JPH0525053A

JPH0525053A - アレルギー性炎症抑制剤用組成物

Info

Publication number: JPH0525053A
Application number: JP3337009A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Yamamoto; 達夫山本; Kiyoshi Kuriyama; 澄栗山; Tatsutake Shimizu; 達丈清水
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-19
Publication date: 1993-02-02

Abstract

(57)【要約】【目的】原材料として放線菌Ｓ．ノビリスを用いてア
レルギー性炎症抑制剤用組成物を得る。【構成】アレルギー性炎症抑制剤用組成物は、放線菌
ストレプトマイセス・ノビリス（Streptomyces nobili
s ）の培養液またはその乾固物から有機溶剤によって抽
出された物質よりなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、放線菌ストレプトマイ
セス・ノビリス（以下、「Ｓ．ノビリス」と略記する）
の培養液またはその乾固物から有機溶剤によって抽出さ
れた物質よりなるアレルギー性炎症抑制剤用組成物に関
する。

【０００２】

【従来の技術】アレルギーは、ある抗原との２度目の接
触の際に生じる免疫反応が、個々人によって過度にある
いは不適当な形で現われる一種の病的症状であって、関
与する抗体の性質の違いからＩ型、II型、III 型および
IV型の反応に分類されている。これら４つの型のうち、
III 型反応（免疫複合体反応：アルサス反応）およびIV
型反応（細胞性免疫反応：遅延型過敏症反応）に関与す
るアレルギー性炎症反応は慢性関節リウマチのような自
己免疫疾患、更には肝炎、腎炎、感染症のような種々の
炎症性疾患の発症進展に重要な役割を演じていることが
明らかになってきた。

【０００３】ところで、従来より放線菌培養濾液中には
種々の抗生物質が見つけられており、該培養濾液は生理
活性物質の宝庫と言われている。しかしながら、アレル
ギー性炎症を抑制する物質は、現在までのところ放線菌
培養濾液から見つけられた例がない。

【０００４】また、従来の抗炎症剤であるアスピリンや
インドメタシンはアレルギー性炎症に対して抑制作用が
極めて弱いという問題点がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、この
ような実情から、原材料として放線菌Ｓ．ノビリスを用
８て得られるアレルギー性炎症抑制剤用組成物を提供す
るにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、III 型お
よびIV型アレルギーに対するアレルギー性炎症抑制物質
を見つけ出すために、III 型アレルギー反応の動物モデ
ルであるラット４時間異種受身皮膚アナフィラキシー
（４時間heterologous ＰＣＡ）反応、IV型アレルギー
反応の動物モデルであるマウス遅延型過敏症（ＤＴＨ）
反応および慢性関節リウマチのモデルであるアジュバン
ト関節炎を用いてスクリーニングを行った結果、放線菌
Ｓ．ノビリスの培養液またはその乾固物の溶剤抽出物に
アレルギー性炎症抑制作用を示す物質が含有されている
という驚くべき事象を見出し、この知見に基づき本発明
を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明によるアレルギー性炎症
抑制剤用組成物は、放線菌Ｓ．ノビリスの培養液または
その乾固物から有機溶剤によって抽出された物質よりな
るものである。

【０００８】本発明組成物の原料である放線菌Ｓ．ノビ
リスは、公的保存機関から入手可能であり、たとえば理
化学研究所の保存菌(JCM 4274)（これは米国においてAT
CC19252 およびオランダにおいてCBS 198.65としても保
存）などの菌が使用できる。

【０００９】放線菌Ｓ．ノビリスの培養は、然るべき栄
養物を含んだ培地を用いて行う。液体培養の場合、その
培地の成分としてはブドウ糖などの糖類、ペプトンや麦
芽エキスなどのタンパク質類、ビタミン類、核酸類、ア
ミノ酸類、複合糖質類の一種または数種を含んだ水溶液
が好適に用いられる。代表的な培地例としては、澱粉・アンモニウム系の液体培地（可溶性澱粉、Ｋ₂ＨＰＯ
₄、ＮＨ₄Ｃｌを含む）が挙げられる。液体培地のｐＨは５〜９の範囲が好まし
く、培養温度は２０〜４０℃が好ましい。また液体培養
の好ましい培養時間は３〜１４日である。固体培養の場
合、主に上記の液体培養の培地にさらに寒天を含んだも
のを用いるが、固体培養の培養条件も液体培養のそれと
ほぼ同じである。こうして、Ｓ．ノビリスを培養した
後、溶剤抽出処理を行う。溶剤抽出は、培養液をそのま
ま溶剤と接触させる方法、または培養液を蒸発乾固させ
乾固物を溶剤と接触させる方法などによって行い、抽出
相からアレルギー性炎症抑制剤の活性成分を取得する。
溶剤抽出処理に際しては、該培養液またはその乾固物中
にＳ．ノビリス菌体を存在させてもよいし、させなくて
もよい。菌体を存在させずに抽出を行う場合は、培養液
を固液分離し、その分離液相をそのままもしくはこれを
乾固させたものを溶剤抽出処理に使用する。固液分離手
段としては、遠心分離、濾過などが適宜用いられる。

