CN117323352A - 一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物及其制备方法和应用。该冬虫夏草提取物的制备步骤为：1)冬虫夏草干燥粉末依次采用正己烷、乙酸乙酯和无水乙醇提取，药渣干燥后用水提取，得到水提液W1，水提液W1脱蛋白处理后浓缩，经分级醇沉离心得到醇沉物W1CC～W4CC及水提液W2。2)水提液W2用大孔吸附树脂纯化，以乙醇/水混合液梯度洗脱，收集水‑20％乙醇‑水洗脱液，浓缩干燥，得到提取物W5CC。3)将醇沉物W1CC与提取物W5CC复配，得到冬虫夏草提取物。本发明的冬虫夏草提取物具有降低阿霉素诱导的足细胞损伤药效，其活性成分明确，可作为肾病综合征等慢性肾损伤治疗药物，具有广阔的应用前景。

Description

一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物及其制备方法和应用。
背景技术
随着医学技术的进步，以及生活条件的改善，人们的平均寿命不断增长，但同时也面临越来越严峻的人口老龄化问题。肾脏是易受机体衰老发生结构和功能改变的重要器官，慢性肾脏病(CKD)的患病率随年龄而增加。普通人群CKD的患病率为10％～13％，但老年人CKD的患病率可以达到30％～50％，是影响老年人生活质量的重大慢性疾病。全球有约8％～16％的人口罹患不同程度的CKD，中国有约10.8％的人患有CKD，是危害人类尤其是老年人健康的严重疾病。预防性干预并通过治疗逐渐恢复肾脏功能，是解决慢性肾脏病危害人类身心健康的有效措施。
慢性肾脏疾病是由原发或继发性肾脏损伤导致的一类疾病综合症，糖尿病肾病(DN)、原发性肾小球肾炎、肾小管间质病变等均为慢性肾脏疾病的主要发病因素。足细胞是位于肾小球基底膜(GBM)上的高度分化的细胞，具有维持肾小球基底膜的完整性及毛细血管襻的空间结构，分泌血管内皮生长因子等功能。大量研究证实足细胞的损伤在慢性肾脏疾病如糖尿病肾病，膜性肾病(MN)，IgA肾病(Ig AN)及局灶节段性肾小球硬化(FSGS)等疾病中扮演重要角色，足细胞(肾小球上皮细胞)已被认为是各种慢性肾脏疾病进展的关键细胞，也是中、西药物治疗的关键靶点。
冬虫夏草是指由冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)侵染蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆虫幼虫而形成的幼虫尸体与真菌子座复合体，是青藏高原特有的生物资源。近年来大量临床试验和基础研究报道了冬虫夏草通过抗炎、抗氧化及抗缺氧保护肾脏，证明了冬虫夏草对治疗各种因素造成的肾损伤具有积极的治疗作用，如IgA肾病、慢性肾小球肾炎、糖尿病肾病、慢性马兜铃肾病和药物肾毒性等。
冬虫夏草具有多种类型的代谢产物，虽然已经有大量的报道证实冬虫夏草对慢性肾脏疾病具有一定的治疗效果，但具体的活性部位或活性成分尚不明确，为了提高冬虫夏草对慢性肾脏疾病的治疗药效，开发活性成分明确、质量可控的冬虫夏草慢性肾脏疾病制剂，本发明公开了一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物的制备方法及应用。
本发明制备的冬虫夏草足细胞保护活性提取物，制备工艺简单，成本低廉，活性显著，质量易控制，对冬虫夏草治疗慢性肾脏疾病制剂的开发和利用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物，可用于慢性肾脏疾病治疗药物制剂的开发。
本发明的目的之二在于，提供上述冬虫夏草提取物的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)冬虫夏草新鲜药材干燥至恒重，粉碎后依次采用正己烷、乙酸乙酯和无水乙醇提取，药渣干燥备用；冬虫夏草药渣加入水提取，得到水提液W1；水提液W1脱蛋白处理后浓缩，得到浓缩液；将浓缩液分级醇沉低温放置并析出沉淀，离心得到不同乙醇浓度沉淀的醇沉物W1CC～W4CC，以及去除沉淀后的冬虫夏草水提液W2；
