CN115894277B - 一种从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱eb-a的制备方法及应用 - Google Patents

一种从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱eb-a的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱EB‑A的制备方法，包括：木贼麻黄的干燥草质茎，回流提取，减压浓缩；将浓缩浸膏分散溶解，萃取；将二氯甲烷部位层析，依次梯度洗脱，将Fr.7的浓缩液经过硅胶柱层析，洗脱，Fr.7‑3浓缩液洗脱，Fr.7‑3‑2浓缩液层析，洗脱，Fr.7‑3‑2‑2浓缩液层析，洗脱，Fr.7‑3‑2‑2‑2的浓缩液层析，洗脱，Fr.7‑3‑2‑2‑2‑1浓缩液层析，洗脱，Fr.7‑3‑2‑2‑2‑1‑2分离纯化，浓缩干燥，得到酰胺类生物碱；首次从木贼麻黄中提取分离得到了一种具有抗哮喘活性的酰胺类生物碱，证明了其对过敏性哮喘小鼠肺部损伤和炎症的改善，社会和经济效益巨大。

Description

一种从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱EB-A的制备方法 及应用
技术领域
本发明涉及生物碱提取方法，特别是一种从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱EB-A的制备方法及应用。
背景技术
过敏性哮喘是一种常见的下呼吸道慢性、异质性疾病，其特征是伴有气道炎症和高反应性的可逆性气流阻塞，以及哮喘发作时的咳嗽、喘息、呼吸困难和胸闷等症状。哮喘影响着全球超3亿人，并且还在快速增长，在国内，哮喘也影响着过千万人；其中，近70％未被诊断，95％未接受标准治疗，从而造成巨大的健康和经济负担。吸入性皮质类固醇(ICS)是哮喘治疗的基础。然而，吸入或全身性皮质类固醇对许多哮喘患者无效，使得类固醇抵抗型哮喘患者的治疗选择很少。因此，迫切需要新的疗法和治疗靶点，以更好地控制重症哮喘患者的症状和恶化，并避免口服皮质类固醇(OCS)引起的不良反应。
哮喘的病理生理学涉及多种免疫和结构细胞的变化。上皮屏障损伤在许多过敏性和自身免疫性疾病(如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎和炎症性肠病等)的发生和发展中起着重要作用。气道上皮细胞表达模式识别受体，如Toll样受体(TLRs)和蛋白酶激活受体(PARs)，它们可以感知各种环境刺激，包括过敏原、微生物和颗粒污染物等。当吸入刺激时，上皮细胞释放促炎细胞因子并激活树突状细胞，进而促进Th2型免疫反应的发展并驱动先天免疫细胞的激活。树突状细胞作为功能最强的抗原提呈细胞(APC)，在启动和指导免疫反应中发挥着重要作用。在免疫反应开始后，多种免疫细胞如2型天然淋巴细胞(ILC2)、B细胞、肥大细胞(MC)和嗜酸性粒细胞等参与反应过程。值得注意的是，MC是哮喘发病机制中的关键效应细胞，其释放的颗粒可引起平滑肌收缩和粘膜水肿，从而导致细支气管狭窄。目前，许多治疗药物的药理就是针对这一关键的脱粒过程。
全球疾病负担研究已将哮喘确定为全球最普遍的慢性呼吸道疾病。在针对哮喘的治疗中，中医药长久以来有着显著的疗效。在用于哮喘和过敏性疾病的多种治疗方剂中均包含中国传统中药——麻黄。然而，麻黄的成分复杂多样，作用机制也尚未阐明，因此，探究其治疗哮喘的物质基础和作用机制并开发出有效的治疗药物是非常重要和必要的。
麻黄始载于《神农本草经》，为麻黄科植物草麻黄(Ephedra sinica Stapf)、中麻黄(Ephedrae intermedia Schrenk et C.A.Mey.)或木贼麻黄(Ephedra equisetinaBge.)的干燥草质茎。其性温，味辛、微苦。现代药理学研究表明，麻黄有着良好的药用价值，具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿、降血糖、抗炎和免疫调节等作用。麻黄作为临床常用中药，且作为“肺经专药”，在肺系疾病的治疗中有着较高的使用频率。以其为代表的方剂，如麻杏石甘汤、小青龙汤、射干麻黄汤等，已被广泛用于哮喘的治疗当中。经典名方中麻黄的本草考证结果显示，古时所用麻黄的基原虽主要为草麻黄，但也有不少木贼麻黄混用的情况。且麻黄的化学成分分析表明，三种麻黄中木贼麻黄的生物碱含量最高，而生物碱组分是麻黄发挥平喘作用的主要有效组分。除此之外，木贼麻黄还具有较好的免疫调节作用，这为木贼麻黄干预哮喘的研究提供了依据。本发明在对木贼麻黄的化学成分挖掘中，首次发现了一个酰胺类生物碱(EB-A)，其对小鼠过敏性哮喘具有明显的改善作用。为麻黄的药理研究和抗哮喘药物的开发提供实验依据，迄今为止未见有公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱EB-A的制备方法及应用，可有效改善过敏性哮喘。
为实现上述目的，本发明解决的技术方案是，一种从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱EB-A的制备方法，包括以下步骤：
(1)取木贼麻黄的干燥草质茎进行粉碎，以木贼麻黄10倍重量体积、质量浓度70％的乙醇溶剂回流提取4次，每次1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩浸膏；
(2)将浓缩浸膏用纯水分散溶解，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及纯水部位；
(3)将二氯甲烷部位经硅胶柱层析，依次用石油醚：丙酮的体积比为50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100及质量浓度100％甲醇梯度洗脱，得9个洗脱部位Fr.1～Fr.9；
