CN113018281B - 一种Pellino1天然小分子抑制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种6‑羟基‑4β‑(4‑羟基‑3‑甲氧基苯基)‑3α‑羟甲基‑7‑甲氧基‑3,4‑二氢‑2‑萘醛在制备Pellino1蛋白抑制剂中的应用。本发明还公开了一种6‑羟基‑4β‑(4‑羟基‑3‑甲氧基苯基)‑3α‑羟甲基‑7‑甲氧基‑3,4‑二氢‑2‑萘醛在制备治疗与人Pellino1蛋白相关疾病的药物中的应用，所述与人Pellino1蛋白相关疾病为类风湿性关节炎、骨关节炎、溃疡性结肠炎、脓毒症、自身免疫性脑脊髓炎、哮喘和呼吸系统病毒感染的多种炎症免疫性疾病、多发性硬化症、中枢神经系统炎症。化合物VNL可与Pellino1蛋白直接结合，与Pellino1的结合常数KD值为2.92μM。

Description

一种Pellino1天然小分子抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于涉及医药技术领域，涉及Pellino1抑制剂，具体涉及一种Pellino1天然小分子抑制剂及其医药用途。
背景技术
Pellino1是一种RING(really interesting new gene)指样E3泛素连接酶，主要通过催化白介素-1受体相关激酶1(interleukin-1receptor-associated kinase 1，IRAK1)的泛素化过程(Paul N.Moynagh.The roles of Pellino E3 ubiquitin ligasesin immunity.Nature Reviews Immunology，2014,14:122-131)，在固有免疫细胞和获得性免疫细胞中参与蛋白降解、蛋白间相互作用等，与炎症和自身免疫密切相关(陈方如，郝飞.泛素连接酶Pellinol蛋白研究进展.免疫学杂志，2015,7:633-636)。
目前Pellino1蛋白与疾病相关性的研究报道还较少。有研究发现，Pellino1基因敲除小鼠的免疫器官和细胞发育没有明显异常，但是对致死剂量LPS诱导的内毒素性休克敏感性显著降低(Chang M，Jin W，Sun SC.Pelil facilitates TRIF-dependent Toll-like receptor signaling and proinflammatory cytokine production.Nat Immunol，2009，10：1089-1095)。但Pellino1缺陷小鼠的免疫耐受会遭受一定程度的破坏，导致狼疮样症状的出现(Chang M，Jin W，Chang JH，et a1.The ubiquitin ligase Pelilnegatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity.Nat Immunol，2011，12：1002-1009)。在实验室自身免疫性脑脊髓炎动物模型中，Pellino1缺陷可阻止疾病的发生和进展，并且在多发性硬化患者中也发现Pellino1的表达升高，提示中枢神经系统炎症与其密切相关(Xiao Y，Jin J，Chang M，et a1.Pelil promotes microglia-mediated CNS inflammation by regulating Traf3 degradation.Nat Med，2013，19：595-602)。一项针对韩国人群的GWAS结果报道，Pellino1基因与镍过敏皮炎有关(Kim DS，Kim DH，Lee H，et a1.Agenome-wide association study in Koreans identifiessusceptibility loci for allergic nickel dermatitis.Int Arch Allergy Immunol，2013，162：184-186)。