置未处理细胞对照组和接受处理细胞对照组,每孔设3个复孔。种板后的细胞培养24h,待细胞贴壁后,吸弃培养基,将白及葡配甘露聚糖不同剂量(10mg/L,20mg/L,40mg/L)分别与培养贴壁后的细胞接触处理72h,处理结束后,吸弃液体。避光,每孔加入10μl的MTT Stock,37℃培养箱内继续孵育4h。吸弃培养基,每孔加100μl MTT溶解剂,摇床室温下轻柔摇15min,37℃孵育半h,倒置显微镜观察紫色结晶全部溶解。在570nm波长下测量OD吸光度值,检测细胞的活性和增殖情况,以相对生长率(relative growth rate,RGR)表示:
RGR=(ODe÷ODc)×100%,其中ODe表示实验组、ODc表示空白组。
同时,将与白及葡配甘露聚糖作用后的模型细胞,用扫描电镜对细胞形态与生长情况进行观察。
2.2、实验结果
结合图1-2所示,高中低三个剂量组的相对生长率高于空白组,具有显著性差异(t-test,p<0.05),结果表明本发明制备的白及葡配甘露聚糖对人阴道上皮细胞VK2/E6E7安全无毒并具有显著的促进细胞增殖作用,细胞形态结构完整,排列紧密有序,并能够减少细胞损伤且具有剂量依耐性。
其中,图2中A-对照组,B-低剂量组,C-中剂量组,D-高剂量组。
(三)对阴道组织中胶原蛋白表达的影响
胶原蛋白对阴道组织的完整性、柔韧性以及盆底结缔组织韧性强弱有着重要作用,其中主要是I型(Collagen I)和III型胶原蛋白(Collagen III)。Collagen I直径较粗,抗张能力强,具有出色的抗拉伸强度,起支持作用;Collagen III直径较细,柔韧性强,主要存在于需要增加柔初性和扩张力并承受周期性压力的组织中,而弹性纤维则为组织提供弹性和张力。Collagen I和Collagen III结构和功能的完整性异常,使阴道组织韧性、弹力降低,引起支撑盆腔肌纤维强度降低而影响盆底结构和功能。
3.1、实验方法
将成年健康雌性SD大鼠分别随机分为模型组(造模后不给予药物)、空白组(不作任何处理)、白及葡配甘露聚糖高中低剂量组(10mg/L,20mg/L,40mg/L)。除空白组外,其余各组按照建立大鼠阴道炎动物模型的标准操作规范制作成白色念珠菌的模型,使模型大鼠阴道黏膜局部出现充血、肿胀、黏膜糜烂、伪膜及分泌物增多等症状。模型组和空白组不给予任何药物,葡甘露聚糖组按照高、中、低剂量连续给药7天。给药结束后,处死动物,取100mg新鲜阴道组织,PBS洗净血污,冰上剪碎组织。配制裂解液,RIPA:PMSF=100:1,加入剪碎的组织中,超声震荡1min,冰上裂解30min,4℃13000g离心30min,取上清于新EP管中,备用。采用免疫蛋白印记法(western-blot)检测胶原蛋白I蛋白、胶原蛋白III蛋白的表达。主要步骤:SDS-PAGE凝胶制备及灌胶,上样、电泳、切胶及制备硝酸纤维素膜(PVDF)、转膜、抗原封闭、加入一抗和二抗,在避光条件下显影,具体操作方法按试剂盒说明书步骤进行。
3.2、实验结果
实验结果表明,如图3所示,白及葡配甘露聚糖能够促进阴道组织Collagen I和Collagen III的表达,且具有剂量依耐性。通过阴道组织Collagen I和Collagen III的表达可以修复受损的病灶组织,同时可提高盆底结缔组织韧性强度增加而对阴道机能退化引起的盆腔脏器脱垂和尿失禁有一定的预防作用。
(四)白及葡配甘露聚糖的降解性
4.1、实验方法:
按照如下配方制备阴道模拟液:3.51g/L的NaCl、1.4g/L的KOH、0.222g/L的Ca(OH)2、1g/L的乙酸、2g/L的乳酸、0.16g/L的甘油、0.4g/L的尿素与5g/L D-葡萄糖,溶解于纯化水并用1mol/L盐酸调节pH=4.5。量取20mL阴道模拟液置于锥形瓶中,加入50mg的白及葡配甘露聚糖,然后于37℃水浴孵育6h,取混合液采用傅里叶变换红外色谱(FTIR,Bruker-Tnesor27)进行扫描。
