CN115429787A - 淫羊藿中黄酮衍生物及其药物组合物的免疫增敏用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开5种从淫羊藿中提取分离的黄酮衍生物及其药物组合物在制备免疫增敏药物中的应用，特别是制备疫苗的免疫增敏药物和单链RNA病毒感染性疾病的免疫增敏治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及淫羊藿中黄酮衍生物在制备免疫增敏药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
病毒是一类非细胞生物，可以通过多种途径感染宿主细胞，完成增殖和传播。病毒感染人体会导致严重的疾病，可以损伤各种靶器官甚至导致死亡。病毒感染性疾病一直是对人类健康的重大挑战，在历史上多种因病毒感染引起的疾病给人类带来了巨大的伤亡和灾难。虽然因为卫生条件的改善、医药科技的进步和疫苗的应用，很多病毒感染性疾病得到了有效控制，但是随着人类的远距离迁移、更频繁的人际交流以及城市化导致的人口密度的增加，通过呼吸道和密切接触传播的病毒感染性疾病却仍频繁爆发。
在病毒感染性疾病疫情防控中，除了控制传染源和阻断传播途径外，开发预防性疫苗接种易感人群，在人体诱导病毒抗原特异的适应性免疫反应，是保护易感人群最为重要的手段。例如在新冠病毒肺炎疫情防控中，自从新冠病毒肺炎疫情爆发及完成病毒鉴定和RNA测序后，灭活新冠病毒疫苗、重组亚单位新冠疫苗、mRNA新冠疫苗和腺病毒载体新冠疫苗迅速进入开发阶段。截止2021年4月30日，中国国家药品监督管理局已经批准两种灭活新冠病毒疫苗和一种腺病毒载体新冠疫苗上市，俄罗斯公共卫生部及英国药品和保健产品监管署也各批准上市了一种腺病毒载体新冠疫苗，美国食品药品监督管理局批准了两种mRNA新冠疫苗上市，另外多种重组亚单位新冠疫苗也处于临床试验阶段。根据已有的报道，目前新冠病毒疫苗虽然能够对易感人群发挥保护作用，但是仍然存在着保护效力低或安全风险大的缺陷，并且长期使用还存在因病毒基因突变失效的风险。特别是灭活新冠病毒疫苗和重组亚单位新冠疫苗，具有免疫原性较弱的缺陷，需要增强免疫原性以提高疫苗保护效力。为了防控病毒感染性疾病，其它很多抗病毒疫苗也同样亟需在保障具有良好安全性的前提下，提高免疫原性和保护效力。
对于病毒感染性疾病的治疗，除对症支持治疗外，主要通过康复患者血浆中和病毒、直接抗病毒和免疫增强等方面进行治疗。病毒感染性疾病康复患者血浆中含有较高浓度病毒中和抗体，可以有效治疗病毒感染性疾病，但是难以获得足够血浆用于临床治疗，另外血浆疗法有传染其它传染病的风险。直接抗病毒药物是治疗病毒感染性疾病的重要手段，但是目前大多数病毒感染性疾病还严重缺乏直接抗病毒药物用于疾病的治疗。免疫增强方面主要利用干扰素-α和干扰素-β增强病毒感染性疾病患者抗病毒免疫反应，促进病毒清除，这类药物在乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎治疗中发挥了一定作用，但因为全身性给药，不良反应较多。因此，寻找新型安全、高效和广谱抗病毒药物对于病毒感染性疾病的治疗具有重要意义。
淫羊藿是小檗科植物淫羊藿的干燥地上部分，属于传统中药材。中国药典记载淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，用于治疗阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛、更年期高血压。根据现代中药药理理论，淫羊藿可能是通过正向调节身体机能和免疫功能发挥这些祛邪扶正的功效。本发明人对广泛存在于淫羊藿中的黄酮衍生物进行了提取分离和结构鉴定，并对它们的免疫调节作用进行了筛选，发现淫羊藿提取物对佛波酯或病原相关分子模式诱导中性粒细胞和树突状细胞活化具有很强的增敏作用，然后通过活性筛选导向的提取分离，分离鉴定了多个黄酮衍生物，5个含量较高的黄酮衍生物具有很强的免疫增敏作用，进一步体内研究发现这些黄酮衍生物中的YYH-3体内给药对疫苗或狂犬病毒诱导的细胞免疫具有增敏作用。因此，这些黄酮衍生物具有制备为免疫增敏药物的潜力，可能能够用于抗病毒疫苗的增敏和病毒感染性疾病的免疫增敏治疗。
发明内容
本发明人经过长期的提取分离和结构鉴定，从淫羊藿中获得大量已知或未知的黄酮衍生物，经过药理筛选和深入的药效学研究，首次发现如下表格的5个已知黄酮衍生物具有对病原相关分子模式诱导天然免疫细胞活化的增敏作用，其中编号YYH-3的化合物具有最强活性。同时本发明首次发现YYH-3对天然免疫细胞中的树突状细胞活化具有更强的增敏作用，并且对Toll-like receptor 7/8(TLR7/8)的配体R848诱导树突状细胞活化具有最强的增敏作用，因而具有对单链RNA病毒诱导抗病毒天然免疫和适应性免疫的增敏作用，并通过体内实验验证了YHY-3的活性。
本发明的目的在于提供选自上述表格中的5个黄酮衍生物在制备免疫增敏药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供含有效剂量上述表格中任一种或多种化合物的药物组合物在制备免疫增敏药物中的应用。
本发明的化合物可根据本领域公知的方法制备。
本发明通过超氧化物测定和流式细胞测定，证明本发明涉及化合物对佛波酯和TLRs诱导中性粒细胞活化具有增敏作用。
本发明通过实时荧光定量聚合酶链反应测定和酶联免疫吸附测定，证明本发明涉及化合物对TLRs诱导巨噬细胞活化具有增敏作用。
本发明通过流式细胞测定、实时荧光定量聚合酶链反应测定和酶联免疫吸附测定，证明本发明涉及化合物对TLRs诱导树突状细胞活化具有增敏作用，同时证明本发明涉及化合物对TLR7/8的配体R848诱导树突状细胞活化具有最强的增敏作用。
本发明通过混合淋巴反应测定，证明化合物YHY-3对异源树突状细胞刺激CD4+T细胞增殖具有增敏作用。
本发明通过卵清蛋白混合弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂免疫小鼠模型，证明YHY-3对卵清蛋白诱导的抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应具有增敏作用。
