WO2003059366A1

WO2003059366A1 - Preparation pour la peau destinee a une utilisation externe et contenant des excrements de purpuricenus temminckii en tant que principe actif

Info

Publication number: WO2003059366A1
Application number: PCT/JP2003/000287
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Akihisa; Toshinori Ishikawa; Yoshihiro Suzuki; Seishiro Mochizuki; Hirotaka Kishida
Original assignee: Nihon University School Juridical Person
Priority date: 2002-01-16
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2003-07-24
Also published as: JP4450406B2; JP2003277276A; KR20040081118A; KR100602924B1; US7431953B2; CN1306941C; AU2003201892A1; CN1620303A; US20050037028A1

Description

明細書ベニ力ミキリフラスを有効成分とする皮膚外用薬技術分野

本発明は、ベニ力ミキリフラスを有効成分とする皮膚外用薬などの薬剤に関するものである。

背景技術

人が生命体を維持して、活動を行っていく上で、体表面の皮膚に感ずる痒みとは、皮膚や粘膜の痛点が弱い刺激によって生じる感覚、搔痒感のことである。近年、生活環境の変化に伴いアトピー性皮膚炎の発症が激増している。アトピ一性皮膚炎の発症には環境要因が大きく作用するといわれている。環境要因には、非ァレルギ一的要因とァレルギ一的要因に分けられる。非ァレルギ一的要因には、皮膚の乾燥、発汗、皮膚の加圧 '加重、皮膚の搔破等によるものである。アレルギー的要因では、食物アレルゲンの吸引によるもの、だに、ハウスペット、花粉、金属等との接触などによるものである。

非アレルギー要因による場合には、要因と接触することで、痒みが生じ、その痒みに対して皮膚を搔くことにより皮膚組織が破壊され、皮膚が有する防御機能が損なわれ、皮膚過敏や病原菌による感染症状が引き起こされる。

アレルギー症状は、体内で起こる抗原抗体反応による免疫グロブリン E ( I g E) の産生により、結果的に肥満細胞の細胞膜を刺激し、ヒスタミン、ロイコトリエン、セロトニンなどの活性物質を放出することにより起こる。放出されたこれらの物質は、血管透過性を促進させる作用や、平滑筋を収縮させる作用があるため、白血球や蛋白質を血管から漏出させたり、炎症により気管支を収縮させ、喘息を引き起こす原因となる。また、体内にアレルゲンが侵入すると T細胞が感作され、再度アレルゲンに接触するとリンホカインと呼ばれる炎症性因子を放出し、反応を起こす。このような症状に対して、予防 *改善に有効な因子を探し出す研究が行われている。

そして、抗アレルギー成分に関し、ボルネオールの肥満細胞膜安定可能を利用するもの（特開平 6— 2 1 1 7 1 3号公報）、放線菌培養液による炎症抑制作用を利用するもの（特開平 5— 2 5 0 5 3号公報）などが知られている。また、ごま油を摂取することによって、アレルギー反応の原因となるロイコトリェンの産生を抑制する効果が知られている（Prostaglandin 第 3 6卷、第 3号、 1 9 8 8年）。また、ドコサへキサェン酸（D HA) 、或いはリノレン酸を含む油脂の抗アレルギー性を利用するもの（特開平 2— 2 9 0 8 1号公報）が知られている。これらの天然に存在する坑ァレルギ一剤は副作用が少ないが、抗ァレルギ一症状の予防及ぴ治療には、その効果は、十分ではない。

ヒスタミンを代表とする多数の活性物質力肥満細胞や好塩基球から遊離されることが影響を与えていることから、前記の抗アレルギー症状を軽減させるために、ヒスタミン受容体阻害剤が有効と考えられ、クロラルフエニルァミン、ジフェンヒドラミンなどの抗ヒスタミン剤や副腎皮質ホルモンが用いられるが、これらの薬剤を用いる場合には、副作用を伴うことが問題とされている。

このようなことから、副作用が少ない薬剤の開発が進められており、天然物由来の物質の開発が進められている。

この種の天然物としてはキク科ヒマヮリ属の花弁抽出物を用いるもの（特開 2 0 0 0 - 3 5 1 7 2 3号公報）、ァカナノキなどの抽出物（特開 2 0 0 0 - 2 6 3 0 7号公報）、ティートリ一の抽出物（特開平 1 1一 2 5 5 6 6 1号公報）、トコフエロール抽出物（特開 2 0 0 1 _ 1 6 3 7 6 4号公報）、キトサンを用いるもの（特開 2 0 0 1 - 5 5 3 3 5号公報）などが開発されている。