【００１０】アレルギー性炎症抑制活性成分の抽出溶剤
としては有機溶剤が用いられる。この抽出処理用の有機
溶剤の代表例としては、酢酸エチルなどのエステル類；
メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロ
パノール、ｎ−ブタノールなどのアルコール類；エチル
エーテル、ジオキサンなどのエーテル類；アセトン、メ
チルエチルケトンなどのケトン類などが挙げられるが、
使用可能な溶剤はこれらに限定されない。また、上記溶
剤の混合液を用いることもできる。特に好適な溶剤は酢
酸エチル、メタノールなどである。

【００１１】培養液をそのまま用いた抽出の場合、培養
液と溶剤との比率は特に限定されないが、抽出効率およ
び操作の容易さの観点から培養液１容あたり好ましくは
溶剤０．５〜２容の範囲である。培養液の乾固物を用い
た抽出の場合、溶剤の使用量は特に限定されない。溶剤
抽出は室温で行っても加熱下に行ってもよいが、後者の
方が効率的である。加熱は常圧下での溶剤の沸点以下の
温度範囲で行う。抽出時間は溶剤の種類や抽出温度など
によっても異なるが、好ましくは３〜１２０分の範囲で
ある。また抽出中は液を静置するかまたは時々攪拌しな
がら放置する。好ましくは、同一の培養液またはその乾
固物に対して抽出操作を複数回繰り返す。

【００１２】本発明組成物をアレルギー性炎症抑制剤に
製剤化するには、通常はこれを製剤用担体と共に製剤組
成物の形態とする。担体としては剤形に応じた薬剤を調
製するのに通常使用される充填剤、崩壊剤、増量剤、結
合剤、付湿剤、表面活性剤、滑沢剤などの稀釈剤あるい
は賦形剤が例示される。また適当な溶剤を選定すること
により、得られた溶剤抽出液ないしはその濃縮物をその
ままの形態で外用液剤として使用することもできる。

【００１３】本発明組成物を用いて製剤化されるアレル
ギー性炎症抑制剤の投与単位形態としては、上記の如き
外用液剤の外、錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、
乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁
剤など）、軟膏剤などが例示される。

【００１４】アレルギー性炎症抑制剤中に含有すべき本
発明組成物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択さ
れるが、好ましくはアレルギー性炎症抑制剤中に０．１
〜５０重量％の範囲である。

【００１５】本発明組成物より得られたアレルギー性炎
症抑制剤は、その使用に際し各種形態に応じた方法で投
与される。たとえば上記の如き外用液剤の場合には、こ
れを皮膚ないしは粘膜などの所要部位に直接塗布し、錠
剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプ
セル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈
内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤
の場合には直腸内投与され、また軟膏剤の場合には塗布
される。

【００１６】本発明組成物より得られたアレルギー性炎
症抑制剤の投与量は、使用目的、症状などにより適宜選
択されるが、通常は１日当り本発明組成物として０．５
〜１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。また上記製剤組
成物を３〜４回／日に別けて投与することももちろん差
し支えない。

【００１７】本発明組成物より得られたアレルギー性炎
症抑制剤のヒトおよび動物に対する安全性については、
後述の毒性試験結果からも明らかなように、全く問題が
ない。

【００１８】

【実施例】つぎに、本発明の実施例を挙げて、上述した
効果を実証する。

【００１９】実施例（溶剤抽出物の調製）理化学研究所から購入した放線菌Ｓ．ノビリス (JCM427
4)１白金耳を１００ｍｌの澱粉・アンモニウム培地（蒸
留水１００ｍｌ中に可溶性澱粉を１ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄を
０．０５ｇ、ＮＨ₄Ｃｌを０．０５ｇ含む）に接種し、
３０℃で７日間振盪培養した。この培養液を３，０００
rpm で２０分間遠心分離し、分離した上清液９５ｍｌを
得た。この上清液を分液ロートに入れ、これに等量の酢
酸エチルを加え、液全体を１０分間振盪した。５分間静
止後、水相と酢酸エチル相を分離した。分離した水相に
等量の酢酸エチルを加え、上述の操作を繰り返し、再度
水相と酢酸エチル相を分離した。分離した水相に等量の
酢酸エチルを加え、上述の操作をもう一度繰り返し、３
回目の抽出を行った。こうして３回の操作で得られた酢
酸エチル相を集めて、集合液をエバポレータで濃縮乾固
し、抽出物２０ｍｇを得た。

