CN115887615A - 一种复方抗hpv生物蛋白凝胶敷料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复方抗hpv生物蛋白凝胶敷料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。该敷料通过在阴道壁形成一层保护膜，物理隔离病原微生物，从而阻止病原微生物在阴道壁定植。该敷料利用经过修饰后的酸酐化牛β‑乳球蛋白/β‑葡聚糖表面带有非常多负电荷与HPV衣壳蛋白正电荷区域结合，阻断病毒侵入宿主细胞，达到阻断HPV感染的目的，预防HPV感染引起的皮肤病变，降低物理治疗后尖锐湿疣复发率。胶状卡波姆可将失活的HPV病毒吸附、包裹排出体外，并加快糜烂组织快速修复、再生和愈合。通过上述作用机理用于降低HPV载量，缓解阴道炎引起的分泌物增多、瘙痒、疼痛，以及宫颈炎等引起的充血、水肿等症状。

Description

一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料及其制备方法和应用。
背景技术
人乳头瘤状病毒(HPV)的传播途径主要是性传播，人类是唯一的宿主。HPV 可分为高危型HPV(HR-HPV)和低危型(LR-HPV)。世界卫生组织(WHO)已确认HR-HPV感染是宫颈癌的首要病因及发生的必要条件。目前针对HPV感染的治疗较多，其中局部用药为常用方法之一，药物种类繁多，但临床治愈率均不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料，该凝胶敷料是通过在阴道壁形成一层保护性凝胶膜，将阴道壁与病原微生物进行物理隔离，同时通过酸酐化牛β-乳球蛋白和β-葡聚糖复方混合，均提高抗病毒和隔离病毒的特性，从而达到预期用途，用于解决现有技术多是以单纯靠药物治疗的方法或物理疗法为主导致的治疗效果较差，且容易出现副作用带来的其他新的病症。
本发明通过以下技术方案实现：
一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料，所述复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
酸酐化牛β-乳球蛋白0.1wt％-0.3wt％、卡波姆0.3wt％-0.9wt％、甘油1 wt％-8wt％、β-葡聚糖0.05wt％-0.2wt％、三乙醇胺0.01wt％-0.05wt％、余量为纯化水。
上述提供了一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料，该凝胶敷料是由酸酐化牛β-乳球蛋白、卡波姆、甘油、β-葡聚糖、三乙醇胺和纯化水组成。该凝胶敷料中酸酐化牛β-乳球蛋白作为病毒进入的抑制剂应用于复方抗HPV感染；卡波姆作为增稠剂；甘油作为保湿剂；β-葡聚糖起增强皮肤免疫力；三乙醇胺作为酸碱调节剂。酸酐化牛β-乳球蛋白和β-葡聚糖复合使用，再搭配其他原料，能够具有的功效如下：a.阻断生殖道高危HPV感染，用于降低HPV载量，预防宫颈病变发生。b.阻断HPV感染，用于HPV感染引起的皮肤病变，降低物理治疗后尖锐湿疣复发率。c.通过在阴道壁形成一层保护性凝胶膜。将阴道壁与外界细菌物理隔离，从而阻止病原微生物定植。d.用于缓解阴道炎引起的分泌物增多、瘙痒、疼痛，以及宫颈炎、宫颈柱状上皮异位引起的充血、水肿、分泌物增多的症状；葡聚糖也具有隔离病毒，降低HPV载量功能。
上述除纯化水外，原材料酸酐化牛β-乳球蛋白、卡波姆、甘油、β-葡聚糖、三乙醇胺均来源于正规的生产企业，在使用前均进行所有项目检验合格后方可使用。纯化水符合《中华人民共和国药典》标准的要求(详见检测报告)，为保证产品质量，纯化水应为最新制备。
作为优选地，所述复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
酸酐化牛β-乳球蛋白0.2wt％、卡波姆0.6wt％、甘油5wt％、β-葡聚糖0.1 wt％、三乙醇胺0.03wt％、余量为纯化水。
酸酐化的β-乳球蛋白液，用磷酸盐缓冲液透析3-5次，就可以得到修饰β-乳球蛋白。因为β乳球蛋白在酸酐化修饰后，其表面净值负电荷明显增加，具有了阻断HPV假病毒感染细胞的能力。上述将酸酐化牛β-乳球蛋白作为病毒进入的抑制剂应用于复方抗HPV感染。酸酐化是采用4-羟基苯酐、4-羟基苯酐的衍生物、琥珀酸酐或马来酸酐对蛋白进行修饰而得。复方抗HPV功能性妇科敷料中β-乳球蛋白的含量为2‰。
