KR20040081118A

KR20040081118A - 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 유효성분으로 하는 피부외용약

Info

Publication number: KR20040081118A
Application number: KR10-2004-7010744A
Authority: KR
Inventors: 아키히사도시히로; 이시카와도시노리; 스즈키요시히로; 모치즈키세이시로; 기시다히로타카
Original assignee: 학교법인 일본대학
Priority date: 2002-01-16
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2004-09-20
Also published as: KR100602924B1; US7431953B2; AU2003201892A1; US20050037028A1; CN1620303A; JP4450406B2; WO2003059366A1; CN1306941C; JP2003277276A

Abstract

본 발명은 피부에서 느끼는 각종 가려움에 대하여 유효한 천연물 유래의 가려움 방지, 아토피성 피부염이나 알레르기성 증상의 예방 및 치료가 되는 항알레르기제, 피부 외용제, 피부염 억제제, 화분증 경감제 및 목욕용제의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제, 피부 외용약, 피부염 억제제, 화분증 경감약 및 목욕용제에 관한 것이다.

Description

대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 유효성분으로 하는 피부 외용약{SKIN PERPARATION FOR EXTERNAL USE CONTAINING PURPURICENUS TEMMINCKII FRASS AS THE ACTIVE INGREDIENT}

사람이 생명체를 유지하고, 활동을 행해 가는 데에 있어서, 체표면인 피부에 서 느끼는 가려움이란, 피부나 점막의 통점이 약한 자극에 의해 생기는 감각, 괴양감의 것이다.

최근, 생활환경의 변화에 따라 아토피성 피부염의 발증이 격증하고 있다. 아토피성 피부염의 발증에는 환경요인이 크게 작용한다고 한다. 환경요인으로는 비 알레르기적 요인과 알레르기적 요인으로 나뉘어진다. 비 알레르기적 요인으로는 피부의 건조, 발한, 피부의 가압·가중, 피부의 괴파 등에 의한 것이다. 알레르기적 요인으로는 음식물 알레르겐의 흡인에 의한 것, 진드기, 하우스페트, 화분, 금속 등과의 접촉 등에 의한 것이다.

비 알레르기요인에 의한 경우에는 요인과 접촉함으로써 가려움이 생기고, 그 가려움에 대하여 피부를 긁음으로써 피부조직이 파괴되고, 피부가 가지는 방어기능이 손상되어 피부과민이나 병원균에 의한 감염증상이 야기된다.

알레르기증상은, 체내에서 일어나는 항원항체반응에 의한 면역 글로블린 E(IgE)의 산생에 의하여 결과적으로 비만세포의 세포막을 자극하여 히스타민, 류코트리엔, 세로토닌 등의 활성물질을 방출함으로써 일어난다. 방출된 이들 물질은, 혈관 투과성을 촉진시키는 작용이나, 평활근을 수축시키는 작용이 있기 때문에, 백혈구나 단백질을 혈관으로부터 누출시키거나, 염증에 의해 기관지를 수축시켜 천식을 야기하는 원인이 된다. 또 체내에 알레르겐이 침입하면 T 세포가 감작되어 다시 알레르겐에 접촉하면 림포카인이라 불리우는 염증성 인자를 방출하여 반응을 일으킨다. 이와 같은 증상에 대하여 예방·개선에 유효한 인자를 찾아내는 연구가 행하여지고 있다.

그리고 항알레르기성분에 관하여, 보르네올의 비만세포막 안정 가능을 이용하는 것(일본국 특개평6-211713호 공보), 방선균 배양액에 의한 염증 억제작용을 이용하는 것(일본국 특개평5-25053호 공보) 등이 알려져 있다. 또 참기름을 섭취함으로써 알레르기반응의 원인이 되는 류코트리엔의 산생을 억제하는 효과가 알려져 있다 (Prostaglandin, 제36권, 제3호, 1988년). 또 도코사헥사엔산(DHA), 또는 리놀렌산을 함유하는 유지의 항알레르기성을 이용하는 것(일본국 특개평2-29081호 공보)이 알려져 있다. 이들 천연에 존재하는 항알레르기제는 부작용이 적으나, 항알레르기증상의 예방 및 치료에는 그 효과는 충분하지 않다.

히스타민을 대표로 하는 다수의 활성물질이 비만세포나 호염기구로부터 유리되는 것이 영향을 미치고 있는 것으로부터 상기한 항알레르기증상을 경감시키기 위하여 히스타민수용체 저해제가 유효하다고 생각되어, 클로랄페닐아민, 디펜하이드라민 등의 항히스타민제나 부신피질 호르몬이 사용되나, 이들 약제를 사용하는 경우에는 부작용을 수반하는 것이 문제로 되어 있다.

이러한 것으로부터 부작용이 적은 약제의 개발이 진행되고 있고, 천연물 유래의 물질의 개발이 진행되고 있다.