【００２０】試験例１（ III型アレルギー反応に対する
作用）ｉ）ウサギ抗オボアルブミン (ovalbumin)血清の調製江田らの方法（日薬理誌、６６巻、２３７頁、１９７０
年）に準じて、つぎの手法でウサギ抗オボアルブミン血
清を調製した。すなわち、生理的食塩水に溶解したオボ
アルブミン（Sigma 社製）の２ｍｇ／ｍｌ溶液と完全フ
ロイントアジュバント（Difco 社製）との等量混合乳化
液よりなる抗原液を調製した。この抗原液の０．５ｍｌ
ずつを体重約３ｋｇのニュージーランド産ホワイト種の
雄性家兎の左右臀筋内に１週間毎に４回注射した。最終
注射の７日後に頸動脈から採血し、血清のみを分離取得
し、ウサギ抗オボアルブミン血清とした。この抗血清の
ラット４時間異種受身皮膚アナフィラキシー（heterolo
gous ＰＣＡ）反応の力価は１：３２であった。

【００２１】 ii) ラット４時間異種ＰＣＡ反応（ III型アレルギー
性皮膚反応）に対する作用実施例で得られた乾固状の抽出物を、最終濃度が１０ｍ
ｇ／ｍｌになるように、５重量％アラビアゴム水溶液に
ジメチルスルホキサイドを５重量％添加してなる溶液に
懸濁した。こうして得られた懸濁液を供試液とした。被
検動物としては体重１２０〜２００ｇのウイスター雄性
ラットを用いた。

【００２２】まず、上記供試液をラットに２ｍｌ／ｋｇ
（抽出物量として２０ｍｇ／ｋｇラット）で腹腔内投与
しておいた。

【００２３】ついで供試液投与の２０時間後に、上記ウ
サギ抗オボアルブミン血清を生理的食塩水で４倍に希釈
してなる注射液０．０５ｍｌを、上記ラットの背部皮内
に注射し、ラットを上記抗血清で感作した。

【００２４】さらに、上記抗血清注射の３時間後に、上
記供試液を感作ラットに２ｍｌ／ｋｇ（抽出物量として
２０ｍｇ／ｋｇラット）で再度腹腔内投与した。

【００２５】つぎに、２回目の供試液投与の１時間後
に、対応する抗原として２ｍｇ／ｍｌのオボアルブミン
を含む０．５重量％エバンスブルー生理的食塩水を２．
５ｍｌ／ｋｇ静脈内注射して、４時間異種ＰＣＡ反応を
惹起した。

【００２６】こうして皮内反応を惹起した部位の漏出色
素を、Haradaらの方法 (J.Pharm.Pharmacol. ２３巻、２１８頁、１９７１年）
に従って抽出定量した。すなわち、抗原注射の１時間後
に動物を屠殺し、４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚を細切
し、これを０．３％（ｗ／ｖ）Ｎａ₂ＳＯ₄水溶液３容
とアセトン７容の混合液中に４８時間浸漬放置し、漏出
色素を抽出した。こうして抽出した色素を６２０ｎｍで
比色定量し、漏出色素量を求め、これをウサギ抗オボア
ルブミン血清を注射した部位(site)当たりの漏出色素量
（μｇ）として表わした。

【００２７】また、供試液として２５ｍｇ／ｍｌの最終
濃度を有する液を調製し、この供試液のラットへの投与
量を２ｍｌ／ｋｇ（抽出物量として５０ｍｇ／ｋｇラッ
ト）とし、その他の点は上記操作と同様に行って漏出色
素量を求めた。

【００２８】また、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を有する
供試液を用いた上記試験において、４時間異種ＰＣＡ反
応に当たり抗原注射から屠殺までの時間を３０分とし、
その他の点は上記操作と同様に行って漏出色素量を求め
た。

【００２９】この試験のコントロールとして、上記抽出
物含有液の代わりに、上記溶剤抽出物を含まない上記ジ
メチルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液を用い、
その他の点は上記操作と同様に行って漏出色素量を求め
た。