β-葡聚糖是一种广泛存在于细菌、真菌、藻类和植物(如：大麦和燕麦) 细胞壁中的多醣，由几种不同类型的beta-糖苷键连接在一起，形成线状或分枝状结构。例如，谷物(燕麦和大麦)具有(1,3/1,4)连接模式，而来自真菌来源(蘑菇和酵母)的β-葡聚醣具有(1,3/1,6)连接模式，各自有不同程度的侧链分支附着在主干上。侧链分支的次数和长度已被证明对生物活性具有重要意义，一般来说，分支程度越高，生物活性就越强，常被宣称的效果有：增强免疫、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和伤口愈合等。β–葡聚糖通过结合巨噬细胞、树状细胞等自然免疫系统细胞受体，将信息传递到细胞内，促进产生细胞分裂素，结果将激活T细胞、HK细胞等活性，增强人体免疫力。β-葡聚糖除了能促进朗格罕氏细胞增殖从而能增强皮肤的免疫能力,临床研究也表明β-葡聚糖还具有显著的消炎、抗过敏活性,并能有助于皮肤抵御外源性的各种机械和化学刺激。0.2％浓度β-葡聚糖与含有1.0％氢化可的松的化妆品中可具有同样的消炎作用。同时，β-葡聚糖还可以明显降低由果酸等有刺激性的活性成分所引起的皮肤过敏炎症的作用。
一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照相应质量分数选取β-葡聚糖和甘油分散均匀后留作备用物A；
(2)按照相应质量分数选取酸酐化牛β-乳球蛋白和纯化水充分混匀，获得备用物B；
(3)按照相应质量分数选取纯化水后置于乳化装置中进行均质处理，将乳化装置升温至80-90℃后，保温20-30min之后降温至50-60℃，加入步骤(1) 的备用物A混匀处理；
(4)待步骤(3)处理结束降温至40-50℃时，加入三乙醇胺搅拌；
(5)待步骤(4)处理结束降温至不高于40℃时，加入备用物B搅拌至料体透明无杂质，过滤，放料，获得成品。
作为优选地，所述步骤(3)中，纯化水置于乳化装置中进行均质处理时，采用均质速度为20-30HZ进行。
作为优选地，所述步骤(3)中，加入步骤(1)的备用物A混匀处理时，采用均质速度为20-30HZ，均质时长为2-3min。
作为优选地，所述步骤(4)中，加入三乙醇胺搅拌时，搅拌时长为2-3min，搅拌速度为15-20HZ。
作为优选地，所述步骤(5)中，加入备用物B搅拌时，搅拌时长为3-5min，搅拌速度为15-20HZ。
作为优选地，所述步骤(5)中，过滤时采用200-400目滤布。
一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料在制备复方抗HPV生物蛋白凝胶产品中的应用，其特征在于，采用所述的复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料或如所述的复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法获得。
上述复方抗HPV生物蛋白凝胶产品对HPV病毒抑制的一个作用原理：利用正负电荷非特异性相互。具体为：
a、经过修饰后的酸酐化牛β-乳球蛋白/β-葡聚糖表面带有非常多负电荷与 HPV衣壳蛋白的L1的C端和L2肽段的N端的正电荷区域结合，阻断病毒侵入宿主细胞，从而达到阻断HPV感染的目的。
b、酸酐化牛β-乳球蛋白/β-葡聚糖表面的负电荷与人类乳头瘤病毒(HPV) 颗粒上的正电荷相互络合，从而导致HPV蛋白构象变化而失活。同时胶状卡波姆可将失活的HPV病毒吸附、包裹排出体外，并加快糜烂组织快速修复与再生，促进愈合。
c、通过上述作用机理与工作原理在阴道壁形成一层保护性凝胶膜。将阴道壁与外界进行物理隔离，从而阻止病原微生物定植。
与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