(4)将Fr.7的浓缩液经过硅胶柱层析，依次用CH2Cl2:MeOH＝20:1、10:1、5:1洗脱，得4个洗脱部位Fr.7-1～Fr.7-4；然后将Fr.7-3的浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用质量浓度80％的甲醇洗脱，得3个洗脱部位Fr.7-3-1～Fr.7-3-3；将Fr.7-3-2的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2:MeOH＝50:1、20:1、10:1、5:1进行洗脱，得到5个洗脱部位Fr.7-3-2-1～Fr.7-3-2-5；将Fr.7-3-2-2的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2：MeOH＝30:1进行洗脱，得到2个洗脱部位Fr.7-3-2-2-1～Fr.7-3-2-2-2；将Fr.7-3-2-2-2的浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用质量浓度70％的甲醇洗脱，得到3个洗脱部位Fr.7-3-2-2-2-1～Fr.7-3-2-2-2-3；将Fr.7-3-2-2-2-1的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2：MeOH＝25:1进行洗脱，得到2个洗脱部位Fr.7-3-2-2-2-1-1～Fr.7-3-2-2-2-1-2；将Fr.7-3-2-2-2-1-2用C18 ODS RP-HPLC分离纯化，浓缩干燥，得到酰胺类生物碱EB-A，保留时间为tR＝26.4min。
所述方法提取的酰胺类生物碱EB-A在抗过敏性哮喘药物中的应用。
本发明首次从木贼麻黄中提取分离得到了一种具有抗哮喘活性的酰胺类生物碱(EB-A)，并通过体内外实验证明了其对过敏性哮喘小鼠肺部损伤和炎症的改善，以及对树突状细胞成熟和肥大细胞活化的抑制。为阐明木贼麻黄的活性成分提供了有力的实验证据，也有助于麻黄药效成分的完整解析，是提取酰胺类生物碱EB-A上的一大创新，社会和经济效益巨大。
附图说明
图1是本发明EB-A的质谱图。
图2是本发明EB-A的1H-NMR图谱。
图3是本发明EB-A的13C-NMR图谱。
图4是本发明EB-A对OVA诱导的过敏性哮喘典型表型的改善图。
图5是本发明EB-A对OVA诱导的过敏性哮喘小鼠肺组织损伤和炎症的影响图。
图6是本发明EB-A对过敏性哮喘小鼠肺组织中PAR2活化的影响图。
图7是本发明EB-A对过敏性哮喘小鼠体内树突状细胞成熟的影响图。
图8是本发明EB-A对肥大细胞活化脱颗粒的影响图。
图9是本发明体外验证EB-A抑制树突状细胞成熟的机制结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例
本发明一种从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱EB-A的制备方法，包括以下步骤：
(1)取35.0kg木贼麻黄的干燥草质茎进行粉碎，以木贼麻黄10倍重量体积、质量浓度70％的乙醇溶剂回流提取4次，每次1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩浸膏8.84kg；
(2)将浓缩浸膏用纯水分散溶解，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，得石油醚部位0.87Kg、二氯甲烷部位0.99Kg、乙酸乙酯部位0.64Kg、正丁醇部位1.31Kg以及纯水部位5.04Kg；
所述石油醚萃取条件为：5L石油醚萃取10次，每次4h，二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取条件与石油醚相同(即石油醚(5L×10次×4h)、二氯甲烷(5L×10×4h)、乙酸乙酯(5L×10×4h)以及正丁醇(5L×10×4h))；
(3)将二氯甲烷部位经硅胶柱层析，依次用石油醚：丙酮的体积比为50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100及质量浓度100％甲醇梯度洗脱，得9个洗脱部位Fr.1～Fr.9；
(4)将Fr.7(石油醚：丙酮＝1:1)的浓缩液经过硅胶柱层析，依次用CH2Cl2(二氯甲烷):MeOH(甲醇)＝20:1、10:1、5:1洗脱，得4个洗脱部位Fr.7-1～Fr.7-4；然后将Fr.7-3的浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用质量浓度80％的甲醇洗脱，得3个洗脱部位Fr.7-3-1～Fr.7-3-3；将Fr.7-3-2的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2:MeOH＝50:1、20:1、10:1、5:1进行洗脱，得5个洗脱部位Fr.7-3-2-1～Fr.7-3-2-5；将Fr.7-3-2-2的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2：MeOH＝30:1进行洗脱，得2个洗脱部位Fr.7-3-2-2-1～Fr.7-3-2-2-2；将Fr.7-3-2-2-2的浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用质量浓度70％的甲醇洗脱，得3个洗脱部位Fr.7-3-2-2-2-1～Fr.7-3-2-2-2-3；将Fr.7-3-2-2-2-1的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2：MeOH＝25:1进行洗脱，得2个洗脱部位Fr.7-3-2-2-2-1-1～Fr.7-3-2-2-2-1-2；将Fr.7-3-2-2-2-1-2用C18 ODS RP-HPLC分离纯化，浓缩干燥，得到酰胺类生物碱EB-A47.0mg，保留时间为tR＝26.4min。其中C18 ODS RP-HPLC制备的条件为5μm，250×10mm，55％甲醇，3mL/min。
上述所用仪器与试药：Bruker AVANCE III500核磁共振仪(Bruker)，Brukermaxis HD Q-TOF高分辨质谱仪(Thermo Scientific,USA)，YMC AA12S05-2510WT型C18反相色谱柱(德国Dr.Maisch GmbH)，OSB-2000型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，N-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)，NVP-1000型隔膜真空泵(上海爱朗仪器有限公司)，暗箱式紫外透射仪(上海宝山顾村电光仪器厂)。
色谱柱填料：Sephadex LH-20(Parmacia Biotech)、柱层析用硅胶H(100-200目，200-300目)、薄层层析硅胶(10-40μm)(青岛海洋化工厂)。甲醇(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司)，所用分析纯试剂(甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)均为天津市富宇精细化工有限公司及天津市致远化学试剂有限公司生产。
显色剂：茴香醛-浓硫酸-乙醇(体积比为4:8:400)。
药材：木贼麻黄购自新疆西域漠草中药材开发有限公司。经河南中医药大学董诚明鉴定为中药木贼麻黄(Ephedra equisetina Bge.)的干燥草质茎。