이 종류의 천연물로서는 국화과 해바라기속의 꽃잎 추출물을 사용하는 것(일본 특개2000-351723호 공보), 아카나노키 등의 추출물(일본 특허공개2000-26307호공보), 티트리의 추출물(일본국 특개평11-255661호 공보), 토코페롤추출물(일본국 특개2001-163764호 공보), 키토산을 사용하는 것(일본 특개2001-55335호 공보) 등이 개발되어 있다.

본 발명은 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 유효성분으로 하는 피부 외용약 등의 약제에 관한 것이다.

도 1은 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물의 히스타민 유리 억제시험의결과를 나타내는 도,

도 2는 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물의 류코트리엔 분비 억제시험의 결과를 나타내는 도,

도 3은 연령 및 성별에 의한 환자의 분포상태를 나타내는 도,

도 4는 가려움에 대한 개선의 효과가 나타나기까지의 시간을 나타내는 도,

도 5는 가려움의 원인이 되는 증상의 분포를 나타내는 도,

도 6은 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 추출물 분획 스킴을 나타내는 도,

도 7은 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 n-헥산추출물에 의한 β-헥소사미니다제 유리 측정법의 결과를 나타내는 도,

도 8은 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물에 의한 β-헥소사미니다제 유리 측정법의 결과를 나타내는 도,

도 9는 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물의 24구멍 멀티웰·스크리닝법에 의한 김자염색의 결과를 도시한 도면이다.

본 발명의 과제는 피부에 느끼는 여러가지의 가려움 방지 및 개선에 대하여 유효한 천연물 유래의 가려움 멈추는 약, 아토피성 피부염나 알레르기성 증상의 예방, 개선 및 치료가 되는 항알레르기제, 피부 외용제, 피부염 억제제 및 목욕용제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하도록 예의 연구하여 대나무류에 기생하는 대추나무주홍하늘소의 유충의 배설물인 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 성분을 함유하는 조성물, 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 물 혹은 유기용매로 처리하여 얻어지는 추출물을 사용하여 히스타민 유리 억제시험 및 류코트리엔 분비 억제시험을 행한 바, 고활성을 나타내고, 알레르기성의 피부염, 아토피성 피부염 등의 알레르기성 증상에 유효하게 작용하는 것을 발견하고, 다시 실제로 히스타민이 관여하는 알레르기성의 피부염, 아토피성 피부염이나 알레르기성 증상, 화분증상 경감약, 벌레물림, 환경요인에 의한 피부 소양증 등에 사용하여 시험한 바, 광범위에 걸친 가려움 증상에 대하여 단시간으로 현저한 효과를 볼 수 있고, 각종 가려움의 내복약 및 외용약으로서 예방 및 개선에 유효한 것, 또한 기능성 식품으로서 사용하면 가려움의 예방·개선에 유효한 것, 또한 이들을 목욕용제로서 사용하면 가려움의 예방·개선에도 유효한 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명에 의하면 이하의 발명이 제공된다.

(1) 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제.

(2) 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용약.

(3) 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 피부염 억제제.

(4) 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 목욕용제.

(5) 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 화분증 경감제.

본 발명의 대상인 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 성분을 취득하기 위하여 사용되는 원료의 대나무로서는, 맹종죽속, 사방죽속, 참대속, 슈도사사속(Pseudosasa), 사사모르파속(Sasamorpha), 업평죽, 당죽속 등의 대나무류가 적합하게 사용된다. 그 중에서도 참대속의 맹종죽 및 담죽이 적합하게 사용된다. 이들 대나무가 잘라내져 방치되면, 대추나무주홍하늘소(Purpuricenus temminckii Guerin-Meneville1844)가 알을 낳아 그 유충이 대나무류를 먹고 성장한다. 그 성장과정에서 배설물을 대나무의 속에 남긴다. 이것을 대추나무주홍하늘소 유충의 똥이라 부른다. 이 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 모아 본 발명의 항알레르기제 등의 대상물질로 한다.

또한 대추나무주홍하늘소는, 주로 일본국에서는 혼슈(야생 동백꽃대-너도밤나무대 하부), 사도, 시코쿠, 구주, 이키, 쯔시마 등에 분포하고, 봄부터 여름에 걸쳐출현한다.

대나무로부터 얻어지는 대추나무주홍하늘소 유충의 똥은, 축축하게 한 입자상태의 옅은 황색을 띤 조성물로서 얻어진다.

이 대추나무주홍하늘소 유충의 똥은, 수분을 함유하기 때문에 이것을 건조시킴으로써 수분을 제거하여 분상체로 할 수 있다. 건조시키기 위해서는 30 내지 80℃의 조건하에 행한다. 80℃를 초과하는 고온에서 처리하면 분해 등을 수반하기 때문에 바람직하지 않다.