本发明提供了一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料，该凝胶敷料中酸酐化牛β-乳球蛋白作为病毒进入的抑制剂应用于复方抗HPV感染；卡波姆作为增稠剂；甘油作为保湿剂；β-葡聚糖起增强皮肤免疫力；三乙醇胺作为酸碱调节剂。酸酐化牛β-乳球蛋白和β-葡聚糖复合使用，再搭配其他原料，能够具有的功效如下：a.阻断生殖道高危HPV感染，用于降低HPV载量，预防宫颈病变发生。 b.阻断HPV感染，用于HPV感染引起的皮肤病变，降低物理治疗后尖锐湿疣复发率。c.通过在阴道壁形成一层保护性凝胶膜。将阴道壁与外界细菌物理隔离，从而阻止病原微生物定植。d.用于缓解阴道炎引起的分泌物增多、瘙痒、疼痛，以及宫颈炎、宫颈柱状上皮异位引起的充血、水肿、分泌物增多的症状；葡聚糖也具有隔离病毒，降低HPV载量功能。
该生物蛋白凝胶敷料通过在阴道壁形成一层保护性凝胶膜，将阴道壁与病原微生物进行物理隔离，阻止病原微生物定植，从而达到预期用途，它一改常规技术以单纯靠药物治疗的方法，以物理疗法为主，辅助药物的方法对HPV感染者提供了一个新的选择。通过上述作用机理用于降低HPV载量，缓解阴道炎引起的分泌物增多、瘙痒、疼痛，以及宫颈炎等引起的充血、水肿等症状。
该生物蛋白凝胶敷料利用经过修饰后的酸酐化牛β-乳球蛋白/β-葡聚糖表面带有非常多负电荷与HPV衣壳蛋白的L1的C端和L2肽段的N端的正电荷区域结合，阻断病毒侵入宿主细胞，从而达到阻断HPV感染的目的。酸酐化牛β-乳球蛋白/β-葡聚糖表面的负电荷与人类乳头瘤病毒(HPV)颗粒上的正电荷相互络合，从而导致HPV蛋白构象变化而失活。同时胶状卡波姆可将失活的 HPV病毒吸附、包裹排出体外，并加快糜烂组织快速修复与再生，促进愈合。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的一种具体实施方式的技术方案为：
一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料，所述复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
酸酐化牛β-乳球蛋白0.1wt％-0.3wt％、卡波姆0.3wt％-0.9wt％、甘油1 wt％-8wt％、β-葡聚糖0.05wt％-0.2wt％、三乙醇胺0.01wt％-0.05wt％、余量为纯化水。
上述除纯化水外，原材料酸酐化牛β-乳球蛋白、卡波姆、甘油、β-葡聚糖、三乙醇胺均来源于正规的生产企业，在使用前均进行所有项目检验合格后方可使用。纯化水符合《中华人民共和国药典》标准的要求(详见检测报告)，为保证产品质量，纯化水应为最新制备。
作为优选地，所述复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
酸酐化牛β-乳球蛋白0.2wt％、卡波姆0.6wt％、甘油5wt％、β-葡聚糖0.1 wt％、三乙醇胺0.03wt％、余量为纯化水。
一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照相应质量分数选取β-葡聚糖和甘油分散均匀后留作备用物A；
(2)按照相应质量分数选取酸酐化牛β-乳球蛋白和纯化水充分混匀，获得备用物B；
(3)按照相应质量分数选取纯化水后置于乳化装置中进行均质处理，将乳化装置升温至80-90℃后，保温20-30min之后降温至50-60℃，加入步骤(1) 的备用物A混匀处理；
(4)待步骤(3)处理结束降温至40-50℃时，加入三乙醇胺搅拌；
(5)待步骤(4)处理结束降温至不高于40℃时，加入备用物B搅拌至料体透明无杂质，过滤，放料，获得成品。
作为优选地，所述步骤(3)中，纯化水置于乳化装置中进行均质处理时，采用均质速度为20-30HZ进行。
作为优选地，所述步骤(3)中，加入步骤(1)的备用物A混匀处理时，采用均质速度为20-30HZ，均质时长为2-3min。
作为优选地，所述步骤(4)中，加入三乙醇胺搅拌时，搅拌时长为2-3min，搅拌速度为15-20HZ。
作为优选地，所述步骤(5)中，加入备用物B搅拌时，搅拌时长为3-5min，搅拌速度为15-20HZ。
作为优选地，所述步骤(5)中，过滤时采用200-400目滤布。
一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料在制备复方抗HPV生物蛋白凝胶产品中的应用，其特征在于，采用所述的复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料或如所述的复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法获得。