本发明提取得到的酰胺类生物碱化合物EB-A，具有治疗过敏性哮喘的作用，有效用于治疗过敏性哮喘药物中，并经过多次反复试验均取得了相同或近似的结果，有关资料如下：
一、结构鉴定
本发明提取的酰胺类生物碱化合物EB-A为黄色无定形粉末，茴香醛-浓硫酸105℃加热显橙红色。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 216[M+Na]+，(calcd.For C11H15NO2Na)，确定其分子式为C11H15NO2。如图2、3所示，由1H-NMR谱低场区δH：7.41(2H,d,J＝7.3Hz)，7.30(2H,t,J＝7.4Hz)，7.22(1H,t,J＝7.2Hz,H-4)结合13C-NMR谱中δC：143.6，129.0，128.2，127.4四个碳信号，确定该化合物中存在单取代类型的苯环；此外，在低场区δH：4.67(1H,d,J＝4.8Hz)以及4.10(1H,m)提示该结构中应含有连有吸电子基团的氢质子信号，高场区δH：1.87(3H,s)以及1.03(3H,d,J＝6.8Hz)为两个甲基氢质子信号；见图3所示，13C-NMR谱中有一个δC：172.5，提示该结构中含有酰胺键。根据以上信息，鉴定该化合物为N-(2-hydroxy-1-methyl-2-phenylethyl)acetamide(EB-A)，该化合物首次从木贼麻黄(植物)中提取得到，分子结构式为：
化合物EB-A的1H-NMR(500MHz，CD3OD)和13C-NMR(125MHZ，CD3OD)数据归属见下表1所示。
表1数据归属表
No. δH(J,Hz) δC No. δH(J,Hz) δC
1 - 143.6 8 4.10(1H,m) 52.2
2,6 7.41(2H,d,7.3) 127.4 9 1.03(3H,d,6.8) 14.6
3,5 7.30(2H,t,7.4) 129.0 11 - 172.5
4 7.22(1H,t,7.2) 128.2 12 1.87(3H,s) 22.6
7 4.67(1H,d,4.8) 76.7
二、体内外实验
2.1实验动物
SPF级BALB/c小鼠50只，雌性，体重18-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2021-0006)。实验小鼠安置于河南中医药大学标准化饲养动物房，相对湿度40％～60％，温度(23±2)℃，12h光照/12h黑暗周期中自由进食和饮水。动物实验经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号DWLL2018080003)。
2.2实验细胞
大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株(RBL-2H3)和人支气管上皮细胞系(16HBE)均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)的体外分离培养见下述实验方法3.10免疫印迹分析。
2.3实验药物与试剂
醋酸地塞米松，购自浙江仙琚制药股份有限公司(阳性对照药，批号：180102)；卵清白蛋白II级(批号：A5253)、卵清白蛋白V级(批号：A5503)、Compound 48/80(批号：C2313)、脂多糖(LPS)(批号：L2880)、4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖(批号：N9376)，购自美国Sigma公司；InjectTM明矾佐剂(批号：77161)，购自美国Thermo FisherScientific公司；PAR2活化肽(批号：HY-P0283)、AZ3451(批号：HY-112558)，购自美国MedChemExpress公司；胎牛血清(批号：1011-881)，购自四季青浙江天杭生物科技有限公司；DMEM高糖培养基(批号：2082064)、RPMI-1640培养基(批号：31800022)，购自GibcoInvitrogen公司；氨苄青霉素钠(批号：A8180)、硫酸链霉素(批号：S8290)、红细胞裂解液(批号：R1010)、台式液(批号：T1421)，购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠GM-CSF(批号：315-03)，购自美国Peprotech公司。
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I凋亡检测试剂盒(批号：559763)购买于美国BD Biosciences公司；活性氧检测试剂盒(批号：CA1410)、全蛋白提取试剂盒(批号：BC3710)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：PC0020)，购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠免疫球蛋白E(IgE)(批号：MM-0056M1)、组胺(HIS)(批号：MM-0548M1)、白三烯C4(LTC4)(批号：MM-0395M1)、前列腺素D2(PGD2)(批号：MM-43727M1)、白介素-4(IL-4)(批号：MM-0165M1)、白介素-5(IL-5)(批号：MM-0164M1)、白介素-10(IL-10)(批号：MM-0176M1)、白介素-13(IL-13)(批号：MM-0173M1)、γ-干扰素(IFN-γ)(批号：MM-0182M1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(批号：MM-0132M1)、肥大细胞β类胰蛋白酶(β-MCT)(批号：MM-46274M1)、肥大细胞蛋白酶(mMCP-1)(批号：MM-45085M1)ELISA试剂盒，购自江苏酶免生物科技有限公司。
TSLP(货号：ab47943)、PAR2(货号：ab180953)，购自英国Abcam公司；TPSAB1(货号：13343-1-AP)、GM-CSF(货号：17762-1-AP)、IL-33(货号：66235-1-Ig)、Anti-Mouse CD11cPE(货号：65130)，购自武汉Proteintech公司；Anti-Mouse MHC Class II FITC(货号：11-5321-81)、Anti-Mouse CD11c FITC(货号：11-0114-81)、Anti-Mouse CD80 APC(货号：17-0801-81)、Anti-Mouse CD86 FITC(货号：11-0860-82)、Anti-Mouse CD40 PE(货号：12-0401-81)、Anti-Mouse CD4 FITC(货号：11-0041-82)、Anti-Mouse CD25 PE(货号：12-0251-83)、Anti-Mouse Foxp3 APC(货号：17-5773-82)，购自美国eBioscience公司。
