KR20140145324A - 인(仁) 혼합물을 기반으로 하는 복합 인 발효물, 이 발효물의 제조방법 및 이 발효물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 홍반 진정 효과와 피부 염증(구체적으로, 아토피 피부염) 및 피부 노화의 억제 효과가 있는 복합 생약 발효물에 관한 것이다. 구체적으로, 복합 생약 발효물은 과루인, 구채인, 도인, 백자인, 산조인, 여인, 의이인, 호마인, 행핵인, 및 사상인으로 구성되는 복합 인 재료의 증숙 여액에 바실러스 속 미생물을 접종 발효시켜 수득한 복합 인 발효물을 의미하는 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 복합 인 발효물의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 복합 인 발효물을 함유하는 피부 홍반 진정 효과와 피부 염증 및 피부 노화의 억제 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

인(仁) 혼합물을 기반으로 하는 복합 인 발효물, 이 발효물의 제조방법 및 이 발효물을 함유하는 화장료 조성물{FERMENTED SEED COMPLEX DERIVED FROM MIXED SEED EXTRACT, METHOD FOR PREPARING OF THE FERMENTED SEED COMPLEX, AND COSMETIC COMPOSITION CONTAINING THE FERMENTED SEED COMPLEX}

본 발명은 일반적으로 복합 생약 발효물에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 인(仁) 혼합물을 기반으로 하는 복합 인 발효물, 상세하게는 과루인, 구채인, 도인, 백자인, 산조인, 여인, 의이인, 호마인, 행핵인, 및 사상인으로 구성되는 10종의 복합 인 저온 추출물에 바실러스 속 미생물의 배양물을 접종 발효시켜 수득한 복합 인 발효물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 발효물의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 복합 인 발효물을 함유하는, 피부 진정 효과 및 아토피 피부 개선용 및 항산화 효능에 기인하는 피부노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

민감성 피부(sensitive skin)란 외부의 자극성 물질, 알레르기성 물질, 환경 변화, 생리적인 인체 내부 원인 등에 대해 정상적인 피부보다 더 예민하게 반응하여 홍반과 같은 자극 반응이나 피부염을 잘 일으키는 피부이다. 민감성 피부의 증상은 주관적 증상과 객관적 증상으로 나눌 수 있는데, 주관적 증상으로는 전형적인 자극성 피부염 또는 알레르기성 피부염으로 분류되지 않는 증상으로, 어떤 물질이 피부에 노출될 때 작열감, 따가움, 소양감, 당김 호소 등을 포함하고, 객관적 증상으로는 홍반, 구진, 인설, 수포, 미란 등이 관찰된다.

이러한 민감성 피부에 의한 질환으로는 습진, 주사형 피부염, 접촉성 피부염 등을 들 수 있으며, 그 중 대표적인 질환으로는 아토피성 피부염을 들 수 있다. 아토피성 피부는 피부 장벽(skin barrier) 기능이 저하됨에 따라 자극유발물질이 각질층 내로 침입하여 자극을 유발하고, 정상 피부에서는 침입하기 어려운 항원 단백질이 침입함에 따라 피부 알레르기 등이 용이하게 발생하여 견디기 힘든 정도의 소양증 증상을 나타낸다. 아토피 환자의 90% 이상이 가려움을 참지 못해 고통스러워하고, 세균 등의 외독소가 우리 몸의 면역체계를 자극하여 알레르기를 일으키는 화학물질을 나오게 하여 아토피를 악화시키기도 한다. 세계적으로 아토피 피부가 증가하고 있으며, 이로 인해 수분 보유력이 저하되고 피부 보호 기능이 상실되어 약한 자극에도 민감하게 반응하여 알레르기가 발생하며, 또한 활성 산소에 의해 과산화지질이 생성되어 이로 인해 아토피 피부가 발생하기도 한다. 이러한 아토피를 치료하기 위해서는 항균, 고보습, 항염의 효과가 우수하며, 부작용이 없고, 비용이 저렴한 생약 재료의 개발이 필수적이다.

다양한 천연 생약 재료 중에서, 씨앗은 스스로의 힘으로 새로운 생명의 탄생을 위해 필요한 영양분과 외부로부터 보호할 수 있는 보호 물질을 풍부하게 간직하고 있기 때문에, 이러한 특성에 기초하여 씨앗으로부터 고품질 화장품 원료를 수득하기 위한 연구에 착수하였다. 이에 다양한 인 원료들 가운데서 본 발명에서 제시하는 10종의 인 원료 혼합물의 추출물은 피부 홍반에 대한 탁월한 진정 효과가 있음을 발견하게 되어 본 연구를 완성하기에 이르렀다.