4.2、实验结果
如图4所示,白及葡配甘露聚糖降解物具有与葡萄糖与甘露糖一致的特征峰,而失去原聚糖分子的特征峰,结果表明白及葡配甘露聚糖能在阴道模拟液中降解成单糖片段(参考图3),因而具有良好的生物相容性而可以避免对阴道黏膜产生刺激。
(五)白及葡配甘露聚糖对阴道黏膜的安全性评价
5.1、实验方法:
成年健康日本大耳雌性白兔12只,体重2.0~2.5kg;饲养环境为室温18~22℃,相对湿度40~50%。
按照《消毒技术规范》(卫生部2002版)中阴道黏膜刺激性试验方法进行。将试验动物随机分为4组,对照组和葡配甘露聚糖高中低剂量组,每组3只。操作方法,①白及葡配甘露聚糖高中低剂量组:将8cm长的导尿管与2mL注射器连接,注射器和导尿管内注满受试样品聚糖高中低剂量组(10mg/L,20mg/L,40mg/L),将兔子仰面固定并暴露出会阴和阴道口,将导尿管润湿后插入阴道约5cm,并注入2mL受试物。②对照组:给予等体积生理盐水作同样处理。
24h后处死实验动物,解剖取出兔子阴道组织,纵向切开,肉眼观察有无充血、水肿等;然后将阴道组织置于10%的甲醛溶液中固定48h,取出阴道的内端、中央和外端3个部位的组织进行HE染色和病理组织学检查。
表1阴道刺激反应症状和评分标准:
表1阴道刺激反应症状和评分标准
注意:0为无刺激性;1~3为最小刺激性;4~6为轻度刺激性;7~9为中度刺激性;10~12为明显刺激性。
5.2、实验结果:
肉眼观察外阴及阴道有无异常分泌物,用生理盐水冲洗干净,肉眼观察给药处阴道黏膜有无红斑、水肿等刺激反应症状。病理观察结果如下表2和图5所示,由下表2可知:葡配甘露聚糖高中低剂量组的动物均未出现无红斑、水肿等刺激反应症状,而对照组兔子则出现一定程度的炎症状况。图5所示,A为高剂量组、B为中剂量组、C为低剂量组、D为对照组,对照组与葡配甘露聚糖高中低剂量组的阴道上皮结构相似,均能观察到鳞状上皮细胞完整,无明显的血管扩张与细胞坏死,肌层结构完整。结果表明本发明的白及葡配甘露聚糖对阴道黏膜无刺激。
表2阴道黏膜刺激反应评分:
(六)白及葡配甘露聚糖载药性能评价
6.1、实验方法:
药用辅料作为一种药学上可接受的药物递送聚合物,其载药能力和相容性是赋形剂的基本性能。众所周知,较高的载药能力通常与赋形剂的更好相容性呈正相关。以积雪草苷为模型药物,通过不同的积雪草苷负载制剂(药物:白及葡配甘露聚糖=0.3:1、0.5:1、0.7:1和1:1,w/w)研究聚糖高分子对药物负载能力,使用X射线衍射仪(XRD,X'Pert PRO,Netherlands)扫描测定药物、聚糖高分子与不同药物负载量的聚糖高分子制剂。扫描条件:Cu-Kα在45kV和40mA下辐射,测试范围为5°~90°,扫描速率为2°/min。
6.2、实验结果:
如图6所示,由于白及葡配甘露聚糖具有疏松的空隙结构,因此与药物的相容性良好且包载量较大,最高可达50%左右。
白及葡配甘露聚糖的制剂成型性
7.1、实验方法:
以白及葡配甘露聚糖为载体材料,制备阴道给药系统相关剂型如水凝胶、膜剂、泡沫剂、微球与海绵剂;同时测定药物(以积雪草苷为模型药物)在各剂型中的释药行为。
7.2、实验结果:
如图7所示,以白及葡配甘露聚糖为载体材料可制备得到水凝胶、膜剂、泡沫剂、微球与海绵剂,各剂型成型性良好。
此外,如图8所示,各剂型可与阴道黏膜发生紧密黏附作用,可以耐受阴道自洁作用的冲刷而延长制剂在体内的滞留时间。不同的剂型具有不同的释药行为如缓释或速释,因此,可满足不同的临床治疗需求。
实施例1
一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法;