発明の開示

本発明の課題は、皮膚に感ずる種々の痒み防止及び改善に対して有効な、天然物由来のかゆみどめ、アトピー性皮膚炎やアレルギー性症状の予防、改善及ぴ治療となる、抗アレルギー剤、皮膚外用剤、皮膚炎抑制剤及び浴用剤を提供することである。

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究し、竹類に寄生するべ二力ミキリの幼虫の排泄物であるべ二力ミキリフラスの成分を含む組成物、ベニ力ミキリフラスを水或いは有機溶媒で処理して得られる抽出物を用いて、ヒスタミン遊離抑制試験及ぴロイコトリエン分泌抑制試験を行つたところ、高活性を示し、ァレルギー性の皮膚炎、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性症状に有効に作用することを見出し、さらに、実際にヒスタミンが関与するアレルギー性の皮膚炎、ァトビー性皮膚炎やアレルギー性症状、花粉症状軽減薬、虫さされ、環境要因による皮膚そう痒症等に用いて試したところ、広範囲にわたる痒み症状に対して短時間で顕著な効果が見られ、各種の痒みの内服薬及び外用薬として予防及び改善に有効であること、更に機能性食品として用いると、痒みの予防 ·改善に有効であること、更にこれらを浴用剤として用いると、痒みの予防 ·改善にも有効であることを見出して、本発明を完成させた。

すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。

( 1 ) ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする抗アレルギ一剤。

( 2 ) ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする皮膚外用薬。

( 3 ) ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする皮膚炎抑制剤。

( 4 ) ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする浴用剤。

( 5 ) ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする花粉症軽減剤。

図面の簡単な説明

図 1は、ベニ力ミキリフラス水抽出物のヒスタミン遊離抑制試験の結果を示す図である。

図 2は、ベニ力ミキリフラス水抽出物のロイコトリェン分泌抑制試験の結果を示す図である。

図 3は、年齢及ぴ性別による患者の分布の状態を示す図である。

図 4は、痒みに対する改善の効果が現れるまでの時間を示す図である。

図 5は、痒みの原因となる症状の分布を示す図である。

図 6は、ベニ力ミキリフラスの抽出物分画スキームを示す図である。

図 7は、ベニ力ミキリフラスの n—へキサン抽出物による；3 —へキソサミニダーゼ遊離測定法の結果を示す図である。

図 8は、ベニカミキリフラスの水抽出物による /3 —へキソサミニダーゼ遊離測定法の結果を示す図である。

図 9は、ベニ力ミキリフラス水抽出物の 2 4穴マルチウエル'スクリーニング法によるギムザ染色の結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の対象であるべ二力ミキリフラス成分を取得するために用いられる原料の竹としては、モウソゥチク属、シホウチク属、マダケ属、シュドササ属、ササモルファ属、ナリヒラタケ属、トウチク属などの竹類が用いられる。なかでも、マダケ属の孟宗竹及びハチクが好適に用いられる。これらの竹が切り取られ、放されると、ベニカ^キリ (Purpuricenus temminckii Guerin-Menevillel844) が卵をうみつけ、その幼虫が竹類を食べて成長する。その成長過程で、排泄物を竹の中に残す。これをべ二力ミキリフラスと呼ぶ。このべ二力ミキリフラスを集めて、本発明の抗ァレルギ一剤などの対象物質とする。

なお、ベニカミキリは、主に我が国では、本州（ャブツバキ帯一ブナ帯下部）、佐渡、四国、九州、卷岐、対馬などに分布し、春から夏にかけて出現する。

竹から得られるベニ力ミキリフラスは、しっとりとした粒状の薄黄色を帯びた組成物として得られる。

このべ二力ミキリフラスは、水分を含有するので、これを乾燥させることにより水分を取り除いて粉状体とすることができる。乾燥させるには、 3 0〜8 0 °C の条件下に行う。 8 0 °Cを越える高温で処理すると、分解などを伴うので、好ましくない。

この粉状のものを、ガーゼなどを用いて患部に直接接触させることにより、薬剤として使用することができる。また、このべ二力ミキリフラスは、格別水分などを取り除くことなく、そのまま薬剤として使用することもできる。後述する実施例で直接用いた結果を示すが、薬斉として良好な結果を示すものである。

また、水又は有機溶媒により抽出された抽出液の状態のものを、アレルギー症状を緩和させるために、患部に前記と同様に接触させて用いることができるし、水に溶解させたものを、花粉症点鼻薬として粘膜にほどこすことができる。