나아가 본 발명자는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 유해의심 화학물질, 예컨대 파라벤류, 이소프로필알코올, 파라-아미노벤조산(PABA), 광유, 바셀린 등이 사용됨이 없이 씨앗의 모든 생리활성 물질(수용성, 지용성, 불용성)의 완벽한 추출을 가능하게 하는 발효 공정을 추가하여 인체에 부작용이 낮고 인체친화성인 원료 개발을 달성할 수 있음을 확인하였기에, 이 발효물을 이용한 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

제1 양태로, 본 발명은 과루인(瓜蔞仁), 구채인(구菜仁), 도인(桃仁), 백자인(柏子仁), 산조인(酸棗仁), 여인(艸仁), 의이인(薏苡仁), 호마인(胡麻仁), 행핵인(杏核仁), 및 사상인(蛇床仁)의 혼합물을 열수 중에서 증숙한 후 여과하여 얻은 증숙 여액에 바실러스 속 미생물의 배양물을 접종하여 발효시켜 수득한 복합 인 발효물에 관한 것이다.

제2 양태로, 본 발명은 과루인, 구채인, 도인, 백자인, 산조인, 여인, 의이인, 호마인, 행핵인, 및 사상인으로 구성되는 복합 인 재료를 80 내지 90℃의 열수 중에서 증숙하는 단계; 증숙 후 냉각 여과한 여액(본원에서 추출물이라고도 함)에 바실러스 속 미생물의 배양물을 접종하여 상기 여액을 발효시키는 단계; 및 발효 완료 후 발효액을 여과 정제하여, 제1 양태의 복합 인 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 복합 인 발효물의 제조 방법에 관한 것이다.

제3 양태로, 본 발명은 제1 양태에 기재된 복합 인 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 화장료 조성물은 피부 홍반의 진정 효과, 아토피 피부 개선 효과 및 항산화 효과를 기반으로 하는 피부 노화 방지 효과를 제공한다. 특히, 본 발명의 복합 인 발효물을 함유하는 화장료 조성물은 석유계 계면활성제, 에탄올, 색소, 미네랄오일, 유해방부제 등, 통상의 일반 화장품에 흔히 사용되는 유해의심물질을 함유하지 않는다는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 과루인(瓜蔞仁), 구채인(구菜仁), 도인(桃仁), 백자인(柏子仁), 산조인(酸棗仁), 여인(艸仁), 의이인(薏苡仁), 호마인(胡麻仁), 행핵인(杏核仁), 및 사상인(蛇床仁)으로 구성되는 복합 인 재료의 발효물은 이러한 복합 인 재료의 증숙 여액에 비해 높은 피부 홍반의 진정 효과와 아토피 개선 효과 및 피부 노화의 억제 효과가 있어, 기능성 천연 한방 화장품과 같은 고가 제품에 부가 가치가 높은 기능성 재료로 활용도가 높을 것으로 생각된다.

도 1은 본 발명에 따른 복합 인 발효물의 농도에 따른 DPPH 소거능을 나타내는 그래프.
도 2는 본 발명에 따른 복합 인 발효물의 TNF-a 생성 저해 효과를 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명에 따른 복합 인 발효물의 IL-4 생성 저해 효과를 나타내는 그래프.
도 4는 본 발명에 따른 복합 인 발효물의 IFN-γ의 생성 저해 효과를 나타내는 그래프.
도 5는 본 발명에 따른 복합 인 발효물의 IL-6의 생성 저해 효과를 나타내는 그래프.

이하 본 발명에 대해 더 구체적으로 설명하고자 한다.

제1 양태에 따르면, 본 발명은 먼저, 과루인, 구채인, 도인, 백자인, 산조인, 여인, 의이인, 호마인, 행핵인 및 사상인에 열수를 넣고 증숙한 뒤, 여과하여 복합 생약의 증숙 여액(본원에서 추출물이라고도 지칭함)을 얻은 다음, 이 여액에 바이러스 속 미생물의 배양물을 접종하여 발효시킨 후, 이 발효액을 여과 정제하여 수득한 복합 인 발효물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에 사용되는 생약 재료들은 기본적으로 다음과 같은 약효가 있는 것으로 알려진 것들이다:

과루인(Trichosanthes Kirilowii)은 호로과에 속한 다년생 만초인 하늘타리의 과실의 종자로 성질은 차고 맛은 쓰며 독이 없다. 소갈로 열이 나고 가슴이 답답하면서 그득한 것을 낫게 하며 장위 속에 오래된 열과 8가지 황달로 몸과 얼굴이 누렇게 입술과 입 안이 마르는 것을 낫게 한다. 소장을 잘 통하게 하며 고름을 빨아내고 중독을 삭게 하며 유용, 등창, 치루, 창절을 치료한다(동의보감).