本发明通过乙型肝炎病毒表面抗原混合弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂免疫小鼠模型，证明YHY-3对乙型肝炎病毒表面抗原诱导的抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应具有增敏作用。
本发明通过灭活狂犬病毒免疫小鼠模型，证明YHY-3对单链RNA病毒诱导抗病毒细胞免疫反应和体液免疫反应具有增敏作用。
本发明通过以上药理学实验证明了本发明涉及化合物及其药物组合物可以对单链RNA病毒诱导树突状细胞活化及抗原提呈发挥增敏作用，进而用于制备免疫增敏药物。
本发明涉及化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。
本发明的化合物或含有它们的药物组合物制备的药物可以单位剂量形式给药，给药途径可为口服、静脉注射、肌肉注射、鼻腔、口腔粘膜、皮肤或直肠等。
本发明的化合物或含有它们的药物组合物制备的药物的给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其它剂型如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明的化合物或含有它们药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围：本发明涉及的化合物的用量为0.1～20mg/Kg体重，可一次服用或分2～4次服用。本发明的化合物或含有它们的药物组合物制备的药物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。
本发明的化合物或含有它们的药物组合物制备的免疫增敏药物可以用于疫苗诱导免疫反应的增敏或直接用于单链RNA病毒感染性疾病的免疫增敏治疗。
本发明的化合物或含有它们的药物组合物制备的药物能够发挥免疫增敏的疫苗，可以是减毒活疫苗、灭活疫苗或含TLR7/8配体为佐剂的灭活疫苗、重组亚单位疫苗、mRNA疫苗。
具体实施方式
以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1：淫羊藿中黄酮衍生物对佛波酯(PMA)诱导中性粒细胞释放超氧化物的增敏作用测定
颈椎脱臼处死8周龄BALB/c小鼠，无菌取小鼠股骨，利用注射器吸取磷酸盐缓冲液(PBS)冲出股骨骨髓细胞，室温300g离心5分钟，去除上清。然后加入红细胞裂解液裂解红细胞，室温300g离心5分钟，去除上清，加入含2％胎牛血清的IMDM培养基清洗细胞，室温300g离心5分钟，再加入含2％胎牛血清的IMDM培养基重悬细胞，调整细胞浓度至5×106/ml。将骨髓细胞悬液接种到96孔培养板中，100μl/孔，然后设置溶媒对照组、药物对照组、模型组、模型+药物组，各组3个复孔，各孔加入20μl WST-8溶液(利用生理盐水配制的5mM溶液)，然后在药物对照组及模型+药物组各孔中加入40μl各种黄酮衍生物溶液(利用培养基配制的50μM溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育15分钟。然后在模型组及模型+药物组各孔中加入40μl PMA溶液(利用培养基配制的250ng/ml溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育1.5小时。利用酶标仪测定450nm波长的光密度值(OD450nm)，结果利用平均值±标准差表示，n＝3。
结果(表1)显示PMA刺激骨髓中的中性粒细胞后，相对溶媒对照组能够显著诱导中性粒细胞释放超氧化物(#P＜0.05 vs Control)，淫羊藿中黄酮衍生物单独处理骨髓中的中性粒细胞，相对溶媒对照组不能诱导中性粒细胞释放超氧化物(P＞0.05 vs Control)，淫羊藿中黄酮衍生物联合PMA处理骨髓中的中性粒细胞，不仅相对溶媒对照组能够显著诱导中性粒细胞释放超氧化物(#P＜0.05 vs Control)，同时相对PMA单独处理组能够显著增加中性粒细胞释放的超氧化物(*P＜0.05 vs PMA)，这表明淫羊藿中黄酮衍生物YYH-1～YYH-5对PMA诱导中性粒细胞释放超氧化物具有显著增敏作用。
表1：淫羊藿中黄酮衍生物对PMA诱导中性粒细胞释放超氧化物的增敏作用测定
实施例2：淫羊藿中黄酮衍生物对R848诱导树突状细胞活化的增敏作用测定
颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，无菌取小鼠股骨，利用注射器吸取PBS冲出股骨骨髓细胞，室温300g离心5分钟，去除上清。然后加入红细胞裂解液裂解红细胞，室温300g离心5分钟，去除上清，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基清洗细胞，室温300g离心5分钟，再加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度至4×106/ml。将骨髓细胞悬液接种到12孔培养板中，1ml/孔，37℃细胞培养箱孵育2小时，然后吸弃未贴壁细胞，再加入1ml新鲜培养基，同时加入重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)至终浓度20ng/ml。将细胞置于37℃细胞培养箱培养6天，第3天加入0.5ml含GM-CSF和IL-4的新鲜培养基。第6天收集骨髓单核细胞诱导的原代树突状细胞，