步骤一:根据需要,称取符合现行版《中国药典》质量标准的白及药材质量份5份,破碎后加入15倍量纯化水,浸泡180min,于85℃搅拌下进行3次动态热浸渍提取,且每次提取时间为60min,将3次的提取液合并冷却至室温后,置于冷库静置12h,吸取A上清液,沉淀层弃掉,得A上清液,备用;
步骤二:将步骤一所得A上清液在真空度-0.08~-0.1MPa的真空度下进行减压浓缩,得到1mL等于原药材1g的A浓缩物,放至室温,加入95%乙醇使其含醇量达到50%,间隔1h后,继续添加95%乙醇使其含醇量达到75%,常温下静置24h,经离心分离,得到湿白及葡配甘露聚糖粗品,将其置于洁净的医用塑料包装袋,扎口密闭,置于冷库存放,备用;
步骤三:称取步骤二所得的湿白及葡配甘露聚糖粗品,加入纯化水,通过均质机或胶体磨使其溶解完全并达到浓度为35%,加入总体积20%的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V),搅拌至混匀,静置12h,吸取B上清液,沉淀层弃掉,向B上清液中继续加入总体积15%的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V),搅拌至混匀,静置24h,吸取C上清液,沉淀层弃掉,得C上清液,备用;
步骤四:在步骤三所得C上清液中,加入总体积5%的医用双氧水,搅拌混合均匀,用氨水调节体系的pH=7.0±0.2,静置1.5h,进行真空浓缩,浓缩至无明显的溶剂冷凝析出,得到B浓缩物,冷却至室温后,加入95%乙醇使含其醇量达到80%,静置12h,经离心甩干,得到精制的白及葡配甘露聚糖湿样品,再于65~70℃鼓风干燥,得到白色干燥物,备用;
步骤五:将步骤四得到的白色干燥物进行粉碎、质检,得到白色粉末状白及葡配甘露聚糖,密闭包装,阴凉干燥处存放,即得本发明一种用于阴道给药系统的功能性辅料-白及葡配甘露聚糖。
实施例2
一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法;
步骤一:根据需要,称取符合现行版《中国药典》质量标准的白及药材质量份5份,破碎后加入15倍量纯化水,浸泡120min,于90℃搅拌下进行3次动态热浸渍提取,且每次提取时间为60min,将3次的提取液合并冷却至室温后,置于冷库静置12h,吸取A上清液,沉淀层弃掉,得A上清液,备用;
步骤二:将步骤一所得A上清液在真空度-0.08~-0.1MPa的真空度下进行减压浓缩,得到1mL等于原药材1g的A浓缩物,放至室温,加入95%乙醇使含醇量达到55%,间隔1h后,继续添加95%乙醇使含醇量达到80%,常温下静置24h,经离心分离,得到湿白及葡配甘露聚糖粗品,将其置于洁净的医用塑料包装袋,扎口密闭,置于冷库存放,备用;
步骤三:称取步骤二所得的湿白及葡配甘露聚糖粗品,加入纯化水,通过均质机或胶体磨使其溶解完全并达到浓度为40%,加入总体积15%的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V),搅拌至混匀,静置12h,吸取B上清液,沉淀层弃掉,向B上清液中继续加入总体积20%的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V),搅拌至混匀,静置24h,吸取C上清液,沉淀层弃掉,得C上清液,备用;
步骤四:在步骤三所得C上清液中,加入总体积7%的医用双氧水,搅拌混合均匀,用氨水调节体系的pH=7.0±0.2,静置2.5h,进行真空浓缩,浓缩至无明显的溶剂冷凝析出,得到B浓缩物,冷却至室温后,加入95%乙醇使其含醇量达到85%,静置12h,经离心甩干,得到精制的白及葡配甘露聚糖湿样品,再于65~70℃鼓风干燥,得到白色干燥物,备用;
步骤五:将步骤四得到的白色干燥物进行粉碎、质检,得到白色粉末状白及葡配甘露聚糖,密闭包装,阴凉干燥处存放,即得本发明一种用于阴道给药系统的功能性辅料-白及葡配甘露聚糖。