이 분상의 것을 가제 등을 사용하여 환부에 직접 접촉시킴으로써 약제로서 사용할 수 있다. 또 이 대추나무주홍하늘소 유충의 똥은, 특별히 수분 등을 제거하지 않고 그대로 약제로서 사용할 수도 있다. 뒤에서 설명하는 실시예에서 직접 사용한 결과를 나타내나, 약제로서 양호한 결과를 나타내는 것이다.

또, 물 또는 유기용매에 의해 추출된 추출액상태의 것을, 알레르기증상을 완화시키기 위하여 환부에 상기와 마찬가지로 접촉시켜 사용할 수 있고, 물에 용해시킨 것을 화분증 점비약으로서 점막에 입힐 수 있다.

대추나무주홍하늘소 유충의 똥으로부터 수추출물을 빼내는 경우에는 과잉량의 물(열수)과 용기 내에서 접촉시킨다. 물에는 열탕을 사용하는 것이 효과적이다. 통상 0.001 ~ 0.007 중량% 정도의 농도가 되도록 물량을 조절한다. 추출에는 환류조건하에 가열한다. 가열시간은 적절히 설정한다. 가열처리는 통상 적어도 15분 이상, 1시간 정도는 필요하다.

그 결과, 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 유효성분은 열수층으로 이행시킬 수 있다. 이 열수처리는 2회 이상, 통상 3회 정도까지 반복하는 것이 유효하다.

이 제 1회째의 조작에 의하여 일반적으로는 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 중량에 대하여 0.3 ∼ 1.0% 정도, 통상 0.7 중량% 정도의 비율로 액상물이 얻어진다. 이와 같이 하여 얻어지는 액상물을 감압조건하에 농축한다. 최종적으로 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 추출물은, 다갈색의 분말상의 것으로서 얻어진다. 수량(收量)은 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 중량에 대하여 1.0 ∼ 2.0 중량% 정도의 것이 얻어진다.

온수의 이용도 가능하다. 압력을 가한 조건하에도 행할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 분말상의 수추출물을, 사용시에는 적절하게 물에 녹여 약제로서 이용한다.

뒤의 실시예에 나타내는 바와 같이 대나무 부스러기 10g을 사용하여 수추출을 행한 결과, 176.2 mg의 부스러기 추출물을 얻고 있다.

대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 유기용매에 접촉시켜 처리함으로써 유기용매에 의한 추출물로 한 것을 약제로서 이용할 수 있다.

유기용매로서는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 등의 알콜류, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1, 3 - 부틸렌글리콜 등의 다가 알콜 또는 그 유도체, 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤류, 아세트산에틸, 아세트산이소프로필 등의 에스테르류, 에틸에테르, 이소프로필에테르 등의 에테르류를 들 수 있다. 또 석유에테르, n - 헥산, n - 펜탄 등의 지방족 탄화수소 등도 사용할 수 있다.

이들 중에서는 에탄올, 1, 3 - 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등이 사용된다. 이들에는 물을 포함시켜 혼합용매로서 사용할 수도 있다.

어느 것이나 용매 추출한 후, 다시 다른 용제에 접촉시켜 다시 특정한 성분을 빼낼 수 있으나, 그와 같은 조작을 실시하지 않고 에탄올 또는 1, 3 - 부틸렌글리콜용매의 것을 적당한 농도의 것으로서 환부에 직접 바르는, 또는 가제 등에 스며 들게 한 상태로 댐으로써 사용할 수 있다.

대추나무주홍하늘소 유충의 똥성분의 유기용매 추출에 있어서는, 헥산 등에서 추출을 행하여 헥산 추출물과 잔류물로 나누고, 이 잔류물을 메탄올 추출하여 메탄올 추출물과 잔류물로 나누고, 메탄올 추출물을 아세트산에틸용해성분과 부탄올 용해성분으로 나눌 수 있고, 잔류물을 수추출을 행하는 등으로 하여 각종 용해성분을 빼낼 수도 있다.

대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 성분을 함유하는 조성물은, 항알레르기제로서 사용할 수 있다. 항알레르기제로서는 경구 내복약, 정맥주사, 외용약으로서 이용할 수 있다. 또 화분증 경감약, 또 기능성 식품이나 과자 등의 식품 및 각종 음료 중에 첨가하여 가려움 방지 또는 개선을 도모할 수도 있다. 또 피부 외용제, 피부보호제, 피부염 억제제, 로션 및 크림 및 비누 등에 첨가하여 가려움 방지·개선을 도모하는 화장품으로서 이용할 수도 있고, 가려움 방지·개선작용도 가지는 두발제에도 사용할 수도 있다. 또 목욕용제에 첨가하여 목욕용제에 가려움 방지·개선을 도모하도록 할 수도 있다. 경우에 따라서는 속옷이나 양말 등의 의료에 함유시켜 의료에 가려움 방지·개선의 작용을 가지게 할 수도 있다.