将树突状细胞重悬于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至1.25×106/ml，然后接种到48孔培养板中，400μl/孔，然后设置溶媒对照组、药物对照组、模型组、模型+药物组，各组3个复孔，然后在药物对照组及模型+药物组各孔中加入50μl各种黄酮衍生物溶液(利用培养基配制的100μM溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育15分钟。然后在模型组及模型+药物组各孔中加入50μl R848溶液(利用培养基配制的100μM溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育24小时。收集细胞到离心管中，4℃、300g离心5分钟，去除上清，加入200μl含0.2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS重悬细胞，再加入50μl PE-CY7标记的大鼠抗小鼠CD11c抗体、FITC标记的大鼠抗小鼠CD80抗体、PE标记的大鼠抗小鼠CD86抗体、APC标记的大鼠抗小鼠CD40抗体、APC-CY7标记的大鼠抗小鼠MHC II抗体和死细胞染色液7-氨基放线菌素D(7-AAD)，避光冰浴30分钟，然后利用含0.2％BSA的PBS清洗2次，最后利用400μl的含0.2％BSA的PBS重悬细胞，完成流式细胞测定。利用FlowJo流式数据处理软件分析各样本中CD11c阳性树突状细胞表面CD80、CD86、CD40和MHC II的平均荧光强度(MFI)，结果利用平均值±标准差表示，n＝3。
结果(表2)显示R848刺激树突状细胞后，相对溶媒对照组能够显著诱导树突状细胞上调CD80、CD86、CD40和MHC II的表达(#P＜0.05 vs Control)，淫羊藿中黄酮衍生物单独处理树突状细胞，相对溶媒对照组不能诱导树突状细胞上调CD80、CD86、CD40和MHC II的表达(P＞0.05 vs Control)，淫羊藿中黄酮衍生物联合R848处理树突状细胞，不仅相对溶媒对照组能够显著诱导树突状细胞上调CD80、CD86、CD40和MHC II的表达(#P＜0.05 vsControl)，同时相对R848单独处理组能够显著增加树突状细胞上调CD80、CD86、CD40和MHCII中的一种或多种蛋白的表达(*P＜0.05 vs R848)，其中化合物YYH-3和YYH-5能够显著增加CD80、CD86、CD40和MHC II的表达，化合物YYH-1能够显著增加MHC II的表达，化合物YYH-2和YYH-4能够显著增加CD80和CD86的表达。这表明淫羊藿中黄酮衍生物YYH-1～YYH-5对R848诱导树突状细胞活化具有显著增敏作用，化合物YYH-3和YYH-5具有更强的增敏活性。
表2：淫羊藿中黄酮衍生物对R848诱导树突状细胞活化的增敏作用测定
实施例3：化合物YYH-3对不同TLR配体诱导中性粒细胞活化的增敏作用测定
颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，无菌取小鼠股骨，利用注射器吸取PBS冲出股骨骨髓细胞，室温300g离心5分钟，去除上清。然后加入红细胞裂解液裂解红细胞，室温300g离心5分钟，去除上清，加入含2％胎牛血清的IMDM培养基清洗细胞，室温300g离心5分钟，再加入含2％胎牛血清的IMDM培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.25×106/ml。将骨髓细胞悬液接种到48孔培养板中，400μl/孔，然后设置溶媒对照组、药物对照组、模型组、模型+药物组，各组3个复孔，然后在药物对照组及模型+药物组各孔中加入50μl化合物YYH-3(利用培养基配制的100μM溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育15分钟。然后在模型组及模型+药物组各孔中加入50μl TLR2配体Zymosan(300μg/ml)、TLR3配体Poly(I：C)(300μg/ml)、TLR4配体LPS(10μg/ml)、TLR7/8配体R848(100μM)或TLR9配体CpG溶液(100μg/ml)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育1.5小时。收集细胞到离心管中，4℃、300g离心5分钟，去除上清，加入200μl含0.2％BSA的PBS重悬细胞，再加入50μl APC标记的大鼠抗小鼠Ly6G抗体、FITC标记的大鼠抗小鼠CD62L抗体、PE标记的大鼠抗小鼠CD11b抗体和7-AAD，避光冰浴30分钟，然后利用含0.2％BSA的PBS清洗2次，最后利用400μl的含0.2％BSA的PBS重悬细胞，完成流式细胞测定。利用FlowJo流式数据处理软件分析各样本中Ly6G阳性中性粒细胞表面CD62L和CD11b的平均荧光强度(MFI)，结果利用平均值±标准差表示，n＝3。
结果(表3)显示Zymosan、Poly(I：C)、LPS、R848或CpG刺激中性粒细胞后，相对溶媒对照组都能够显著诱导中性粒细胞下调CD62L和上调CD11b(#P＜0.05 vs Control)，化合物YYH-3单独处理中性粒细胞，相对溶媒对照组不能诱导中性粒细胞下调CD62L或上调CD11b(P＞0.05 vs Control)，化合物YYH-3联合不同TLR配体处理中性粒细胞，不仅相对溶媒对照组能够显著诱导中性粒细胞下调CD62L和上调CD11b(#P＜0.05 vs Control)，同时相对Poly(I：C)、LPS、R848单独处理组能够显著增强中性粒细胞下调CD62L(*P＜0.05 vsPoly(I：C)、LPS或R848)，另外相对Poly(I：C)单独处理组显著增加中性粒细胞上调CD11b(*P＜0.05 vs Poly(I：C))。这表明化合物YYH-3对Poly(I：C)、LPS和R848诱导中性粒细胞活化具有一定的增敏作用。
表3：化合物YYH-3对不同TLR配体诱导中性粒细胞活化的增敏作用测定
实施例4：化合物YYH-3对不同TLR配体诱导巨噬细胞活化的增敏作用测定
颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，无菌取小鼠股骨，利用注射器吸取PBS冲出股骨骨髓细胞，室温300g离心5分钟，去除上清。然后加入红细胞裂解液裂解红细胞，室温300g离心5分钟，去除上清，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基清洗细胞，室温300g离心5分钟，再加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度至4×106/ml。将骨髓细胞悬液接种到12孔培养板中，1ml/孔，37℃细胞培养箱孵育2小时，然后吸弃未贴壁细胞，再加入1ml新鲜培养基，同时加入重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)至终浓度20ng/ml。将细胞置于37℃细胞培养箱培养6天，第3天加入0.5ml含M-CSF的新鲜培养基。第6天收集骨髓单核细胞诱导的原代巨噬细胞。
在部分含有巨噬细胞的12孔培养板中，利用PBS清洗细胞，然后各孔加入800μlRPMI1640培养基，设置溶媒对照组、药物对照组、模型组、模型+药物组，各组3个复孔，然后在药物对照组及模型+药物组各孔中加入100μl化合物YYH-3(利用培养基配制的100μM溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育15分钟。然后在模型组及模型+药物组各孔中加入100μl的Zymosan(300μg/ml)、Poly(I：C)(300μg/ml)、LPS(10μg/ml)、R848(100μM)或CpG溶液(100μg/ml)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育12小时。然后去除各孔培养基，利用PBS清洗2次细胞，然后加入1ml Trizol裂解细胞，再利用mRNA抽提试剂盒提取总mRNA，然后利用逆转录反应合成cDNA，最后利用多种细胞因子引物完成实时荧光定量多聚酶链反应(RT-qPCR)测定。计算各种基因mRNA相对GAPDH的表达水平，结果利用平均值±标准差表示，n＝3。
另外通过胰酶消化收集部分原代巨噬细胞，将细胞重悬于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至1.5×106/ml，然后接种到96孔培养板中，100μl/孔，同样设置溶媒对照组、药物对照组、模型组、模型+药物组，各组3个复孔，然后在药物对照组及模型+药物组各孔中加入50μl化合物YYH-3(利用培养基配制的40μM溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育15分钟。然后在模型组及模型+药物组各孔中加入50μl的Zymosan(120μg/ml)、Poly(I：C)(120μg/ml)、LPS(4μg/ml)、R848(40μM)或CpG溶液(40μg/ml)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育24小时。然后收集各孔细胞培养上清，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)定量分析巨噬细胞分泌的细胞因子浓度，结果利用平均值±标准差表示，n＝3。
RT-qPCR测定结果(表4)显示Zymosan、Poly(I：C)、LPS、R848或CpG刺激巨噬细胞后，相对溶媒对照组都能够显著诱导巨噬细胞上调炎症因子TNF-α、IL-6和MIP-1α的mRNA转录(#P＜0.05 vs Control)，化合物YYH-3单独处理巨噬细胞，相对溶媒对照组不能诱导巨噬细胞上调TNF-α、IL-6和MIP-1α的mRNA转录(P＞0.05 vs Control)，化合物YYH-3联合不同TLR配体处理巨噬细胞，不仅相对溶媒对照组能够显著诱导巨噬细胞上调TNF-α、IL-6和MIP-1α的mRNA转录(#P＜0.05 vs Control)，同时相对Zymosan、LPS、R848、CpG单独处理组能够显著增加巨噬细胞上调TNF-α的mRNA转录(*P＜0.05 vs Zymosan、LPS、R848或CpG)，另外相对Poly(I：C)、LPS、CpG单独处理组显著增加巨噬细胞上调IL-6的mRNA转录(*P＜0.05vs Poly(I：C)、LPS或CpG)，相对Zymosan、LPS、CpG单独处理组显著增加巨噬细胞上调MIP-1α的mRNA转录(*P＜0.05 vs Zymosan、LPS或CpG)。这表明化合物YYH-3对多种TLR配体诱导巨噬细胞炎症因子转录具有增敏作用。
表4：化合物YYH-3对不同TLR配体诱导巨噬细胞表达炎症因子的增敏作用测定
ELISA测定结果(表5)显示Zymosan、Poly(I：C)、LPS、R848或CpG刺激巨噬细胞后，相对溶媒对照组都能够显著诱导巨噬细胞分泌炎症因子TNF-α、IL-6和MIP-1α(#P＜0.05vs Control)，化合物YYH-3单独处理巨噬细胞，相对溶媒对照组不能诱导巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和MIP-1α(P＞0.05 vs Control)，化合物YYH-3联合不同TLR配体处理巨噬细胞，不仅相对溶媒对照组能够显著诱导巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和MIP-1α(#P＜0.05 vsControl)，同时相对LPS和R848单独处理组能够显著增加巨噬细胞分泌TNF-α(*P＜0.05 vsLPS或R848)，另外相对Poly(I：C)和R848单独处理组显著增加巨噬细胞分泌IL-6(*P＜0.05vs Poly(I：C)或R848)，相对CpG单独处理组显著增加巨噬细胞分泌TNF-α(*P＜0.05 vsCpG)。这表明化合物YYH-3对多种TLR配体诱导巨噬细胞分泌炎症因子具有增敏作用。
表5：化合物YYH-3对不同TLR配体诱导巨噬细胞分泌炎症因子的增敏作用测定
实施例5：化合物YYH-3对不同TLR配体诱导树突状细胞活化的增敏作用测定
颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，无菌取小鼠股骨，利用注射器吸取PBS冲出股骨骨髓细胞，室温300g离心5分钟，去除上清。然后加入红细胞裂解液裂解红细胞，室温300g离心5分钟，去除上清，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基清洗细胞，室温300g离心5分钟，再加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度至4×106/ml。将骨髓细胞悬液接种到12孔培养板中，1ml/孔，37℃细胞培养箱孵育2小时，然后吸弃未贴壁细胞，再加入1ml新鲜培养基，同时加入重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)至终浓度20ng/ml。将细胞置于37℃细胞培养箱培养6天，第3天加入0.5ml含GM-CSF和IL-4的新鲜培养基。第6天收集骨髓单核细胞诱导的原代树突状细胞。
将树突状细胞重悬于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，调整细胞浓度至1.25×106/ml，然后接种到48孔培养板中，400μl/孔，然后设置溶媒对照组、药物对照组、模型组、模型+药物组，各组3个复孔，然后在药物对照组及模型+药物组各孔中加入50μl化合物YYH-3(利用培养基配制的100μM溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育15分钟。然后在模型组及模型+药物组各孔中加入50μl的Zymosan(300μg/ml)、Poly(I：C)(300μg/ml)、LPS(10μg/ml)、R848(100μM)或CpG溶液(100μg/ml)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育24小时。收集细胞到离心管中，4℃、300g离心5分钟，去除上清，加入200μl含0.2％BSA的PBS重悬细胞，再加入50μl PE-CY7标记的大鼠抗小鼠CD11c抗体、FITC标记的大鼠抗小鼠CD80抗体、PE标记的大鼠抗小鼠CD86抗体、APC标记的大鼠抗小鼠CD40抗体、APC-CY7标记的大鼠抗小鼠MHC II抗体和7-AAD，避光冰浴30分钟，然后利用含0.2％BSA的PBS清洗2次，最后利用400μl的含0.2％BSA的PBS重悬细胞，完成流式细胞测定。利用FlowJo流式数据处理软件分析各样本中CD11c阳性树突状细胞表面CD80、CD86、CD40和MHC II的平均荧光强度(MFI)，结果利用平均值±标准差表示，n＝3。
将部分1.25×106/ml的树突状细胞悬液接种到12孔培养板中，800μl/孔，设置溶媒对照组、药物对照组、模型组、模型+药物组，各组3个复孔，然后在药物对照组及模型+药物组各孔中加入100μl化合物YYH-3(利用培养基配制的100μM溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育15分钟。然后在模型组及模型+药物组各孔中加入100μl的Zymosan(300μg/ml)、Poly(I：C)(300μg/ml)、LPS(10μg/ml)、R848(100μM)或CpG溶液(100μg/ml)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育12小时。然后去除各孔培养基，利用PBS清洗2次细胞，然后加入1ml Trizol裂解细胞，再利用mRNA抽提试剂盒提取总mRNA，然后利用逆转录反应合成cDNA，最后利用多种细胞因子引物完成RT-qPCR测定。计算各种基因mRNA相对GAPDH的表达水平，结果利用平均值±标准差表示，n＝3。
另外将部分树突状细胞调整细胞浓度至1.5×106/ml，然后接种到96孔培养板中，100μl/孔，同样设置溶媒对照组、药物对照组、模型组、模型+药物组，各组3个复孔，然后在药物对照组及模型+药物组各孔中加入50μl化合物YYH-3(利用培养基配制的40μM溶液)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育15分钟。然后在模型组及模型+药物组各孔中加入50μlZymosan(120μg/ml)、Poly(I：C)(120μg/ml)、LPS(4μg/ml)、R848(40μM)或CpG溶液(40μg/ml)，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育24小时。然后收集各孔细胞培养上清，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)定量分析树突状细胞分泌的细胞因子浓度，结果利用平均值±标准差表示，n＝3。
流式细胞测定结果(表6)显示Zymosan、Poly(I：C)、LPS、R848或CpG刺激树突状细胞后，相对溶媒对照组能够显著诱导树突状细胞上调CD80、CD86、CD40和MHC II的表达(#P＜0.05 vs Control)，化合物YYH-3单独处理树突状细胞，相对溶媒对照组不能诱导树突状细胞上调CD80、CD86、CD40和MHC II的表达(P＞0.05 vs Control)，化合物YYH-3联合不同TLR配体处理树突状细胞，不仅相对溶媒对照组能够显著诱导树突状细胞上调CD80、CD86、CD40和MHC II的表达(#P＜0.05 vs Control)，同时相对LPS、R848、CpG单独处理组能够显著增加树突状细胞上调CD80的表达(*P＜0.05 vs LPS、R848或CpG)，相对Zymosan、Poly(I：C)、LPS、R848、CpG单独处理组能够显著增加树突状细胞上调CD86的表达(*P＜0.05 vsZymosan、Poly(I：C)、LPS、R848或CpG)，相对LPS、R848、CpG单独处理组能够显著增加树突状细胞上调CD40的表达(*P＜0.05 vs LPS、R848或CpG)，另外相对R848、CpG单独处理组能够显著增加树突状细胞上调MHC II的表达(*P＜0.05 vs R848或CpG)。这表明YYH-3对多种TLR配体诱导树突状细胞活化具有显著增敏作用，特别是对R848和CpG诱导树突状细胞活化具有更强的增敏活性。