Bennett等(Bennett JA，Prince LR，Parker LC，et a1.Pellino-1selectively regulates epithelial cell responses to rhinovirus.J Viro1.2012，86：6595-6604)报道，人主支气管上皮细胞被鼻病毒感染后，下调高表达的Pellino1蛋白水平可以抑制病毒诱导的有害的中性粒细胞炎症，但仍可控制病毒引起的潜在感染，这为呼吸道病毒感染的治疗提供了新的线索。此外，有研究者发现，中性粒细胞型哮喘患者中Pellino1基因的表达显著升高(Baines KJ，Simpson JL，Wood LG，et a1.Transcriptionalphenotypes of asthma defined by gene expression profiling of induced sputumsamples.J Allergy Clin Immunol，2011，127：153-160)。由此可见，Pellino1蛋白与多种重要疾病的发生发展密切相关，因此，高效、低毒和选择性好的Pellino1抑制剂的挖掘和发现可为相关疾病治疗药物的研发奠定坚实基础，潜力巨大。
6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛(6-Hydroxy-4β-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3α-hydroxymethyl-7-methoxy-3,4-dihydro-2-naphthaldehyde，代号VNL，黄荆子素)是从马鞭草科牡荆属植物黄荆中分离得到的化合物(Zheng CJ,Tang WZ,Huang BK,Han T,Zhang QY,Zhang H,QinLP.Bioactivity-guided fractionation for analgesic properties and constituentsof Vitex negundo L.seeds.Phytomedicine,2009,16:560–567.)。黄荆子素VNL属于苯代萘型木脂素，该类成分为牡荆属植物中的特征性成分(Zheng CJ,Li HQ,Ren SC,Xu CL,Rahman K,Qin LP,Sun YH.Phytochemical and pharmacological profile of Vitexnegundo.Phytotherapy Research,2015,2015,29:633-647)。已有研究表明，黄荆子素VNL具有抗氧化、抗炎、镇痛和抗肿瘤等生物活性(Zheng CJ,Li HQ,Ren SC,Xu CL,Rahman K,Qin LP,Sun YH.Phytochemical and pharmacological profile of Vitexnegundo.Phytotherapy Research,2015,29:633-647)，但至今未见该化合物(6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛)在制备治疗Pellino1相关疾病药物中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛在制备Pellino1蛋白抑制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛在制备Pellino1蛋白抑制剂中的应用。
所述Pellino1蛋白抑制剂为6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛，化学结构式如下所示：
Figure BDA0002948390230000031
本发明的第二方面提供了一种6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛在制备治疗与人Pellino1蛋白相关疾病的药物中的应用。
所述与人Pellino1蛋白相关疾病为类风湿性关节炎、骨关节炎。
所述与人Pellino1蛋白相关疾病为溃疡性结肠炎、脓毒症。