대추나무주홍하늘소 유충의 똥을, 수추출물, 유기용제 추출물, 또는 건조물로서 O.001 ∼ 20 중량% 정도의 농도의 것으로서 사용하는 것이 일반적이다.

이 중에 항염증제, 항알레르기성 질환제인 아즈렌, 염산디펜하이드라민, d1 -α토코페롤 및 그 유도체와 함께 사용할 수도 있다.

또, 다당류 등의 천연고분자, 전분, 수용성 고분자, 음이온, 양이온, 비이온 등의 계면활성제를 사용할 수도 있다.

입욕제로서 사용하는 경우에는, 분상의 대추나무주홍하늘소 유충의 똥, 탄산수소 나트륨, 무수황산나트륨, 붕사, 향료, 안정제 등과 함께 혼합한 것을 물 등에 용해 추출물을 적절히 물에 녹여 약제로서 이용한다. 또 액상의 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 호호바유, 향유, 색소, 보습제, 계면활성제와 혼합한 액상의 것으로서도 이용할 수 있다.

이하에, 본 발명의 내용을 실시예에 의하여 설명한다.

본 발명의 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 추출물의 제조방법으로서, 유기용매에 의한 추출물의 제조방법 및 물에 의한 추출물의 제조방법에 대하여 나타낸다.

본 발명의 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 약제로서 사용한 효과에 대해서는 히스타민 유리 억제 및 류코트리엔 분비 억제시험, β-헥소사미니다제 유리 억제시험을 행함으로써 가려움 등에 대한 효과를 확인할 수 있다.

본 발명의 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 각종 피부질환에 사용하는 경우의 독성시험으로서, 섬유아세포를 사용하는 「24 구멍 멀티웰·스크리닝법」에 의하여 행하고, 그 결과로부터 그 독성의 유무를 확인할 수 있다. 이하에 그 내용 및 실험결과에 대하여 상세하게 설명한다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명의 내용을 설명한다.

실시예 1

(대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 유기용매에 의한 추출물의 제조)

대나무로부터 얻어진 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 591g을, 헥산으로 추출을 행하여, 헥산 추출물 332 mg과 잔류물로 나누고, 이 잔류물을 메탄올 추출하여 메탄올 추출물 14.6 g과 잔류물로 나누고, 메탄올 추출물이 아세트산에틸에 용해된 구분 3. 685 g과 물에 의해 용해된 구분으로 나눌 수 있고, 물에 의하여 용해된 구분에 대하여 n - 부탄올용제로 처리하고, 부탄올용해 구분 1.931 g과 물구분으로 나눌 수 있고, 메탄올 추출 잔류물을 수(열수)추출을 행하여 수 추출물 12.132 g을 얻었다.

실시예 1 - 2

대나무로부터 얻어진 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 1037 g을, 헥산으로 추출을 행하고, 헥산 추출물 509.9 mg과 잔류물로 나누어, 이 잔류물을 메탄올 추출하고, 메탄올 추출물과 잔류물로 나누어 메탄올 추출물을 아세트산에틸 용해구분 5.41 g 및 물 용해구분으로 나눌 수 있고, 물에 의해 용해된 구분에 대하여 n - 부탄올용제로 처리하여 부탄올 용해구분 2.53 g과 물구분 3.65 g으로 나눌 수 있고, 메탄올 추출 잔류물을 수(열수)추출을 행하여 수추출물 27. 132 g을 얻었다.(도 6)

실시예 1 - 3

(n - 헥산 추출물로부터의 성분의 분리)

대추나무주홍하늘소 유충의 똥(1037 g)을, n - 헥산(3L)으로 3회, 3시간 가열 환류추출하여 얻어진 추출물(461 mg)을 실리카겔의 컬럼크로마토로 분획(分劃)하였다. 얻어진 3 - 옥소스테로이드화분의 박층 크로마토그래피 및 역상분취 HPLC 를 행하여 3종의 화합물을 단리하였다.

3종의 화합물은, 스티그마스트 - 4 - 엔 - 3, 6 - 디온(2.9 mg), 스티그마스터 - 4, 22 - 디엔 - 3온(1.0 mg) 및 스티그마스트 - 4 - 엔 - 3 - 온(5.9 mg)으로 동정하였다. 이들 3종의 3 - 옥소스테로이드에 대하여 β-헥소사미니다제 유리 측정법의 시료로 하였다.

실시예 2 - 1

(대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 수추출물의 제조)

대나무로부터 채취한 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 10 g을, 물 500mL에 용해시켜 가열하여 환류조건하에 가열하였다. 가열처리는 5시간 행하였다.

얻어진 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 추출성분을 함유하는 성분에 관하여, 마찬가지로 2회 조작을 반복하였다. 그 결과, 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물 176.2 mg을 얻었다. 이후의 실시예에서는 이것을 필요량의 물에 용해시켜 사용한다.