表6：化合物YYH-3对不同TLR配体诱导树突状细胞活化的增敏作用测定
RT-qPCR测定结果(表7)显示Zymosan、Poly(I：C)、LPS、R848或CpG刺激树突状细胞后，相对溶媒对照组都能够显著诱导树突状细胞上调细胞因子IL-15、IL-12b、TNF-α和MIP-1α的mRNA转录(#P＜0.05 vs Control)，化合物YYH-3单独处理树突状细胞，相对溶媒对照组不能诱导树突状细胞上调细胞因子IL-15、IL-12b、TNF-α和MIP-1α的mRNA转录(P＞0.05vs Control)，化合物YYH-3联合大部分TLR配体处理树突状细胞，相对溶媒对照组能够显著诱导树突状细胞上调细胞因子IL-15、IL-12b、TNF-α和MIP-1α的mRNA转录(#P＜0.05 vsControl)，同时相对Zymosan、Poly(I：C)、LPS、R848单独处理组能够显著增加树突状细胞上调IL-15的mRNA转录(*P＜0.05 vs Zymosan、Poly(I：C)、LPS或R848)，相对LPS、R848单独处理组能够显著增加树突状细胞上调IL-12b的mRNA转录(*P＜0.05 vs LPS或R848)，相对Poly(I：C)、LPS、R848单独处理组显著增加树突状细胞上调TNF-α的mRNA转录(*P＜0.05 vsPoly(I：C)、LPS或R848)，相对R848单独处理组显著增加树突状细胞上调MIP-1α的mRNA转录(*P＜0.05 vs R848)。另外化合物YYH-3也抑制Zymosan诱导树突状细胞上调TNF-α和MIP-1α的mRNA转录(*P＜0.05 vs Zymosan)，抑制Poly(I：C)诱导树突状细胞上调IL-12b和MIP-1α的mRNA转录(*P＜0.05 vs Zymosan)，抑制CpG诱导树突状细胞上调IL-12b、TNF-α和MIP-1α的mRNA转录(*P＜0.05 vs CpG)。这表明化合物YYH-3对不同TLR配体诱导树突状细胞细胞因子转录具有不同的调节作用，其中对R848诱导树突状细胞细胞因子转录具有很强的增敏作用。
表7：化合物YYH-3对不同TLR配体诱导树突状细胞表达细胞因子的增敏作用测定
ELISA测定结果(表8)显示Zymosan、Poly(I：C)、LPS、R848或CpG刺激树突状细胞后，相对溶媒对照组，大部分能够显著诱导树突状细胞分泌细胞因子IL-15、IL-12/p40、TNF-α和MIP-1α(#P＜0.05 vs Control)，化合物YYH-3单独处理树突状细胞，相对溶媒对照组不能诱导树突状细胞分泌细胞因子IL-15、IL-12/p40、TNF-α和MIP-1α(P＞0.05 vsControl)，化合物YYH-3联合不同TLR配体处理树突状细胞，不仅相对溶媒对照组能够显著诱导树突状细胞分泌IL-15、IL-12/p40、TNF-α和MIP-1α(#P＜0.05 vs Control)，同时相对LPS单独处理组能够显著增加树突状细胞分泌IL-15和IL-12/p40(*P＜0.05 vs LPS)，另外相对R848单独处理组显著增加树突状细胞分泌IL-15、IL-12/p40、TNF-α和MIP-1α(*P＜0.05 vs R848)。这表明化合物YYH-3对LPS和R848诱导树突状细胞分泌细胞因子具有增敏作用，其中对R848诱导树突状细胞分泌细胞因子具有最强的增敏作用。
表8：化合物YYH-3对不同TLR配体诱导树突状细胞分泌细胞因子的增敏作用测定
实施例6：化合物YYH-3对混合淋巴反应的增敏作用测定
颈椎脱臼处死8周龄BALB/c小鼠，无菌取小鼠股骨，利用注射器吸取PBS冲出股骨骨髓细胞，室温300g离心5分钟，去除上清。然后加入红细胞裂解液裂解红细胞，室温300g离心5分钟，去除上清，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基清洗细胞，室温300g离心5分钟，再加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度至4×106/ml。将骨髓细胞悬液接种到12孔培养板中，1ml/孔，37℃细胞培养箱孵育2小时，然后吸弃未贴壁细胞，再加入1ml新鲜培养基，同时加入重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)至终浓度20ng/ml。将细胞置于37℃细胞培养箱培养6天，第3天加入0.5ml含GM-CSF和IL-4的新鲜培养基。第6天收集骨髓单核细胞诱导的原代树突状细胞。
另外在第6天颈椎脱臼处死8周龄C57BL/6小鼠，无菌取小鼠脾脏放入70μm孔径滤网中，在滴加PBS的同时，利用注射器内芯研磨为单细胞悬液，室温300g离心5分钟，去除上清。然后加入红细胞裂解液裂解红细胞，室温300g离心5分钟，去除上清，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基清洗细胞，室温300g离心5分钟，弃去上清。然后利用PBS重悬细胞，调整细胞浓度至1×107/ml，加入CFSE至终浓度5μM，室温避光标记10分钟，室温300g离心5分钟，弃去上清，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基清洗细胞，室温300g离心5分钟，弃去上清。然后加入含2mM乙二胺四乙酸和0.5％BSA的PBS(细胞分选缓冲液)重悬细胞，调整细胞浓度至1×108/ml。在细胞悬液中加入小鼠CD4+T细胞阴性磁珠分选试剂盒中的生物素标记抗体，4℃孵育5分钟，然后按比例加入链霉亲和素标记的磁珠溶液，4℃孵育10分钟，然后将细胞悬液过LS细胞分选柱，收集流出的CD4+T细胞，经过RPMI1640完全培养基清洗后，将细胞重悬于RPMI1640完全培养基。