2.4实验仪器
402A1型超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；YLS-8A型多功能诱咳引喘仪(济南益延科技发展有限公司)；BD FACS Aria III流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)；SORVALL ST16R Centrifuge5810R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；BioTek多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司)；二氧化碳3111型培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；ECLPSE TS100倒置显微镜(日本Nikon公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；；转膜仪(美国Bio-Rad公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Odyssey双色红外荧光成像仪(美国LI-COR公司)。
三、实验方法
3.1动物实验
将6-7周龄的BALB/c雌鼠适应性喂养3d后，随机分为5组，即正常对照组(NC)、模型组(OVA)、阳性药地塞米松组(Y)、EB-A低剂量组(Low)及EB-A高剂量组(High)，每组10只。
如图4A所示，采用OVA和氢氧化铝凝胶腹腔注射及OVA雾化激发方法建立过敏性哮喘小鼠模型。除正常对照组外，在第0、7、14天分别给予其余实验小鼠腹腔注射鸡卵白蛋白(OVA)与氢氧化铝(Al2(OH)3)混悬液0.2mL致敏(OVA 50μg，Al2(OH)3 2mg溶于0.2mL无菌生理盐水)，第21天至27天分别给予溶于生理盐水的1％ OVA进行雾化激发(100mg OVA溶于10mL生理盐水)，30min/次/d。模型组、阳性药地塞米松组、EB-A低剂量组及EB-A高剂量组在激发前30min分别给予等体积生理盐水、醋酸地塞米松(0.5mg/kg)、EB-A(10mg/kg)及EB-A(20mg/kg)。正常对照组在第0、7、14天分别给予每只小鼠腹腔注射氢氧化铝(Al2(OH)3)混悬液0.2mL致敏(Al2(OH)3 2mg溶于0.2mL无菌生理盐水)，第21天至27天分别给予生理盐水雾化激发30min，激发前30min给予等体积生理盐水。末次雾化激发24h后，检测各组小鼠肺功能并收集样本。
3.2咳喘指标检测
末次激发24h后，将小鼠放置于多功能诱咳引喘仪的气雾箱中，用25％氨水喷雾诱咳15s取出，以小鼠腹肌收缩，同时张嘴为标准，观察小鼠从喷雾开始至第一次张口咳嗽的时间，即小鼠的咳嗽潜伏期，记录小鼠的咳嗽潜伏期及2min内咳嗽次数。
类似地，以0.1％的磷酸组胺和2％的氯化乙酰胆碱等量混合液喷雾致喘，观察小鼠从喷雾开始到出现气短喘促的时间，即小鼠的引喘潜伏期。记录小鼠的引喘潜伏期及2min内喘息次数。
3.3气道反应性检测
末次激发24h后，将小鼠依次放入FinePointe WBP体积描记腔中，用PBS调整基线值，记录基础值约2min。随后每只小鼠给予倍数递增浓度(0、3.125mg/mL、6.25mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL、50mg/mL)的乙酰甲胆碱(Mech)雾化吸入，每个剂量雾化30s，连续记录5min。测量不同浓度下的肺功能变化及气道反应性(Penh)。
3.4血清及肺泡灌洗液样本的收集
气道反应性检测完成后，采取摘眼球法取血，4000rpm离心10min，获得血清样本，-80℃保存备用。采血后行气管插管取支气管肺泡灌洗液(BALF)，用无菌生理盐水灌洗全肺3次，0.5mL/次。4000rpm离心10min，收集上清，置于-80℃保存备用。
3.5肺组织病理学评估
每组随机选择3只小鼠，取未经灌洗的左肺及气管，浸泡于4％多聚甲醛中固定24h，分别进行H&E、PAS及Masson染色。
3.6原代肺细胞ROS及凋亡水平检测
每组随机挑选3只小鼠，迅速解剖小鼠取出肺脏，将脏器上血迹漂洗干净拭干，取适量肺组织于1.5mL离心管中剪碎，加入1mL胰酶消化20～30min至细胞呈黏液状，加入血清终止消化。过滤收集滤液，1200rpm/min离心5min。离心结束后，缓缓倒掉上清液，得到原代肺细胞。制备单细胞悬液，之后按照活性氧检测试剂盒和PE Annexin V ApoptosisDetection Kit I凋亡检测试剂盒要求处理细胞，并用流式细胞检测仪进行检测分析。
3.7相关细胞因子水平的检测
参照试剂盒说明书，ELISA法检测血清中的IgE、PGD2、HIS和L TC4，以及血清和BALF中的IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、INF-γ、TNF-α、mMCP-1和β-MCT的水平。
3.8流式细胞术检测小鼠外周血及肺组织中树突状细胞和调节性T细胞的水平
采用摘眼球法取小鼠外周血，分取血浆各100μL于流式管中，标记为DCs和Tregs。分别用PE-CD11c、FITC-CD86抗体标记DCs细胞，用FITC-CD4、PE-CD25、APC-Foxp3抗体标记Tregs细胞。每管加入对应外标抗体避光孵育30min，之后加入1×红细胞裂解液，裂解约10min至液体澄清，300×g离心5min，弃上清，加入2mL PBS重悬，重复洗涤两次。每管加入1mL破膜固定工作液重悬细胞，室温避光孵育45min；每管加入2mL 1×破膜缓冲液，500×g离心5min，弃上清；用100μL 1×破膜缓冲液重悬细胞，加入对应内标抗体(APC-Foxp3抗体)避光孵育30min，之后每管加入300μL PBS重悬细胞并上机检测。
小鼠原代肺细胞单细胞悬液的制备参照方法3.5，检测步骤同上。
3.9肺组织免疫荧光染色
取肝组织石蜡切片，脱蜡至水，抗原修复。将切片用无血清蛋白封闭液处理后，加入一抗[TPSAB1(1:200)，PAR2(1:200)，GMCSF(1:200)，IL-33(1:200)，TSLP(1:200)，4℃孵育过夜；次日，加入相应的荧光标记二抗[山羊抗兔IgG(1:300，GB21303，Servicebio)或山羊抗小鼠IgG(1:300，GB21301，Servicebio)]，室温孵育1h；随后用含DAPI的VECTASHIELD固定液染细胞核。在激光共聚焦显微镜(Nikon Eclipse C1)下观察，并利用Nikon DS-U3系统获得荧光图像。