ベニ力ミキリフラスより水抽出物を取り出す場合には、過剰量の水（熱水）と容器内で接触させる。水には熱湯を用いることが効果的である。通常、 0 . 0 0 1 〜 0 . 0 0 7重量％程度の濃度になるように水量を調節する。抽出には、還流条件下に加熱する。加熱時間は、適宜設定する。加熱処理は、通常少なくとも 1 5分以上、 1時間程度は必要である。

その結果、ベニ力ミキリフラスの有効成分は熱水層に移行させることができる。この熱水処理は 2回以上、通常 3回程度まで繰り返すことが有効である。

この一回目の操作により、一般には、ベニ力ミキリフラス重量に対して 0 . 3 〜 1 . 0 %程度、通常 0 . 7重量％程度の割合で液状物が得られる。このようにして得られる液状物を減圧条件下に濃縮する。最終的に、ベニ力ミキリフラスの抽出物は、茶褐色の粉末状のものとして得られる。収量は、ベニ力ミキリフラスの重量に対して 1 . 0〜 2 . 0重量％程度のものが得られる。

温水の利用も可能である。圧力をかけた条件下にも行うことができる。このようにして得られる粉末状の水抽出物を、使用に際しては、適宜水に溶かして薬剤として利用する。

後の実施例に示すように竹フラス 1 0 gを用いて水抽出を行った結果、 1 7 6 . 2 m gのフラス抽出物を得ている。

ベニ力ミキリフラスを有機溶媒に接触させて処理することにより有機溶媒による抽出物としたものを薬剤として利用することができる。

有機溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプロパノールなどのアルコール類、グリセリン、エチレングリコーノレ、プロピレングリコール、 1 ， 3—ブチレングリコールなどの多価アルコール又はその誘導体、アセトン、メチルェチルケトンなどのケトン類、酢酸ェチル、酢酸イソプロピルなどのエステル類、ェチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテノレ類を挙げることができる。また、石油エーテル、 n—へキサン、 n—ペンタンなどの脂肪族炭化水素なども用いることができる。

これらの中では、エタノール、 1 , 3—ブチレングリコール、プロピレングリコールなどが用いられる。これらには、水を含めて混合溶媒として用いることもできる。

いずれも溶媒抽出した後、更に他の溶剤に接触させて、さらに特定の成分を取り出すことができるが、そのような操作を施すことなく、エタノール或いは 1 ， 3—プチレングリコール溶媒のものを適当な濃度のものとして、患部に直接、塗りつける、或いはガーゼなどにしみこませた状態であてがうことによって、用いることができる。

ベニ力ミキリフラス成分の有機溶媒抽出に当たっては、へキサンなどで抽出を行って、へキサン抽出物と残さに分け、この残さをメタノール抽出し、メタノール抽出物と残さに分け、メタノール抽出物を酢酸ェチル溶解成分とブタノール溶解成分に分けることができ、残さを水抽出を行うなどして、各種溶解成分を取り出すこともできる。

ベニ力ミキリフラスの成分を含有する組成物は、抗アレルギー剤として用いることができる。抗アレルギー剤としては、経口内服薬、静脈注射、外用薬として利用できる。また、花粉症軽減薬、又、機能性食品や菓子などの食品及ぴ各種飲料中に添加して痒み防止或いは改善をはかることもできる。又、皮膚外用剤、皮膚保護剤、皮膚炎抑制剤、ローション及ぴクリーム及ぴ石鹼などに添加して、痒み防止 ·改善をはかる化粧品として利用することもできるし、痒み防止 ·改善作用も有する頭髪剤にも用いることもできる。また、浴用剤に添カ卩して浴用剤に痒み防止 ·改善をはかるようにすることもできる。場合によっては、下着や靴下などの衣料に含有させて、衣料に痒み防止 ·改善の作用をもたせることもできる。ベニ力ミキリフラスを、水抽出物、有機溶剤抽出物、或いは乾燥物として 0 . 0 0 1〜2 0重量％程度の濃度のものとして用いることが一般的である。

この中に、抗炎症剤、抗アレルギー性疾患剤である、ァズレン、塩酸ジフェンヒドラミン、 d 1 —ひトコフェロール及ぴその誘導体と共に用いることもできる。また、多糖類などの天然高分子、でんぷん、水溶性高分子、ァニオン、カチォン、ノ二オンなどの界面活性剤を用いることもできる。