所述与人Pellino1蛋白相关疾病为自身免疫性脑脊髓炎、哮喘和呼吸系统病毒感染的多种炎症免疫性疾病、多发性硬化症、中枢神经系统炎症。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛在制备Pellino1蛋白抑制剂中的应用及其在制备治疗与人Pellino1蛋白相关疾病的药物中的应用，其中所述与人Pellino1蛋白相关疾病为类风湿性关节炎、骨关节炎、溃疡性结肠炎、脓毒症、自身免疫性脑脊髓炎、哮喘和呼吸系统病毒感染的多种炎症免疫性疾病、多发性硬化症、中枢神经系统炎症。
本发明提供的6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛可以作为Pellino1天然小分子抑制剂，Pellino1是一种RING(reallyinteresting new gene)指样E3泛素连接酶，主要通过催化白介素-1受体相关激酶1(IRAK1)的泛素化过程，在固有免疫细胞和获得性免疫细胞中参与蛋白降解、蛋白间相互作用等，与炎症和自身免疫密切相关。采用亲和色谱技术发现苯代萘型木脂素化合物6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛(黄荆子素，VNL)可与Pellino1蛋白直接结合；采用表面等离子体共振SPR技术测得化合物VNL与Pellino1的结合常数KD值为2.92μM。进一步机制研究表明，该化合物可直接影响Pellino1与IRAK1的相互作用，对Pellino1介导的IRAK1泛素化有显著的抑制作用，从而抑制TGF-β活化激酶1(TAK1)的磷酸化与激活，因此可有效抑制炎症细胞模型中多种炎症信号通路的激活和关键炎症因子的表达。本发明所发现的天然小分子抑制剂黄荆子素VNL可以为治疗与Pellino1有关疾病(如类风湿性关节炎、骨关节炎、溃疡性结肠炎、脓毒症、自身免疫性脑脊髓炎、哮喘和呼吸系统病毒感染的多种炎症免疫性疾病、多发性硬化症、中枢神经系统炎症)的药物研发提供基础。体内动物实验表明，黄荆子素VNL可有效降低II型胶原诱导的大鼠关节炎指数评分、提高碘乙酸致骨关节炎大鼠足底痛阈值、改善葡聚糖硫酸钠所致小鼠溃疡性结肠炎疾病活动指数DAI评分和提高盲肠结扎穿孔脓毒症小鼠生存率，对于与Pellino1相关的多种疾病动物模型都表现出良好的治疗效果。
本发明的化合物黄荆子素VNL是Pellino1被文献报道以来发现的第一个天然小分子抑制剂，有望成为与人Pellino1蛋白相关疾病的first in class治疗药物，可进行进一步的结构优化，具有非常好的应用前景。
附图说明
图1是6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛(黄荆子素，VNL)的结构式。
图2是黄荆子素VNL对炎症细胞模型中NF-κB转录活性和关键细胞因子表达水平的影响示意图，其中vs模型组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.01。
图3是黄荆子素VNL对炎症细胞模型中NF-κB和MAPK信号通路的影响示意图。
图4是黄荆子素VNL对炎症细胞模型中TAK1磷酸化和IRAK1泛素化的影响示意图。
图5是黄荆子素VNL与Pellino1蛋白直接结合的分析示意图。
图6是黄荆子素VNL对II型胶原诱导的大鼠关节炎指数评分的影响(mean±SD，n＝8)示意图，其中vs模型组，*p<0.05，**p<0.01。
图7是黄荆子素VNL对碘乙酸致骨关节炎大鼠足底痛阈值的影响(mean±SD，n＝8)示意图，其中vs模型组，*p<0.05，**p<0.01；vs空白组，#p<0.05。
图8是葡聚糖硫酸钠所致小鼠溃疡性结肠炎疾病活动指数DAI评分标准示意图。
图9是黄荆子素VNL对葡聚糖硫酸钠所致小鼠溃疡性结肠炎疾病活动指数DAI评分的影响(mean±SD，n＝10)示意图，其中vs模型组，*p<0.05，**p<0.01。
图10是黄荆子素VNL对盲肠结扎穿孔脓毒症小鼠生存率的影响(mean±SD，n＝10)示意图，其中*vs模型组，p<0.05。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