3.10免疫印迹分析
进行蛋白质印迹分析以检测TPSAB1(1:1500)、PAR2(1:1000)、GM-CSF(1:1000)、IL-33(1:1000)和TSLP(1:1000)的表达水平。使用全蛋白质提取试剂盒从肺组织中提取蛋白质，并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。将每组40μg蛋白质样品加载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶中进行电泳分离，之后将目的蛋白转印到PVDF膜上，室温下封闭1.5h，加入待测一抗，4℃孵育过夜；次日，加入相应的荧光二抗(1:30000)，室温孵育1h。采用Odyssey双色红外荧光成像系统扫描成像，并用Image Studio软件对蛋白质密度进行定量分析。
3.11小鼠骨髓源性树突状细胞的体外分离培养
(1)将BALB/c小鼠采用颈椎脱臼法处死后，浸泡在75％酒精中约3-5min，取出小鼠，于无菌条件下用镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪开皮肤并分离。剥离下肢皮肤，游离出小鼠的两条下肢，小心剥离下肢的肌肉，获取双侧股骨及胫骨，放入直径10cm无菌培养皿中，使用RPMI-1640培养基浸泡。
(2)仔细剔除骨周围软组织，并将骨放入新的无菌培养皿中，用剪刀剪去两端骨骺，使用1mL注射器吸取RPMI-1640培养基，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓，直至骨变白。
(3)骨髓细胞悬液经200目(70μm)滤网过滤，除去组织碎片，收集骨髓细胞悬液至15mL离心管中。用RPMI-1640培养基冲洗培养皿，尽可能多地收集骨髓细胞。
(4)1200rpm离心5min，弃上清，加入3-4mL 37℃预温的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温静置2-4min，去除红细胞。按1:9的体积比加入无菌PBS终止裂解。
(5)1200rpm离心5min，弃上清，再用无菌PBS冲洗细胞一次。
(6)用配制好的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，细胞计数板计数。
(7)使用含20ng/mL GM-CSF、10％ FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为2×10^5cells/mL，接种于培养皿中，10mL/皿，置于37℃、5％CO2培养箱培养。此为BMDC培养的第0天。
(8)第3天时首次换液，向每皿细胞中再加入10mL含有20ng/mL GM-CSF的RPMI-1640完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(9)第6天时半量换液，缓慢吸取上层细胞悬液10mL，再加入10mL含有20ng/mL GM-CSF的RPMI-1640完全培养基，轻轻晃动培养皿，使培养基适当混合均匀，置于37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(10)第8天时收获BMDC，轻轻晃动培养皿，缓慢吹打，将细胞收集至无菌离心管中，并用无菌PBS轻轻吹打洗皿2遍，合并细胞悬液，1200rpm离心5min，获得BMDC，进行下一步实验研究。
3.12RBL-2H3细胞脱颗粒实验
3.12.1脱颗粒水平检测
将处于对数生长期的RBL-2H3细胞以5×104cells/mL接种于24孔细胞培养板中。培养24h后，分为正常对照组(NC)、模型组(M，C48/80，20μg/mL)、不同浓度EB-A组(20μg/mLC48/80+1μM、10μM、20μM、40μM、80μM EB-A)、总酶组(TE，1％ Triton X-100)。在37℃，5％CO2培养箱中孵育30min后，离心，取上清液以测量β-氨基己糖苷酶(β-Hex)和组胺(HIS)的释放。
β-Hex释放率的测定：取50μL细胞上清，加入50μL 1m mol/L的β-氨基己糖苷酶底物溶液，37℃孵育1h，加入150μL Na2CO3/NaHCO3终止液终止反应，酶标仪405nm下检测吸光度，计算β-Hex释放率。(计算公式：β-Hex释放率＝(实验组上清OD值-空白孔上清OD值)/(总酶孔上清OD值-空白孔上清OD值)×100％)
HIS释放率的测定：严格按照试剂盒说明书，ELISA法检测RBL-2H3细胞的HIS释放率。
3.12.2中性红染色
对3.12.1中取过上清的细胞，用4％甲醛固定，400μL/孔，随后用0.5％的中性红染液进行染色，300μL/孔，室温条件下染色10min。弃去染液，PBS洗两遍后，于倒置显微镜下观察并拍照。
3.13 16HBE-BMDCs细胞共培养实验
3.13.1PAR2激活条件筛选
将处于对数生长期的16HBE细胞以3×104cells/mL接种于96孔板中，200μL/孔，待细胞贴壁生长后，用无血清培养基继续培养24h。实验分组：(1)正常对照组(NC)：不予任何处理；(2)PAR2激活肽处理组(PAR2-AP)：给予不同浓度的PAR2-AP(10mM、50mM、100mM、250mM、500mM)。作用24h后，利用In-cell western法检测PAR2的表达。
3.13.2EB-A对16HBE细胞中PAR2激活的干预
将处于对数生长期的16HBE细胞以3×104cells/mL接种于96孔板中，200μL/孔，待细胞贴壁生长后，用无血清培养基继续培养24h。实验分组：(1)正常对照组(NC)：不予任何处理；(2)PAR2激活肽处理组(PAR2-AP)：给予500mM PAR2-AP；(3)EB-A干预组：给予10μMEB-A。作用24h后，利用In-cell western法检测PAR2的表达。
3.13.3 16HBE-BMDCs细胞共培养
利用Transwell小室与24孔培养板构建共培养体系。首先，将处于对数生长期的16HBE细胞接种于24孔培养板(下室)中，每孔细胞量为1×104cells/孔，600μL/孔，待细胞贴壁生长后，用无血清培养基继续培养24h。PAR2-AP处理12h激活16HBE细胞中PAR2，AZ3451或EB-A处理组需预处理1h。随后，将上述3.11中培养第8天的BMDCs以浓度为1×106/mL接种于Transwell小室(上室)中，100μL/孔。注意上、下室界面处不要有气泡。共培养48h后利用流式细胞术进行上室中BMDCs的表型检测。