【００３０】それぞれの試験（投与量２０ｍｇ／ｋｇラ
ット、投与量５０ｍｇ／ｋｇラット、投与量２０ｍｇ／
ｋｇラットとし抗原注射から屠殺までの時間を３０分と
した試験、およびコントロール）は、それぞれ５匹のラ
ットを用いて行い、漏出色素量（μｇ／site）はこれら
ラットについて得られた値の平均値をとった。

【００３１】なお、コントロールは上記それぞれの試験
毎にコントロール試験を行った。

【００３２】この試験結果を図１、図２および図３にそ
れぞれ示す。なお、上記の投与量２０ｍｇ／ｋｇラット
とし抗原注射から屠殺までの時間を３０分とした試験の
結果は、コントロールの漏出色素量に対する、供試液投
与実験の漏出色素量の比率（％）で表わした。

【００３３】これらの図から明らかなように、実施例の
溶剤抽出物を含有する供試液を投与した群では、同抽出
物を含有しない溶液を用いたコントロール群に比べ、ラ
ット４時間異種ＰＣＡ反応部の皮膚に漏出する色素量が
大幅に減少し、顕著なアレルギー性炎症抑制活性が認め
られる。

【００３４】試験例２（IV型アレルギー反応に対する作
用）つぎの方法でマウスＤＴＨ反応での上記溶剤抽出物の作
用を調べた。

【００３５】まず、試験例１と同様の操作で濃度１０ｍ
ｇ／ｍｌの抽出物含有供試液を調製した。また、被検動
物としては体重４０〜５０g のＩＣＲ雄性マウスを用い
た。

【００３６】羊赤血球を生理的食塩水で最終濃度が４×
１０⁹個／ｍｌになるように希釈し、この希釈液０．０
５ｍｌをマウスの左足蹠皮内に注射し、マウスを羊赤血
球で感作した。

【００３７】ついで、感作の４日後に、上記供試液０．
１ｍｌ（抽出物量として２０〜２５ｍｇ／ｋｇマウス）
を感作マウスに腹腔内投与した。

【００３８】この供試液投与の直後に、羊赤血球４×１
０⁹個／ｍｌの０．０５ｍｌを感作マウスの右足蹠皮内
に再度注射してＤＴＨ反応を誘発した。

【００３９】さらに、上記ＤＴＨ反応誘発の６時間後
に、上記供試液０．１ｍｌ（抽出物量として２０〜２５
ｍｇ／ｋｇマウス）を同マウスに再度腹腔内投与した。

【００４０】最後に２回目の供試液投与の１８時間後
に、マウスの右足蹠の腫れ度合を肉眼的評点で調べた。

【００４１】また、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌの上記供試
液のマウスへの投与量を０．２ｍｌ（抽出物量として４
０〜５０ｍｇ／ｋｇマウス）とし、その他の点は上記操
作と同様に行ってマウスの右足蹠の腫れ度合を調べた。

【００４２】また、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌの上記供試
液のマウスへの投与量を０．１ｍｌ（抽出物量として２
０〜２５ｍｇ／ｋｇマウス）とした上記試験を別にもう
一度行い、マウス右足蹠の厚みを厚みゲージを用いて測
定することにより、マウスの右足蹠の腫れ度合を調べ
た。

【００４３】この試験のコントロールとして、上記抽出
物含有液の代わりに、溶剤抽出物を含まない上記ジメチ
ルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その
他の点は上記操作と同様に行って、マウスの右足蹠の腫
れ度合を調べた。

【００４４】それぞれの試験（投与量２０〜２５ｍｇ／
ｋｇマウス、投与量４０〜５０ｍｇ／ｋｇマウス、およ
びコントロール）は、それぞれ７匹のマウスを用いて行
い、腫れの度合はこれらマウスについて得られた値の平
均値をとった。

【００４５】なお、コントロールは上記それぞれの試験
毎にコントロール試験を行った。

【００４６】この試験結果を図４、図５および図６にそ
れぞれ示す。

【００４７】これらの図から明らかなように、実施例の
溶剤抽出物を含有する供試液を投与した群では、同抽出
物を含有しない溶液を用いたコントロール群に比べ、右
足蹠の腫れが明らかに抑制され、顕著なアレルギー性炎
症抑制活性が認められる。

【００４８】試験例３（アジュバント関節炎に対する作
用）つぎの方法でラットアジュバント関節炎に対する上記溶
剤抽出物の効果を調べた。

【００４９】まず、試験例１と同様の方法で２５ｍｇ／
ｍｌ濃度の供試液を調製した。また、被検動物としては
体重２００から２５０ｇのウイスタールイス雄性ラット
を用いた。