实施例1：
一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
(1)先将称量好的纯化水840.7g称入乳化锅中，打开均质速度为20-30HZ，乳化锅升温至90℃左右，保温30分钟后开始降温；
(2)称量配方中纯化水10g及酸酐化牛β-乳球蛋白2g充分搅拌，使其溶解；
(3)将β-葡聚糖1g装容器中用处方量的甘油50g分散均匀；
(4)待乳化锅温度降至60℃左右时，加入分散均匀的甘油、β-葡聚糖溶液，将均质速度调为20-30HZ，均质2分钟左右。待降温至50℃左右时，加入三乙醇胺并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20HZ；待乳化锅降温至40℃以下时，加入预先单独溶解好的酸酐化牛β-乳球蛋白溶液，充分搅拌3-5分钟，搅拌速度为15-20HZ，观察料体透明无杂质，取样检验合格后，用200目滤布过滤后，放料。
实施例2：
一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
(1)先将称量好的纯化水840.7g称入乳化锅中，打开均质速度为20-30HZ，乳化锅升温至80℃左右，保温20分钟后开始降温；
(2)称量配方中纯化水10g及酸酐化牛β-乳球蛋白2g充分搅拌，使其溶解；
(3)将β-葡聚糖1g装容器中用处方量的甘油50g分散均匀；
(4)待乳化锅温度降至50℃左右时，加入分散均匀的甘油、β-葡聚糖溶液，将均质速度调为20-30HZ，均质3分钟左右。待降温至40℃左右时，加入三乙醇胺并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20HZ；待乳化锅降温至40℃以下时，加入预先单独溶解好的酸酐化牛β-乳球蛋白溶液，充分搅拌3-5分钟，搅拌速度为15-20HZ，观察料体透明无杂质，取样检验合格后，用400目滤布过滤后，放料。
使用方法：本产品根据其适用范围及使用人群，预期在医疗机构或家庭中使用，使用部位为阴道。使用本品前应确认产品包装完好，无破损。本品可涂于外阴，也可采用阴道推注的给药方式；每晚睡前，将给凝胶器轻轻插入阴道深处，利用助推杆将凝胶推入，若有少量凝胶流出，擦净即可；每天一次，每次一支，连用15天为一疗程。本产品仅需按产品说明书使用，在使用过程中无其它特殊的使用环境条件要求。皮肤疣使用：清洁患处皮肤，取本品外敷于患处，每天2～3次，每两周为一个疗程。尖锐湿疣患者建议先冷冻或激光治疗后再使用本品。
实验例一：动物刺激试验(阴道刺激)
1、实验目的：本试验根据国家标准GB/T 16886.10-2017《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验》中推荐的方法进行家兔阴道刺激试验，对供试样品引起阴道刺激反应的潜在性进行评价。
方法：将试验样品(实施例1制备得到的产品)原样注入家兔阴道内(lmL/ 只)，每次间隔(24士2)h，重复上述步骤，连续5d。将0.9％氯化钠注射液作阴性对照，同法操作。初次接触后(24士2)h和每次试验前检查动物阴道溢液、水肿和/或其他感染、刺激和I或损伤迹象。末次给药(24士2)h后取下的整个阴道组织放入10％福尔马林中固定后进行组织病理学检查。每块阴道组织应取其两端和中央三部分。对阴道每一组织进行评分。试验组全部动物显微镜评价记分相加后再除以观察总数即得出试验组平均记分。对照组同法计算。试验组平均记分减去对照组平均记分即得出刺激指数。
结果：新西兰兔阴道组织显微镜观察评分为0。
结论：在本试验条件下，试验样品对家兔阴道刺激试验组织显微镜观察评分为0。阴道刺激反应类型为无刺激反应。
2试验样品、对照品及其他溶媒、介质信息
2.1试验样品
样品名称：实施例1制备得到的产品。运输：置常温干燥处保存。预期用途/应用：1.阻断生殖道高危HPV感染，用于降低HPV载量，预防宫颈病变发生。2阻断HPV感染，用于HPV感染引起的皮肤病变，降低物理治疗后尖锐湿犹复发率。3.通过在阴道壁形成一层保护性凝胶膜。将阴道壁与外界细菌物理隔离，从而阻止病原微生物定植。用于缓解阴道炎引起的分泌物增多、骚痒、疼痛，以及宫颈炎、宫颈柱状上皮异位引起的充血、水肿、分泌物增多的症状。