구채인(Allium Tuberosum)은 부추씨의 다른 말로 백합과에 속하는 다년생초이다. 한의학적으로는 부추의 씨를 가구자 또는 구채자라 하여 약용으로 사용한다. 구채인은 동의보감에 성질이 따뜻하여 밤에 정액이 저절로 나오는 증상이나 소변이 하얗게 나오는 증상을 치료하며 허리와 무릎을 따뜻하게 하고 남성의 성기능을 강하게 하여 정력이 약해지는 증상을 치료하는데 매우 좋은 약이라고 설명하고 있다.

도인(Prunus Persica)은 장미과의 복숭아나무의 종자로 맛은 약간 쓰고 물을 가해 부술 때는 벤즈알데히드의 방향을 발산하는 것으로 알려져 있다. 약용으로 소염성 구어혈제 등에 쓰이는데, 하복부가 팽만하면서 아픈 경우, 월경 불순 등에 사용되었다. 동의보감에 따르면 여성이 이를 먹으면 안색이 좋아지고 피부 미용에 좋아 미인이 된다고 알려진 바 있으며 무독하여 피부가 가렵고 건조하거나 기미, 주근깨 등에 바르면 좋다고 알려져 있다.

백자인(Thuja Orientalis)은 측백나무과에 속하는 측백엽의 씨앗을 말하며 자양강장제로 많이 알려져 있다. 맛이 달고 성질은 평하며 심, 간, 신장에 작용하여 호흡곤란, 역절, 요통을 치료하며 익혈하고 지한(止汗)한다(명의별록)고 알려져 있다. 혈관내피세포에서 TNF-a 유도 세포부착 억제 효과가 있으며 항혈소판, 항산화 효과가 있는 것으로 연구되어 있다.

산조인(Zizyphus Jujuba)은 갈매나무과의 못대추의 씨로 만든 약재로, 약한 기름 냄새가 있고 맛은 달고 시며 성질이 평하다. 신경과민, 불면증, 식은땀 등에 사용되며 진정, 최면, 혈압강화, 진통, 체온강화작용, 항산화작용, 면역항진작용, 자구응분작용, 화상환부부종억제작용이 보고되어 있다.

여인(Litchi chinensis Sonn)은 여지핵 또는 우리말로는 여주라고 하며 한해살이 덩굴풀로 본초강목에는 '자양강장제로 폐기능을 보강하고 소화기능을 원활히 하며 신경을 안정시키고 보혈하기도 한다'고 되어 있으며 '풍씨금남비록'을 저술한 약물학자 풍초담에 따르면 피부미용에 뛰어난 효과가 있다고 알려져 있다.

의이인(Coix Lacryma-Jobi Ma-yuen)은 벼과의 율무의 종피를 제거한 씨를 말한다. 맛은 조금 달고 담백하며 성질은 서늘하다. 수종, 각기, 비위허약으로 소변이 잘 나오지 않는 증상, 설사, 식욕부진 등에 쓰이며 항암, 골격근수축억제, 장관자궁억제, 진정, 진통 해열작용이 보고되어 있다.

호마인(Sesamum indicum L)은 참깨과의 1년생 초본인 참깨의 성숙한 검은 종자로 간(肝)과 신(腎)을 보하는 명약으로 모발이 빠지는 증상을 치료하고 노화방지의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

행핵인(Prunus armeniaca)은 장미과에 속한 낙엽교목 살구나무의 종자로, 쓴맛이 있는 것은 고인이라 하여 대부분 약용한다. 맛은 달고 쓰며 독이 있고 성질은 따듯하다. 폐와 대장에 작용하여 폐기가 위로 솟고 건조하여 발생하는 기침, 천식 등에 효과가 있고 항암작용, 진해작용, 평천작용, 항종양작용, 항균작용이 있으며, 여드름, 피부미용뿐 아니라 각종 암을 다스리는 것으로 알려져 있다(동의학사전).

사상인(Troilis japonica decandolle)은 미나리과의 두해살이풀인 사상자의 종자로, 사상자는 자궁냉증, 트로코모나성 질염에 의한 심한 가려움증, 백대하, 피부소양증에 효과가 있다고 알려져 있으며 피부질환으로 습진, 알레르기성 피부염 및 진물 등에 외용하며 특히 종자인 사상인은 매우 가려운 괴질을 치료하는데 효과가 있다고 알려져 있다.