在本发明中，首先采用炎症细胞模型发现黄荆子素VNL可有效抑制多种炎症信号通路的激活和关键炎症因子的表达。根据信号通路结果分析，初步推测其作用机制涉及IRAK1/TAK1通路，进一步采用亲和色谱技术发现苯代萘型木脂素化合物6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛(黄荆子素，VNL)可与Pellino1蛋白直接结合；采用表面等离子体共振SPR技术测得化合物VNL与Pellino1的结合常数KD值为2.92μM。进一步机制研究表明，该化合物可直接影响Pellino1与IRAK1的相互作用，对Pellino1介导的IRAK1泛素化有显著的抑制作用，从而抑制TGF-β活化激酶1(TAK1)的磷酸化与激活。因此，本发明所发现的天然小分子抑制剂可以为治疗与Pellino1有关疾病(如类风湿性关节炎、骨关节炎、溃疡性结肠炎、脓毒症、自身免疫性脑脊髓炎、哮喘和呼吸系统病毒感染等多种炎症免疫性疾病)的药物研发提供基础。
实施例1
黄荆子素VNL的制备
(1)制备提取液：将1kg黄荆子(药材自采于四川省简阳市)药材粉碎后，投入提取罐，用70％的乙醇10L回流提取2次，每次溶媒用量约为生药量的8～10倍，每次提取时间为1～2小时，合并提取液。
(2)萃取：将上述提取液合并浓缩至密度约为1.4g/cm3，调节pH至6.0为止，加入4倍体积乙酸乙酯萃取2次，将萃取液减压干燥。
(3)分离纯化：将上述萃取物溶解后调整上样液浓度为0.75mg/mL(以VNL浓度算)，上样LX-3020大孔树脂柱，流速2.0BV/h，以20％乙醇洗脱4BV除杂后，40％乙醇进行洗脱，收集洗脱液10BV，洗脱液减压浓缩至小体积后真空干燥至完全成粉状得黄荆子素VNL粗品。将粗品溶于二氯甲烷-甲醇(体积比为1:1)溶剂系统进行重结晶，得黄荆子素VNL纯品(纯度>90％)。
结合1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC以及NOESY等波谱数据(ZhengCJ,Huang BK,Han T,Zhang QY,Zhang H,Rahman K,Qin LP.Nitric oxide scavenginglignans from Vitex negundo seeds.J.Nat.Prod.,2009,72(9):1627–1630)，鉴定VNL的化学结构图1所示，图1是6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛(黄荆子素，VNL)的结构式。
实施例2
黄荆子素VNL的体外作用机制研究
2.1.RA成纤维滑膜细胞的分离及培养纯化
(1)从类风湿性关节炎病人关节处取滑膜组织(上海长海医院提供)；
(2)将滑膜组织置于含10％双抗的PBS缓冲液中于4℃带入实验室；
(3)将滑膜组织在超净台中用含10％双抗的PBS缓冲液洗涤数次；
(4)将粉色偏向白色的滑膜层剥离置新的培养皿中，并进一步用含10％双抗的PBS缓冲液洗涤数次；
(5)将滑膜层用灭菌的剪刀剪碎(越小越好)，1000r，离心5min；
(6)弃掉上清，加入4mg/mlⅠ型胶原蛋白酶于37℃培养箱中消化2h；
(7)2h之后，吸取消化液于细胞过滤网中过滤，1000r，离心5min，得到的细胞加入完全培养基(高糖DMEM培养基45mL，FBS 5mL，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素0.5mL)于37℃恒温培养箱中进行培养；将上清继续加入培养皿中，收回组织，继续消化，4h后收集消化液，重复上述操作；
(8)必要时24h，48h可继续重复上述操作，收集细胞；
(9)3天更换新的完全培养基，至第一代细胞增殖至80％左右，消化传代至第二代，并继续进行纯化传代至第三代(传代时需加PBS多次洗涤，离心以除去杂细胞)，细胞增殖至密度为105-106/mL可进行后续实验。
2.2.RAW264.7和293T细胞培养
(1)从液氮中取出293T/RAW264.7细胞，迅速于37℃孵化。
(2)将细胞悬液移至15mlEp管中，加入完全培养基稀释至原来的10倍以上。
(3)1000r，离心3min。
(4)弃去上清，加入PBS洗2次，加入新的完全培养基，于37℃，5％CO2，相对湿度为95％的细胞培养箱中培养。
(5)倒置显微镜下观察细胞密度达到80％左右。
(6)传代，弃掉上清，加入提前灭菌的PBS 2ml洗涤3次。
(7)加入0.25％胰蛋白酶1ml于37℃培养箱中消化1-3min至80％细胞形态变圆。