2.2阴性对照品
0.9％氯化钠注射液，由广西裕源药业有限公司生产。
2.3供试品制备：直接吸取1.0mL本试验样品为供试品，阴性对照同法操作。
3实验系统
实验动物品种/品系新西兰兔等级普通级性别雌性使用数量6只。供应单位湖南太平生物科技有限公司动物使用体重范围2.0～2.Skg。
选择动物理由：GB/T 16886.10-2017《刺激与皮肤致敏试验阴道刺激》推荐使用该种动物。
4试验方法
4.1试验前准备：将一短软管(6cm)与一容量大于lmL的注射器连接，注射器和导管注满样品后可使动物能接受lmL试验样品。将动物置于固定器中固定，以便于接触阴道。导管可用对照液进行润湿处理。
4.2给样方法：提起动物尾巴暴露阴道口，然后将润湿处理过的导管轻柔地插入阴道，用注射器注入lmL试验样品，抽出导管。如有溢出，可用软纸轻轻拭去溢出的液体。每次间隔(24土2)h重复上述步骤，共5d。阴性对照同法操作。
4.3动物观察：初次接触后24h和每次实验操作前注意并记录阴道口及会阴部位溢液、红斑和水肿迹象。对于出现过度溢液、红斑或难以给药的动物，应无痛处死后做组织病理学检查。
4.4结果评价：末次给药(24土2)h后无痛处死动物，取下的整个阴道组织放入10％福尔马林中固定后进行组织病理学检查。每块阴道组织应取其两端和中央三部分。对阴道每一组织进行评芬了试验组全部动物显微镜评价记分相加后再除以观察总数即得出试验组平均记分。对照组同法计算。试验组平均记分减去对照组平均记分即得出刺激指数。
4.5给药日期：2022年07月18日-2022年07月22日。解剖日期：2022 年07月23日。
5结果与评价
5.1阴道组织检查评分标准
1、上皮反应：正常，完好无损，记0分；细胞变性或变扁平，记1分；组织变形，记2分；局部糜烂，记3分；广泛糜烂，记4分。
2、白细胞浸润(每个高倍视野)反应：无，记0分；极少＜25个，记1 分；轻度26-50个，记2分；中度51-100个，记3分；重度＞100个，记4 分。
3、血管充血反应：无，记0分；极轻，记1分；轻度，记2分；中度，记 3分；重度伴血管破裂，记4分。
4、水肿反应：无，记0分；极轻，记1分；轻度，记2分；中度，记3分；重度，记4分。
刺激指数：
平均记分 反应程度
0 无
1-4 极轻
5-8 轻度
9-11 中度
12-16 重度
5.2阴道刺激肉眼观察结果
试验组(实施例1制备得到的产品)初次接触后(24士2)h和每次实验操作前阴道口及会阴部位均未见溢液、红斑和水肿迹象。
阴性对照组(0.9％氯化钠注射液)初次接触后(24土2)h和每次实验操作前阴道口及会阴部位均未见溢液、红斑和水肿迹象。
5.3阴道刺激大体解剖观察结果
试验组(实施例1制备得到的产品)大体解剖观察未见上皮层的刺激、损伤以及坏死迹象。具体结果见组织病理学观察记录表。
阴性对照组(0.9％氯化钠注射液)大体解剖观察未见上皮层的刺激、损伤以及坏死迹象。具体结果见组织病理学观察记录表。
5.4显微镜下阴道组织观察结果
阴性对照组(0.9％氯化钠注射液)：IFOl、1F02、1F03号动物阴道上端、中央端、下端粘膜上皮正常，完好无损、固有层结缔组织内未见血管充血、水肿、炎症细胞浸润等病理变化，评分均为0分。
试验组(实施例1制备得到的产品)：2F01、2F02、2F03号动物阴道上端、中央端、下端粘膜上皮正常，完好无损、固有层结缔组织内未见血管充血、水肿、炎症细胞浸润等病理变化，评分均为0分。具体结果见组织病理学观察记录表。
6结论：在本试验条件下，实施例1制备得到的产品对家兔阴道刺激试验组织显微镜观察评分为0。阴道刺激反应类型为无刺激反应。
表7组织组织病理学观察记录表
Figure BDA0003921495370000131
Figure BDA0003921495370000141
注：上述表格中的*代表：上皮/白细胞浸润/血管充血/水肿。
实验例二：皮肤致敏试验(封闭贴敷试验)
1实验目的：本试验根据国家标准GB/T 16886.10-2017《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验》中推荐的皮肤致敏试验中封闭贴敷试验的要求进行试验，对样品引起豚鼠迟发型超敏反应的潜在性进行评价。