【００５０】流動パラフィンに０．６重量％の濃度で懸
濁した結核菌体Mycobacteriumtubercurosis H37RA（Dif
co 社製）の菌液アジュバント０．１ｍｌをラットの右
足蹠皮内に投与した。

【００５１】その後、上記供試液をラットに２ｍｌ／ｋ
ｇ（抽出物量として５０ｍｇ／ｋｇ）の割合で当日より
１日１回２２日間、毎日腹腔内投与した。また、アジュ
バント投与日から２３日間、毎日ラットの左右後肢の足
蹠の容積をPlethysmometer(Ugo Basile 社製) を用いて
測定し、それらの容積の変化を調べた。

【００５２】この試験のコントロールとして、上記抽出
物含有液の変わりに、溶剤抽出物を含まない上記ジメチ
ルスルホキサイド含有アラビアゴム水溶液を用い、その
ほかの点は上記操作と同様に行って左右後肢の足蹠の容
積の変化を調べた。

【００５３】それぞれの試験（供試液、コントロール）
は、それぞれ５匹のラットを用いて行い、左右後肢の足
蹠の容積はこれらラットについて得られた値の平均値を
とった。

【００５４】この試験結果を図７および図８に示す。

【００５５】これらの図から明らかなように、実施例の
溶剤抽出物を含有する供試液を投与した群では、同抽出
物を含有しない溶液を用いたコントロール群に比べ、左
右後肢の足蹠の容積の増加が明らかに抑制され、アジュ
バント関節炎に対する顕著な有効性が認められる。

【００５６】試験例４（毒性試験）つぎの方法で上記溶剤抽出物の毒性を調べた。

【００５７】まず、実施例で得られた抽出物を、最終濃
度が１０００ｍｇ／５ｍｌになるように、５重量％アラ
ビアゴム水溶液にジメチルスルホキサイドを５重量％添
加してなる溶液に懸濁した。こうして得られた懸濁液を
供試液とした。被検動物としては体重２５〜３０ｇのＩ
ＣＲ雄性マウスを用いた。

【００５８】上記供試液をマウスに５ｍｌ／ｋｇ（試験
例１、２の有効量の２０〜５０倍量に相当）腹腔内投与
した。その結果、毒性症状は特に認められず、また供試
液投与２週間後の死亡率は０％であった。生存した被検
動物の剖検においても何ら異常は認められなかった。こ
の結果からも明らかなように、実施例で得られた抽出物
は有効量の２０〜５０倍量で毒性を示さなかった。な
お、この試験は５匹のマウスを用いて行った。

【００５９】

【発明の効果】本発明によれば、放線菌ストレプトマイ
セス・ノビリスの培養液またはその乾固物を有機溶剤に
よって抽出処理することによって、顕著なアレルギー性
炎症抑制作用を示す活性成分を含む組成物を提供するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｓ．ノビリス培養液の抽出物含有液（２０ｍｇ
／ｋｇ）とそのコントロールの漏出色素量を示すグラフ
である（抗原注射から屠殺までの時間１時間）。

【図２】図２はＳ．ノビリス培養液の抽出物含有液（５
０ｍｇ／ｋｇ）とそのコントロールの漏出色素量を示す
グラフである。

【図３】Ｓ．ノビリス培養液の抽出物含有液（２０ｍｇ
／ｋｇ）とそのコントロールの漏出色素量を示すグラフ
である（抗原注射から屠殺までの時間３０分）。

【図４】Ｓ．ノビリスの抽出物含有液（２０〜２５ｍｇ
／ｋｇ）とそのコントロールの右足蹠の腫れ度合を示す
グラフである（肉眼的評価）。

【図５】Ｓ．ノビリスの抽出物含有液（４０〜５０ｍｇ
／ｋｇ）とそのコントロールの右足蹠の腫れ度合を示す
グラフである。

【図６】Ｓ．ノビリスの抽出物含有液（２０〜２５ｍｇ
／ｋｇ）とそのコントロールの右足蹠の腫れ度合を示す
グラフである（右足蹠の厚みの測定）。

【図７】Ｓ．ノビリスの抽出物含有液（５０ｍｇ／ｋ
ｇ）とそのコントロールの右足蹠の容積を示すグラフで
ある。

【図８】Ｓ．ノビリスの抽出物含有液（５０ｍｇ／ｋ
ｇ）とそのコントロールの左足蹠の容積を示すグラフで
ある。

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】放線菌ストレプトマイセス・ノビリス
（Streptomycesnobilis ）の培養液またはその乾固物か
ら有機溶剤によって抽出された物質よりなるアレルギー
性炎症抑制剤用組成物。