(8)加入完全培养基1ml终止消化，上下冲洗，用移液枪轻微吹散，使细胞完全脱落。
(9)将细胞悬液移入15ml EP管中，1000r，25℃，离心3min。
(10)弃掉上清，加入完全培养基，轻微吹散混匀，按1:3的比例传代。
2.3.双报告基因法测定化合物对293T细胞NF-κB转录活性的影响
(1)将对数生长期的293T细胞以6×104/ml种植于96孔板中，每孔100μl，按上述细胞培养步骤进行培养，待细胞密度达80％左右时，进行转染；
(2)按2.0μg NF-κB质粒、0.2μg SV-40质粒、3倍质粒的FUGENE转染试剂(6.6μl)和100μl DMEM培养基的比例进行配置，轻柔混匀10min，每孔加入10μl；
(3)转染6h之后，更换不含双抗的完全培养基100μl每孔；
(4)24小时之后，VNL处理组(1μΜ，5μΜ，10μΜ，20μΜ)，每孔设3个副孔；
(5)4h后加入TNF-α刺激(终浓度为20ng/ml)，同时设定空白对照组和只含TNF-α的刺激组，刺激6h；
(6)移去培养基，加入不含双抗的完全培养基和同比例的荧光素酶试剂(详见双荧光素酶报告基因检测试剂盒E1910说明书，将荧光素酶检测底物溶解于10mL荧光素酶检测缓冲液中，可用于100次检测)，轻微吹打混匀10min，取20μl，Turner Designs TD20/20荧光检测仪检测荧光强度(即为萤火虫荧光)，再加入20μl Stop&
Figure BDA0002948390230000071
试剂混匀，检测荧光强度(即为海肾荧光)。
2.4.细胞RNA提取
(1)将对数生长期的RA成纤维滑膜细胞以3×105/well种植于12孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜；
(2)设立空白对照，VNL处理组(1μΜ，5μΜ，10μΜ，20μΜ)，加药处理；
(3)4h后，加入LPS(1μg/ml)刺激24h；
(4)将12孔板中的培养基吸掉，加入灭菌的PBS 3ml，洗涤3次；
(5)加入500μl/well RA2裂解(核蛋白裂解)，充分混匀5-10次，静置1min；
(6)收集于内套管中，12000r离心1min；
(7)取出内套管，吸掉外套管中的液体放回内套管，加入500μl洗液(75％乙醇)，去除杂质，12000r离心1min，重复再洗一次；
(8)取出内套管，吸掉外套管中的液体，不加洗液，12000r离心1min；
(9)将内套管移入新的1.5ml Ep管中，加入25-50μl洗脱液，静置1min，12000r离心1min；
(10)得总RNA，紫外分光光度仪测定260nm/280nm波长处光密度值，测定RNA浓度。
2.5.Western blot分析
2.5.1.细胞总蛋白提取
(1)贴壁细胞弃掉上清，PBS洗三次，弃掉残余PBS；
(2)加入细胞裂解液(5×105细胞加80-120μl裂解液，可适当调节浓度)，使细胞快速被覆盖，置于冰上，裂解30min；
(3)收集裂解混合液与1.5mlEp管中，12000r，4℃离心10min；
(4)缓慢吸取上清于新的Ep管中，用于蛋白定量和后续实验。
2.5.2.BCA法蛋白定量
(1)PBS稀释标准品牛血清白蛋白(BSA)使终浓度为0.5mg/ml；
(2)标准曲线制备：依次加入0.5mg/ml的BSA0，1，2，4，6，8μl于96孔板中，再依次加入PBS补足至10μl每孔，各做3个副孔；
(3)为了防止误差，取样品蛋白4μl加入36μl PBS稀释10倍，移液枪吹打混匀，分别移入96孔板中，每孔10μl，做3个副孔；
(4)蛋白标准品孔和样品蛋白孔分别加入100μl BCA工作液(A液：B液＝50:1，充分混匀)，37℃孵育30min，酶标仪570nm测OD值，以标准品的浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据测出的未知样品的OD值计算其蛋白浓度；
(5)以30μg标准上样量上样。
2.5.3.电泳及转膜
(1)将上述提取好的蛋白加入1/4倍蛋白的5×蛋白缓冲液，95℃煮沸5min，-20℃保存；