실시예 2 - 2

(β-헥소사미니다제 유리 측정법에 사용한 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 수추출액의 제조)

대나무로부터 채취한 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 1037g에, 물 3L를 가하여 3시간 가열 환류를 행하여 추출을 행하였다. 얻어진 추출물의 일부(41.2 mg)를 Shodex 컬럼(GS-320HQ)으로 7구획분으로 분획하였다. 이들 7구획분[Fr.1(3.2 mg), Fr2(3.2 mg), Fr3(8.2 mg), Fr4(6.8 mg), Fr5(6.2 mg), Fr6(5.0 mg), Fr7(5.0 mg)에 대하여 β-헥소사미니다제 유리 측정법에 사용하는 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 수추출물로 하였다.

실시예 3

(히스타민 유리 억제시험)

실시예 2 - 1에서 얻어진 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출액의 히스타민 유리 억제효과를 래트유래 호염기구 세포(RBL-2H3)로부터 유리되는 히스타민을 지표로 하는 항알레르기작용 시험법을 사용하여 평가하였다.

RBL-2H3을 24구멍 플레이트에 2.5 × 10⁵세포/구멍이 되도록 세포를 파종하여 24시간 배양(이산화탄소 5%, 37도)후, PBS (Phosphate buffersaline)로 1회 세정한 후, 각 농도의 대나무칩 추출물/20mM Hepes-DMEM 180㎕를 가하여 이산화탄소 5%, 37도에서 30분 배양하고, 다음에 자극제 A23187(칼슘이오노프아)를 20㎕ 가하여 30분 배양한 후, 상청 200㎕을 빼내었다. 또 20㎕ Hepes-DMEM(Medium) 및 계면활성제 0.05% Triton X-100(세포벽을 용해시킴으로써 세포 중의 모든 히스타민함량을 측정한다)을 사용하여 상기와 마찬가지로 자극하여 얻어진 상청을 각각 음성 대조구(Negative Control), 양성 대조구(Positive Control)로 하였다.

이와 같이 하여 빼내어진 상청 중의 히스타민함량은 ELISA(Histamine enzyme-linked immunoadsorbent assay) Kit (ICN Pharmaceuticals사 제품)를 사용하여 정량하였다. 또한 히스타민 유리율 및 제어에 대한 히스타민 유리율은 식 1 및 식 2를 사용하여 산출하였다. 제어에 대한 각 농도의 히스타민 유리율을 도 1에 나타낸다.

히스타민 유리율(%)

= ((A-B)/(C-B)) × 100

A는 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출액 처리한 세포에 A23187로 자극한 상청 중의 히스타민함량

B는 음성 대조구에 의한 상청 중의 히스타민 함량

C는 양성 대조구에 의한 상청 중의 히스타민함량

제어에 대한 히스타민 유리율(%)

= (D / E)× 100

D는 각 농도의 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물의 히스타민 유리율(%)

E는 A23817자극만(대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물로 미처리)의 히스타민 유리율(%)

제어는 A23187로 자극만(대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물로 미처리)의 상청중의 히스타민 유리율(%)

(결과)

A23187은 브랭크의 결과이다.

0.625 mg/mL의 경우에는 현저하게 감소되어 있고, 그후 1.25 mg/mL, 1.25 mg/mL 이후 서서히 값이 감소하고 있다. 히스타민 유리 억제효과는 충분히 있는 것을 이해할 수 있다.

실시예 4

(류코트리엔 분비 억제시험)

실시예 2 - 1에서 얻은 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물의 류코트리엔 분비 억제효과를 래트유래 호염기구 세포(RBL-2H3)로부터 분비되는 류코트리엔을 지표로 하는 항알레르기 작용시험법을 사용하여 평가하였다.

RBL-2H3을 24구멍 플레이트에 2.5 × 10⁵세포/구멍이 되도록 세포를 파종하여 24시간 배양(이산화탄소 5%, 37도)후, PBS(Phosphate buffer saline)로 1회 세정한 후, 각 농도의 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물/20 mM Hepes-DMEM 180㎕를 가하여 이산화탄소 5%, 37도에서 30분 배양하고, 다음에 항원 20㎕을 가하여 자극하고 30분 배양한 후, 상청 200㎕을 빼내었다.

이와 같이 하여 빼낸 상청 중의 류코트리엔 분비량은 류코트리엔 C₄EIA (Leukotriene C₄Enzyme immunoassay(EIA)) Kit(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)를 사용하여 정량하였다. 또한 류코트리엔의 분비량은 류코트리엔 표준용액(0 ∼ 1000 pg/mL)에 의한 검량선을 사용하여 산출하였다. 각 농도에 의한 류코트리엔 분비 억제효과를 도 2에 나타낸다.