(2)冬虫夏草水提液W2采用大孔吸附树脂纯化，以乙醇/水混合液进行梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到冬虫夏草提取物W5CC；
(3)将醇沉物W1CC与提取物W5CC按一定比例混合，得到具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物WS。
优选的，步骤(1)中，所述依次采用正己烷、乙酸乙酯和无水乙醇提取，所用的料液比均为1:5～10，提取次数均为3次，提取方法均为超声或回流；所述加入水提取，所用的料液比为1:5～10，提取次数为3次，提取方法为超声或回流。
优选的，步骤(1)中，所述脱蛋白处理是将冬虫夏草水提液W1与等体积的二氯甲烷-正丁醇混合溶液混合，剧烈振摇脱蛋白，重复除蛋白10次。所述的二氯甲烷-正丁醇混合溶液中二氯甲烷：正丁醇＝1:1～3，体积比，优选的，二氯甲烷：正丁醇＝1:1，体积比。
优选的，步骤(1)中，所述浓缩是浓缩至密度为1.0g/mL～1.1g/mL。更优选，是浓缩至密度为1.02g/mL。
优选的，步骤(1)中，所述醇沉物W1CC～W4CC的制备步骤为：在浓缩液中先加入乙醇至乙醇浓度为20％，在4℃放置12h析出沉淀，离心得沉淀W1CC后继续加入乙醇至乙醇浓度为40％，在4℃放置12h析出沉淀，离心得沉淀W2CC后继续加入乙醇至乙醇浓度为60％，在4℃放置12h析出沉淀，离心得沉淀W3CC后继续加入乙醇至乙醇浓度为80％，在4℃放置12h析出沉淀，离心得沉淀W4CC以及去除沉淀后的冬虫夏草水提液W2。
优选的，步骤(2)中，所述大孔树脂为AB-8、D-101、D301、HP-20、S-8、X-5、XAD-1、XAD-4、H-103中的一种。更优选，所述大孔树脂为AB-8、D-101、HP-20、D301中的一种。
优选的，步骤(2)中，所述梯度洗脱是以乙醇/水体积比为0:100～80:20进行洗脱；所述收集洗脱液是收集乙醇/水体积比为0:100～20:80的洗脱液。
优选的，步骤(2)中，样品的上样浓度为1.01g/mL，洗脱速率为3BV/h。
优选的，步骤(2)中，所述浓缩是指减压浓缩，温度60℃，所述干燥是指减压真空干燥、冷冻干燥或喷雾干燥。
优选的，步骤(2)中，浓缩液的终浓度为1.2g/mL,，减压真空干燥温度为60℃。
优选的，步骤(3)中，所述醇沉物W1CC与提取物W5CC是按质量比为1:1～50混合。更优选，所述醇沉物W1CC与提取物W5CC是按质量比为1:25～50混合。
优选的，步骤(2)中，所述冬虫夏草提取物W5CC的高效液相指纹图谱中包含腺苷、肌苷、鸟苷和胸腺嘧啶四种药效成分。
优选地，所述步骤(2)中，冬虫夏草提取物W5CC的高效液相指纹图谱色谱条件为：
流动相：以A相为超纯水，B相为乙腈进行梯度洗脱，所述流动相梯度条件为：0～10min，流动相中A(100％→100％)，流动相B(0％→0％)；10～25min，流动相中A(100％→90％)，流动相B(0％→10％)；25～30min，流动相中A(90％→80％)，流动相B(10％→20％)；30～35min，流动相中A(80％→100％)，流动相B(20％→0％)；35～40min，流动相中A(100％→100％)，流动相B(0％→0％)；
色谱柱：C18色谱柱，优选为InfinityLab Poroshell 120EC-C18，规格：4.6×100mm，2.7Micron。
流速：0.5mL/min；
柱温：30℃
检测波长：227nm。
本发明还提供一种根据上述制备方法制备得到的具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物。
本发明还提供上述的冬虫夏草提取物在制备保护足细胞的药物和/或保健品中的应用。
本发明还提供上述的冬虫夏草提取物在制备防治慢性肾脏疾病的药物和/或保健品中的应用。