(2)电泳：配10％SDS-PAGE凝胶(上层浓缩胶10％和下层分离胶6％，比例5:2)，检漏，向两板之间加入蒸馏水，观察下面是否会漏；加入下层胶并用乙醇封压，等下层胶凝固时，加入上层胶，迅速插入梳子，待凝固；上层胶凝固后，轻微取出梳子，向电泳槽中加入电泳缓冲液，内槽的缓冲液要没过加样孔，外槽没过电极；用微量加样器向孔中加入30μg样品蛋白及4μl预染marker；电泳装置接通电源，80V电压使溴酚蓝前沿进入分离胶时，加压至120V至电泳结束；
(3)转膜：电泳结束后，将胶条切至所需大小，至转膜液中平衡；
同样将PVDF膜切至所需大小，于转膜液中活化；转模装置依次按阳极板、3层滤纸、PVDF膜、3层滤纸、胶条、阴极板的顺序精确对齐放好，并一步一步除去气泡，接入电源，恒流至250mA，4℃转移80min；
(4)转膜结束后，取出PVDF膜，丽春红染液于摇床上染色5min；
(5)PBST洗涤，10min/次，洗3次，弃掉PBST；
(6)封闭：加入封闭液，室温于摇床上封闭30min或4℃封闭过夜；
(7)PBST洗涤，10min/次，洗3次，弃掉PBST；
(8)抗体孵育：一抗：NF-κBp65，p-p65，IκB-α，p-IκBα，ERK，p-ERK，JNK，p-JNK，p38，p-p38，TAK1，p-TAK1，IRAK1，p-IRAK1，IRAK4，p-IRAK4，Pellino1，GAPDH抗体用一抗二抗稀释液按1:1000进行稀释，4℃孵育过夜或室温孵育至少2h，PBST洗涤，10min/次，洗3次，弃掉PBST；二抗：依据抗体说明书，将上述一抗所对应的二抗用一抗二抗稀释液以1:2000进行稀释，室温孵育1h，PBST洗涤，10min/次，洗3次，弃掉PBST；
(9)显色：将膜放入显色液(A液：B液＝1:1，混匀，现配现用)孵育1-2min，移入Tanon5200光密度扫描仪中进行扫描，分析差异条带；
(10)如有需要可进行去除一抗二抗，滤膜可重复使用2-3次，加入抗体去除液去除5-10min之后，PBST洗涤，10min/次，洗3次，弃掉PBST；抗体孵育方法如上所述。
(11)将扫描结果保存至电脑中，后续采用image J进行灰度分析，用目标蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值作为蛋白相对表达水平数值。
2.6.亲和色谱pulldown试验
将重组的GST-Pellino 1蛋白(1μg蛋白每组样品)与20μM VNL树脂探针或空白树脂共孵育，置于振荡器上4℃过夜。使用IP细胞裂解缓冲液对蛋白和树脂探针复合物进行清洗，重复清洗3-4次。加入5×SDS上样缓冲液对蛋白复合物进行蒸煮变性，使用Pellino 1抗体对样品采用蛋白免疫印迹方法进行检测。
2.7.蛋白质免疫共沉淀
将IL-1R细胞(表达带标签的IRAK1融合蛋白)培养于100mm细胞培养皿中，待细胞长满至90％，使用MG-132(蛋白酶抑制剂)预处理24小时后，加入20μM VNL处理4小时。然后，加入IL-1β(10ng/ml)刺激30分钟。使用PBS缓冲液清洗细胞2次后，加入500μL IP细胞裂解缓冲液(含1×PMSF，苯甲基磺酰氟)冰上裂解。每个样品各取约500ug蛋白和20μL anti-Flag M2亲和纯化胶进行免疫共沉淀。将细胞提取液和anti-Flag M2亲和纯化胶置于振荡器上4℃过夜共孵育。使用IP细胞裂解缓冲液对蛋白和亲和纯化胶的复合物进行清洗，重复清洗4次。加入5×SDS上样缓冲液对蛋白和亲和纯化胶的复合物进行蒸煮变性，使用ubiquitin、TRAF6和Pellino 1抗体对样品采用蛋白免疫印迹方法进行检测。
2.8.统计学分析
所有的实验内容均进行三次独立重复实验，且实验结果数据经分析后均以“平均值±标准差”的形式呈现。统计学分析通过生物统计学软件SPSS进行分析，当p值小于0.05时，具有显著的统计学差异。
2.9.结果分析
如图2所示，图2是黄荆子素VNL对炎症细胞模型中NF-κB转录活性和关键细胞因子表达水平的影响示意图，其中vs模型组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.01。图2中，第一个图是黄荆子素对白介素1β的mRNA表达水平的影响示意图，第二个图是黄荆子素对白介素6的mRNA表达水平的影响示意图，第三个图是黄荆子素对白介素8的mRNA表达水平的影响示意图，第四个图是黄荆子素对荧光素酶活性的影响示意图。从图中可以看出，黄荆子素VNL可有效抑制TNF-α诱导293T细胞中NF-κB的转录活性，该作用呈剂量依赖关系，并在20μM剂量下使NF-κB的转录活性基本降回到正常水平；并显著抑制IL-1β刺激的RA滑膜成纤维细胞中IL-1β，L-6和IL-8的mRNA的表达。