(결과)

DNP-BSA는, 블랭크의 결과이다. 0.625 mg/mL 이후, 서서히 감소하고, 5.0 mg에서는 45 pg/mL이라는 작은 결과의 값을 얻었다. 이것으로부터 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물의 류코트리엔 분비 억제효과는 충분히 확인할 수 있었다.

(β - 헥소사미니다제 측정법)

β - 헥소사미니다제 측정법의 측정원리는, 이하와 같다.

β - 헥소사미니다제는 당분해 효소이며, 마스트세포의 과립 속에 풍부하게 존재하는 리소좀효소의 하나이다.

β - 헥소사미니다제 측정법은, 본 효소의 존재에 의하여 p-니트로페놀이 분리된다. 이 분리된 p-나트로페놀을 비색법에 의하여 측정하고(405 nm),이 결과를 β-헥소사미니다제 효소활성으로 한다.

(결과)

NADPH 옥시다제의 저해제인 DPI를 사용하여, β-헥소사미니다제 억제효과를 검토한 바, DPI는 항원자극에 의해 생긴 β-헥소사미니다제를 농도 의존적으로 억제하였다.

β - 헥소사미니다제 억제효과는, 히스타민 억제효과와 동등한 평가가 가능하였다.

(β - 헥소사미니다제 유리 억제시험)

β - 헥소사미니다제 유리 측정효과는, 래트유래 호염기구균(RBL-2H3)으로부터 유리되는 β - 헥소사미니다제를 지표로 하는 항알레르기 작용시험법을 사용하여 평가하는 것으로 하였다.

RBL-2H3을, 10% 우태아 혈청(FCS) 100단위/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신함유 MEME(Minimum Essential Medium Eagle)에서 배양(5% 이산화탄소, 37℃)하였다. 다음에 세포배양용 24웰 바닥이 평평한 마이크로플레이트에 2 × 10⁵셀수(500㎕ 배지/웰)씩 파종하여 24시간 배양(5% 이산화탄소, 37℃)함으로써 세포를 감작시켰다. 그후 감작된 세포를 500㎕의 PBF로 1회 세정하고, 160㎕의 5.6 mM 글루코스, 1 mM 염화칼슘, 0.1% BSA 함유 시라가니언(siraganian) 완충액을 가하였다. 각 농도의 샘플액, 20㎕의 피험물질 용액(DMSO : 0.1%)을 가하여 10분후에 항원(DNP-BSA:10μg/mL)을 가하여 10분간 인큐베이트하여 세포를 자극하였다. 10분간 빙냉하여 반응을 멈춘 후, 상청 50㎕를 96웰 바닥이 평평한 마이크로플레이트로 옮기고, 효소반응액 100㎕를 가하여 혼화하여 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하고, 이하의 식에 의해 유리율을 구하였다(측정파장 : 405 nm, 참조파장 : 655 nm).

β- 헥소사미니다제 유리율(%)

=[자극에 의해 유리된 β-헥소사미니다제량 / 세포내 모든 β-헥소사미니다제량] × 100

세포 내 모든 β-헥소사미니다제의 측정에는, 초음파 파쇄기로 파쇄한 세포를 원심분리한 상청을 사용하였다.

(헥산추출물에 의한 β - 헥소사미니다제 유리 측정법)

실시예 1 - 2의 헥산추출물로부터 얻어진 3종의 옥소스테로이드(스티그마스트 - 4 - 엔 - 3, 6 - 디온, 스티그마스터 - 4, 22 - 디엔 - 3 - 온, 및 스티그마스트 - 4 - 엔 - 3 - 온)에 대하여 β - 헥소사미니다제 유리 측정효과를 측정하였다. 이들 에 대해서는 우선 β - 헥소사미니다제 유리 측정효과를 확인하였다. 결과는 도 7과 같다.

실시예 5

(수추출물에 의한 β - 헥소사미니다제 유리 측정법)

실시예 2 - 2에서 얻어진 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 수추출물(대나무로부터 채취한 대추나무주홍하늘소 유충의 똥 1037g에, 물 3L를 가하고, 3시간 가열 환류를 행하여 추출을 행하였다. 얻어진 추출물(41.2 mg)의 일부를, Shodex 컬럼(GS-320 HQ)에 의하여 7구획분으로 분획하였다. 이들 7구획분(Fr. 1 ∼ Fr. 7))에 대하여 β - 헥소사미니다제 유리 측정시험을 행하였다.

결과를 (도 8)에 나타내었다.

전체에 일단의 활성을 볼 수 있었다. Fr. 1 및 2에 대해서는 활성이 강한 것을 알 수 있었다.

실시예 6

(24 구멍 멀티웰·스크리닝법(독성시험))

24 구멍 멀티웰·스크리닝법(다카오카 사토코 지음「조직배양입문」학회출판 센터 발행 68페이지)에 의하여 본 발명의 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 약제의 독성시험을 행하였다.