入浴剤として用いる場合には、粉状のベニ力ミキリフラス、炭酸水素ナトリウム、無水硫酸ナトリウム、硼砂、香料、安定剤などとともに混合したものを、水などに溶解抽出物を適宜水に溶かして薬剤として利用する。また、液状のベニ力ミキリフラスをホホバ油、香油、色素、保湿剤、界面活性剤と混合した液状のもとしても利用することができる。

以下に、本発明の内容を実施例により説明する。本発明のベニ力ミキリフラスの抽出物の製造方法として、有機溶媒による抽出物の製造方法及ぴ水による抽出物の製造方法について示す。

本発明のベニ力ミキリフラスの薬剤として用いた効果については、ヒスタミン遊離抑制及びロイコトリェン分泌抑制試験、 β 一へキソサミニダーゼ遊離抑制試験を行うことによって、痒みなどに対する効果を確認することができる。

本発明のベニ力ミキリフラスの各種皮膚疾患に使用する場合の毒性試験として、線維芽細胞を用いる「2 4穴マルチウエル'スクリーニング法」により行い、その結果から、その毒性の有無を確認することができる。以下に、その内容及ぴ実験結果について詳細に説明する。

実施例

以下、実施例により本発明の内容を説明する。

実施例 1

(ベニ力ミキリフラスの有機溶媒による抽出物の製造）

竹から得られたベニ力ミキリフラス 5 9 1 gを、へキサンで抽出を行って、へキサン抽出物 3 3 2 m gと残さに分け、この残さを、メタノール抽出し、メタノール抽出物 1 4 . 6 gと残さに分け、メタノール抽出物が酢酸ェチルに溶解した区分 3 . 6 8 5 gと水により溶解した区分に分けることができ、水により溶解した区分について、 n—ブタノール溶剤で処理し、ブタノール溶解区分 1 . 9 3 1 gと水区分に分けることができ、メタノール抽出残さを水（熱水）抽出を行って、水抽出物 1 2 . 1 3 2 gを得た。

実施例 1一 2

(ベニ力ミキリフラスの有機溶媒による抽出物の製造）

竹から得られたベニ力ミキリフラス 1 0 3 7 gを、へキサンで抽出を行って、へキサン抽出物 5 0 9 . 9 m gと残さに分け、この残さを、メタノール抽出し、メタノール抽出物と残さに分け、メタノール抽出物を酢酸ェチル溶解区分 5 . 4 1 g及ぴ水溶解区分にわけることができ、水により溶解した区分について、 n— ブタノール溶剤で処理し、ブタノール溶解区分 2 . 5 3 gと水区分 3 . 6 5 gに分けることができ、メタノール抽出残さを水（熱水）抽出を行って、水抽出物 2 7 . 1 3 2 gを得た。（図 6 ) 実施例 1一 3

( n一へキサン抽出物からの成分の分離）

ベニ力ミキリフラス（1037 g) を、 n—へキサン（3 L) で 3回、 3時間加熱還流抽出し、得られた抽出物（461mg) をシリカゲルのカラムクロマトで分画した。得られた 3—ォキソステロイド画分の薄層クロマトグラフィ及び逆相分取 HP LCを行い、 3種の化合物を単離した。

3種の化合物は、スチグマスト一 4—ェンー 3， 6—ジオン（2. 9mg) 、スチグマスター 4， 22—ジェン一 3オン (1. Omg) 、及びスチグマストー 4一ェンー 3—オン（5. 9mg) と同定した。これらの 3種の 3—ォキソステロイドについて、 —へキソサミニダーゼ遊離測定法の試料とした。

スチグマスト- 4-ェン- 3-オン

スチグマスト- 4-ェン- 3, 6-ジオン

スチグマスタ- 4, 22-ジェン- 3-ォン実施例 2—1

(ベニ力ミキリフラスの水抽出物の製造）

竹から採取したベニ力ミキリフラス 10 gを、水 500 mLに溶解させ、加熱し、還流条件下に加熱した。加熱処理は、 5時間行った。

得られたベニ力ミキリフラスの抽出成分を含有する成分に関し、同様に 2回操作を繰り返した。その結果、ベニ力ミキリフラス水抽出物 1 76. 2mgを得た。以後の実施例ではこれを必要量の水に溶解して用いる。

実施例 2— 2

( β—へキソサミニダーゼ遊離測定法に用いたベニ力ミキリフラスの水抽出液の竹から採取したベニ力ミキリフラス 1037 gに、水 3 Lを加え、 3時間加熱還流を行い、抽出を行った。得られた抽出物の一部（41. 2mg) を、

