KR101664871B1 - 인삼 추출물에 의한 선천적 및 후천적 면역반응의 활성화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유효량의 인삼 분획을 피험자에게 투여함으로써 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 피험자에서 상태를 예방, 치료 또는 완화하기 위한 인삼 분획 및 방법, 다른 의약 또는 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 인삼 분획을 포함하는 제약 조성물, 또는 인삼 분획을 포함하는 식품에 관한 것이다. 인삼 분획은 Panax quinquefolius로 제조되거나, 또는 CVT-E002, PQ₂, PQ₂₂₃ 및 CVT-E002, PQ₂ 및 PQ₂₂₃로부터 정제된 분획으로부터 선택될 수 있다.

Description

인삼 추출물에 의한 선천적 및 후천적 면역반응의 활성화{ACTIVATION OF INNATE AND ADAPTIVE IMMUNE RESPONSES BY A GINSENG EXTRACT}

본 발명은 유효량의 인삼 분획을 피험자에게 투여함으로써 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 피험자에서 상태를 예방, 치료 또는 완화하기 위한 인삼 분획 및 방법, 인삼 분획을 포함하는 제약 조성물 또는 식품에 관한 것이다. 이러한 상태는 알레르기, 천식, 바이러스 및 미생물 감염, 및 암을 포함한다. 인삼 분획은 백신 애쥬번트로서 사용될 수 있다.

북미산 인삼(Panax quinquefolium)의 뿌리에서 추출한 수용성 추출물인 CVT-E002가 COLD-FX™로서 시중에서 독점 판매되고 있다. 이 추출물은 아시아나 미국산 인삼 제품과 다당류 및 진세노사이드의 함량에서 차이를 나타내며, 주로 폴리-퓨라노실-피라노실-당류로 구성된다. 이 제품의 뱃치별 품질은 ChemBioPrint™ 기술에 의해서 검증되며, 이로써 제품의 화학적 및 약리학적 일관성이 보장된다. 이 독점 판매되는 천연 추출물은 면역조절 효과를 가진다고 알려져 있다(Wang et al, 2002, 2004). CVT-E002는 마우스 비장 세포의 증식을 강화하고, 시험관내에서 복막 대식세포에 의한 인터류킨-1(IL-1), IL-6, 종양괴사인자(TNF)-α 및 산화질소의 생산을 증가시킨다. 마우스에 CVT-E002를 투여하자 혈청 면역글로불린 G(IgG) 항체 수준이 증가하였고(Wang et al, 2001), 바이러스-유발 백혈병에 걸린 마우스에 CVT-E002를 매일 투약하자 골수 및 비장에서 대식세포와 NK 세포의 비율이 증가하는 한편, 백혈병 세포 수는 감소하였다(Miller, 2006). 간 인플루엔자 바이러스와 함께 배양된 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)에 대한 최근 연구에서는 CVT-E002가 IL-2와 인터페론 γ(IFNγ)의 생산을 증대시키는데 효과적이었다(Jing et al, 제출중). IL-2 및 IFNγ는 중요한 T 및 NK 세포 사이토카인이며, 바이러스-특이적 후천적 면역반응과 관련된다. 임상 연구에서 건강한 성인이 매일 적은 양의 COLD-FX™를 보충 섭취하자 혈장에서 NK 세포의 비율이 증가하였다(Predy et al, 2006).

대식세포와 NK 세포는 둘 다 미생물 병원체에 대한 제 1 방어선으로서, 선천적 면역의 중요한 요소이다. 이들 세포는 즉각적으로 작용하여 사이토카인, 인터페론 및 케모카인과 같은 항균제의 방출과 포식 또는 세포용해 활동에 의해서 감염원의 증식 및 확산을 제한한다.

전임상 연구에서 바이러스-관련 상부 호흡기 감염의 예방을 위한 CVT-E002의 잠재적인 사용이 제안되었으므로, 규정에 맞는 198명의 노인을 포함한 임상 시험이 수행되었다. 이 연구에서 인플루엔자 시즌 중 4개월간 CVT-E002를 매일 투여한 경우, 인플루엔자 및 호흡기 세포융합 바이러스로 인한 급성 호흡기 질환의 상대적인 위험이 89%까지 감소하였음이 증명되었다(McElhaney et al, 2004). 또 다른 연구에서도 CVT-E002가 323명의 건강한 중년 성인에서 호흡기 감염의 재발을 상당히 감소시킨 것으로 나타났다(Predy et al, 2005). 또한, CVT-E002 치료는 건강한 성인에서 상부 호흡관 감염과 관련된 증상의 위중도 및 기간을 감소시켰다. 65세 이상의 지역 거주 성인 43명을 대상으로 한 무작위 이중 맹검, 위약 대조군 시험에서는 CVT-E002를 매일 섭취하자 호흡기 증상의 상대적 위험 및 기간이 각각 48% 및 55%까지 감소하였다. CVT-E002의 매일 투여는 건강한 노인의 급성 호흡기 질환을 예방하는 안전한 천연 치료 수단인 것으로 밝혀졌다.

포유류 면역 시스템은 감염에 대한 보호를 위해 다층적이며 상호작용하는 방어 시스템을 발전시켜 왔으며, 이것은 넓게는 선천 면역과 후천 면역으로 구분되고 있다. 선천 면역은 미생물 병원체에 대한 제 1 방어선이며, 거의 즉각적으로 작용하여 수지상 세포 및 대식세포와 같은 포식 및 항원-제시 세포의 활성화를 통해서 감염원의 초기 증식 및 확산을 제한하고, 인터페론 및 디펜신과 같은 각종 사이토카인, 케모카인 및 항균 인자들의 방출을 통해서 염증반응의 개시를 제한한다. 선천 면역은 진화론적으로 예전의 일이며, 수년간 선천 면역의 연구는 면역학자들에 의해 상대적으로 비특이적인 사건으로서 거의 무시되었다. 대부분 인간은 선천 면역 시스템에 의해서 감염에 대해 보호된다. 감염성 유기체가 선천 면역의 방어를 뚫는다면, 이 선천적 방어는 침입한 병원체에 의해서만 특유하게 발현되는 고도로 특이적인 결정소를 향하는 후천적 면역반응의 발생을 촉진하고 인도한다. 이들 반응은 B 세포 및 T 세포에서의 특이적 항원-수용체 유전자의 재배열에 의존하며, 그 결과로서 고-친화성 항원-특이적 항체(체액성 면역)와 T 세포 또는 세포-매개 면역을 생성한다. 항체는 세포외 병원체와 그들의 독소의 제거, 파괴 또는 중화를 촉진한다. T 세포-매개 면역반응은 세포내 병원체의 제거 또는 제어를 돕는다. 선천적 면역반응과는 달리, 후천적 면역반응은 특이적 면역 기억에 대한 홀마크를 가진다.