实施例3
一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法;
步骤一:根据需要,称取符合现行版《中国药典》质量标准的白及药材质量份5份,破碎后加入18倍量纯化水,浸泡150min,于87℃搅拌下进行3次动态热浸渍提取,且每次提取时间为60min,将3次的提取液合并冷却至室温后,置于冷库静置12h,吸取A上清液,沉淀层弃掉,得A上清液,备用;
步骤二:将步骤一所得A上清液在真空度-0.08~-0.1MPa的真空度下进行减压浓缩,得到1mL等于原药材1g的A浓缩物,放至室温,加入95%乙醇使含醇量达到53%,间隔1h后,继续添加95%乙醇使含醇量达到78%,常温下静置24h,经离心分离,得到湿白及葡配甘露聚糖粗品,将其置于洁净的医用塑料包装袋,扎口密闭,置于冷库存放,备用;
步骤三:称取步骤二所得的湿白及葡配甘露聚糖粗品,加入纯化水,通过均质机或胶体磨使其溶解完全并达到浓度为38%,加入总体积17%的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V),搅拌至混匀,静置12h,吸取B上清液,沉淀层弃掉,向B上清液中继续加入总体积17%的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V),搅拌至混匀,静置24h,吸取C上清液,沉淀层弃掉,得C上清液,备用;
步骤四:在步骤三所得C上清液中,加入总体积6%的医用双氧水,搅拌混合均匀,用氨水调节体系的pH=7.0±0.2,静置2h,进行真空浓缩,浓缩至无明显的溶剂冷凝析出,得到B浓缩物,冷却至室温后,加入95%乙醇使其含醇量达到83%,静置12h,经离心甩干,得到精制的白及葡配甘露聚糖湿样品,再于65~70℃鼓风干燥,得到白色干燥物,备用;
步骤五:将步骤四得到的白色干燥物进行粉碎、质检,得到白色粉末状白及葡配甘露聚糖,密闭包装,阴凉干燥处存放,即得本发明一种用于阴道给药系统的功能性辅料-白及葡配甘露聚糖。
实施例4
一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法;
步骤一:根据需要,称取符合现行版《中国药典》质量标准的白及药材质量份5份,破碎后加入15倍量纯化水,浸泡120min,于86℃搅拌下进行3次动态热浸渍提取,且每次提取时间为60min,将3次的提取液合并冷却至室温后,置于冷库静置12h,吸取A上清液,沉淀层弃掉,得A上清液,备用;
步骤二:将步骤一所得A上清液在真空度-0.08~-0.1MPa的真空度下进行减压浓缩,得到1mL等于原药材1g的A浓缩物,放至室温,加入95%乙醇使含醇量达到55%,间隔1h后,继续添加95%乙醇使含醇量达到75%,常温下静置24h,经离心分离,得到湿白及葡配甘露聚糖粗品,将其置于洁净的医用塑料包装袋,扎口密闭,置于冷库存放,备用;
步骤三:称取步骤二所得的湿白及葡配甘露聚糖粗品,加入纯化水,通过均质机或胶体磨使其溶解完全并达到浓度为36%,加入总体积20%的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V),搅拌至混匀,静置12h,吸取B上清液,沉淀层弃掉,向B上清液中继续加入总体积20%的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V),搅拌至混匀,静置24h,吸取C上清液,沉淀层弃掉,得C上清液,备用;
步骤四:在步骤三所得C上清液中,加入总体积6%的医用双氧水,搅拌混合均匀,用氨水调节体系的pH=7.0±0.2,静置2h,进行真空浓缩,浓缩至无明显的溶剂冷凝析出,得到B浓缩物,冷却至室温后,加入95%乙醇使其含醇量达到85%,静置12h,经离心甩干,得到精制的白及葡配甘露聚糖湿样品,再于65~70℃鼓风干燥,得到白色干燥物,备用;