如图3所示，图3是黄荆子素VNL对炎症细胞模型中NF-κB和MAPK信号通路的影响示意图。图3中，第一个图是黄荆子素对NF-κB信号通路中相关蛋白表达水平的影响示意图，第二个图是黄荆子素对MAPK信号通路相关蛋白表达水平的影响示意图。从图中可以看出，VNL可同时抑制IL-1β诱导的RA滑膜成纤维细胞中NF-κB和MAPKs信号通路的激活，抑制IL-1β诱导的IκB和p65磷酸化以及IκB的降解，降低MAPKs通路中ERK、JNK和p38磷酸化水平。
如图4所示，图4是黄荆子素VNL对炎症细胞模型中TAK1磷酸化和IRAK1泛素化的影响示意图。图4中，第一个图是黄荆子素对p-TAK1和TAK1蛋白表达的影响示意图，第二个图是黄荆子素对p-IRAK4、p-IRAK1和IRAK1蛋白表达的影响示意图，第三个图是黄荆子素对IRAK1的mRNA表达水平的影响示意图，第四个图是通过免疫共沉淀实验考察黄荆子素对Pellino1、Traf6和IRAK1之间蛋白相互作用的影响示意图。从图中可以进一步发现，VNL可剂量依赖地抑制TGF-β活化激酶1(TAK1)的磷酸化，却不影响IRAK4和IRAK1的磷酸化水平以及IRAK1的mRNA表达量，但可使IRAK1蛋白表达量增加，提示VNL可抑制IRAK1的泛素化，通过蛋白质免疫共沉淀实验证实了上述猜测。同时明确了该化合物可直接影响Pellino1与IRAK1的相互作用，对Pellino1介导的IRAK1泛素化有显著的抑制作用，从而抑制TAK1的磷酸化与激活。由此推测，Pellino1可能是化合物VNL的直接作用靶点。
如图5所示，图5是黄荆子素VNL与Pellino1蛋白直接结合的分析示意图。从图中可以进一步看出，采用亲和色谱pulldown试验发现黄荆子素VNL确实可与Pellino1蛋白直接结合；并采用表面等离子体共振SPR技术测得化合物VNL与Pellino1的结合常数KD值为2.92μM，且通过同源模建和分子对接技术，模拟了VNL与Pellino1的主要结合位点为Thr117、Val118、Asp116、Gln122、Gln239、Pro344和Glu373。
实施例3
黄荆子素VNL的体内药效学实验
3.1.II型胶原诱导的大鼠关节炎模型
将鸡II型胶原蛋白醋酸溶液与等容量的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化。第0天，80只SD大鼠尾根进行皮内注射(1mg/ml)，每只0.1ml；7日后，加强免疫，大鼠尾根用0.1ml/只溶液注射作为激发注射，第15日左右造成RA动物模型。根据关节炎指数评分标准去除造模不成功动物，将造模成功的SD大鼠按体重随机分为6组，每组8只，自由饮食、进水。分为空白组、模型组、阳性药组和化合物VNL高、中、低剂量组。阳性药组：地塞米松，0.05mg/kg，灌胃给药，每日1次；化合物VNL组：自造模成功之日起，给予大鼠VNL，灌胃给药，每日1次，高、中、低剂量分别为60、30和15mg/kg，连续给药30d。
结果如图6所示，图6是黄荆子素VNL对II型胶原诱导的大鼠关节炎指数评分的影响(mean±SD，n＝8)示意图，其中vs模型组，*p<0.05，**p<0.01。从图中可以看出，模型组关节炎指数与空白组呈显著性差异，给药VNL后可显著改善RA大鼠关节炎指数评分，并呈剂量依赖关系。在高剂量60mg/kg时，药效与阳性药地塞米松相当。
3.2.碘乙酸致大鼠骨关节炎模型
取8周雄性SD大鼠60只造模。使用0.3mL的胰岛素注射器关节腔内(经髌下韧带)注射2mg碘乙酸MIA(溶于50μl无菌生理盐水中)。动物经异氟醚麻醉后，翻身放置，将右后肢折成约90°，针头穿过髌腱，将MIA注射入膝滑膜中，缓慢注射全部50μL的药物后，缓慢取出针头并将小块纱布覆盖注射点以减少倒流和漏液。碘乙酸注射7天后，使用Electric VonFrey电子测痛仪测量足底痛阈值筛选造模成功的动物。取48只造模成功的大鼠，按体重随机分成6组，空白组、模型组、阳性药组和化合物VNL高、中、低剂量组。阳性药组：塞来昔布，20mg/kg，灌胃给药，每日1次；化合物VNL组：自造模结束之日起，给予大鼠VNL，灌胃给药，每日1次，高、中、低剂量分别为40、20和10mg/kg，连续给药7d。