이전 연구에서는 숙주 선천 면역 시스템이 어떻게 감염을 감지하며, 자기/비-자기 병원체 또는 감염원을 어떻게 구별하는지 결정하려고 시도했다. Toll-유사 수용체(TLR)의 발견 및 특성화에 의해 선천적 면역인식에 대한 상당히 통찰이 이루어졌으며, 감염에 대한 숙주 방어에서 선천 면역 시스템의 핵심적 역할이 확립되었다(Akira et al, 2006; Hargreaves and Medzhitov, 2005; Kawai and Akira, 2006; Philpott and Girardin, 2004; Seth et al, 2006). TLR은 선천 면역과 후천 면역에서 핵심 분자이다. 선천 면역 시스템은 여러 군에 속하는 점라인-암호화된 패턴 인식 수용체(PRR)를 이용하여 감염을 감지하고, 다양한 항균 방어 기전을 촉발시킨다(Janeway and Medzhitov, 1998). 이들 PRR은 식물 및 과일 날벌레부터 포유류까지 종들 간에 진화론적으로 매우 잘 보존된다. 선천적 면역인식의 전략은 많은 타입의 미생물에는 존재하며 숙주 세포에는 존재하지 않는 고도로 보존적인 필수 구조의 감지에 기초한다(Janeway, 1992; Janeway and Medzhitov, 1999). 보존된 분자 패턴이 선천적 면역인식의 표적이므로, 이들은 병원체-관련 분자 패턴(PAMPs)이라고 불린다. PAMPs는 이들을 선천적 면역 감지의 이상적인 표적으로 만드는 중요한 특징을 가진다. PAMPs는 미생물에 의해서만 생산되고 숙주 세포에 의해서는 생산되지 않는다. 이것이 바로 자기/비-자기 감염원을 구별하기 위한 기초가 된다. PAMPs가 주어진 부류의 미생물들 간에 보존되므로, 제한된 수의 PRR이 많은 부류의 침입한 병원체의 존재를 검출할 수 있게 된다. 예를 들어, LPS의 패턴에 의해 단일 PRR은 모든 그람-음성 박테리아의 존재를 검출할 수 있다. PAMPs는 미생물 생존에 필수적이며, PAMPs의 어떤 돌연변이나 손실은 유기체에 치명적이거나, 아니면 이들의 적응능력을 상당히 감소시킨다. 선천적 면역인식에 관한 이러한 새로운 통찰은 감염성 질환에서의 면역방어, 발병기전, 및 치료 및 예방에 대한 이해를 근본적으로 바꾸고 있다.

TLRs는 PRRs의 일 군을 나타내며, PAMPs를 감지하고 신호화 수용체로서 기능하는 진화론적으로 보존된 막통과 수용체이다. TLRs는 초파리에서 발견되었는데, 여기서 TLRs는 과일 날벌레 배/등 방향의 발생에서 어떤 역할을 한다(Stein et al, 1991). 이 유전자가 돌연변이된 경우, 발생한 날벌레는 "Toll"인 것으로 판명되었는데, 이것은 기이한 또는 "틀을 벗어난"이라는 뜻의 독일 속어이다. 또한, Toll 돌연변이를 가진 날벌레는 진균 감염에 매우 민감하다고 밝혀졌다(Lemaitre et al, 1996). 지금까지 11개의 TLRs가 포유류에서 확인되었으며, 이들 각각은 상이한 집단의 미생물 자극을 감지하고, 서로 다른 신호화 경로 및 전사 인자를 활성화함으로써 병원체에 대한 특이적 반응을 유도한다(Kawai and Akira, 2005). TLRs는 다양한 수의 류신-부화-반복(LRR) 모티프를 함유하는 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 Toll/IL-1R 상동성(TIR) 도메인이라고 명명된 인터류킨-1 수용체(IL-1R)의 도메인과 상동성인 세포질 신호화 도메인을 특징으로 하는 타입 I 통합 막 당단백질이다(O'Neill, 2006). LRR 도메인은 19-25개의 탠덤 LRR 모티프로 이루어지며, 이들 각각은 24-29개 아미노산 길이이다.

최초로 발견된 포유류 TLR인 TLR4는 오랫동안 찾아온 그람-음성 박테리아 리포다당(LPS)의 수용체라는 것이 밝혀졌다(Medzhitov et al, 1997; Poltorak et al, 1998). TLR2는 그람-양성 박테리아 및 미코플라즈마의 리포단백질과 리포펩티드에 더하여 펩티도글리칸을 인식한다(Takeda et al, 2003; Takeuchi et al, 1999). TLR2는 TLR1 또는 TLR6과 헤테로다이머를 형성함으로써, 각기 디아실 리포펩티드와 트리아실 리포펩티드를 구별할 수 있게 된다. 또한, TLR2는 비-TLR 수용체 덱틴-1과 협력하여 효모 세포벽에서 발견된 자이모산에 대한 반응을 매개한다(Gantner et al, 2003). TLR5는 박테리아 편모의 단백질 성분인 플라겔린을 인식한다(Hayashi et al, 2001). TLR5와 가까운 친족인 TLR11은 마우스의 비뇨생식관에서 풍부히 발현되는 것으로 나타났으며, 요로병원성 박테리아에 대한 보호와 관련되었고(Zhang et al, 2004), 최근에는 원생동물 기생충 Toxoplasma gondii 유래의 프로필린-유사 단백질을 인식한다고 밝혀졌다(Yarovinsky et al, 2005). TLR3, 7, 8 및 9는 핵산을 인식하며, 세포 표면에서는 발현되지 않고 엔도솜 구획에서만 독점적으로 발현된다(Latz et al, 2004; Matsumoto et al, 2003). TLR3은 바이러스 감염 중에 생성된 이중가닥 RNA(dsRNA)의 인식에 연루되고(Alexopoulou et al, 2001), 한편 가까운 친족인 TLR7 및 8은 구아노신 또는 우리딘(Diebold et al, 2004; Heil et al, 2004)과 합성 이미다조퀴놀린-유사 분자인 이미퀴모드 및 레지퀴모드(R-848)(Hemmi et al, 2002; Jurk et al, 2002)에 풍부한 바이러스 단일가닥(ss) RNA를 인식한다. TLR9는 박테리아 및 바이러스 비메틸화 CpG DNA 모티프의 인식을 매개하며(Hemmi et al, 2000), 최근에는 또한 말라리아 기생충 유래의 헤모조인과 같은 비-DNA 병원성 성분을 인식한다는 것이 밝혀졌다(Coban et al, 2005). TLR1O은 병원체-매개 염증 경로, 병원체 인식 및 선천 면역의 활성화에서 어떤 역할을 하지만, TLR10 리간드는 아직 알려지지 않았다.

또한, TLRs는 서열 유사성에 기초하여 6개의 주요 하위군으로 구분될 수 있으며(Roach et al, 2005), 이들 각각은 관련된 PAMPs를 인식한다. TLR1, TLR2 및 TLR6로 구성된 하위군은 리포펩티드를 인식하고, TLR3은 dsRNA, TLR4는 LPS, TLR5는 플라겔린을 인식하며, 매우 근친인 TLR7과 TLR8을 포함하는 TLR9 하위군은 핵산을 인식한다. 중요한 것은 TLRs의 아세포 국지화가 서열 유사성보다는 이들의 리간드의 성질과 상관된다는 점이다(Hargreaves and Medzhitov, 2005). TLR1, 2, 4, 5, 6 및 10은 표면 원형질막에 존재하고, 여기서 이들이 병원체-매개 염증 경로에 연루되고 및/또는 박테리아와 바이러스 성분을 인식하는데 비해, 항-바이러스 TLRs인 TLR3, 7, 8 및 9는 세포내 엔도솜에서 발현된다. 항-바이러스 TLRs에 의해 인식되는 핵산은 척추동물에서도 발견되므로, 엔도솜 내에서 이들의 위치가 자기 핵산에 대한 반응성을 제한한다(Barton et al, 2006). TLR11은 세포 표면에 존재하는 요로병원성 박테리아 및 원생동물 기생충에 대한 수용체이다.

TLRs에 의한 신호화는 복잡하며, 다른 곳에서 검토되었다(Akira and Takeda, 2004; O'Neill, 2006). 간단히 말해서, TLR3를 제외한 모든 TLRs는 TIR 도메인과 죽음 도메인(death domain)을 함유한 세포질 단백질인 어뎁터 분자 미엘로이드 분화 인자 88(MyD88)을 통해 신호를 보낸다. 궁극적으로, NF-κB 및 MAPKs가 TRAF6의 하류에서 활성화되어 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-12와 같은 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 생산을 유도한다. MyD88에 더하여, TLR3와 TLR4는 타입 I 인터페론 및 타입 I 인터페론-의존성 유전자의 생산에 필요한 또 다른 TIR-함유 어뎁터인 TRIF를 통해 신호를 보낸다.