优选的，冬虫夏草提取物WS的最终使用浓度为50-500μg/mL。
本发明还提供一种保护足细胞或防治慢性肾脏疾病的药物和/或保健品，其包含上述的冬虫夏草提取物作为活性成分。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明的一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物，能够有效地降低阿霉素(Adriamycin，ADM)诱导的小鼠足细胞株MPC5损伤，提高足细胞MPC5的生长率，并以活性模型为指导，对冬虫夏草足细胞保护活性成分进行纯化、去杂质；以阿霉素刺激足细胞，可以诱导足细胞凋亡造成慢性损伤，足细胞是肾小球基底膜的最外层屏障，若足细胞造成损伤将导致肾小球过滤功能下降，从而产生蛋白尿，慢性肾脏疾病是造成足细胞损伤的主要因素，保护足细胞，降低足细胞的损伤并促进足细胞再生是治疗慢性肾脏疾病的主要途径。本发明建立在阿霉素诱导小鼠足细胞MPC5损伤的体外模型中，通过检测加入冬虫夏草提取物后阿霉素对足细胞生长的抑制率，评价冬虫夏草提取物对足细胞的保护作用。
2.本发明的一种冬虫夏草足细胞保护活性提取物属于冬虫夏草两种不同活性部位的复合物，经过两种不同活性部位的配比使用，相比单一使用时活性得到增强，进一步分析获知其中活性部位W1CC主要含大分子多糖类化合物，活性部位W5CC高效液相指纹图谱主要包含五种活性成分，并且鉴定了其中四种，对冬虫夏草提取物的质量控制提供了有效的方法。
3.本发明通过使用多种不同极性的溶剂提取，得到不同极性提取物，结合活性筛选模型，去除非活性成分，最终获得具有显著活性的冬虫夏草提取物。提取和浓缩方法高效，提取方法相对比较稳定且品质可控，为批量生产及广泛推广提供了参考。
附图说明
图1为冬虫夏草提取物W5CC的HPLC指纹图谱(峰1：肌苷；峰2：鸟苷；峰3：未知化合物；峰4：胸腺嘧啶；峰5：腺苷)。
图2为足细胞生长图片(模型组：加入阿霉素但未加样品的处理；WS组：同时加入阿霉素和冬虫夏草提取物WS样品的处理)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物的制备方法，包括以下步骤：
选取人工培育冬虫夏草50g作为原料，冷冻干燥至恒重后粉碎，过10目筛网，得到冬虫夏草粗粉，在冬虫夏草粗粉中加入500mL正己烷溶剂，超声提取，超声提取使用的功率为400W，工作频率为40KHz，提取时间为15min，提取3次，得正己烷提取物2.51g(收率5.02％)，冬虫夏草药渣常温放置，挥干正己烷溶剂备用；在冬虫夏草药渣中加入500mL乙酸乙酯溶剂，超声提取，超声提取使用的功率为400W，工作频率为40KHz，提取时间为15min，提取3次，得到乙酸乙酯提取物0.75g(收率1.50％)，冬虫夏草药渣常温放置，挥干乙酸乙酯溶剂备用；在冬虫夏草药渣中加入500mL无水乙醇溶剂，超声提取，超声提取使用的功率为400W，工作频率为40KHz，提取时间为15min，提取3次，得到无水乙醇提取物0.89g(收率1.79％)，冬虫夏草药渣常温放置，挥干无水乙醇溶剂备用；在冬虫夏草药渣中加入500mL水，加热回流提取，提取时间为30min，提取3次，收集冬虫夏草水提液W1。在冬虫夏草水提液W1中加入等体积的二氯甲烷-正丁醇(1:1，体积比)混合溶剂，剧烈振摇析出蛋白后静置沉淀，离心除去沉淀，如此重复除蛋白10次，除蛋白后的冬虫夏草提取液W1在60℃下减压浓缩至密度为1.02g/mL，在W1的浓缩液中加入乙醇至含醇量为20％，放入4℃冰箱12h，离心得20％醇沉物0.41g(W1CC，收率0.82％)，继续加入乙醇至含醇量为40％，放入4℃冰箱12h，离心得40％醇沉物0.39g(W2CC，收率0.78％)，继续加入乙醇至含醇量为60％，放入4℃冰箱12h，离心得60％醇沉物0.72g(W3CC，收率1.44％)，继续加入乙醇至含醇量为80％，放入4℃冰箱12h，离心得到80％醇沉物1.18g(W4CC，收率2.36％)以及去除沉淀后的冬虫夏草水提液W2。