이러한 복합 인 발효물은 이하 실시예에서 입증되는 바와 같이 상기 복합 인의 증숙 여액에 비해 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(DPPH) 라디칼 소거능, TNF-a 생성 저해 효과, IL-4 및 IFN-γ 생성 저해 효과, IL-6 생성 억제 효과, 피부 자극 진정 효과가 모두 뛰어난 것을 발견하였기에, 본 발명이 목적으로 하는 아토피 개선 및 피부 노화 방지 효과가 탁월하고 부작용이 적고 인체친화성인 화장료 조성물의 달성을 가능하게 하였다.

전술한 DPPH 라디칼 소거능 실험은 항산화 효과를 입증하기 위한 시약으로 채택하였다. 일반적으로, 피부 노화 과정은 지질 과산화, DNA 산화, 멜라닌 생성, 결합 조직의 절단 및 비정상적인 교차결합 등을 포함한다. 이 반응들은 거의 모두 라디칼 반응으로, 자동산화반응 과정을 포함한다. 생체 내에서 자동산화반응을 차단시키는 역할을 항산화제가 담당하고, 전자를 주는 능력인 환원력이 클수록 강한 항산화제가 된다. 이에 본 발명에서는 항산화제의 환원력을 측정하는 시약으로 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(DPPH) 라디칼을 사용한다. DPPH는 화합물 내 질소 중심의 안정화된 구조의 라디칼로 존재하고, 517nm에서 최대 흡수를 하며, 환원 시 517nm에서의 흡수가 없어진다. 따라서, 본 발명에 따른 복합 인 발효물의 항산화성 측정에는 환원력 크기 시험으로서, 라디칼 소거 활성(SC₅₀)을 사용한다. SC₅₀은 DPPH의 농도가 50% 감소하는데 필요한 농도를 나타낸다.

DPPH 라디칼 소거 활성(%) = (1-시료 첨가군의 흡광도)/대조군의 흡광도)x100

본 발명의 목적 중 하나인 항염증성 효과의 시험에는 면역 세포에서의 염증 사이토카인인 TNF-a, IL-4, IFN-γ 및 IL-6의 생성 저해 효과 등을 비교 실험할 수 있다. 즉, 면역 세포에서의 염증 사이토카인인 TNF-a, IL-4, IFN-γ 및 IL-6의 생성 저해 효과가 클수록 알레르기 유발 물질 및 아토피 유발 물질로 인한 피부염에 대한 억제 효과가 크다는 것을 입증할 수 있다.

이러한 본 발명의 복합 인 발효물의 효능에 대한 실험은 이하 실시예에 자세하게 설명된다.

제2 양태로, 본 발명은 과루인, 구채인, 도인, 백자인, 산조인, 여인, 의이인, 호마인, 행핵인 및 사상인으로 구성되는 복합 생약을 80 내지 90℃의 열수 중에서 증숙하는 단계; 증숙 후 냉각 여과한 여액(본원에서 추출물이라고도 함)에 바실러스 속 미생물의 배양물을 접종하여 상기 여액을 발효시키는 단계; 및 발효 완료 후 발효액을 여과 정제하여, 제1 양태의 복합 인 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 복합 인 발효물의 제조 방법에 관한 것이다.

이의 구체예에 따르면, 복합 인 재료는 과루인, 구채인, 도인, 백자인, 산조인, 여인, 의이인, 호마인, 행핵인 및 사상인을 각각 동일한 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다. 각 재료는 총 중량을 기준으로 각각 0.001 내지 30 중량%로 혼합 사용할 수 있다. 이 재료를 혼합한 후, 80 내지 90℃의 열수를 첨가하여 증숙을 수행할 수 있다. 열수는 복합 인 재료의 5배의 양으로 첨가하는 것이 적당하다. 증숙은 약 4시간 정도 수행할 수 있고, 증숙 후에는 37℃로 냉각하고 여과한다.

이와 같이 얻은 증숙 여액에 바실러스 속 미생물의 배양물을 접종 발효시켜 복합 인 발효물을 얻을 수 있다. 이러한 발효 단계에 사용되는 바실러스 속 미생물은 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 대표적으로, 바실러스 속 미생물로는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 등이 가능하고, 더욱 바람직하게는 오랜기간 발효식품에 많이 사용해 온 바실러스 서브틸리스를 사용한다.