TLRs는 다양한 면역 및 비-면역 세포에서 발현된다. 뮤린 대식세포는 TLR1-9를 발현하는데, 이것은 전염증 반응의 개시에서 이들의 중요성을 반영한다. 바이러스 감염 중에 다량의 타입 I 인터페론을 생산하는 플라스마시토이드 DCs(pDCs)는 TLR7 및 9를 발현한다. 마우스에 존재하는 모든 종래 DCs가 TLR1, 2, 4, 6, 8 및 9를 발현하는데 비해, TLR3만은 CD8+ 및 CD4- CD8- DC 서브셋에 국한된다(Iwasaki and Medzhitov, 2004). 인간에서는 TLR9 발현이 pDCs 및 B 세포에 제한된다(Bauer et al, 2001; Krug et al, 2001).

대부분의 감염에서 제 1 방어선으로서 작용하는 점막 상피세포(ECs) 상에서 TLRs의 발현을 이해하는데 관심이 많다. 최근 연구에서(Yao X-D et al, 2007) 우리는 마우스 및 인간 생식관의 ECs 상에서 TLRs의 발현 및 조절을 이해하는데 집중했다. 레이저 캡처 미소절개법(LCM)을 사용하여, 암컷 마우스에서 발정주기가 질 상피에서 TLRs의 발현에 상당히 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. TLR11을 제외한 본질적으로 모든 TLRs의 mRNA 발현은 발정휴지기 동안 상당히 증가했으며, 장기 작용성 프로게스틴인 Depo-Provera로 처리한 후 특히 그러했다(Yao X-D et al, 원고 제출중). 이러한 발견은 성 매개 감염에 대한 선천 면역방어를 이해하는데 도움이 되었으며, 여성의 생식건강의 질을 증진시켰다.

CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(TLR9의 리간드인 ODN), dsRNA, 및 플라겔린을 포함하는 TLR 리간드의 점막 송달은 선천적 항-바이러스 효과를 유도함으로써 HSV-2의 질내(IVAG) 시험감염으로부터 마우스를 보호할 수 있다(Ashkar and Rosenthal, 2002). HSV-2 유래의 정제된 외피 당단백질(gB)을 CpG ODN 애쥬번트와 함께 비내 투여함으로써 질관에서는 강한 gB-특이적 IgA 및 IgG(발정주기 내내 지속됨)가 그리고 전신 및 생식기에서는 gB-특이적 CTL이 유도되었고, 치사성 IVAG HSV-2 감염으로부터 보호되었다는 것이 연구들에서 밝혀졌다(Gallichan et al, 2001). 계속해서, 비활성화 gp120-고갈 HIV-1과 CpG ODN에 의한 비내 면역화가 생식관에서 항-HTV IgA와 IFNγ 및 β-케모카인의 생산을 포함하는 HIV-특이적 T 세포-매개 면역반응을 유도했다는 것이 밝혀졌다(Dumais et al, 2002). 또한, HIV-1과 CpG로 비내 면역화된 마우스에서는 생식관에서 CD8+ T 세포가 유도되었으며, 이것은 상이한 클레이드 유래의 HIV-1 gag를 발현하는 재조합 우두 바이러스에 의한 IVAG 시험감염에 대해 교차-클레이드 보호를 제공했다(Jiang et al, 2005). 더 최근에는, 생식관이 불량한 면역 유도 부위인 것으로 생각되고 있고, 특히 비-복제 항원에 의한 면역화 후에 그러하다고 하지만, 재조합 서브유닛 HSV-2 gB와 CpG에 의한 암컷 마우스의 면역화는 항원만으로 면역화된 마우스에 비해서 혈청 및 질 세정물에서 더 높은 수준의 gB-특이적 IgG 및 IgA 항체를 유도했으며, gB와 CpG로 면역화된 마우스는 HSV-2로 인한 질 감염에 대해 더 잘 보호되었다(Kwant and Rosenthal, 2004). 따라서, 적합한 점막 애쥬번트가 사용될 경우, 비-복제 서브유닛 단백질 항원에 의한 IVAG 면역화 후 보호성 면역반응을 유도하는 것이 가능하다.

최근 연구에서는 CpG DNA, dsRNA, 및 LPS를 포함하는 PAMPs가 시험관내에서 헤르페스 단순 바이러스 타입 2(HSV-2) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 억제할 수 있었음이 밝혀졌다(Ashkar et al, 2003 & 2004). 어떤 바이러스 항원의 부재하에 질 점막에 경점막 송달된 CpG ODN의 1회분 투약량에 의해 치사량의 HSV-2에 의한 생식기 감염이 보호되었다. 이런 보호작용은 B 및 T 세포를 결여한 녹아웃 마우스에서 발생했으므로, 선천 면역 시스템에 의해 매개된 것이었다. CpG ODN의 국소 IVAG 송달은 질 상피의 빠른 증식과 비후화를 가져왔고, 질 상피세포에서 바이러스 진입은 차단하지 못하지만 바이러스 복제는 억제하는 TLR9-의존성 항-바이러스 상태를 유도했다(Ashkar et al, 2003). TLR3의 리간드인 dsRNA의 점막 송달은 생식기 HSV-2 감염에 대해 보호하였으며, 이때 CpG ODN로 인한 국소 또는 전신 염증은 보이지 않았다(Ashkar et al, 2004). 따라서, TLR3 리간드의 국소 송달은 생식기 바이러스 감염에 대한 더 안전한 보호 수단일 수 있다.

TLRs는 일단의 반응을 유도하며, 이러한 반응은 이들이 활성화되는 세포 타입에 좌우된다(Ashkar and Rosenthal, 2002; Iwasaki and Medzhitov, 2004). 예를 들어, TLR9를 통해 작용하는 CpG DNA에 의한 DCs의 처리는 DCs를 성숙한 상태로 활성화하는데, 여기에는 MHC 부류 II 및 보조-자극성 분자의 상향조절과 전염증성 사이토카인, 케모카인의 생성 및 항원 제시의 증진이 포함된다. 유사하게, CpG에 의한 B 세포의 처리는 이들의 활성화 및 증식, 항체와 IL-6 및 IL-10의 분비를 유도하고, B 세포는 아폽토시스에 내성으로 된다. CpG DNA에 의한 면역세포의 활성화는 Th1-지배 반응을 유도한다.

PRRs가 병원체에 대한 숙주 방어를 매개하는 기전이 주력이 되는 연구 대상이다. 선천 면역반응을 강화하는 이들의 능력으로 인해, 세포내 박테리아, 기생충 및 바이러스로 인한 감염에 대한 보호 또는 치료를 제공할 목적으로 단독 제제로서 PRRs의 리간드, 합성 효현제 또는 길항제를 사용하기 위한 새로운 전략(즉, "선천 면역학")이 필요하다. 또한, 각자의 리간드 또는 효현제를 이용한 PRRs를 통한 선천 면역 시스템의 활성화는 특정 병원체에 대한 면역반응을 강화할 수 있는 전략이며, 이로써 PRRs를 통해 신호를 보내는 제제가 잠재적 백신 애쥬번트가 된다.

해로운 부작용이나 불쾌감을 일으키지 않고 알레르기, 천식, 바이러스 및 미생물 감염, 및 암과 같은 관련된 상태를 치료할 수 있도록 선천적 및 후천적 면역반응을 특이적으로 활성화하는 천연 약초 분획 또는 조성물이 필요하다. 면역반응의 타입은 잘 알려져 있다. Th1 반응은 암과 같은 세포내 병원체 및 세포내 결함에 대한 반응으로서 킬러 T 세포 및 어떤 항체의 생성을 특징으로 한다. Th2 반응은 세포외 병원체에 대항한다. 알레르기 반응은 환경 물질(즉, 알레르겐)에 반응하여 발생하며, 특이적 Th2 반응의 결과이다. Th2 반응은 다른 특이적 타입의 항체의 생성을 특징으로 하며, 전형적인 알레르기 반응으로서, 알레르겐을 점막 표면의 병원체로서 착각하여 면역반응을 촉발시키고, 그 결과 눈물어림, 기도 염증 및 폐내 기도 근육세포의 수축과 같은 증상이 초래된다. TLR 활성화는 항원-제시 세포가 Th1-타입 면역반응을 지향하는 사이토카인을 생산하도록 유도하며, 이로써 알레르겐에의 노출로 인한 해로운 Th2 반응의 발생이 예방되거나 감소한다.