方法：豚鼠经过一段时间反复接触试验样品进行诱导后(对照组给予0.9％氯化钠注射液浸透吸水性纱布)，用试验样品对试验组全部试验动物在剃毛的未试部位进行激发。并在除去敷贴片后24h、48h再对所有动物激发部位皮肤反应进行分级。阴性对照组动物同法操作。
结果：试验组动物和阴性对照组动物激发部位皮肤均未见敷贴试验反应，评分等级均为0，致敏发生率均为0。
结论：在本试验条件下，实施例制备得到的产品对豚鼠皮肤致敏试验未引起豚鼠皮肤致敏反应。
2.试验样品、对照品及其他溶媒、介质信息
2.1试验样品
样品名称：样品名称：实施例1制备得到的产品。运输：置常温干燥处保存。预期用途/应用：l阻断生殖道高危HPV感染，用于降低HPV载量，预防宫颈病变发生。2.阻断HPV感染，用于HPV感染引起的皮肤病变，降低物理治疗后尖锐湿犹复发率。3.通过在阴道壁形成一层保护性凝胶膜。将阴道壁与外界细菌物理隔离，从而阻止病原微生物定植。用于缓解阴道炎引起的分泌物增多、报痒、疼痛，以及宫颈炎、宫颈柱状上皮异位引起的充血、水肿、分泌物增多的症状。生产单位：湖南银华棠医药科技有限公司，由湖南银华棠医药科技有限公司提供。
0.9％氯化钠注射液，由广西裕源药业有限公司生产。吸水性纱布，生产单位：湖南康沃医疗用品有限公司。
2.3供试品制备：取样品0.5mL/份浸透2.5cmx2.5cm的吸水性纱布，阴性对照用0.5mL/份0.9％氯化钠注射液浸透2.5cmx2.5cm的吸水性纱布。
2.4阳性对照品的制备：诱导，称取1-氯2,4-二硝基苯100mg，加75％乙醇溶液，配制成1％的溶液，0.5mL/份浸透2.5cmx2.5cm的吸水性纱布；激发称取1-氯-2,4-二硝基苯50mg,加75％乙醇溶液，配制成0.1％的溶液，0.5mL/份浸透2.5cmx2.5cm的吸水性纱布。
3实验系统
实验动物品种/品系白化豚鼠等级；动物使用体重范围300～400g。
4试验系统合理性
白化豚鼠是国家标准GB/T 16886.10-2017《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤过敏》推荐使用的动物，在该类实验研究中，认为是最敏感的动物模型。该实验采用2,4-二硝基氯苯(DNCB)作为豚鼠致敏物，已在本公司得到试验证实。阳性对照皮肤致敏敷贴反应等级为2.0，致敏发生率均为100％，完成日期2022.06.06-2022.07.08。
5试验方法
5.1准备：在试验开始前剃除动物全部试验部位被毛，选用健康、皮肤无损伤动物进行试验。
5.2诱导阶段：用样品0.5mL/份浸透2.5cmx2.5cm的吸水性纱布，置于玻璃纸之上，用压敏胶带封闭固定于每只动物的左E胥祁位。6h后除去固定物和敷贴片。一周连续3天重复该步骤，同法连续操作3周。对照组动物使用0.5mL/ 份0.9％氯化钠注射液浸2.5cmx2.5cm的吸水性纱布同法操作。
5.3激发阶段：最后一次诱导贴敷后14d,用试验样品对全部试验动物和对照动物进行激发。取样品0.5mL/份浸透2.5cmx2.5cm的吸水性纱布，置于同样大小的玻璃纸之上，用压敏胶带封闭固定于每只动物的右上背部位。6h后除去固定物和贴敷片，去除敷贴片24h后剃去激发部位及周围动物被毛并用温水清洗脱毛区。
5.4诱导日期：2022年07月18日～2022年07月20日；
2022年07月25日～2022年07月27日；
2022年08月01日～2022年08月03日；
5.5激发日期：2022年08月17日
5.6观察：除去贴敷片后24h、48h观察试验组和对照组动物激发位皮肤反应情况，按Magnusson和Kligman分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行描述并分级。
评分表：
敷贴试验反应 等级
无明显改变 0
散发性或斑点状红斑 1
中度融合性红斑 2
重度红斑和/或水肿 3
6试验结果
6.1临床观察结果：试验过程中试验组和阴性对照组所有动物未见异常表现。
6.2致敏反应结果：试验组动物与阴性对照组动物激发部位皮肤均未见敷贴试验反应，未观察到明显致敏反应症状，评分等级为0，致敏发生率均为0。具体情况详见附表l。