구체적으로, 바실러스 균 배양물은 상기 추출물의 중량을 기준으로 0.1% 내지 10%의 함량으로 접종할 수 있다. 발효는 37℃, pH 5.5의 조건 하에 수행할 수 있고, 발효 시간은 2 내지 4일간 시행한다. 발효액은 그 다음 여과하여 정제할 수 있다. 발효액의 정제에는 0.2㎛ 여과지를 사용할 수 있다. 이 여과지는 불순물과 균주를 제거하기 위해 사용하며, 발효 여액에 존재하는 냄새와 색깔을 제거하기 위해서는 활성탄을 사용할 수 있다. 활성탄은 예를 들어 발효물 중량을 기준으로 1 내지 10%의 함량으로 사용할 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 여액의 균질화를 위해 사이클로덱스트린을 첨가할 수 있다.

제3 양태로, 본 발명은 제1 양태에 기재된 복합 인 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 이의 구체적 예에 따르면, 이 화장료 조성물은 피부 홍반의 진정 효과를 나타낸다. 이와 같이 피부 홍반 진정 효과를 나타내는 화장료 조성물에 함유된 본 발명의 복합 인 발효물은 예컨대 화장료 조성물의 중량을 기준으로 약 10중량%의 함량으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 복합 인 발효물을 함유하는 화장료 조성물은 일반 화장품에 통상적인 제형을 가질 수 있으며, 예를 들어 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 바디로션, 바디오일, 바디에센스 등의 제형으로 제조할 수 있다. 이들 각 제형의 조성물의 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업계에 잘 알려져 있고, 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 이하 실험예에서는 아토피성 피부에 대해 피부 진정 효과를 갖는 화장료 조성물의 대표적인 크림 조성물을 사용하여 설명한다. 또한, 본 발명에 따른 피부 진정 효과를 나타내는 화장료 조성물은 통상적인 사용 방법에 따라 사용될 수 있고, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 실시할 수 있는 구체적 실험과 결과를 예시하고자 한다.

실시예

실시예 1: 복합 인 발효물의 제조

과루인, 구채인, 도인, 백자인, 산조인, 여인, 의이인, 호마인, 행핵인, 및 사상인으로 구성되는 각 재료는 최종 조성물의 중량%를 기준으로 동일한 중량비로 칭량하여 혼합했다. 이 혼합 재료에 80 내지 90℃의 열수를 혼합 재료의 5배량으로 첨가한 후 4시간 증숙했다. 증숙 후 37℃로 냉각하고 여과했다. 이 증숙 여액(본원에서, 추출물이라고도 지칭)에 바실러스 서브틸리스 배양물을 접종한다. 바실러스 배양물은 포도당 90g, 프로테오스 펩톤 No.3 100g, 비프추출물 100g, 효모추출물 50g, 덱스트로스 200g, 폴리솔베이트80 10g, 암모늄시트레이트 20g, 소듐아세테이트 50g, 마그네슘설페이트 1g, 망간설페이트 0.5g, 디포타슘포스페이트 200g을 함유하는 배지 1L에 접종하여 하룻밤 동안 배양하여 준비했다. 이 배양물을 1x10⁴ 내지 1x10⁵ 세포수의 양으로 상기 추출물에 접종하고, 37℃, pH 5.5로 유지하여 48시간 발효를 수행한 후, 발효가 완료된 발효액을 0.2㎛ 여과지로 여과하여 불순물과 균주를 제거하고, 여액에 활성탄 20g을 넣고 1시간 동안 흡착시켜 냄새와 색깔을 제거한 후 다시 여과했다. 이후 여액에 사이클로덱스트린 50g을 넣고 균질화시켜 본 발명의 최종 복합 인 발효물을 수득했다.

이렇게 제조한 복합 인 발효물이 항산화성, 항염증성, 아토피 개선 효과 및 피부 자극 진정 효과가 있는지에 대해 예시 조사하고자 한다.

실험예 1: 복합 인 발효물의 농도에 따른 DPPH 소거능에 의한 항산화 효과

활성 산소에 의한 피부 노화 과정은 지질 과산화, DNA 산화, 멜라닌 생성, 결합 조직의 절단 및 비정상적인 교차결합들을 포함한다. 이들 반응들은 거의 대부분 라디칼 반응으로써, 자동산화반응 과정을 포함한다. 생체내에서 자동산화반응을 차단하는 역할은 항산화제가 담당하고 있다. 전자를 주는 능력으로서 환원력이 클수록 강한 항산화제가 된다.