3.13.4流式细胞术检测BMDCs表面共刺激分子的表达情况
(1)缓慢吹打收集Transwell小室(上室)中的BMDCs至流式管，用无菌PBS清洗培养板孔2遍，并收集至对应的流式管中。
(2)1200rpm离心5min，弃上清。
(3)每管加入200μL含有2％ FBS的PBS封闭液，4℃避光反应30min(封闭非特异性抗体的Fc段)。
(4)反应完毕后，按下列表2方案分别加入抗体进行染色。
表2染色方案
(5)室温避光孵育30min，期间每10min轻弹流式管底部，防止细胞聚集导致染色不充分。
(6)向每管样本中加入2mL PBS，混匀，1200rpm离心5min，弃上清，重复此步骤2次。
(7)向每管样本中加入300μL PBS，重悬细胞，并于4h内用流式细胞仪进行检测。
3.14分子对接
EB-A的2D/3D结构由Chemoffice软件制备。从数据库(https://www.rcsb.org/)中获得受体蛋白PAR2(PDB ID:5NDD)的晶体结构。使用AutoDock Vina软件进行分子对接，并使用Discovery Studio Visualizer软件将对接结果进行可视化处理。
3.15统计方法
实验数据以表示，SPSS 20.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)统计处理。使用GraphPad Prism 8.0(GraphPad Software Inc.，美国)呈现所有统计分析结果。
四、实验结果
4.1EB-A对OVA诱导的过敏性哮喘典型表型的改善
与NC组小鼠相比，OVA组小鼠气道反应性(Penh)、咳喘次数及血清中PGD2的水平均显著增加(P<0.01)，咳喘潜伏期明显缩短(P<0.001，或P<0.05)；与模型组相比，EB-A干预显著阻止了这种变化(P<0.001，P<0.01或P<0.05)(见图4B–E)。此外，OVA组小鼠的血清总IgE水平显著高于NC组(P<0.01)，而Y组和EB-A低、高剂量组的血清总IgE水平显著低于OVA组(P<0.01)(见图4F)。此外，肺组织病理学分析显示过敏性哮喘小鼠的肺组织出现了明显的炎性细胞浸润和胶原沉积(P<0.001)；而EB-A干预后以上情况明显改善(P<0.001)(见图4G)，提示EB-A显著改善了OVA诱导的过敏性哮喘的典型特征。
图4中，A.OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型构建的示意图；B.气道高反应性(n＝3)；C.血清中PGD2水平(n＝6)；D–E.小鼠咳喘次数及潜伏期(n＝6)。F.血清中IgE水平(n＝6)。G.肺组织HE和Masson染色及评分。黄色箭头所指代表病变部位。与NC组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与OVA组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
4.2EB-A对OVA诱导的过敏性哮喘小鼠肺组织损伤和炎症的影响
为了进一步评估EB-A对哮喘小鼠肺组织损伤和炎症的影响，本发明检测了原代小鼠肺组织细胞的凋亡和ROS水平，以及血清和BALF中多种细胞因子的水平。结果显示，与NC组相比，过敏性哮喘小鼠原代肺组织细胞的凋亡和ROS水平均显著增加(P<0.001)，而EB-A干预显著降低了凋亡和ROS的水平(P<0.01)(见图5A-B)。此外，ELISA法检测血清和BALF中的细胞因子水平的结果显示，与NC组相比，OVA组小鼠血清及BALF中除IFN-γ和IL-10的水平下调之外，IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α的水平均显著上调(P<0.001、P<0.01或P<0.05)；与OVA组相比，Y组和EB-A低、高剂量组的IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α水平显著下降，而IFN-γ和IL-10水平显著升高(P<0.001、P<0.01或P<0.05)(见图5C-H)，提示EB-A能够减轻OVA诱导的过敏性哮喘小鼠的肺组织损伤和炎症。
图5中，A.原代肺细胞凋亡流式图及量化结果(n＝3)；B.原代肺细胞ROS流式图及量化结果(n＝3)；C-H.依次为血清及BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α和IL-10的水平。与NC组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与OVA组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
4.3EB-A对过敏性哮喘小鼠肺组织中PAR2活化的影响
PAR2是气道上皮细胞表达的参与过敏性气道炎症反应的一种模式识别受体。在本发明中，研究EB-A对过敏性哮喘小鼠肺组织中PAR2活化，及其下游相关效应分子，包括GM-CSF，IL-33和TSLP的表达水平的影响。结果显示，与NC组相比，OVA组小鼠肺组织中PAR2被激活，且GM-CSF，IL-33和TSLP的水平明显增加(P<0.001，或P<0.01)；而EB-A干预使小鼠肺组织中PAR2的激活被显著抑制，GM-CSF、IL-33和TSLP的水平也显著下降(P<0.001，P<0.01，或P<0.05)(见图6A-B)。为了进一步研究EB-A和PAR2之间的分子间相互作用，对PAR2和EB-A进行了分子对接，结果如图6C所示，EB-A以氢键、静电和疏水相互作用等与PAR2中的拮抗剂结合口袋相互结合。提示EB-A干预抑制了肺组织中PAR2的活化，且EB-A可能是一种潜在的PAR2拮抗剂。
图6中，A.肺组织中PAR2、GM-CSF、IL-33和TSLP的免疫荧光图；B.肺组织中PAR2、GM-CSF、IL-33和TSLP的免疫印迹图及量化结果；C.EB-A与PAR2的结合构象。与NC组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与OVA组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
4.4EB-A对过敏性哮喘小鼠体内树突状细胞成熟的影响
树突状细胞在适应性免疫反应和免疫病理学的启动和指导中起着核心作用，并最终决定了慢性疾病的严重程度。在炎症环境中，树突状细胞(DC)趋于成熟，成熟的树突状细胞(mDCs)表面共刺激分子的表达上调，其免疫原性增强。为了评估EB-A在DC成熟中的作用，本发明利用流式细胞术检测了小鼠外周血(PB)和肺组织中树突状细胞的水平，还检测了调节性T细胞(Treg)的水平以评估抑制DC成熟对免疫耐受的后续影响。如图7所示，OVA致敏后，EB-A干预抑制了DC成熟，增加了Treg分化(P<0.001，P<0.01，或P<0.05)。