Shodexカラム（GS— 320HQ) にて 7区画分に分画した。これら 7区画分

[F r . 1 (3. 2mg) 、 F r 2 (3. 2mg) 、 F r 3 (8. 2mg) 、 F r 4 (6. 8mg) 、 F r 5 (6. 2mg) 、 F r 6 (5. Omg) 、 F r . 7 (5. Omg) について、 j3—へキソサミニダーゼ遊離測定法に用いるベニ力ミキリフラスの水抽出物とした。

実施例 3

(ヒスタミン遊離抑制試験）

実施例 2— 1で得られたベニ力ミキリフラス水抽出液のヒスタミン遊離抑制効果を、ラット由来好塩基球細胞（RBL—2H3) カら遊離されるヒスタミンを指標とする抗アレルギー作用試験法を用いて評価した。 RBL— 2H3を 24穴プレートに 2. 5 X 10 細胞 Z穴となるように細胞を播種し、 24時間培養（二酸化炭素 5 %、 37度）後、 Phosphate buffer saline (PBS) で 1回洗浄した後、各濃度の竹チップ抽出物/ 20 mM He p e s—DMEM 180 μ Lを加えて二酸化炭素 5 %、 37度で 30分培養し、次に、刺激剤 A23187 (カルシウムィオノファ）を 20/z L加えて 3 0分培養した後、上清 200 μ Lを取り出した。また、 20mM He p e s— DMEM (Me d i um) 及ぴ界面活性剤 0. 05%T r i t o X- 100 (細胞壁を溶解することで細胞中の全ヒスタミン含量を測定する）を用いて上述と同様に刺激して得られた上清を各々 Negative Control, Positive Controlとした。

このようにして取り出した上清中のヒスタミン含量は Histamine enzyme- linked immunoadsorbent assay (EL I S A) K i t 、I CN Pharmaceuticals 社製）を用いて定量した。なお、ヒスタミン遊離率およびコントロールに対するヒスタミン遊離率は式 1及ぴ式 2を用いて算出した。コント口ールに対する各濃度のヒスタミン遊離率を図 1に示す。

ヒスタミン遊離率 (%)

= ( (A-B) / (C— B) ) X 1 00 · . · (式 1) Aはべ二力ミキリフラス水抽出液処理した細胞に A 231 87で刺激した上清中のヒスタミン含量

Bは N e g a t i v e Co n t r o lによる上清中のヒスタミン含量

Cは P o s i t i v e Con t r o lによる上清中のヒスタミン含量

コント口ールに対するヒスタミン遊離率（％)

= (D/E) X 100 · · · (式 2)

Dは各濃度のベニ力ミキリフラス水抽出物のヒスタミン遊離率（％)

Eは A238 1 7刺激のみ（ベニ力ミキリフラス水抽出物で未処理）のヒスタミン遊離率（％)

コント口ールは A 23187で刺激のみ（ベニ力ミキリフラス水抽出物で未処理）の上清中のヒスタミン遊離率（％)

(結果） A23187はブランクの結果である。

0. 625mg/mLの場合には、顕著に減少しており、その後、 1. 25 mg/mL, 1. 25mg/mL以降徐々に値が減少している。ヒスタミン遊離抑制効果は十分にあることが理解できる。

実施例 4

(ロイコトリェン分泌抑制試験）

実施例 2— 1で得たベニ力リキリフラス水抽出物のロイコトリエン分泌抑制効果をラット由来好塩基球細胞（RBL— 2H3) から分泌されるロイコトリェンを指標とする抗アレルギー作用試験法を用いて評価した。

RB L— 2H 3を 24穴プレートに 2. 5 X 1 0⁵糸田胞 Z穴となるように細胞を播種し、 24時間培養（二酸化炭素 5 %、 37度）後、 Ph o s p h a t e b u f f e r s a l i n e (PBS) で 1回洗浄した後、各濃度のベニ力ミキリフラス水抽出物 /2 OmM H e p e s -DMEM 180 Lをカロえて二酸化炭素 5%、 37度で 30分培養し、次に、抗原 20 μ Lを加えて刺激し 30分培養した後、上清 200/i Lを取り出した。

このようにして取り出した上清中のロイコトリェン分泌量は Leukotriene C₄ Enzyme immunoassay (EIA) Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) 用レヽて疋' した。なお、ロイコトリェンの分泌量はロイコトリェン標準溶液（0〜： L 000 p g/mL) による検量線を用いて算出した。各濃度によるロイコトリェン分泌抑制効果を図 2に示す。