알레르기는 특히 IgE에 의한 비만세포 및 호염기구라고 불리는 백혈구의 과도한 활성화로 인한 극단적인 염증반응을 특징으로 한다. 알레르기 경향의 사람이 알레르겐에 처음 노출되면, 다량의 상응하는 특이적 IgE 항체가 만들어진다. IgE 분자는 비만세포(조직 내의) 또는 호염기구(순환계 내의)의 표면에 부착된다. 비만세포는 폐, 피부, 혀, 그리고 코 및 장관의 안쪽에서 발견된다. 비만세포 또는 호염기구 상의 IgE 항체가 그것의 특이적 알레르겐과 마주치면, IgE 항체가 비만세포 또는 호염기구로 신호를 보내서 히스타민, 헤파린, 및 호산구 및 호중구와 같은 혈소판을 활성화하고 2차 세포를 유인하는 물질 등, 화학물질이 방출된다. 활성화된 비만세포 또는 호염기구는 또한 프로스타글란딘 및 류코트리엔을 포함하는 새로운 매개인자를 합성한다. 이들 화학적 매개인자들은 쌕쌕거림, 재채기, 눈물어림 및 가려움증을 포함하는 알레르기와 관련된 증상들을 야기한다. 습진, 두드러기, 건초열, 천식, 음식 알레르기, 및 말벌 및 꿀벌과 같은 쏘는 곤충의 독에 대한 반응 등이 흔히 발생하는 알레르기 반응이다.

천식 악화는 환자의 폐 기능에 심각한 위해를 끼치며, 그 결과는 주로 입원과 심지어 사망에까지 이르게 된다. 폐의 주 기도인 기관지 관들에 염증이 생겼을 때 천식이 발생한다. 기관지 벽의 근육이 수축되고, 폐의 세포들이 과잉의 점액을 생성하여 기도가 좁아지고, 심하지 않은 쌕쌕거림에서 심각한 호흡곤란까지 일어나게 된다. 천식은 감기와 같은 호흡기 바이러스 감염에 의해 주로 촉발되지만, 담배연기, 먼지 진드기, 동물 비듬, 식물 꽃가루, 공기오염, 방취제 및 향수와 같은 다른 자극제들도 더욱 빈번히 심하며 통제할 수 없는 천식 증상을 일으킬 수 있다. 다른 천식 촉발제는 운동, 차가운 공기, 및 감정적인 스트레스를 포함한다. 대부분의 천식 악화는 일반적인 기도 바이러스 감염에 의해서 촉진된다. 아이들에 있어서는 아토피 및 바이러스 감염 두 가지가 중요 위험 인자로서, 쌕쌕거리는 증상 때문에 병원에 입원하기도 한다. 천식 발작 및 특히 바이러스에 의한 천식 악화의 임상적 중요성은 분명하지만, 천식 환자가 흔한 감기 바이러스에 걸린 후에 그렇게 악화되는지의 이유는 충분히 이해되지 않고 있다.

정상 상태에서는 바이러스 감염에 의해 CD8+ T 세포로 주로 이루어진 큰 단핵세포 성분과 함께 기도로의 호중구 유입이 일어난다. 그러나, 숙주의 기존 상태에 따라서는 바이러스 감염이 기도 호산구증가증을 포함하여 일단의 염증반응을 야기할 수 있다는 것이 분명해지고 있다. 아토피 개체에서는 리노바이러스 감염 실험에서 항원 시험감염 후에 기도로의 호산구 동원이 증가하며, 비-알레르기 개체에 비하여 기도 반응성이 증가한다. 리노바이러스의 비내 감염 후, 천식 개체의 하기도 생검조직은 증가된 호산구를 함유하며, 이것은 심지어 회복기까지도 지속된다. 천식 환자에서 악화 시기 동안 기도에 호산구가 존재한다는 사실은 잘 확립되었다. 천식 악화 동안 기도에서의 호산구 발견은 다소 역설적이며, 이러한 악화가 대체로 바이러스 감염에 의해서 촉발된다고 생각된다. 천식 환자에서 바이러스 감염 중에 기도에 존재하는 호산구와 이들의 탈과립화 산물의 관련성이 설명되었지만, 호산구가 바이러스에 반응하여 활성화되는지의 여부와 이 활성화가 어떻게 일어나는지는 아직 알려지지 않았다.

천식 악화가 발생하는 것에 대한 현재의 설명은 이펙터 세포(즉, 호산구, 비만세포, 호염기구, 호중구)가 활성화될 수 있음을 시사한다. 도 1은 기도에서 바이러스-유도 호산구 매개인자 방출 모델을 예시하는데, 이것은 기도 평활근의 신경통제 불능으로 인한 기도 과다반응성을 유발한다. 바이러스 또는 바이러스 항원은 기억 T 세포 쪽에 출현한다. 활성화된 T 세포(CD4)는 미지의 가용성 탈과립화 인자를 방출하는데, 이것은 GM-CSF와 같은 사이토카인일 가능성이 있다. 또한, 이들 T 세포는 세포 표면 리간드, 예를 들어 ICAM-1을 발현할 수 있다. 호산구는 가용성 매개인자, 세포 표면 리간드, 또는 이들의 조합에 반응하며, 동시에 여러 호산구 매개인자들(즉, 호산구 주요 염기성 단백질, 호산구 퍼옥시다제, RANTES)이 방출된다.

천식 환자에서 기도 내 바이러스-유도 호산구 매개인자 방출은 천식 악화의 발생과 상관된다. 호산구가 바이러스-유도 천식 악화의 발생에 연루되는 것에 관하여, 그것은 다른 세포를 통해 간접적으로 또는 직접적으로 바이러스에 반응하는 것이 틀림없다. 이 과정이 바로 바이러스-유도 호산구 매개인자 방출이다.

서구의 의사들은 약초의 예방적 및 치료적 특정에 관한 과학적 연구의 부족으로 인하여 약초 의약을 처방하는 것을 내키지 않아 했다. 그러나, 약초 의약은 합성 약물이 일반적으로 직면하는 장기간의 개발 시간과 많은 비용을 필요로 하지 않는다. 또한, 이들은 쉽게 입수할 수 있으며, 피험자에게 처방약 또는 백신에 비해서 최소한의 부작용으로 더욱 편안하게 이용할 수 있는 대용품을 제공한다.

한 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 인삼 분획의 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 피험자에서 선천 면역 신호화의 활성화에 의한 치료에 민감한 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 이러한 상태는 알레르기, 천식, 바이러스 감염, 미생물 감염 또는 암에서 선택된다. 한 구체예에서, 바이러스 감염은 호흡기 또는 점막 매개 바이러스로 인한 것이며, 제한은 아니지만, 인플루엔자, 코로나 바이러스, 헤르페스, 호흡기 세포융합 바이러스, 랍도비리다에, 또는 인간 면역결핍 바이러스를 포함한다.