항산화제의 환원력을 측정하는 시약으로, 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH)) 라디칼이 있다. DPPH는 화합물 내 질소 중심의 안정화된 구조의 라디칼로 존재한다. 517nm에서 최대 흡수를 나타내며, 환원되면 517nm에서의 흡수가 없어진다.

앞에서와 같이 수득한 복합 인의 증숙 여액과 발효 공정을 통해 효능의 극대화를 이룬 복합 인 발효물이 각각 나타내는 환원력을 비교 측정하여 본 발명에 따른 복합 생약 발효물의 효능을 살펴보고자 한다.

환원력의 크기는 라디칼 소거 활성(scavenging activity, SC₅₀)으로 나타냈으며, SC₅₀은 DPPH의 농도가 50% 감소하는데 필요한 농도를 의미한다. SC₅₀은 각 시험 물질의 농도별로 검사하여, 즉 전술한 복합 인의 증숙 여액과 복합 인 발효물을 각각 5mg/ml, 10mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml, 100mg/ml의 농도로 만들고, 이 농도별 시료 100㎕에 5x10^-4 M의 DPPH를 혼합하여 25℃에서 30분간 반응시켜, DPPH 소거능을 마이크로평판 계수기로 540nm 흡광도를 측정하여 평가했다. 그 결과는 도 1에 제시했다. 도 1의 그래프로부터 알 수 있듯이, 두 시료 모두 농도에 비례해서 DPPH 소거능이 증가하지만, 발효물의 DPPH 소거능이 증숙 여액에 비해 더 우수함을 알 수 있었다. 이는 본 발명의 복합 인 증숙 여액이 발효를 통해 항산화성이 향상되었음을 시사한다.

DPPH 라디칼 소거 활성(%)=(1-시료 첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도)x100

실험예 2: TNF-a 생성 저해 효과

TNF-a는 염증 형성 과정에 관여하는 단백질로서, 염증을 촉진시킨다. 이에 TNF-a의 생성 저해 효과를 살펴봄으로써 항염증성을 입증하고자 한다.

마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포를 5x10⁵ 세포/ml의 농도로 1ml씩 6웰 평판에 분주한 후, 세포가 평판 바닥에 부착될 수 있도록 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 12시간 배양 후 실험에 사용했다. 배양 시 사용된 배지를 제거한 후 FBS를 첨가하지 않은 새 배지에 두 시료를 각각 200 ㎍/ml 주입하고, LPS(1㎍/ml)와 함께 24시간 동안 배양했다.

LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포가 복합 인 증숙 여액과 복합 인 발효물의 처리 시 분비한 TNF-a를 정량했다. 면역 세포에서의 염증 사이토카인인 TNF-a의 생성 저해를 측정한 결과, 복합 발효물이 증숙 여액에 비해 TNF-a 생성 저해 효과가 더 우수하다는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

실험예 3: IL-4 및 IFN-γ 생성 저해 효과 (아토피 개선 효과)

아토피 개선 효과를 살펴보기 위해, 염증 사이토카인인 IL-4와 IFN-γ 생성 저해 효과를 측정했다.

먼저, 아토피 유발 모델로 잘 알려진 수컷 NC/Nga 마우스(Japan SLC, Inc.)를 중앙실험동물(주)로부터 구입하여 7일간 순환시켰다. 그 후, 알레르기성 피부염 유발에 사용되어지는 알레르기원으로서 합텐 형성 물질인 피크릴 클로라이드(1-클로로 2,4,6-트리니트로벤젠, Sigma, CAT. NO. 79874-1G-F)를 이용하여 피부염을 인위적으로 유도했다. 아토피 유발은 6주령의 NC/Nga 마우스의 등 부위를 애완견 제모기를 사용하여 깨끗하게 제모한 뒤, 제모 24시간 경과 후 5% 피크릴 클로라이드를 100㎕씩 도포한 뒤 4일 후 1% 피크릴 클로라이드를 100㎕씩 1주일 간격으로 적용하여 총 6주간 도포하여 알레르기성 피부염을 유발시켰다. 각 시료 처리는 아토피 유발 시점인 3차 도포 때부터 2일에 한번씩 양쪽 귀에 도포하였다. 양성대조군으로, 덱사메타손 20㎍/ml를 사용했다.