(結果）

DNP— BSAは、ブランクの結果である。 0. 625mg/mL以降、徐々に減少し、 5. 0 m gでは、 45 p g Zm Lという小さな結果の値を得た。このこと力ゝら、ベニ力ミキリフラス水抽出物のロイコトリェン分泌抑制効果は、十分に確認することができた。

( β一へキソサミニダーゼ測定法）

β—へキソサミニダーゼ測定法の測定原理は、以下の通りである。

;3—へキソサミニダーゼは、糖分解酵素であり、マスト細胞の顆粒中に豊富に存在するリソソーム酵素の一つである。一へキソサミニダーゼ測定法は、本酵素の存在により、 p—ニトロフエノールが分離する。この分離された P-ニトロフエノールを比色法により測定し（4 05 nm) 、この結果を jS—へキソサミニダーゼ酵素活性とする。

(結果）

NAD PH oxidaseの阻害剤である DP Iを用いて、；8—へキソサミニダーゼ抑制効果を検討したところ、 DP Iは抗原刺激により生じた j8—へキソサミニダーゼを濃度依存的に抑制した。

P—へキソサミニダーゼ抑制効果は、ヒスタミン抑制効果と同等の評価が可能であった。

( β—へキソサミニダーゼ遊離抑制試験）

β—へキソサミニダーゼ遊離測定効果は、ラット由来好塩基球菌（ R B L— 2 Η 3) から遊離される β—へキソサミニダーゼを指標とする抗アレルギー作用試験法を用いて評価することとした。

RBL—2H3を、 1 0%ゥシ子牛血清（ F C S ) 100単位/ m Lぺニシリン、 100 g/mLストレプトマイシン含有 Minimum Essential Medium

Eagleで培養（5%二酸化炭素、 37°C) した。次に、細胞培養用 24ゥヱル平底マイクロプレートに、 2 X 1 0⁵セル数 ( 500 At L medium/well) づっ播種し、 24時間培養（5%二酸化炭素、 37°C) することによって、細胞を感作させた。その後、感作した細胞を 500 μ Lの PB Fで 1回洗浄し、 160 の 5. 6 mMグルコース、 I mM塩化カルシウム、 0. 1 %B S A含有 siraganian緩衝液を加えた。各濃度のサンプル液、 20 Lの被験物質溶液

(DMSO： 0. 1%) を加え、 10分後に抗原（DNP— B S A： 10 μ g/ mL) を加えて 10分間ィンキュベートして細胞を刺激した。 10分間氷冷して反応を止めた後、上清 50 /z Lを、 96ゥエル平底マイクロプレートに移し、酵素反応液 100 μ Lを加えて、混和し、マイクロプレートリーダーにて吸光度を測定し、以下の式により遊離率を求めた（測定波長： 405 nm、参照波長： 6 55 n mj 。

β一へキソサミニダーゼ遊離率（％)

= [刺激により遊離した一へキソサミニダーゼ量 Ζ 細胞内全 —へキソサミニダーゼ量] X 100 細胞内全 jS—へキソサミニダーゼの測定には、超音波破碎機で破碎した細胞を遠心分離した上清を用いた。

(へキサン抽出物による —へキソサミニダーゼ遊離測定法）

実施例 1一 2のへキサン抽出物から得られた 3種のォキソステロイド（スチグマスト _4一ェンー 3， 6—ジオン、スチグマスタ一 4， 22—ジェン一 3—才ン、及ぴスチグマストー 4ーェン一 3—オン）について、 ]3—へキソサミニダ一ゼ遊離測定効果を測定した。これらについては、一応の —へキソサミニダーゼ遊離測定効果を確認した。結果は、図 7の通り。

実施例 5

(水抽出物による jS—へキソサミニダーゼ遊離測定法）

実施例 2— 2で得られたベニ力ミキリフラスの水抽出物（竹から採取したベニ力ミキリフラス 1037 gに、水 3 Lを加え、 3時間加熱還流を行い、抽出を行つた。得られた抽出物（41. 2mg) の一部を、 Shodexカラム（G S _ 32 0 HQ) により、 7区画分に分画した。これら 7区画分（F r. ：!〜 F r . 7) ) について、 ]3—へキソサミニダーゼ遊離測定試験を行った。

結果を、（図 8) に示した。

全体に一応の活性を見ることができた。 F r . 1及び 2については、活 1"生が強いことがわかった。

実施例 6

( 24穴マルチウエル 'スタリ一二ング法（毒性試験） )