한 구체예에서, 상기 분획은 Panax quinquefolius , Panax trifolia , Panax ginsengs, Panax japonicus , Panax schinseng , Panax notoginseng , Panax pseudoginseng, Panax vietnamensis , Panax elegatior , Panax wangianus , Panax bipinratifidus, 생삼 또는 수삼, 백삼, 또는 홍삼에서 선택된 인삼으로 제조된다. 한 구체예에서, 분획은 Panax quinquefolius의 분획이다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002, PQ₂, PQ₂₂₃ 또는 CVT-E002, PQ₂ 및 PQ₂₂₃로부터 정제된 분획에서 선택된다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002이다. 한 구체예에서, CVT-E002는 Toll-유사 수용체로부터의 신호 전달을 조정한다. 한 구체예에서, Toll-유사 수용체는 Toll-유사 수용체 2이다. 한 구체예에서, Toll-유사 수용체는 Toll-유사 수용체 2와 Toll-유사 수용체 6의 헤테로다이머이다. 한 구체예에서, Toll-유사 수용체는 Toll-유사 수용체 2와 Toll-유사 수용체 1의 헤테로다이머이다. 한 구체예에서, Toll-유사 수용체는 Toll-유사 수용체 4이다. 한 구체예에서, CVT-E002는 림프구 및 항원-제시 세포의 상향조절, 사이토카인 분비, 항-바이러스 인자 분비, 또는 이들의 조합을 유도한다.

한 구체예에서, 본 발명은 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 상태를 예방, 치료 또는 완화하기 위한 인삼의 분획에 관한 것이다. 한 구체예에서, 분획은 Panax quinquefolius , Panax trifolia , Panax ginseng , Panax japonicus , Panax schinseng , Panax notoginseng , Panax pseudoginseng , Panax vietnatnensis , Panax elegatior, Panax wangianus , Panax bipinratifidus , 생삼 또는 수삼, 백삼, 또는 홍삼에서 선택된 인삼으로 제조된다. 한 구체예에서, 분획은 Panax quinquefolius의 분획이다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002, PQ₂, PQ₂₂₃ 또는 CVT-E002, PQ₂ 및 PQ₂₂₃로부터 정제된 분획에서 선택된다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002이다.

한 구체예에서, 본 발명은 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 상태를 예방, 치료 또는 완화하기 위한 식품을 포함하는 다른 의약 또는 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 인삼 분획을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서, 상기 분획은 Panax quinquefolius , Panax trifolia , Panax ginseng, Panax japonicus , Panax schinseng , Panax notoginseng , Panax pseudoginseng, Panax vietnamensis , Panax elegatior , Panax wangianus , Panax bipinratifidus, 생삼 또는 수삼, 백삼, 또는 홍삼에서 선택된 인삼으로 제조된다. 한 구체예에서, 분획은 Panax quinquefolius의 분획이다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002, PQ₂, PQ₂₂₃ 또는 CVT-E002, PQ₂ 및 PQ₂₂₃로부터 정제된 분획에서 선택된다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002이다.

한 구체예에서, 본 발명은 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 상태를 예방, 치료 또는 완화하기 위한 인삼 분획을 포함하는 식품에 관한 것이다. 한 구체예에서, 분획은 Panax quinquefolius , Panax trifolia , Panax ginseng , Panax japonicus, Panax schinseng , Panax notoginseng , Panax pseudoginseng , Panax vietnamensis, Panax elegatior , Panax wangianus , Panax bipinratifidus , 생삼 또는 수삼, 백삼, 또는 홍삼에서 선택된 인삼으로 제조된다. 한 구체예에서, 분획은 Panax quinquefolius의 분획이다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002, PQ₂, PQ₂₂₃ 또는 CVT-E002, PQ₂ 및 PQ₂₂₃로부터 정제된 분획에서 선택된다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 상태를 예방, 치료 또는 완화하기 위한 제약 조성물 또는 식품의 제조를 위한 인삼 분획의 사용에 관한 것이다. 한 구체예에서, 상기 상태는 알레르기, 천식, 바이러스 감염, 미생물 감염 또는 암에서 선택된다. 한 구체예에서, 바이러스 감염은 호흡기 또는 점막 매개 바이러스로 인한 것이며, 인플루엔자, 코로나 바이러스, 헤르페스, 호흡기 세포융합 바이러스, 랍도비리다에, 및 인간 면역결핍 바이러스를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 분획은 Panax quinquefolius , Panax trifolia , Panax ginseng, Panax japonicus , Panax schinseng , Panax notoginseng , Panax pseudoginseng, Panax vietnamensis , Panax elegatior , Panax wangianus , Panax bipinratifidus, 생삼 또는 수삼, 백삼, 또는 홍삼에서 선택된 인삼으로 제조된다. 한 구체예에서, 분획은 Panax quinquefolius의 분획이다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002, PQ₂, PQ₂₂₃ 또는 CVT-E002, PQ₂ 및 PQ₂₂₃로부터 정제된 분획에서 선택된다. 한 구체예에서, 분획은 CVT-E002이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 인삼 분획 또는 식품을 포함하는 다른 의약 또는 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 인삼 분획을 포함하는 제약 조성물을 피험자에게 투여함으로써 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 이러한 활성화가 필요한 피험자에서 상태를 예방, 치료, 또는 완화하기 위한 방법에 관한 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 필요한 피험자에게 인삼 분획을 투여함으로써 Toll-유사 수용체로부터의 신호 전달을 조정하는 단계를 포함하는 선천 면역 신호화의 활성화와 관련된 상태를 예방, 치료, 또는 완화하기 위한 방법에 관한 것이다.

도 1은 기도 내 바이러스-유도 호산구 매개인자 방출의 작동 모델을 나타낸다.
도 2는 파라인플루엔자 바이러스 및 자가 림프구, 수지상 세포, 및 대식세포의 다양한 조합과 공-배양 후, 인간 호산구로부터의 호산구 퍼옥시다제 방출을 나타낸다(p<0.001). 각 막대는 상이한 공여자를 이용한 적어도 12회의 실험의 평균 ± SEM이다.
도 3은 파라인플루엔자 바이러스 및 항원-제시 세포(즉, 대식세포 및 수지상 세포)와 함께 6일간 배양한 후(34℃, 5% 이산화탄소), 림프구 증식(H3-티미딘 혼입에 의해 측정)이 일어난 것을 나타낸다. 각 막대는 상이한 활성 바이러스 공여자를 이용한 적어도 5회의 실험의 평균 ± SEM이다. 유사한 결과가 RSV에서도 얻어졌다(데이터 나타내지 않음).
도 4는 수지상 세포와의 공-배양물 중의 림프구를 특성화하기 위한 유세포분석의 결과를 나타낸다.
도 5는 ELISA/Searchlight, n=1에 의해 측정된 사이토카인/케모카인의 목록을 나타낸 표이다. 화살표는 적합한 각 대조군에 대한 상대값을 표시한다.
도 6은 림프구, CVT-E002 및 수지상 세포와 함께 6일간 배양한 후(34℃, 5% 이산화탄소), 림프구 증식(광 현미경에 의해 시각화, H3-티미딘 혼입에 의해 측정)이 일어난 것을 나타낸다.
도 7a-7d는 항원 제시 및 DC 돌연변이에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다. 도 7a는 세포의 아집단을 나타낸다. 도 7b는 상이한 조건에서 DQ-OVA 흡수 및 변성에 대해 세포를 스크리닝한 결과를 나타낸다. 수치는 각 범주 내에서 DQ-OVA 양성인 세포의 퍼센트를 표시한다. 도 7c는 크기 및 과립도에 의한 DC 돌연변이 평가를 나타낸다(수치는 각 범주에 존재하는 총 세포의 퍼센트를 표시한다). 도 7d는 CVT-E002 처리를 하지 않은 것(좌측)과 한 것(우측)의 DC의 아집단을 나타낸 유세포분석 이미지이다.
도 8a 및 8b는 CVT-E002 처리가 시험관내 RAW264.7 세포에서 IL-6(도 8a) 및 IFN-β(도 8b) 생산을 자극한 것을 나타낸다.
도 9는 CVT-E002 처리가 시험관내 산화질소(NO) 생산을 자극한 것을 나타낸다.
도 10은 CVT-E002와의 인큐베이션 후, 1차 인간 단핵구/대식세포에 의한 IL-6 생산을 나타낸다.
도 11a 및 11b는 CVT-E002가 시험관내 VSV 복제를 현저히 억제한 것을 나타낸다.
도 12는 C57/B6와 MyD88-/- 복막 대식세포를 CVT-E002 또는 HT-1001로 처리하는 동안의 IL-6 생산을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 C57/B6와 MyD88-/- 복막 대식세포를 CVT-E002 또는 HT-1001로 처리하는 동안의 IL-6(도 13a) 또는 IFN-B(도 13b) 생산을 나타낸다.
도 14는 24시간에 걸친 CVT-E002 처리가 hTLR2, hTLR1/2, hTLR2/6 및 hTLR4로 트랜스펙션된 293 세포에서 IL-8 생산을 자극한 것을 나타낸다(Pam3CSK/LPS 대조군). hTLR4는 hTLR4와 MDR 및 CD14의 공-발현을 표시한다.
도 15는 48시간에 걸친 CVT-E002 처리가 hTLR2, hTLR1/2, hTLR2/6 및 hTLR4로 트랜스펙션된 293 세포에서 IL-8 생산을 자극한 것을 나타낸다(Pam3CSK/LPS 대조군). hTLR4는 hTLR4와 MDR 및 CD14의 공-발현을 표시한다.
도 16a 및 16b는 CVT-E002 처리가 기도 과민반응(AHR)의 발생을 억제하고(도 16a), 호산구 기도 염증의 양을 감소시킨다(도 16b)는 것을 나타낸다.
도 17a 및 17b는 점막 계면으로의 CVT-E002 송달이 동일한 점막 표면에 송달된 바이러스(HSV-2)에 대하여 보호를 제공한 것을 나타낸다. 도 17a는 HSV-2 IVAG 시험감염 후 CVT-E002, HT1OO1 또는 PBS IVAG가 제공된 C57BL/6 마우스의 질 병증 점수를 나타낸다. 도 17b는 HSV-2 IVAG 시험감염 후 CVT-E002, HT1OO1 또는 PBS IVAG가 제공된 C57BL/6 마우스의 생존 퍼센트를 나타낸다.
본 발명의 추가의 양태와 이점이 이후의 설명으로부터 분명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명과 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내는 것으로서 단지 본 발명을 예시할 뿐이며, 이 상세한 설명으로부터 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다.