冬虫夏草水提液W2浓缩至无醇味后调节密度至1.01g/mL，加入到100g AB-8大孔树脂柱中，以3BV/h的流速洗脱，梯度洗脱，洗脱剂依次为水、20％乙醇/水、40％乙醇/水、60％乙醇/水和80％乙醇/水，每种洗脱剂采用3个柱体积的溶剂洗脱，收集水-20％乙醇/水的洗脱液，60℃减压浓缩至1.2g/mL，60℃减压真空干燥至恒重，得冬虫夏草提取物W5CC，收率为11.8％。高效液相色谱测定冬虫夏草提取物W5CC的指纹图谱，检测波长为227nm，柱温为30℃，流速为0.5mL/min，色谱柱优选为InfinityLab Poroshell 120EC-C18，规格：4.6×100mm，2.7Micron，流动相梯度程序为：以A相为超纯水，B相为乙腈，0～10min，流动相中A(100％→100％)，流动相B(0％→0％)；10～25min，流动相中A(100％→90％)，流动相B(0％→10％)；25～30min，流动相中A(90％→80％)，流动相B(10％→20％)；30～35min，流动相中A(80％→100％)，流动相B(20％→0％)；35～40min，流动相中A(100％→100％)，流动相B(0％→0％)，指纹图谱中含腺苷、肌苷、鸟苷和胸腺嘧啶四种药效成分(图1)。将20％醇沉物W1CC和提取物W5CC按照质量比1:50混合均匀，得到两个活性部位的复合物WS。
实施例2
冬虫夏草提取物足细胞保护活性检测：
1.试剂与仪器
小鼠足细胞株MPC5；盐酸阿霉素(ADM)；DMEM高糖培养基；胎牛血清(FBS)；磷酸盐缓冲液(PBS)；二甲基亚砜(DMSO)；1％P/S双抗；Cell counting kit 8(cck8)；精密电子天平；生物安全柜；二氧化碳培养箱；倒置显微镜；低速冷冻离心机；酶标仪；数显恒温水浴锅。
2.MPC5细胞的培养
基础培养基为DMEM培养液+10％FBS+1％P/S双抗；培养条件为37℃、5％CO2及饱和湿度；培养2～3天细胞密度达到90％后可用于实验。
3.冬虫夏草提取物对细胞生长率的影响
将状态良好的足细胞调整密度为5×103个/mL，将其接种至96孔板内(每组6个复孔，每孔100μL)，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h。将原培养基弃去，设置正常组、模型组和样品组，正常组的培养基不加盐酸阿霉素和样品，模型组在培养基中加入盐酸阿霉素溶液(终浓度0.2μg/mL)，样品组在培养基中加入盐酸阿霉素(终浓度0.2μg/mL)和冬虫夏草提取物(终浓度见表1)，培养基加入量为100μL，每组设置6个复孔，培养24h后，每孔加入cck8试剂10μL，37℃孵育2h，酶标仪检测每孔的吸光度值，根据公式计算抑制率。
细胞抑制率＝1-(加药孔-本底值)/(对照孔-本底值)×100％
实验数据采用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析进行显著性差异分析，p<0.05表示显著差异，具有统计学意义。
4.数据分析
不同处理对小鼠足细胞MPC5生长的影响见图2和表1。
由表1可知，小鼠足细胞MPC5在阿霉素的作用下生长率明显下降，与正常组细胞生长率相比具有显著性差异，说明细胞模型造模成功。20％醇沉物(W1CC)和冬虫夏草提取物W5CC在500μg/mL浓度下均表现出一定的足细胞保护活性，40％醇沉物(W2CC)、60％醇沉物(W3CC)、80％醇沉物(W4CC)在3个浓度下未检测出足细胞保护活性，20％醇沉物(W1CC)和冬虫夏草提取物W5CC的复合物WS对阿霉素诱导损伤的足细胞表现出显著的促进生长活性，在一定程度上降低了阿霉素对足细胞的损伤作用，经过本发明技术得到的冬虫夏草提取物WS在对足细胞的保护活性表现得更加强，且呈现出量效关系。
表1冬虫夏草提取物对阿霉素诱导损伤的足细胞生长率影响
注：*代表与模型组相比较，有显著性差异(p<0.05)；