24穴マルチウエル 'スクリーニング法（高岡聡子著「組織培養入門」学会出版センター発行 68頁）により、本発明のベニカリキリフラスの薬剤の毒†生試験を行った。

(この方法は、 AB CD各ライン（行）及び 1から 6列のゥヱル（合計 24 穴）を用意し、 Aラインについて薬剤原液 0. lmLを含む（A1) 、及ぴ濃度が倍々に希釈され、濃度が相違する（（A2〜A5) 、薬剤を含まない（A6) を用意する。次に、細胞の浮遊液を調製する。細胞数は、 5 X 10⁴ZmL程度である。各ゥエルに細胞浮遊液を 0. 9 mLずつ分注する。これを水平にしたまま、左右に軽く揺すって、炭酸ガスふらん器で培養。 3〜7日培養し、培地をすて、メタノールを静かに注入し、 10分以上固定。流水で洗った後、ギムザ染色を行い、染色異常が見られるかどうかで毒性を判定するものである。）

毒性試験の内容は、以下の通りであった。

(1) 薬剤抽出液の作成

ベニ力ミキリフラス水抽出物（ベニ力ミキリフラス 3. 9 gに、 20mLの純水を添加して撹拌し、室温から 100°C直前（沸騰直前）まで加熱し、この温度において煮出した状態として、 1時間保ち、室温まで冷却し、遠心分離器により (1200 r pm. 10分間）、遠心分離を行った。上澄の清浄液を濾過滅菌し、薬剤原液を作成した。

(2) 毒性試験として、前記 24穴マルチウエル ·スクリーニング法を行った。

(3) 使用細胞は、以下の細胞を使用した。

NHDF-NEO CRYOPRESERVED (ヒト皮膚線芽細胞新生児）である。 B I O WH I TTAKER (ACAMBREX COMPANY 製製造年月日： 1 999年 5月 1 0日 ₀1:番号： 9 0889 保証書添付のもの）

(4) 培養培地は、以下の培地を使用した。

FBM (改変 MC D B 202血清添加）

( 5 ) 添加条件は以下の通りであった。

原液のマルチウエルへの添カ卩は、 1ゥエルあたり、 0. lmLであった。

希釈は、 PBS (リン酸緩衝塩類溶液）により、最終濃度を、 0%、 1 2. 5 %、 25 %、 50 %の 4段階とした。

(6) 培養条件

培地 FBMに浮遊した細胞液 0. 9 mLを、各 24ゥエルに添加した。 36°C で 4日間、加温した。

(7) 鑑定法

(ィ）ゥエル内の培地を捨て（細胞は、ゥエルに接地）、直ちに、メタノーで固定後、ギムザ染色を行った。顕微鏡により観察し、写真記録を行った（図 9) 。

(口） 25 cm²のプラスチック培養瓶で原液 50 %を添加し、 8日間観察した。また、培養後、ギムザ染色を行った。

(8) 鑑定結果

(ィ）以上の操作により得られた、 24穴マルチウエル ·スクリーニング法による対照結果（図 9) によれば、対照結果（0%) と前記最終濃度 0%、 1 2. 5 %、 25%、 50%の結果と比較して、最終濃度 0%、 12. 5%、 25%、 5 0 %のいずれも、増殖及ぴ形態に変化はなく、毒性がないことがわかった。 (口） 25 cm のプラスチック培養瓶で原液 50%を添加し、 8日間観察した結果では、増殖及ぴ形態共に影響は見られなかつた。

培養後、ギムザ染色を行った結果によれば、異常はなかった。

(9) 結論

ベニ力ミキリフラスの水抽出液は、ヒト由来線維芽細胞に影響を与えず、薬剤として使用した場合に安全であると言うことができる。

実施例 7

ベニ力ミキリフラスの水抽出物を精製水に溶解し、 0. 005%濃度として、かゆみを呈する際に随時患部に塗布させ、かゆみ症状の改善状況について表 1に示す結果を得た。なお、本剤使用期間中は抗ヒスタミン剤など別の抗ァレルギ一剤の使用は中止させた。

本発明による皮膚外用剤を塗布した症例:！〜 1 1 (皮膚搔痒症、アトピー性皮膚炎、水虫、あせも、蓴麻疹、虫刺され、血液人工透析、かぶれ、刺青、しもやけ、とびひ）の結果は、これら全ての症状によるかゆみに本剤が極めて有効であることを示しており、止痒効果の無い例及び塗布により症状（かゆみ及ぴ皮膚炎など）の悪ィ匕した例は一件も認められなかった。