본 발명을 설명하면서 본원에서 정의되지 않은 모든 용어는 일반적으로 인식되는 기술적인 의미를 가진다. 다음의 설명이 본 발명의 특정 구체예나 특정 용도에 속하는 범위에서, 그것은 단지 예시일 뿐이며, 청구된 발명을 제한하지 않는다. 다음의 설명은 첨부된 청구항에 정의된 대로의 본 발명의 사상 및 범위에 포함되는 모든 대용물, 변형 및 등가물을 포괄한다.

본원 및 청구항에서 사용된, 하기 제시된 용어와 문구들은 다음의 의미를 가진다.

"생체적합성"은 의도된 이용에서 현저한 바람직하지 않은 숙주 반응이 발생하지 않음을 의미한다. 더 바람직하게는, 생체적합성 물질은 의도된 이용에서 비-독성이다. 따라서, 인간에서 이용하기 위해, 생체적합성은 인간 또는 인간 조직에 대해 비-독성인 것이 바람직하다.

"담체"는 생체적합성이며 제약학적으로 허용되는 적합한 비히클을 의미하며, 예를 들어 하나 이상의 고체, 반고체 또는 액체 희석제, 부형제, 애쥬번트, 향미제 또는 투여에 적합한 캡슐화 물질을 포함한다.

"피험자"는 인간 또는 다른 척추동물을 의미한다. 피험자는 아동 또는 성인일 수 있다.

"기능성 식품"은 일반적인 섭식의 일부로서 소비되는 종래의 식품과 외관상 유사하거나, 또는 이러한 종래의 식품일 수 있으며, 생리학적 이점을 가지고 및/또는 기본적인 영양 기능을 넘어서 질환의 위험을 감소시킨다고 증명되는데, 즉 이들은 활성 성분을 함유한다.

"건강보조식품"은 식품으로부터 분리된 또는 정제된 제품으로서, 일반적으로는 식품과는 관련 없이 의약 형태로 통상 판매된다. 건강보조식품은 생리학적 이점을 가지거나, 또는 질환에 대한 보호작용을 제공한다.

"백신 애쥬번트"는 백신에 첨가되었을 때 증가된 또는 강화된 면역반응을 촉진할 수 있는 어떤 물질 또는 화합물을 의미한다.

"백신"은 정상적인 면역반응을 자극하도록 설계된 항원의 어떤 화합물 또는 제조물을 의미한다. 백신은 예방적 또는 치료적일 수 있다.

"유효량" 및/또는 "치료량"은 치료될 질환 상태의 예방, 치료 및/또는 완화를 제공하기에 충분한 투약량을 의미한다. 이것은 환자, 질환, 및 행해질 치료에 따라 변할 것이다. 예를 들어, 바이러스 감염인 경우, "유효량"은 감염이 치료될 가능성을 실질적으로 개선하는데 필요한 양, 특히 감염이 충분히 예방되거나 또는 감염이 발생했을 때 감염이 제거될 가능성을 개선하는 양이다.

"분획"은, 예를 들어 물, 에탄올, 이들의 혼합물, 오일 또는 식물 추출 기술 분야에 잘 알려진 어떤 다른 적합한 용매와 같은 적합한 용매로 식물 또는 식물 일부분을 추출하여 얻어진 농축 제조물을 말한다. 분획 또는 추출물은 약리학적으로 허용된다면 그대로 사용될 수도 있고, 아니면 얻어진 용액의 용매를 제거하고, 잔류물을 그대로 사용하거나, 추가로 워크업한 후, 예를 들어 적합한 용매에 재용해하거나 재현탁한 후 사용한다. 용어 "식물"은 전체 식물 및 활성 성분을 포함하는 식물 일부분, 예를 들어 잎, 줄기, 열매 또는 뿌리를 의미하는 것으로 이해된다.

"인삼"은 다종 다양한 인삼을 말하며, 제한은 아니지만, 하기 목록에 나타낸 것들을 포함한다.

두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 Panax 속 식물의 많은 다른 속들이 존재하며, 이로부터 인삼 분획이 얻어질 수 있고, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 또한, 용어 "인삼"은 야생 인삼 또는 가공된 인삼을 포함한다. 야생 인삼은 가내에서 씨를 심거나 재배한 것이 아니라, 자연적으로 자라며, 자라는 것이 발견된 곳에서 수확한 인삼이다. 가공된 인삼은, 예를 들어 수삼 또는 생삼, 백삼, 및 홍삼을 포함한다. 수삼 또는 생삼은 밭에서 수확한 날 인삼이다. 백삼은 수삼을 건조시켜 얻고, 홍삼은 수삼을 찐 후, 그 찐 인삼을 건조시켜 얻는다.

"인삼 분획" 또는 "인삼 분획들"은 표 1에 열거된 또는 상기 설명된 다종 다양한 인삼으로 제조된 분획, 및 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 약리학적 평가를 수행함으로써 검증된, 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 피험자에서 상태를 예방, 치료 또는 완화하는 활성을 나타내는, 상기 인삼 분획으로부터 얻어진 하위분획을 말한다.

"CVT-E002"는 Panax quinquefolius로부터 얻어진 예시적인 인삼 분획을 말하며, 면역조절 특성을 가진다(본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제6,432,454호; 제7,067,160호; 제7,186,423호 및 제7,413,756호에서 이미 설명되었다). CVT-E002는 본원에 설명된 대로 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하는 추가적 활성을 나타낸다.

"PQ₂"는 Panax quinquefolius로부터 얻어진 예시적인 인삼 분획을 말하며, 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제6,432,454호; 제7,067,160호; 제7,186,423호 및 제7,413,756호에 이미 설명된 대로 면역조절 특성을 가진다.

"PQ₂₂₃"은 Panax quinquefolius로부터 얻어진 예시적인 인삼 분획을 말하며, 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제6,432,454호; 제7,067,160호; 제7,186,423호 및 제7,413,756호에 이미 설명된 대로 면역조절 특성을 가진다.