将C57BL/6小鼠脾脏分选的CD4+T细胞浓度调整为2×106/ml，接种到圆底96孔板中，100μl/孔，设置溶媒对照组和药物对照组，另外将由BALB/c小鼠骨髓单核细胞诱导的原代树突状细胞和C57BL/6小鼠脾脏分选的CD4+T细胞混合，树突状细胞浓度为4×105/ml，CD4+T细胞浓度为2×106/ml，然后将混合细胞悬液接种到圆底96孔板中，100μl/孔，设置模型组、模型+药物组，各组3个复孔。然后在药物对照组及模型+药物组各孔中加入100μl化合物YYH-3，至YYH-3终浓度分别为2.5、5和10μM，其它各孔加入等体积培养基，37℃孵育96小时。收集细胞到离心管中，4℃、300g离心5分钟，去除上清，加入200μl含0.2％BSA的PBS重悬细胞，再加入50μl PE-CY7标记的大鼠抗小鼠CD4抗体和7-AAD，避光冰浴30分钟，然后利用含0.2％BSA的PBS清洗2次，最后利用400μl的含0.2％BSA的PBS重悬细胞，完成流式细胞测定。利用FlowJo流式数据处理软件分析各样本中CFSE荧光强度明显下降的CD4+T细胞(发生增殖的细胞)在总的CD4+T细胞中的比例，结果利用平均值±标准差表示，n＝3。
结果显示(表9)树突状细胞(DC)和CD4+T细胞混合后，相对溶媒对照组能够显著增加分裂的CD4+T细胞比例(#P＜0.05 vs Control)，化合物YYH-3在2.5-10μM浓度单独处理不能增加分裂的CD4+T细胞比例(P＞0.05 vs Control)。化合物YYH-3联合DC处理CD4+T细胞，不仅相对溶媒对照能够显著增加分裂的CD4+T细胞比例(#P＜0.05 vs Control)，同时化合物YYH-3在5和10μM浓度联合DC处理CD4+T细胞，相对DC单独处理能够显著增加分裂的CD4+T细胞比例(*P＜0.05 vs DC)。这表明化合物YYH-3对混合淋巴反应具有显著的增敏作用，同时可能对树突状细胞的抗原提呈功能具有很强的增敏作用。
表9：化合物YYH-3对混合淋巴反应的增敏作用测定
实施例7：化合物YYH-3对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)诱导免疫反应的增敏作用测定
将48只8周龄雄性BALB/c小鼠随机平均分为6组，分别设置为溶媒对照组、YYH-3对照组、模型组、模型+YYH-3低剂量组、模型+YYH-3中剂量组和模型+YYH-3高剂量组。然后第0天利用PBS将HBsAg配制为200μg/ml，然后与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，通过皮下注射免疫模型组及模型+YYH-3组小鼠，200μl乳剂/只小鼠，另外利用PBS与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，通过皮下注射给予溶媒对照组和YYH-3对照组小鼠等体积不含HBsAg的乳剂。第14天再次利用PBS将HBsAg配制为200μg/ml，然后与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化，通过皮下注射免疫模型组及模型+YYH-3组小鼠，200μl乳剂/只小鼠，另外利用PBS与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化，通过皮下注射给予溶媒对照组和YYH-3对照组小鼠等体积不含HBsAg的乳剂。利用0.5％羧甲基纤维素钠水溶液将YYH-3配制为1、2、4mg/ml的混悬液，然后在第11天开始通过灌胃给予YYH-3对照组小鼠40mg/kg剂量的YYH-3，分别给予模型+YYH-3低剂量组、模型+YYH-3中剂量组和模型+YYH-3高剂量组小鼠10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg剂量的YYH-3，连续给药10天。
第21天通过颈椎脱臼处死各组小鼠，无菌取脾脏置于70μm孔径尼龙滤网中，利用5ml注射器内芯轻轻研磨脾脏，同时加入20ml的PBS冲洗脾脏细胞，室温300g离心5分钟，弃去上清。然后加入红细胞裂解液裂解红细胞，室温300g离心5分钟，弃去上清，加入10ml含5％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，室温300g离心5分钟，弃去上清，最后加入10ml含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞。经过细胞计数后，取部分细胞悬液到24孔板中，加入培养基将细胞稀释为2.5×106/ml。然后将细胞接种到小鼠IL-2、IFN-γ和IL-4的酶联免疫斑点(ELISPOT)试剂盒中的PVDF板中，100μl/孔，然后加入100μl的HBsAg溶液(RPMI1640培养基配制)至终浓度10μg/ml，37℃细胞培养箱孵育24小时。取出PVDF板，倒去细胞培养基，然后各孔加入200μl的PBS，倒去PBS，并重复5次。再加入含1％BSA的PBS配制的生物素标记的小鼠IL-2、IFN-γ或IL-4检测抗体，100μl/孔，室温孵育2小时，然后倒去抗体溶液，各孔加入200μl的PBS，倒去PBS，并重复5次。加入含1％BSA的PBS配制的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，100μl/孔，室温孵育1小时，然后倒去酶标亲和素溶液，各孔加入200μl的PBS，倒去PBS，并重复5次。加入BCIP/NBT底物溶液，100μl/孔，室温孵育0.5小时，倒去BCIP/NBT底物溶液，各孔加入200μl的纯水，再倒去纯水，并重复5次，将PVDF板置于避光干燥区域自然干燥。最后利用ELISPOT读板机拍照并进行斑点计数，结果利用平均值±标准差表示，n＝8。