その結果を整理して表に整理したものが、表 1である。表 1

皮膚外用剤塗布による止痒効果

(結果）

以上の表の記載から明らかなように、顕著に効いたものが多く、そして、有効が若干有り、全体として顕著に効いたということができる。無効及び悪化というものは皆無であった。そして、各種の原因による痒みに有効であることが理解でさる。

本調査結果について、集計方法の整理して見ると以下のことがわかる。

男女の割合は、各々 5 0 %であり、同じである。年齢及び性別による患者の分布の状態は、図 3に示すとおりである。ベニ力ミキリフラスの使用に関しては、水抽出物（9 0 %) 、粉末（3 %) 及ぴその両方を併用したもの（7 %) であつた。

効果が現れる迄の時間は、殆ど 1分から 5分の間にあり、痒みに対して即効性があることがわかる（図 4 ) 。痒い症状の原因の分布は、図 5に示すとおりである。この結果から、広範囲の症状に有効であることが理解できる。

実施例 8

ベニ力ミキリフラス 1 0 0 gを水 1 Lにより添カ卩し、加熱し、煮沸した状態で 3時間保持した。得られた抽出液を冷却して、水抽出液を得た。これを点鼻注入器により、 1 0日間にわたり、 1日 3回、花粉症の患者 2 0人に注入した。花粉症の軽減が 1 4人に見られ、そのうち 5人には著効があった。以下に、処方例の一例を示す。本発明はこれに限定されるものではないことは言うまでもない。

ローション状痒み防止 ·軽減剤

エタノーノレ 1 5. 0 (重量％) ヒドロキシ工チノレセノレロース 0. 1

パラォキシ安息香酸メチル 0. 1

ベニ力ミキリフラス水抽出物 0. 2

84. 6

乳状痒み防止 ·軽減剤

ステアリン酸 0. 2 (重量％) セタノ一ノレ 1. 5

ヮセリン 3. 0

流動パラフィン 7. 0

ポリオキシエチレン ( 10 E. O)

モノォレイン酸エステル 1. 5

酢酸トコフヱロール 0. 2

グリセリン 5. 0

パラォキシ安息香酸メチル 0. 1

トリエタノールァミン 0. 1

ベニカイキリ水抽出物 0. 4

精製水 81. 0

ゲル状痒み防止 ·軽減剤

ジプロピレングリコーノレ 10 0 (重量％) カノレポキシビニノレポリマー 0 5

水酸化カリウム 0 1

パラォキシ安息香酸メチル 0 1

ベニカミキリ水抽出物 0 5

88 8

クリーム状痒み ·軽減防止剤みつろう 6. 0 (重量％) セタノーノレ 5. 0

還元ラノリン 8. 0

スクワレン 27. 5

ダリセル脂肪酸エステル 4. 0

親油性グリセルモノステアリン酸エステル 2. 0

ポリオキシエチレン（20E. O) ソルビタン

モノラウリノレ酸エステノレ 5. 0 プロピレンダリコール 5. 0

パラォキシ安息香メチル 0. 1

ベニ力ミキリフラス水抽出物 0. 5

精製水 36. 9

散剤状痒み軽減防止剤

ケィ酸アルミン酸マグネシゥム 95. 3 (重量％) カルポキシメチルセルロースカルシウム 4. 5

ベニ力ミキリフラス乾燥粉末 0. 2

浴用剤

炭酸水素ナトリウム 63. 0 (重量％) 無水硫酸ナトリゥム 30. 0

硼砂 2. 0

ベニ力ミキリフラス乾燥粉末 5. 0

浴用剤

精製ホホバ油 5. 0 (重量％) ポリォキシエチレンソルビタンモノラウレート 20. 0

グリセリンモノラウレート 5. 0

流動パラフィン 2. 0

ラウリン酸ジエタノールァミド 2. 0

ベニ力ミキリフラス水抽出物 3. 0

精製水 67. 0 産業上の利用の可能性

本発明によるべ二力ミキリフラスを成分として含有する皮膚外用剤、皮膚炎抑制剤、及ぴ入浴剤は、皮膚に感ずる各種の痒み、アレルギー性の皮膚炎、アトピ一性皮膚炎やアレルギー性症状、虫さされ、皮膚そう痒症の予防及び治療薬として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする抗アレルギ一剤。

2 . ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする皮膚外用薬。

3 . ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする皮膚炎抑制剤。

4 . ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする浴用剤。

5 . ベニ力ミキリフラスを成分として含有することを特徴とする花粉症軽減剤。