步骤五:将步骤四得到的白色干燥物进行粉碎、质检,得到白色粉末状白及葡配甘露聚糖,密闭包装,阴凉干燥处存放,即得本发明一种用于阴道给药系统的功能性辅料-白及葡配甘露聚糖。
如图9所示,采用本发明方法制备的白及葡配甘露聚糖呈白色固体状,同时,干燥的白及葡配甘露聚糖具有空间网状结构,可通过毛细管作用而易溶于水,其水溶液成无色透明的黏稠状凝胶态,如图10所示,XRD扫描显示其有错综结晶结构而具有良好的刚性和脆性。
如图11所示,采用本发明方法制备的白及葡配甘露聚糖具有良好的生物黏附性,且随剂量增大而逐渐增加。良好的生物黏附性可以使阴道给药系统制剂能够黏附于阴道黏膜而耐受阴道自洁作用的冲刷,以提高药物制剂在体内的滞留时间而延长治疗效果。
本发明是基于白及葡配甘露聚糖的特点以及传统提取制备方法的不足,采用简单、高效与易于工业化推广的技术制备而成。
1.本发明采用的原料为兰科植物白及[Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.]的干燥块茎,又称白根、地螺丝、白鸡儿、白鸡娃、连及草、羊角七。白及,味苦、甘、涩,性平微寒,归肺、胃、肝经。白及具有祛腐生肌、消肿止血的功效。《本草纲目》记载:“白及,性涩而收,得金秋之令,故能入肺止血,生肌治疮也”,素有“外科最善”之称。现代药理研究认为白及的主要有效物质为所含的多糖类成分,主要是白及葡配甘露聚糖,其主要由甘露糖和葡萄糖组成的一种中性多糖,以甘露糖居多,二者比例大约4:1并通过β型糖苷键聚合形成稳定的空间螺旋结构。白及葡配甘露聚糖具有抗溃疡、抗炎、抑菌、抗肿瘤、止血、可促进创面愈合等广泛的药理活性;同时,可降解、生物黏附性良好,可制备成水凝胶、微球、纳米粒、膜剂与泡沫气雾剂等多种给药系统,无抗原性可作为体内植入剂载体材料,毒理安全性评价表明其对人体安全无刺激、无过敏,是一种优良的功能性辅料新材料。因此,白及葡配甘露聚糖作为一种用于阴道给药系统的功能性辅料应用前景广阔、需求量大,开发其简单、高效、普适的制备工艺具有重要意义。
2.本发明采用动态热水浸渍法提取白及葡配甘露聚糖,可提高聚糖高分子在热水中的扩散速度和药材内外的浓度梯度,进而提高提取效率,避免了传统静态浸渍法由于无法维持较高的浓度梯度而提取效率低下,也避免了沸水煎煮法提取时由于过度加热致使杂质含量较多、后续纯化困难与部分产物降解损失的弊端;将白及提取液进行冷藏静置,利用自然沉降原理使不溶性杂质沉淀、析出、结饼而易于除掉,减少杂质含量、提高产品纯度和色泽;将提取液浓缩后进行分步梯度醇沉,可避免聚糖高分子形成沉淀不充分的包埋团块而造成除杂质不充分;通过离心分离出白及葡配甘露聚糖粗品,以湿状态置于冷库存放,由于湿的聚糖高分子具有絮状孔道结构且该结构中含有高浓度乙醇,因此不腐败而利于存放,也能有效保持这种絮状孔道结构而易溶于水,避免了传统需要烘干存放与烘干后复溶困难而不利于加工处理的问题。
3.本发明采用采用连续两步法除蛋白,是将粗品聚糖高分子复溶于纯化水后通过连续的两步法加入沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇=4:1,V/V)可充分除掉蛋白类杂质(蛋白类杂质是导致聚糖高分子韧性增强与溶解困难的主要原因),再通过双氧水脱色,即可保障产品的色泽和纯度,避免了传统单次加入沉淀剂无法充分除掉蛋白而引起的产品在干燥过程发黄变色与溶解困难的弊端;通过真空浓缩,除掉沉淀剂,再进行第二次醇沉,以进一步除掉聚糖高分子上残留的沉淀剂,同时,通过二次醇沉可使聚糖高分子形成特殊的疏松多孔的絮状沉淀,这种疏松多孔的独特结构利于湿聚糖干燥过程易于挥发除掉溶剂而干燥,并得到具有微孔结构和脆性较强的白色干燥物,因此干燥物易溶于水、易于粉碎加工,避免了传统真空浓缩后直接干燥存在的有机溶剂残留与干燥物复溶困难的弊端,避免了使用冷冻干燥法周期长、成本高、产量低的弊端,也避免了传统工艺制备多糖存在的烘干后干燥物韧性大而难于粉碎加工的弊端。