인삼 이외의 식물 또는 식물 일부분 유래의 분획, 또는 본 발명에서 동등하게 사용될 수 있는 합성 분획도 이들의 화학적 성질 및 활성이 본원에서 사용된 인삼 분획과 충분히 유사하다면 본 발명의 범위 내라는 것이 당업자에게 인정될 것이다.

본 발명은 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 상태를 예방, 치료 또는 완화하기 위한 인삼 분획, 또는 인삼 분획을 포함하는 제약 조성물 또는 식품에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Toll-유사 수용체와 같은 패턴 인식 수용체(PPRs)를 통해 선천 및 후천 면역 시스템을 활성화하여 피험자에서 각종 상태를 치료, 예방 또는 완화하기 위한 인삼 분획, 또는 인삼 분획을 포함하는 제약 조성물 또는 식품에 관한 것이다. 이러한 상태는, 제한은 아니지만, 바이러스 및 미생물 감염, 알레르기, 천식, 및 암을 포함한다. 본 발명자가 아는 한에서, 천연 식물-유래 분획이 PRRs를 통해서 포유류 선천 면역 시스템을 특이적으로 활성화한다고 밝혀진 것은 이것이 처음이다. 한 구체예에서, 인삼 분획은 Panax quinquefolius의 분획이다. 한 구체예에서, 인삼 분획은 CVT-E002, PQ₂, PQ₂₂₃ 및 CVT-E00₂, PQ₂ 및 PQ₂₂₃으로부터 정제된 분획으로 구성되는 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 인삼 분획은 CVT-E002이다.

인삼 분획은 전형적으로 먼저 인삼 식물 또는 식물 일부분을 건조시켜 분말화한 다음, 적합한 용매, 전형적으로는 물, 에탄올, 에탄올/물 혼합물, 메탄올, 부탄올, 이소-부탄올, 아세톤, 헥산, 석유 에테르 또는 다른 유기 용매들을 사용하여 추출 과정을 수행함으로써 제조된다. 다음에, 분획 또는 추출물은 추가 증발될 수 있으며, 이로써 농축되어, 분무 건조, 진공 오븐 건조, 또는 동결 건조에 의해 건조 추출물이 수득된다. Panax quinquefolius의 뿌리 부분의 수용성 추출물로부터, CVT-E002, PQ₂, PQ₂₂₃ 및 CVT-E002, PQ₂ 및 PQ₂₂₃으로부터 정제된 분획으로 구성된 군에서 선택되는 예시적인 인삼 분획을 제조하는 과정은 미국특허 제6,432,454호; 제 7,067,160호; 제7,186,423호 및 제7,413,756호에서 이미 설명되었으며, 이들의 명세서가 본원에 참고자료로 포함된다.

일단 제조된 후, 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 약리학적 평가를 수행함으로써 인삼 분획을 평가하여 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하는 활성을 평가 및 확인한다. 본 발명에서, 이러한 평가는, 제한은 아니지만, 바이러스 복제(실시예 1 및 2 참조) 및 수지상 세포 기능(실시예 3 참조)에 대한 예시적인 인삼 분획 CVT-E002의 효과에 관한 시험관내 연구를 포함한다. 본 발명에서는 모든 약리학적 평가가 적합하며, 단 이들 평가는 인삼 분획, 대규모 제조인 경우 인삼 분획 뱃치에서 취한 대표 샘플, 또는 인삼 분획의 감분에서 상기 활성을 표시하는데 집중되어야 한다. 제품의 뱃치별 품질은 ChemBioPrint™ 기술에 의해서 검증될 수 있고, 이로써 제품의 화학적 및 약리학적 일관성이 보장되는데, 이것은 본원에 참고자료로 포함되는 미국특허 제6,156,291호에 설명된다.

또한, 본 발명은 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 피험자에서 상태를 치료, 예방 또는 완화하는데 적합한 제약 조성물 또는 식품의 제조에서, 단독으로의 또는 다른 의약과 조합된 인삼 분획의 사용에 관한 것이다. 한 구체예에서, 인삼 분획은 Panax quinquefolius의 분획이다. 한 구체예에서, 인삼 분획은 CVT-E002, PQ₂, PQ₂₂₃ 및 CVT-E002, PQ₂ 및 PQ₂₂₃으로부터 정제된 분획으로 구성된 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 인삼 분획은 CVT-E002이다.

또한, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 인삼 분획을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 어떤 제약학적으로 허용되는 담체라도 당업자에게 익숙하므로, 본 발명에 따른 제약 조성물의 제조 과정은 상세히 논의하지 않는다. 적합하게, 제약 조성물은 정제, 캡슐, 액체, 로젠지, 로션, 에어로졸, 주사에 적합한 용액 또는 좌약의 형태일 수 있다.

경구 조성물은 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함할 수 있다. 치료용 경구 투여를 위하여, 인삼 분획이 부형제와 혼합되어, 정제, 트로셰, 또는 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 경구 조성물은 마우스워시로서 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수도 있다. 제약학적으로 적합한 결합제 또는 다른 담체 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 이러한 결합제 및 담체는 미세결정 셀룰로오스, 검 트래거캔스 또는 젤라틴과 같은 바인더; 녹말 또는 락토오스와 같은 부형제; 알긴산, 또는 옥수수 녹말과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 콜로이드상 이산화규소와 같은 활택제; 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 향미제일 수 있다.

흡입 투여에서는, 화합물이 적합한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 송달된다.

또한, 전신 투여가 경점막 또는 경피 수단에 의해서 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여에서는, 침투될 장벽에 따른 적합한 침투제가 조제물에 사용된다. 이러한 침투제는 본 분야에 일반적으로 알려져 있다. 경점막 투여는 비강 스프레이, 좌약 또는 직장 송달용 정체 관장제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 좌약은 코코아 버터 및 다른 글리세리드류 등, 종래의 좌약 베이스를 포함할 수 있다. 경피 투여에서는, 본 분야에 일반적으로 알려진 대로, 활성 화합물이 연고, 고약, 젤, 또는 크림으로 조제된다.

또한, 인삼 분획은 임플란트, 코팅 및 마이크로캡슐 송달 시스템을 포함하는 제어 방출 조제물과 같이, 신체로부터의 빠른 제거에 대해 활성제를 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다.

인삼 분획은 단독으로 또는 다른 의약과 조합하여 사용될 수 있다. 암 환자는 면역 시스템이 심각히 억제되는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 인삼 분획은 화학치료제와의 병용투여에, 또는 방사선요법의 보충제로서 특히 적합하다. 또한, 인삼 분획은 면역조절제 또는 백신 애쥬번트로서 사용될 수도 있다.

여러 가지 고체, 반고체 또는 액체 식품이 활성제로서 인삼 분획을 포함하여 제조될 수 있다. 이러한 식품의 비제한적 예들을 시리얼, 파스타, 과자류(예를 들어, 쿠키, 케이크, 캐러멜, 껌, 사탕), 영양제, 스낵 또는 식사대용바, 요구르트, 젤라틴, 잼, 푸딩, 수프, 과일 또는 야채 베이스, 음료(예를 들어, 주스, 소프트 드링크, 스포츠 에너지 드링크, 생수, 우유, 대두 제품), 및 아동 및 유아용 식품(예를 들어, 유아용 포뮬라, 변형 유분말, 베이비 푸드)를 포함한다. 또한, 인삼 분획은 기능성 식품, 건강보조식품, 또는 다이어트 보충제에서 활성 성분으로 사용될 수 있다.