(이 방법은, ABCD 각 라인(행) 및 1 내지 6열의 웰(합계 24구멍)을 준비하고, A 라인에 대하여 약제 원액 0.1 mL를 함유하는 (Al) 및 농도가 점점 희석되고, 농도가 상위한( (A2∼A5), 약제를 함유하지 않은 (A6)을 준비한다. 다음에 세포의 부유액을 조제한다. 세포수는 5 × 10⁴/mL 정도이다. 각 웰에 세포 부유액을 0.9 mL 씩 분주한다. 이것을 수평으로 한 채로, 좌우에 가볍게 흔들어 탄산가스 부란기에서 배양. 3∼7일 배양하고, 배지를 버리고 메탄올을 조용히 주입하여 10분 이상 고정. 흐르는 물로 씻은 후, 김자염색을 행하여 염색 이상이 보이는지의 여부로 독성을 판정하는 것이다.)

독성시험의 내용은, 이하와 같았다.

(1) 약제 추출액의 작성

대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물(대추나무주홍하늘소 유충의 똥 3.9 g에, 20 mL의 순수를 첨가하여 교반하고, 실온으로부터 100℃ 직전(비등 직전)까지 가열하고, 이 온도에서 끓여낸 상태로 하여 1시간 유지하여 실온까지 냉각하고, 원심분리기에 의해(1200 rpm. 10분간), 원심분리를 행하였다. 상층의 깨끗한 청정액을 여과멸균하여 약제 원액을 작성하였다.

(2) 독성시험으로써 상기 24구멍 멀티웰·스크리닝법을 행하였다.

(3) 사용세포는 이하의 세포를 사용하였다.

NHDF - NEO CRYOPRESERVED(인간피부 선아세포 신생아)이다. BIO WHITTAKER (ACAMBREX COMPANY제 제조연월일 : 1999년 5월 10일 Lot번호 : 9F0889 보증서첨부의 것)

(4) 배양 배지는, 이하의 배지를 사용하였다.

FBM(개변 MCDB202 혈청 첨가)

(5) 첨가조건은 이하와 같았다.

원액의 멀티웰에의 첨가는, 1웰당 0.1 mL 이었다.

희석은, PBS(인산 완충염류용액)에 의하여 최종 농도를 0%, 12.5%, 25%, 50%의 4단계로 하였다.

(6) 배양조건

배지 FBM에 부유한 세포액 0.9 mL를 각 24웰에 첨가하였다. 36℃에서 4일간, 가온하였다.

(7) 감정법

(가) 웰 내의 배지를 버리고(세포는, 웰에 접지), 즉시 메탄올로 고정후, 김자염색을 행하였다. 현미경으로 관찰하여 사진기록을 행하였다(도 9).

(나) 25㎠의 플라스틱배양병에 원액 50%를 첨가하여 8일간 관찰하였다.

또, 배양후, 김자염색을 행하였다.

(8) 감정결과

(가) 이상의 조작에 의하여 얻어진 24구멍 멀티웰·스크리닝법에 의한 대조결과(도 9)에 의하면, 대조결과(0%)와 상기 최종농도 0%, 12.5%, 25%, 50%의 결과와 비부하여 최종 농도 0%, 12.5%, 25%, 50% 중 어느 것이나 증식 및 형태에 변화는 없고, 독성이 없는 것을 알 수 있었다.

(나) 25㎠의 플라스틱배양병에서 원액 50%를 첨가하여 8일간 관찰한 결과에서는 증식 및 형태 모두 영향은 보이지 않았다.

배양후, 김자염색을 행한 결과에 의하면 이상은 없었다.

(9) 결론

대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 수추출액은, 인간유래 섬유아세포에 영향을 미치지 않아 약제로서 사용한 경우에 안전하다고 할 수 있다.

실시예 7

대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 수추출물을 정제수에 용해시켜, 0.005% 농도로서 가려움을 나타낼 때에 수시로 환부에 도포시켜, 가려움 증상의 개선상황에대하여 표 1에 나타내는 결과를 얻었다. 또한 본 제 사용기간 동안은 항히스타민제 등 다른 항알레르기제의 사용은 중지시켰다.

본 발명에 의한 피부 외용제를 도포한 증례 1∼11(피부괴양증, 아토피성 피부염, 무좀, 땀띠, 두드러기, 벌레물림, 혈액인공투석, 피부병, 문신, 동상, 농가진)의 결과는, 이들 모든 증상에 의한 가려움에 본 제가 매우 유효함을 나타내고 있고, 지양효과가 없는 예 및 도포에 의해 증상(가려움 및 피부염 등)이 악화된 예는 1건도 확인되지 않았다.

그 결과를 정리하여 표로 정리한 것이, 표 1이다.