阳性对照组动物激发后(24h和48h)激发部位皮肤均可见明显敷贴试验反应 (本实验室每6个月进行一次阳性对照试验)，激发后24h动物平均记分等级为2.0，致敏发生率均为mo％；激发后48h动物平均记分等级为1.8，致敏发生率均为100％。详见附表2。
7结论
在本试验条件下，试验样本对豚鼠皮肤致敏试验未引起豚鼠皮肤致敏反应。
附表1：致敏反应试验观察结果
Figure BDA0003921495370000181
Figure BDA0003921495370000191
附表2：致敏阳性反应试验观察结果(2022/6/6-2022/7/8)
Figure BDA0003921495370000192
Figure BDA0003921495370000201
实验例三：体外细胞毒性试验(MTT法)
1、实验目的：本试验根据GB/T 16886.5《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》中四嗤盐(MTT)比色法进行体外细胞毒性试验，对样品引起细胞毒性的风险进行评价。
方法：取样品按O.lg/mL浸提后，取浸提液4个浓度(100％、50％、25％、12.5％) 的供试液加入到96孔培养板内(孔内为经24小时培养的细胞)，置CO2恒温培养箱37土1℃培养24小时后，采用四嗤盐(MTT)比色法，在酶标仪570run波长下测定吸光度(参照波长650run),计算相对存活率。
结果：培养结束后，在酶标仪570run波长下测定吸光度(参照波长650nm), 空白OD570平均值为0.38，左右两列空白平均值与全部平均值相差为1.6％,阴性对照组细胞相对存活率83.2％,无潜在细胞毒性；阳性对照组细胞相对存活率 21.2％,具有潜在细胞毒性；供试品组100％浸提液细胞相对存活率80.1％,无潜在细胞毒性；供试品组50％浸提液细胞相对存活率94.4％,无潜在细胞毒性。
结论：在本次试验条件下，按标准判定，试验样本产品细胞毒性为无潜在细胞毒性。
2试验材料
2.1试验样品
样品名称：实施例1制备得到的产品。运输：置常温干燥处保存。预期用途/应用：l阻断生殖道高危HPV感染，用于降低HPV载最，预防宫颈病变发生。2.阻断HPV感染，用于HPV感染引起的皮肤病变，降低物理治疗后尖锐湿苀复发率。3通过在阴道壁形成一层保护性凝胶膜。将阴道壁与外界细菌物理隔离，从而阻止病原微生物定植。用于缓解阴道炎引起的分泌物增多、痉痒、疼痛，以及宫颈炎、宫颈柱状上皮异位引起的充血、水肿、分泌物增多的症状。
2.2阴性对照品：高密度聚乙烯树脂，生产单位：山东优索化工科技有限公司。
2.3阳性对照品：二甲基亚砚(DMSO),批号：20210821,规格：500mL, 生产单位：天津市科密欧化学试剂有限公司。
2.4培养基：MEM细胞培养基，生产单位：procell公司。
2.5胎牛血清：生产单位：gibco公司。
2.6抗生素：青霉素链霉素溶液，生产单位：Phygene公司。
2.7胰酶：0.25％胰酶，生产单位：Phygene公司。
2.8四唑盐(MTT),生产单位：Solarbio@公司。
2.9异丙醇，生产单位：国药集团化学试剂有限公司。
2.10供试品制备：无菌操作，取供试品1.05g,加入10.5mL细胞培养液，詈37±1℃含5％的CO2恒温培养箱中浸提24小时，以100％浸提液作为母液，用MEM细胞培养液稀释成50％、25％、12.5％的供试液。
2.11空白对照液：同批浸提介质，置37±1℃含5％的CO2恒温培养箱中37 ±1℃浸提24小时，制备空白对照液。
2.12阴性对照：取高密度聚乙烯材料，用超纯水洗净，121℃灭菌30min后，按0.2g/mL的比例加入同批浸提介质，置37±1℃含5％的CO2恒温培养箱中37 ±1℃浸提24小时，制备阴性对照液。
2.13阳性对照：二甲基亚讽过滤除菌后，取0.5mL,加入9.5mL浸提介质，置37±1℃含5％的CO2恒温培养箱中37±1℃浸提24小时，制备阳性对照液。
6.4标准判定：空白OD570平均值2:0.2,左右两列空白平均值与全部平均值相差不大于15％,如存活率<70％,则具有潜在的细胞毒性，试验样品50％浸提液存活率宜至少有100％浸提液的存活率相同或较高，否则宜重复试验。
6.5细胞培养日期：2022年07月25日-2022年07月27日