图7中，A.小鼠肺组织中DCs和Tregs的流式图及量化结果；B.小鼠外周血中DCs和Tregs的流式图及量化结果。与NC组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与OVA组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
4.5EB-A对肥大细胞活化脱颗粒的影响
研究表明，肥大细胞及其介质与哮喘和过敏的发病机制有关。在本发明中，研究了EB-A对小鼠肺组织中MCs活化的影响。甲苯胺蓝染色显示，在正常小鼠肺组织中几乎看不到MCs，而在OVA诱导的过敏性哮喘小鼠肺组织中观察到MCs和肺间质中分散的染色颗粒(P<0.001)(见图8A)。此外，如图8B-G所示，血清和BALF中肥大细胞蛋白酶1(mMCP-1)和β-胰蛋白酶(β-MCT)水平、血清中组胺和LTC4水平以及哮喘小鼠肺组织中TPSAB1的表达均显著增加；而EB-A干预明显抑制了MCs的活化(P<0.001，P<0.01，或P<0.05)。此外，通过体外构建Compound 48/80(C48/80)诱导RBL-2H3细胞脱颗粒模型模拟体外肥大细胞脱颗粒现象，进一步验证EB-A对肥大细胞活化的影响。结果如图8H-J所示，与NC组相比，C48/80刺激后，RBL-2H3细胞形态由梭变圆，β-Hex和组胺释放率明显增加；而EB-A干预显著抑制了RBL-2H3细胞的脱颗粒现象(P<0.001，P<0.01，或P<0.05)，提示EB-A在体内外均可抑制肥大细胞的活化和脱颗粒。
图8中，A.肺组织甲苯胺蓝染色图及肥大细胞计数结果；BC.血清和BALF中mMCP-1和β-MCT水平；D.肺组织中TPSAB1的免疫荧光图；E.肺组织中TPSAB1的免疫印迹图及量化结果；FG.血清和BALF中HIS和LTC4的水平；H.中性红染色图；I.RBL-2H3细胞β-Hex释放率；J.RBL-2H3细胞HIS释放率。与NC组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与OVA组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
4.6体外验证EB-A抑制树突状细胞成熟的机制
为了探讨肺上皮细胞PAR2活化对DC成熟的影响以及EB-A的干预作用，本发明建立了16HBE-BMDCs体外细胞共培养体系。如图9A–B所示，在500mM的浓度下，PAR2激活肽(PAR2-AP)显著促进16HBE细胞中PAR2的表达(P<0.001)，而在该浓度下，给予EB-A干预能够明显抑制PAR2的表达(P<0.01)。在共培养体系中，PAR2的激活显著刺激了树突状细胞表面标志物(MHC Class II、CD40、CD80和CD86)的表达(P<0.001或P<0.01)；而EB-A干预显著抑制了MHCClass II、CD40、CD80和CD86的表达(P<0.001，P<0.01，或P<0.05)(见图9C)，提示EB-A可能通过抑制PAR2激活来阻止DC成熟。
图9中，A.In-cell western法检测不同浓度PAR2-AP对16HBE细胞中PAR2表达的影响；B.In-cell western法检测EB-A对16HBE细胞中PAR2表达的影响；C.流式细胞术设门逻辑图；DG.共培养体系中BMDCs表面标志物(MHC Class II、CD40、CD80和CD86)的水平。与NC组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与OVA组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
本发明首次发现并证实了从木贼麻黄中提取的一个酰胺类生物碱化合物N-(2-hydroxy-1-methyl-2-phenylethyl)acetamide(EB-A)的平喘活性，并对其平喘机制进行了研究。通过建立OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型，研究EB-A对过敏性哮喘的干预作用。地塞米松主要用于过敏性和自身免疫性炎症疾病，因此在本发明中被用作阳性对照药物。体内实验结果表明，EB-A干预改善了过敏性哮喘小鼠所表现出的典型特征，如血清总IgE水平的升高、肺部炎症、气道高反应性、气道重塑和肺损伤。此外，从肺和气管的病理切片可以清楚地看出，EB-A可以显著抑制小鼠气道重塑和气管平滑肌的增殖。
在哮喘发作期间，气道上皮在结构和功能上出现异常，并且更容易受到吸入性刺激的影响。在针对特定过敏原的致敏过程中，先天和适应性免疫系统的几种细胞类型以及各种配体-受体相互作用被触发。已经有研究证明了PAR2活化与过敏性气道炎症的发展有关。同样，在本发明中也观察到了PAR2的激活和下游炎症信号的产生，而EB-A干预显著抑制了PAR2的激活，改善了肺组织的损伤和炎症，进而保护了肺上皮屏障。当上皮屏障受损时，过敏原易穿过受损的上皮屏障并被位于气道中的树突状细胞(DC)内化。树突状细胞在炎症环境中具有很强的识别和捕获抗原的能力，是唯一能够刺激幼稚T细胞活化和增殖的专职APC。此外，树突状细胞还可以促进免疫耐受，该效应部分是通过控制调节性T细胞(Treg)实现的，这对于抑制自身免疫和慢性炎症至关重要。已有大量实验证据表明，未成熟的树突状细胞(iDC)本身可以将传统的幼稚T细胞转化为Treg表型或促进现有Treg的功能。在本发明中同时测量了小鼠外周血和肺组织中DC和Treg的水平，发现EB-A处理抑制了DC成熟，同时增加了Treg分化，表明EB-A能够抑制过敏性哮喘小鼠体内树突状细胞的成熟，并促进机体免疫耐受的形成。
肥大细胞(MC)起源于造血干细胞，在血液和淋巴系统中循环，并迁移到粘膜组织(如上皮细胞、腺体、平滑肌细胞等)，然后在组织特异性微环境的作用下发育成熟。肥大细胞被认为是与哮喘慢性过敏性炎症相关的长期病理生理变化和组织重塑的关键驱动因素。当身体二次暴露于相同的过敏原时，MC表面的高亲和力IgE受体(FcRI)与多价抗原相互交联，并迅速导致肥大细胞活化和大量过敏介质的释放。本发明考察了EB-A在体内和体外对MC活化的影响，并且发现EB-A能够显著抑制肥大细胞活化和脱粒。
过敏原可以通过病原体相关的分子模式直接激活树突状细胞，也可以通过作用于气道上皮细胞间接激活树突状细胞。在本发明实验中观察到PAR2活化和DC成熟的变化方向是一致的。为了研究肺上皮细胞中PAR2活化对DC成熟的影响，以及EB-A在其中发挥的作用，构建了16HBEBMDCs细胞共培养体系。结果证实，PAR2的激活刺激了树突状细胞，使其趋向成熟；并且在EB-A干预后，DC成熟受到抑制。这些结果表明，EB-A可能通过抑制PAR2活化来阻止树突状细胞的成熟。