结果如图7所示，图7是黄荆子素VNL对碘乙酸致骨关节炎大鼠足底痛阈值的影响(mean±SD，n＝8)示意图，其中vs模型组，*p<0.05，**p<0.01；vs空白组，#p<0.05。从图中可以看出，大鼠右膝关节腔内注射碘乙酸后，右足底痛阈值显著降低。给药VNL后可显著提高骨关节炎大鼠右足底痛阈值，并呈剂量依赖关系。在中剂量20mg/kg时，药效与阳性药塞来昔布相当；且高剂量40mg/kg给药7天后，骨关节炎大鼠右足底痛阈值基本恢复正常。
3.3.葡聚糖硫酸钠(DSS)致小鼠溃疡性结肠炎模型
取雄性18～22g Balb/c小鼠40只，将DSS溶于蒸馏水中配成3％(w/v)溶液，小鼠每天给予DSS溶液灌胃，连续8天造模结束。通过对疾病活动指数(DAI)的评估(评分标准见图8所示，图8是葡聚糖硫酸钠所致小鼠溃疡性结肠炎疾病活动指数DAI评分标准示意图。)筛选造模成功的动物进行分组，分为3组，空白组、模型组和化合物VNL组，每组10只。化合物VNL组：自造模结束之日起，给予大鼠VNL，灌胃给药，每日1次，剂量为40mg/kg，连续给药14d。
结果如图9所示，图9是黄荆子素VNL对葡聚糖硫酸钠所致小鼠溃疡性结肠炎疾病活动指数DAI评分的影响(mean±SD，n＝10)示意图，其中vs模型组，*p<0.05，**p<0.01。从图中可以看出，模型小鼠体重下降显著，稀便和肉眼血便明显。给药VNL后，可明显改善小鼠血便和体重下降现象，显著降低溃疡性结肠炎小鼠的疾病活动指数。
3.4.盲肠结扎穿孔小鼠脓毒症模型
取6–8周雄性18～22g C57BL/6小鼠40只，分为4组，空白组、模型组和化合物VNL高、低剂量组。小鼠盲肠结扎穿孔2小时以后灌胃给药1次，连续灌胃给药3天，每日1次，高剂量组为40mg/kg，低剂量组为10mg/kg。
结果如图10所示，图10是黄荆子素VNL对盲肠结扎穿孔脓毒症小鼠生存率的影响(mean±SD，n＝10)示意图，其中*vs模型组，p<0.05。从图中可以看出，在小鼠盲肠结扎穿孔后两小时给予VNL，可显著提高小鼠的生存率，低剂量组和高剂量组可分别将生存率提高至60％和70％，而模型组的生存率仅为10％。
鉴于上述实验结果，本发明的黄荆子素VNL可与Pellino1蛋白特异性结合，干扰Pellino1与IRAK1的相互作用，对Pellino1介导的IRAK1泛素化有显著的抑制作用，从而抑制TGF-β活化激酶1(TAK1)的磷酸化与激活，因此可有效抑制炎症细胞模型中多种炎症信号通路的激活和关键炎症因子的释放。且对与Pellino1有关的多种疾病动物模型均有一定程度的治疗作用，因此可用于制备靶向人Pellino1蛋白疾病药物，治疗与Pellino1有关的多种疾病(如类风湿性关节炎、骨关节炎、溃疡性结肠炎、脓毒症、自身免疫性脑脊髓炎、哮喘和呼吸系统病毒感染等多种炎症免疫性疾病、多发性硬化症、中枢神经系统炎症)。本发明的化合物是Pellino1被文献报道以来发现的第一个天然小分子抑制剂，可以作为Pellino1蛋白抑制剂，有望成为first in class，可进行进一步的结构优化，具有非常好的应用前景。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (1)

1.6-羟基-4β-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3α-羟甲基-7-甲氧基-3,4-二氢-2-萘醛在制备治疗与人Pellino1蛋白相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述与人Pellino1蛋白相关疾病为溃疡性结肠炎、脓毒症；
化学结构式如下所示：
Figure FDA0003949813940000011
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