실험 종료 후 NC/Nga 생쥐 비장(spleen)을 적출하여 100 메시(mesh)로 비장세포를 분리했다. 전날 항-CD3/CD28 (1㎍/ml)을 96웰 평판에 코팅하여 4℃ 냉장고에서 밤새 방치한 다음, D-PBS로 2회 세정했다. 분리한 비장세포는 ACK 용액으로 RBC를 제거한 후, 진드기 항원이 코팅된 각 웰에 5x10⁵ 세포씩 5% FBS-DMEM 배양액에서 48시간 동안 배양한 후 원심분리기 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 200㎕의 배양상층액을 얻었다. 배양상층액 내의 IL-4(BioSource, U.S.A)와 IFN-γ(BioSource, U.S.A)를 측정했다. 각 웰에 배양상층액 50㎕를 분주하고 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후, 2회 세정 완충액으로 세척한 다음, 항체 비오틴-IgE 접합체를 넣고 2시간 방치했다. 다시 2회 세정 후, 완충액으로 세척한 다음 항체-아비딘-HRP 접합체 100㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척했다. TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100㎕의 정지 용액을 처리한 후 ELISA 판독기로 450nm에서의 흡광도를 측정했다.

각 시료 처리된, 즉 복합 생약의 증숙 여액 및 복합 생약 발효물이 처리된 생쥐의 비장에서 분비된 IL-4와 IFN-γ를 정량하여 각 동물 모델에서의 염증 사이토카인인 IL-4와 IFN-γ 생성의 저해를 분석한 결과, 증숙 여액에 비해 생약 발효물 처리군에서의 저해 효과가 각각 더 우수한 것으로 확인되었다(도 3 및 도 4).

실험예 4: IL -6 생성 억제 효과

항염증성을 살펴보기 위해 면역세포에서의 염증 사이토카인인 IL-6의 생성 저해를 측정했다.

실험예 2에서와 같이, RAW 264.7 세포를 5x10⁵ 세포/ml의 농도로 1ml씩 6웰 평판에 분주한 후, 세포가 평판 바닥에 부착될 수 있도록 37℃, 5% CO² 인큐베이터에서 12시간 배양 후 실험에 사용했다. 배양 시 사용된 배지를 제거한 후 FBS를 첨가하지 않은 새 배지에 두 시료를 각각 0.1 ㎍/ml 주입하고, IL-1β(0.5ng/ml)를 처리하여 24시간 동안 배양했다. IL-6의 정량은 배양 상층액 만을 분리하여 사람 IL-6 ELISA Kit(KOMA BIOTECH INC.)를 사용하여 IL-6을 450nm에서의 흡광도 측정으로 분석했다.

분석 결과, IL-1β에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포에 전술한 증숙 여액과 복합 인 발효물을 처리하여 분비된 IL-6의 생성 저해는 복합 인 발효물이 증숙 여액에 비해 더 우수한 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다(도 5).

실시예 2: 본 발명에 따른 복합 생약 발효물을 함유하는 화장료 조성물

본 발명의 발효물은 다음과 같이 조제예에 따라 화장료 조성물로 제조할 수 있다. 화장료 조성물의 조성 비율은 하기 표 1에 제시한 바와 같다. A 부분은 스테아레스 21, 스테아레스 2, 글리세릴 스테아레이트/PEG-100 스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 세토스테아릴 알코올, 멀티왁스, 수소첨가된 디데센, 유동파라핀, 디메치톤, 스쿠알란, 호호바오일을 제시된 중량%로 혼합하여 준비했고, B 부분은 멸균 처리된 정제수에 1,3-부틸렌글리콜, 레시틴, 글리세린, EDTA-2NA, 산탄 검을 제시된 중량%로 용해시켜 제조한 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명에 따른 복합 인 발효물 10중량%와 혼합하여 화장료를 제조했다.

		성분함량(중량%)
본 발명의 복합 인 발효물		10
A	스테아레스 21	2
	스테아레스 2	1.5
	글리세롤스테아레이트/PEG-100 스테아레이트	0.5
	글리세릴스테아레이트	2
	세토스테아릴알코올	1.7
	멀티왁스	1
	수소첨가된 디데센	3
	유동 파라핀	3
	디메티콘	3
	스쿠알란	2
	호호바 오일	1
B	1,3 부틸렌글리콜	5
	레시틴	1
	글리세린	3
	EDTA-2Na	0.03
	산탄검	0.1
	정제수	To. 100
	방부제	적량

실험예 5: 실시예 2에 따라 제조된 화장료 조성물의 피부 자극성 진정 효과

현재 피부병 내지 피부 알레르기 증상이 없는 20대 내지 30대 남녀 10명을 대상으로 하완의 안쪽 부위에 테이프 스트리핑법(Tape Stripping Method)을 통한 피부 자극을 유발한 후, 본 발명에 따른 복합 인 발효물을 첨가한 화장료 조성물과 발효물을 첨가하지 않은 화장료 조성물을 각각 하완 안쪽 좌우에 도포하여 나타나는 자극 진정 정도를 상대 평가했다.