结果显示(表10)HBsAg混合弗氏完全佐剂和不完全佐剂后免疫小鼠，相对溶媒对照组能够显著诱导小鼠脾脏HBsAg特异性的IL-2、IFN-γ和IL-4分泌细胞的产生(#P＜0.05vs Control)。化合物YYH-3在40mg/kg剂量单独给药不能诱导小鼠脾脏HBsAg特异性的IL-2、IFN-γ和IL-4分泌细胞的产生(P＞0.05 vs Control)。化合物YYH-3在20mg/kg和40mg/kg剂量给予HBsAg免疫小鼠后，相对HBsAg免疫组能够显著增加小鼠脾脏HBsAg特异性的IL-2分泌细胞的产生(*P＜0.05 vs HBsAg)。化合物YYH-3在40mg/kg剂量给予HBsAg免疫小鼠后，相对HBsAg免疫组能够显著增加小鼠脾脏HBsAg特异性的IFN-γ分泌细胞的产生(*P＜0.05 vs HBsAg)。这表明化合物YYH-3在20mg/kg和40mg/kg剂量对HBsAg诱导的细胞免疫反应具有显著增敏作用，其机制可能是通过对弗氏完全佐剂中结核菌体中的脂多糖(LPS)诱导免疫反应的增敏作用实现对HBsAg诱导细胞免疫反应的增敏作用。
表10：化合物YYH-3对HBsAg诱导免疫反应的增敏作用测定
实施例8：化合物YYH-3对灭活狂犬病毒(RV)诱导免疫反应的增敏作用测定
将48只8周龄雄性BALB/c小鼠随机平均分为6组，分别设置为溶媒对照组、YYH-3对照组、模型组、模型+YYH-3低剂量组、模型+YYH-3中剂量组和模型+YYH-3高剂量组。然后第0、7、14天利用PBS将灭活狂犬病毒配制为5IU/ml，然后通过肌肉注射免疫模型组及模型+YYH-3组小鼠，100μl病毒溶液/只小鼠，另外通过肌肉注射给予溶媒对照组和YYH-3对照组小鼠等体积PBS。利用0.5％羧甲基纤维素钠水溶液将YYH-3配制为1、2、4mg/ml的混悬液，然后在第11天开始通过灌胃给予YYH-3对照组小鼠40mg/kg剂量的YYH-3，分别给予模型+YYH-3低剂量组、模型+YYH-3中剂量组和模型+YYH-3高剂量组小鼠10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg剂量的YYH-3，连续给药10天。
第21天通过颈椎脱臼处死各组小鼠，无菌取脾脏置于70μm孔径无菌尼龙滤网中，利用5ml注射器内芯轻轻研磨脾脏，同时加入20ml的PBS冲洗脾脏细胞，室温300g离心5分钟，弃去上清。然后加入红细胞裂解液裂解红细胞，室温300g离心5分钟，弃去上清，加入10ml含5％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，室温300g离心5分钟，弃去上清，最后加入10ml含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞。经过细胞计数后，取部分细胞悬液到24孔板中，加入培养基将细胞稀释为2.5×106/ml。然后将细胞接种到小鼠IL-2、IFN-γ和IL-4的酶联免疫斑点(ELISPOT)试剂盒中的PVDF板中，100μl/孔，然后加入100μl的灭活狂犬病毒溶液(RPMI1640培养基配制)至终浓度0.5IU/ml，37℃细胞培养箱孵育24小时。取出PVDF板，倒去细胞培养基，然后各孔加入200μl的PBS，倒去PBS，并重复5次。再加入含1％BSA的PBS配制的生物素标记的小鼠IL-2、IFN-γ或IL-4检测抗体，100μl/孔，室温孵育2小时，然后倒去抗体溶液，各孔加入200μl的PBS，倒去PBS，并重复5次。加入含1％BSA的PBS配制的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，100μl/孔，室温孵育1小时，然后倒去酶标亲和素溶液，各孔加入200μl的PBS，倒去PBS，并重复5次。加入BCIP/NBT底物溶液，100μl/孔，室温孵育0.5小时，倒去BCIP/NBT底物溶液，各孔加入200μl的纯水，再倒去纯水，并重复5次，将PVDF板置于避光干燥区域自然干燥。最后利用ELISPOT读板机拍照并进行斑点计数，结果利用平均值±标准差表示，n＝8。
结果显示(表11)RV免疫小鼠，相对溶媒对照组能够显著诱导小鼠脾脏RV抗原特异性的IL-2、IFN-γ和IL-4分泌细胞的产生(#P＜0.05 vs Control)。化合物YYH-3在40mg/kg剂量单独给药不能诱导小鼠脾脏RV抗原特异性的IL-2、IFN-γ和IL-4分泌细胞的产生(P＞0.05 vs Control)。化合物YYH-3在20mg/kg和40mg/kg剂量给予RV免疫小鼠后，相对RV免疫组能够显著增加小鼠脾脏RV抗原特异性的IL-2和IFN-γ分泌细胞的产生(*P＜0.05 vsHBsAg)。这表明化合物YYH-3在20mg/kg和40mg/kg剂量对RV诱导的细胞免疫反应具有显著增敏作用，其机制可能是通过对病毒中的单链RNA诱导免疫反应的增敏作用实现对RV抗原诱导细胞免疫反应的增敏作用。
表11：化合物YYH-3对RV诱导免疫反应的增敏作用测定
Claims (7)
1.选自如下表格的化合物在制备免疫增敏药物中的应用
2.权利要求1中任一化合物为活性成分的药物组合物在制备免疫增敏药物中的应用。
3.根据权利要求1或2的应用，其特征在于，所述的化合物包括其立体异构体。
4.根据权利要求1或2的应用，其特征在于，所述的化合物可以以游离状态或药学上可接受盐的形式存在。
5.根据权利要求1或2的应用，其特征在于，所述的免疫增敏包括对疫苗诱导免疫反应的增敏或病毒感染诱导抗病毒免疫反应的增敏。
6.权利要求5中所述的疫苗，包括减毒活疫苗、灭活疫苗或重组亚单位疫苗。
7.权利要求5中所述的病毒，包括所有单链RNA病毒。
Priority Applications (1)
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| CN202110621806.2A CN115429787A (zh) | 2021-06-04 | 2021-06-04 | 淫羊藿中黄酮衍生物及其药物组合物的免疫增敏用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (1)
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