接种后细胞培养日期：2022年07月27日-2022年07月28日
样品浸提日期：2022年07月27日-2022年07月28日
加样日期：2022年07月28日，吸光度检测日期：2022年07月29日
7试验结果：培养结束后，在酶标仪570run波长下测定吸光度(参照波长 650run),空白OD570平均值为0.38,左右两列空白平均值与全部平均值相差为 1.6％，阴性对照组细胞相对存活率83.2％,无潜在细胞毒性；阳性对照组细胞相对存活率21.2％,具有潜在细胞毒性；供试品组100％浸提液细胞相对存活率 80.1％,无潜在细胞毒性；供试品组50％浸提液细胞相对存活率94.4％,无潜在细胞毒性。试验结果详见附表1。
8结论：在本次试验条件下，按标准判定，试验样本无潜在细胞毒性。
附表1：细胞毒性试验结果
Figure BDA0003921495370000231
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料，其特征在于，所述复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
酸酐化牛β-乳球蛋白0.1wt％-0.3wt％、卡波姆0.3wt％-0.9wt％、甘油1wt％-8wt％、β-葡聚糖0.05wt％-0.2wt％、三乙醇胺0.01wt％-0.05wt％、余量为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料，其特征在于，所述复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
酸酐化牛β-乳球蛋白0.2wt％、卡波姆0.6wt％、甘油5wt％、β-葡聚糖0.1wt％、三乙醇胺0.03wt％、余量为纯化水。
3.一种如权利要求1或2所述的复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照相应质量分数选取β-葡聚糖和甘油分散均匀后留作备用物A；
(2)按照相应质量分数选取酸酐化牛β-乳球蛋白和纯化水充分混匀，获得备用物B；
(3)按照相应质量分数选取纯化水后置于乳化装置中进行均质处理，将乳化装置升温至80-90℃后，保温20-30min之后降温至50-60℃，加入步骤(1)的备用物A混匀处理；
(4)待步骤(3)处理结束降温至40-50℃时，加入三乙醇胺搅拌；
(5)待步骤(4)处理结束降温至不高于40℃时，加入备用物B搅拌至料体透明无杂质，过滤，放料，获得成品。
4.根据权利要求3所述的一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，纯化水置于乳化装置中进行均质处理时，采用均质速度为20-30HZ进行。
5.根据权利要求3所述的一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，加入步骤(1)的备用物A混匀处理时，采用均质速度为20-30HZ，均质时长为2-3min。
6.根据权利要求3所述的一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，加入三乙醇胺搅拌时，搅拌时长为2-3min，搅拌速度为15-20HZ。
7.根据权利要求3所述的一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，加入备用物B搅拌时，搅拌时长为3-5min，搅拌速度为15-20HZ。
8.根据权利要求3所述的一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，过滤时采用200-400目滤布。
9.一种复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料在制备复方抗HPV生物蛋白凝胶产品中的应用，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料或如权利要求3-8任一项所述的复方抗HPV生物蛋白凝胶敷料的制备方法获得。
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