먼저, 하완의 안쪽 부위 두 곳에 일반 스카치 테이프로 20회 내지 30회(횟수는 지원자의 피부 민감 정도에 따라 조정함) 테이핑을 하여 피부 홍반을 유발하였다. 홍반 유발 후, 본 발명의 복합 인 발효물 함유 화장료(좌) 및 발효물 무함유 화장료(우)를 도포하였다. 도포 2 시간 후, 피부 진정 정도는 다음과 같은 피부자극정도(홍반) 평가기준에 근거하여 평가했다.

<피부자극정도(홍반) 평가기준>

0 (무반응)

1 (매우 경미한 홍반 흔적)

2 (희미한 또는 가벼운 홍반)

3 (경계가 뚜렷하나 약한 홍반)

4 (뚜렷한 홍반)

5 (심한 홍반)

피검체	피부자극정도		시료 도포 2시간 후 피부자극정도
	좌	우	복합 인 발효물 함유 화장료(좌)	발효물 무 함유 화장료(우)
1	4	4	1	3
2	3	3	1	2
3	2	2	0	1
4	3	3	1	2
5	3	3	1	2
6	2	2	0	1
7	3	3	1	2
8	3	3	1	2
9	2	2	0	1
10	3	3	1	2

상기 표 2에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 복합 인 발효물을 함유한 화장료(좌)를 도포한 좌측 하완 부위는 발효물을 함유하지 않은 화장료(우)를 도포한 우측 하완 부위보다 자극 완화 정도가 높은 것으로 평가되었다.

실험예 6: 독성 시험

본 발명의 세포독성을 알아보기 위하여, 사람 섬유아세포(Human fibroblast cell)를 5X10⁴ 세포/㎖ 농도로 하여 96웰 평판의 배지에 200㎕씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 1일 동안 1차 배양하였다. 이때 배지는 소혈청 10 중량%와 항생제 1중량%가 포함된 IMDM(lscove's Modified Eagle Medium,Gibco)를 이용하였다. 1차 배양을 종료하고 소혈청과 항생제가 배제된 IMDM 배지로 교체하여, 실시예 1의 시료 용액을 농도별로 첨가한 후에, 37 ℃, CO₂ 인큐베이터에서 45시간동안 2차 배양하였다. 2차 배양이 종료되면 5 ㎎/㎖의 MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 시약을 첨가하여 37 ℃, CO₂ 인큐베이터에서 3시간동안 반응시켰다.

상기 반응 종료 후에 배양액을 제거하고 시료별로 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 150 ㎕씩 혼합하고 10분 동안 교반하여 세포 독성 실험용 시료를 형성하였다. 상기 세포 독성 실험용 시료를 마이크로플레이트계수기(Microplate reader)에서 570㎚로 세포 증식률을 측정하되, 실험 결과의 비교를 위해 대조구로서 시료용액이 첨가되지 않는 세포 독성 실험용 시료를 사용하였으며, 상기 측정된 세포 증식률을 다음 표 3에 나타낸다.

	대조군	복합 인 발효물(%)
		0.1	1	5	10	20
세포증식률	100%	100	102	98	95	81

상기 표 3에서 생약 인 발효물에 대해 20% 이하의 농도에서 세포독성이 발현되지 않는 것으로 나타났다.

Claims (4)

1. 과루인, 구채인, 도인, 백자인, 산조인, 여인, 의이인, 호마인, 행핵인, 및 사상인을 열수 중에서 증숙한 후 여과하여 얻은 증숙 여액에 바실러스속 미생물의 배양물을 접종하여 발효 배양 후 수득되는 복합 인 발효물.
2. 과루인, 구채인, 도인, 백자인, 산조인, 여인, 의이인, 호마인, 행핵인, 및 사상인을 혼합하여 복합 인 재료를 준비하는 단계; 이 복합 인 재료에 80 내지 90℃의 열수를 첨가하여 증숙하는 단계; 증숙 후 냉각 여과한 여액에 바실러스 속 미생물을 접종하여 상기 여액을 발효시키는 단계; 및 발효 완료 후 발효액을 여과 정제하여 복합 인 발효물을 수득하는 단계를 포함하는, 복합 인 발효물의 제조 방법.
3. 제2항에 있어서, 바실러스속 미생물이 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)를 포함하는 제조 방법.
4. 제1항에 기재된 복합 인 발효물을 함유하는 화장료 조성물.

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