4.采用本发明方法制备的白及葡配甘露聚糖,为白色块状或粉末(粉碎后),纯度高(纯度≥95%),粉末不易吸潮流动性好、易溶于水;该聚糖高分子能够促进阴道黏膜细胞增殖、促进组织中胶原蛋白表达而对黏膜起到修复保护作用,同时具有良好的抗炎作用,能够生物降解而对黏膜无刺激性;可制备成如水凝胶、微球、泡沫剂、膜剂与海绵剂等阴道给药系统制剂,且成型性、载药性与释药行为优良。因此,白及葡配甘露聚糖可作为一种用于阴道给药系统的功能性辅料而具有广阔的应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖,其特征在于:所述白及葡配甘露聚糖的原材料为兰科植物白及的干燥块茎。
2.根据权利要求1所述的一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
步骤一:根据制剂需要,称取白及药材饮片质量份5份,粗碎后加入其质量份15~20倍量的纯化水,浸泡120~180min,于85~90℃搅拌下进行多次动态热浸渍提取,将多次的提取液合并冷却至室温后,置于4℃的环境中静置12h,吸取A上清液,备用,将沉淀层弃掉;
步骤二:将步骤一所得的A上清液进行减压浓缩得到A浓缩物,将A浓缩物处于室温环境中加入95%乙醇使其含醇量达到50~55%,间隔1~2h后,继续添加95%乙醇使其最终含醇量达到75~80%,阴凉处静置24h,经离心分离,得到湿白及葡配甘露聚糖粗品,将其置于洁净的医用塑料包装袋,扎口密闭,置于冷库存放,备用;
步骤三:称取步骤二所得湿白及葡配甘露聚糖粗品,加入60~65%的纯化水,通过均质机或胶体磨使其溶解完全并达到浓度为35~40%,然后加入其总体积15~20%的沉淀剂,搅拌至混匀,静置12h,吸取B上清液,弃掉沉淀层,在B上清液中继续加入总体积15~20%的沉淀剂,搅拌至混匀,静置24h,吸取C上清液,备用,弃掉沉淀层;
步骤四:在步骤三所得C上清液中,加入总体积5~7%的医用双氧水,搅拌混合均匀,用氨水调节体系的pH=7.0±0.2,静置1.5~2.5h,进行真空浓缩,浓缩至无明显的溶剂冷凝析出,得到B浓缩物,待其冷却至室温后,加入95%乙醇使含醇量达到80~85%,静置12h,经离心甩干,得到精制的白及葡配甘露聚糖湿样品,再于65~70℃鼓风干燥,得到白色干燥物,备用;
步骤五:将步骤四得到的白色干燥物进行粉碎、质检,得到白色粉末状白及葡配甘露聚糖,密闭包装,阴凉干燥处存放,即得到阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖。
3.根据权利要求2所述的一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法,其特征在于:所述步骤一中动态热浸渍提取次数为3次,且每次提取时间为60min。
4.根据权利要求2所述的一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法,其特征在于:所述步骤二中减压浓缩的真空度为:-0.08~-0.1MPa。
5.根据权利要求2所述的一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法,其特征在于:所述步骤二中A浓缩物1mL等于原药材1g。
6.根据权利要求2所述的一种阴道给药系统的功能性辅料白及葡配甘露聚糖的制备方法,其特征在于:所述步骤三中沉淀剂为体积比为4:1的二氯甲烷与正丁醇的混合物。
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