**代表与模型组相比较，有明显的显著性差异(p<0.01)。
本发明的一种冬虫夏草足细胞保护活性提取物，能够有效地抑制阿霉素对足细胞造成的损伤，有效提高阿霉素损伤足细胞的生长率，表现出显著的足细胞保护活性，并以活性模型为指导，对冬虫夏草足细胞保护活性物质进行纯化、去杂质。以阿霉素刺激足细胞，对足细胞产生慢性损伤，可模拟多种慢性肾脏疾病如糖尿病肾病，膜性肾病(MN)，IgA肾病(Ig AN)及局灶节段性肾小球硬化(FSGS)等疾病对肾脏足细胞造成的损伤，足细胞已被认为是各种慢性肾脏疾病进展的关键细胞。本发明建立在阿霉素诱导足细胞MPC5产生慢性损伤的体外模型中，通过检测冬虫夏草提取物对阿霉素刺激后足细胞生长率的影响，评价冬虫夏草提取物对足细胞的保护活性。本发明的一种冬虫夏草足细胞保护活性提取物的制备方法，通过提纯、分离和浓缩等步骤，结合活性部位配比成复合物得到具有显著保护足细胞活性的提取物，对冬虫夏草治疗各种慢性肾脏疾病的药效基础进一步进行了诠释，提取和浓缩方法高效，且提取物相对比较稳定且品质可控。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)冬虫夏草新鲜药材干燥至恒重，粉碎后依次采用正己烷、乙酸乙酯和无水乙醇提取，药渣干燥备用；冬虫夏草药渣加入水提取，得到水提液W1；水提液W1脱蛋白处理后浓缩，得到浓缩液；将浓缩液分级醇沉低温放置并析出沉淀，离心得到不同乙醇浓度沉淀的醇沉物W1CC～W4CC，以及去除沉淀后的冬虫夏草水提液W2；
(2)冬虫夏草水提液W2采用大孔吸附树脂纯化，以乙醇/水混合液进行梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到冬虫夏草提取物W5CC；
(3)将醇沉物W1CC与提取物W5CC按一定比例混合，得到具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物WS。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述依次采用正己烷、乙酸乙酯和无水乙醇提取，所用的料液比均为1:5～10，提取方法均为超声或回流；所述加入水提取，所用的料液比为1:5～10，提取方法为超声或回流。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浓缩是浓缩至密度为1.0g/mL～1.1g/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醇沉物W1CC～W4CC的制备步骤为：在浓缩液中先加入乙醇至乙醇浓度为20％，在4℃放置12h析出沉淀，离心得沉淀W1CC后继续加入乙醇至乙醇浓度为40％，在4℃放置12h析出沉淀，离心得沉淀W2CC后继续加入乙醇至乙醇浓度为60％，在4℃放置12h析出沉淀，离心得沉淀W3CC后继续加入乙醇至乙醇浓度为80％，在4℃放置12h析出沉淀，离心得沉淀W4CC以及去除沉淀后的冬虫夏草水提液W2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述梯度洗脱是以乙醇/水体积比为0:100～80:20进行洗脱；所述收集洗脱液是收集乙醇/水体积比为0:100～20:80的洗脱液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述醇沉物W1CC与提取物W5CC是按质量比为1:1～50混合。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的具有足细胞保护活性的冬虫夏草提取物。
8.权利要求7所述的冬虫夏草提取物在制备保护足细胞的药物和/或保健品中的应用。
9.权利要求7所述的冬虫夏草提取物在制备防治慢性肾脏疾病的药物和/或保健品中的应用。
10.一种保护足细胞或防治慢性肾脏疾病的药物和/或保健品，其特征在于，包含权利要求7所述的冬虫夏草提取物作为活性成分。
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