综上所述，本发明首次从木贼麻黄中提取分离得到了一种具有抗哮喘活性的酰胺类生物碱(EB-A)，并通过体内外实验证明了其对过敏性哮喘小鼠肺部损伤和炎症的改善，以及对树突状细胞成熟和肥大细胞活化的抑制。此外，分子对接和体外细胞共培养实验表明EB-A抗哮喘活性的分子机制可能是由PAR2介导的。本发明为阐明木贼麻黄的活性成分提供了有力的实验证据，也有助于麻黄药效成分的完整解析，是提取酰胺类生物碱EB-A上的一大创新，社会和经济效益巨大。

Claims (3)

1.一种从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱EB-A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取木贼麻黄的干燥草质茎进行粉碎，以木贼麻黄10倍重量体积、质量浓度70%的乙醇溶剂回流提取4次，每次1.5 h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩浸膏；
（2）将浓缩浸膏用纯水分散溶解，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及纯水部位；
（3）将二氯甲烷部位经硅胶柱层析，依次用石油醚：丙酮的体积比为50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100及质量浓度100%甲醇梯度洗脱，得9个洗脱部位Fr.1~Fr.9；
（4）将Fr.7的浓缩液经过硅胶柱层析，依次用CH2Cl2 : MeOH = 20:1、10:1、5:1洗脱，得4个洗脱部位Fr.7-1~Fr.7-4；然后将Fr.7-3的浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用质量浓度80%的甲醇洗脱，得3个洗脱部位Fr.7-3-1~Fr.7-3-3；将Fr.7-3-2的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2 : MeOH = 50:1、20:1、10:1、5:1进行洗脱，得到5个洗脱部位Fr.7-3-2-1~Fr.7-3-2-5；将Fr.7-3-2-2的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2：MeOH = 30:1进行洗脱，得到2个洗脱部位Fr.7-3-2-2-1~Fr.7-3-2-2-2；将Fr.7-3-2-2-2的浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用质量浓度70%的甲醇洗脱，得到3个洗脱部位Fr.7-3-2-2-2-1~Fr.7-3-2-2-2-3；将Fr.7-3-2-2-2-1的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2：MeOH = 25:1进行洗脱，得到2个洗脱部位Fr.7-3-2-2-2-1-1~Fr.7-3-2-2-2-1-2；将Fr.7-3-2-2-2-1-2用C18 ODS RP-HPLC分离纯化，浓缩干燥，得到酰胺类生物碱EB-A，保留时间为tR = 26.4 min。
2.根据权利要求1所述的从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱EB-A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取35.0 kg木贼麻黄的干燥草质茎进行粉碎，以木贼麻黄10倍重量体积、质量浓度70%的乙醇溶剂回流提取4次，每次1.5 h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩浸膏8.84kg；
（2）将浓缩浸膏用纯水分散溶解，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，得石油醚部位0.87 Kg、二氯甲烷部位0.99 Kg、乙酸乙酯部位0.64 Kg、正丁醇部位1.31 Kg以及纯水部位5.04 Kg；
所述石油醚萃取条件为：5 L石油醚萃取10次，每次4h，二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取条件与石油醚相同；
（3）将二氯甲烷部位经硅胶柱层析，依次用石油醚：丙酮的体积比为50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100及质量浓度100%甲醇梯度洗脱，得9个洗脱部位Fr.1~Fr.9；
（4）将Fr.7的浓缩液经过硅胶柱层析，依次用CH2Cl2 : MeOH = 20:1、10:1、5:1洗脱，得4个洗脱部位Fr.7-1~Fr.7-4；然后将Fr.7-3的浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用质量浓度80%的甲醇洗脱，得3个洗脱部位Fr.7-3-1~Fr.7-3-3；将Fr.7-3-2的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2 : MeOH = 50:1、20:1、10:1、5:1进行洗脱，得5个洗脱部位Fr.7-3-2-1~Fr.7-3-2-5；将Fr.7-3-2-2的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2：MeOH = 30:1进行洗脱，得2个洗脱部位Fr.7-3-2-2-1~Fr.7-3-2-2-2；将Fr.7-3-2-2-2的浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用质量浓度70%的甲醇洗脱，得3个洗脱部位Fr.7-3-2-2-2-1~Fr.7-3-2-2-2-3；将Fr.7-3-2-2-2-1的浓缩液经硅胶柱层析，用CH2Cl2：MeOH = 25:1进行洗脱，得2个洗脱部位Fr.7-3-2-2-2-1-1~Fr.7-3-2-2-2-1-2；将Fr.7-3-2-2-2-1-2用C18 ODS RP-HPLC分离纯化，浓缩干燥，得到酰胺类生物碱EB-A 47.0 mg，保留时间为tR = 26.4 min。
3. 根据权利要求1或2所述的从木贼麻黄中提取得到的酰胺类生物碱EB-A的制备方法，其特征在于，所述的C18 ODS RP-HPLC制备的条件为5 μm，250×10 mm，55%甲醇，3 mL/min。
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