피부 외용제 도포에 의한 지양효과

증례	가려움증례	대상증례수	현저	약간 유효	무효	악화
1	피부괴양증	12	8	4	0	0
2	아토피성 피부염	8	7	1	0	0
3	무좀	5	5	0	0	0
4	땀띠	3	3	0	0	0
5	두드러기	2	1	1	0	0
6	벌레물림	2	2	0	0	0
7	혈액인공투석	1	1	0	0	0
8	피부병	1	1	0	0	0
9	문신	1	1	0	0	0
10	동상	1	1	0	0	0
11	농가진	1	1	0	0	0

(결과)

이상의 표의 기재로부터 분명한 바와 같이, 현저하게 효과가 있었던 것이 많고, 그리고 유효가 약간 있어, 전체로서 현저하게 효과가 있었다고 할 수 있다. 무효 및 악화라는 것은 전혀 없었다. 그리고 각종 원인에 의한 가려움에 유효한것을 이해할 수 있다.

본 조사결과에 대하여 집계방법을 정리하여 보면 이하의 것을 알 수 있다.

남녀의 비율은, 각각 50% 로서 동일하다. 연령 및 성별에 의한 환자의 분포상태는, 도 3에 나타내는 바와 같다. 대추나무주홍하늘소 유충의 똥의 사용에 대해서는 수추출물(90%), 분말(3%) 및 그 양쪽을 병용한 것(7%)이었다.

효과가 나타나기까지의 시간은, 거의 1분 내지 5분 사이에 있어, 가려움에 대하여 즉효성이 있음을 알 수 있다(도 4). 가려움 증상의 원인의 분포는, 도 5에 나타내는 바아 같다. 이 결과로부터 광범위한 증상에 유효한 것을 이해할 수 있다.

실시예 8

대추나무주홍하늘소 유충의 똥 100 g을 물 1L에 의하여 첨가하고, 가열하여 펄펄 끓인 상태에서 3시간 유지하였다. 얻어진 추출액을 냉각시켜 수추출액을 얻었다. 이것을 점비주입기에 의하여 10일간에 걸쳐 하루 3회, 화분증 환자 20명에게 주입하였다.

화분증의 경감이 14명에게서 보이고, 그 중에 5명에게는 현저한 효과가 있었다.

이하에 처방예의 일례를 나타낸다. 본 발명은 이것에 한정되는 것이 아님은 물론이다.

로션상 가려움 방지·경감제

에탄올 15.0 (중량%)

하이드록시에틸셀룰로스 0.1

파라옥시벤조산메틸 0.1

대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물 0.2

정제수 84. 6

유액상 가려움 방지·경감제

스테아린산 0.2 (중량%)

세탄올 1.5

바셀린 3.0

유동파라핀 7.0

폴리옥시에틸렌(10E.O)

모노올레핀산에스테르 1.5

아세트산토코페롤 0.2

글리세린 5.0

파라옥시벤조산메틸 0.1

트리에탄올아민 0.1

대추나무주홍하늘소 수추출물 0.4

정제수 81.0

겔상 가려움 방지·경감제

디프로필렌글리콜 10.0 (중량 %)

카르복시비닐폴리머 0.5

수산화칼륨 0.1

파라옥시벤조산메틸 0.1

대추나무주홍하늘소 수추출물 0.5

정제수 88.8

크림상 가려움 · 경감방지제

밀납 6.0 (중량 %)

세탄올 5.0

환원라놀린 8.0

스쿠알렌 27.5

글리셀지방산에스테르 4.0

친유성 글리셀모노스테아린산에스테르 2.0

폴리옥시에틸렌(20E. O)소르비탄

모노라우릴산에스테르 5.0

프로필렌글리콜 5.0

파라옥시벤조메틸 0.1

대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물 0.5

정제수 36.9

산제상 가려움 경감방지제

규산아르민산마그네슘 95.3 (중량 %)

카르복시메틸셀룰로스칼슘 4.5

대추나무주홍하늘소 유충의 똥 건조분말 0.2

목욕용제

탄산수소나트륨 63.0 (중량 %)

무수황산나트륨 30.0

붕사 2.0

대추나무주홍하늘소 유충의 똥 건조분말 5.0

목욕용제

정제호호바유 5.0 (중량 %)

폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 20.0

글리세린모노라우레이트 5.0

유동파라핀 2.0

라우릴산디에탄올아미드 2.0

대추나무주홍하늘소 유충의 똥 수추출물 3.0

정제수 67.0

본 발명에 의한 대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 피부 외용제, 피부염 억제제, 및 입욕제는 피부에 느끼는 각종 가려움, 알레르기성 피부염, 아토피성 피부염이나 알레르기성 증상, 벌레물림, 피부소양증의 예방 및 치료약으로서 유용하다.

Claims

대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 항알레르기제.
대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용약.
대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 피부염 억제제.
대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 목욕용제.
대추나무주홍하늘소 유충의 똥을 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 화분증 경감제.