인삼 분획 조제물은 숙성시 일부 활성이 손실될 수 있으므로, 적합한 형태로 제조하거나, 또는 신선한 투여를 위해, 예를 들어 성분 키트 형태로 제조함으로써, 숙성을 피하고 인삼 분획의 효능을 최대화한다. 사용시까지 조제물의 상을 분리하여 유지하기 위한 적합한 키트 또는 용기는 잘 알려져 있다. 예를 들어, 분말 형태로 인삼 분획을 함유하는 키트는 투약량 특이적 양의 식염수 용액, 알코올 또는 물과 같은 멸균 담체 및 가능한 다른 성분들과 분리하여 포장될 수 있으며, 사용시 혼합된다. 인삼 분획은 "티백" 타입 인퓨저, 파우치 또는 샤셰로 제공될 수 있으며, 이 경우 사용시 액체 조제물이 만들어진다. 티백 타입 인퓨저는 파우치가 어떤 타입의 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의한)에는 해로울 수 있는 분말의 작은 미립자에 대한 필터로 작용할 수 있다는 점에서 유리하다. 또한, 미립자는, 예를 들어 여과에 의해 제거될 수 있다.

본 발명에 따른 인삼 분획의 투약량은 치료될 특정한 상태, 및 환자의 나이, 성별 및 일반적인 건강 상태에 따른다. 그러나, 적합한 투약량은 1 내지 10회의 1일 분량으로 1일 1 내지 5000 mg/kg 체중의 범위에서 찾을 수 있다. 장기 또는 예방적 용도를 위한 바람직한 1일 투약량은 400mg이다. 급성 용도를 위해서는 상당히 더 높은 분량이 처음에 투여된다. 예를 들어, 1800mg이 3회 분량으로 나누어 첫날 투여될 수 있고, 1200mg이 3회 분량으로 나누어 둘째 날 투여될 수 있고, 900 mg이 3회 분량으로 나누어 셋째 날 투여될 수 있다. 이후, 증상이 감소할 때까지 200-400mg이 매일 투여될 수 있다. 인삼 분획은 경구, 주사 또는 주입, 국소, 비강, 안구, 질 또는 직장 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 인삼 분획은 선천적 및 후천적 면역반응을 활성화하여 피험자에서 각종 상태를 예방, 치료 또는 완화하는데 효과적이다. 추가하여, 인삼 분획이 천연, 식용 제품으로부터 제조되기 때문에, 부작용의 가능성이 감소한다. 선천적 및 후천적 면역반응을 자극하여 바이러스 감염, 알레르기 및 천식을 예방, 치료 또는 완화하는 인삼 분획의 능력이 하기 논의되며 및/또는 예시적인 인삼 분획 CVT-E002를 사용하여 실시예에서 증명된다.

CVT-E002는 염증 및 항-바이러스 인자를 생산하는 선천 면역 시스템의 활성을 조절한다. CVT-E002로 시험관내에서 뮤린 단핵구 세포를 처리한 후, 헤르페스 단순 바이러스 타입 2 또는 수포성 구내염 바이러스에 노출시킨 경우에는 IL-6, 인터페론-β 및 산화질소 생산 수준이 용량-의존적 방식으로 상당히 상승한 반면, 미처리 배양물과 대조군 처리된 배양물은 음성이었다(실시예 1, 도 8a, 8b 및 9). 유사하게, 40시간 동안 CVT-E002와 함께 1차 인간 단핵구/대식세포를 인큐베이션한 경우에도 IL-6의 생산이 상당히 용량-의존적이었다(도 10).

녹색 형광 단백질(VSV-GFP)로 표지된 수포성 구내염 바이러스를 사용한 경우에는, CVT-E002가 시험관내에서 바이러스 복제를 상당히 억제했다(도 11a 및 11b). CVT-E002는 HIV-1을 포함하는 여러 가지 성 매개 바이러스 감염에 대해서도 보호할 수 있다. 본원에 설명된 결과는 CVT-E002의 국소 도포가 선천적 점막 면역 시스템을 빠르게 활성화함으로써 국소 항-바이러스 상태를 유도하여 성 매개 원인제에 의한 감염으로부터 점막 표면을 보호한다는 것을 뒷받침한다. 이 접근법은 보호작용에 더욱 "천연 살균제"이며 진화론적으로 오래된 선천적 점막 면역반응을 이용한다는 점에서 훨씬 안전하고 내성 병원체의 선별에 덜 민감할 수 있다.

모든 TLRs(TLR3 제외)에 의한 신호화는 전사 인자 NF-κB를 활성화하는 어뎁터 단백질인 미엘로이드 분화 1차 반응 유전자 88(MyD88)을 통해 일어난다. CVT-E002 처리 후의 사이토카인 반응이 MyD88 신호화에 의존했는지의 여부를 결정하기 위해서, C57B1/6 야생형 또는 MyD88 녹아웃(MyD88-/-) 마우스로부터 복막 대식세포 배양물을 확립하고, CVT-E002로 처리하거나 처리하지 않았다(실시예 4). CVT-E002 처리 후 IL-6과 IFN-β의 생산은 모두 MyD88-의존적이었으며, 이는 CVT-E002가 TLR 신호화의 자극에 기초하여 면역세포에서 전염증성 및 항-바이러스 사이토카인의 생산을 활성화한 것을 나타낸다.

TLRs가 CVT-E002에 의해 활성화되는지 결정하기 위해서, HEK293 세포를 이용하여 특정 인간 TLR 유전자를 안정하게 발현하도록 구성하였다(실시예 5, 도 14 및 15). CVT-E002는 hTLR4를 단독으로 발현하는 세포로부터는 IL-8 생산을 자극하지 않았지만, 이 결과는 CVT-E002가 hTLR4와 MD2-CD14를 발현하는 세포로부터의 IL-8 생산을 두 상이한 시점에서 용량-의존적 방식으로 자극했음을 나타낸다. 흥미롭게도 CVT-E002는 또한 인간 TLR2를 발현하는 세포를 용량-의존적 방식으로 자극했다. 또한, TLR2가 TLR1 및 TLR6과 헤테로다이머를 형성할 수 있으므로, hTLR2를 단독으로 발현하거나 또는 hTLR2/1과 hTLR2/6을 발현하는 세포의 자극을 비교했다. CVT-E002와의 인큐베이션은 이들 각 셀라인에서 용량-의존적 IL-8 생산을 유도했지만, hTLR2만을 발현하는 세포는 상당히 높은 IL-8 수준을 일관적으로 생산했다. 동등한 세포 수를 가진 전체 4개 셀라인을 비교하는 실험에서, CVT의 선천 면역 활성화의 대부분은 TLR2를 통해 이루어졌다. 각 TLRs를 발현하는 세포를 사용하여 CVT-E002가 리포다당(LPS)에 대한 선천적 PRR인 TLR4를 통해서는 최소 신호를 나타낸다는 것이 판명되었다(도 14). 전체적으로, 결과는 인삼 분획(예를 들어, CVT-E002)이 TLRs를 통해서 선천 면역 시스템을 활성화할 수 있음을 시사한다. 이것은 이들의 항-감염 보호 효과를 설명할 수 있으며, 인삼 분획이 백신 성분에 대한 선천 및 후천 면역을 자극하는 것을 돕는 잠재적 백신 애쥬번트로서 유용하며, 이로써 더욱 효과적인 백신을 제조할 수 있다는 것을 나타낸다.

선천적 및/또는 후천적 면역반응을 활성화함으로써 바이러스 복제를 억제하는 CVT-E002의 능력과 관련하여, 본 발명자들은 CVT-E002가, 제한은 아니지만, 알레르기 및 천식을 포함하는 선천 면역 신호화의 활성화와 관련된 다른 상태들의 예방, 치료 또는 완화에도 유용하다는 것을 발견했다.

알레르겐/항원 시험관내 모델에 기초하여, 분리된 인간 백혈구 세포와 함께 기도 바이러스를 인큐베이션하는 세포 공-배양 시스템이 파라인플루엔자 바이러스 타입 I(PIV) 및 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)를 사용하여 개발되었다. 이들 바이러스는 사람의 일생 동안 사람을 자주 감염시키고, 천신 악화에 관련된 ssRNA 기도 바이러스라는 점에서 선택되었다.

도 2에 나타낸 대로, 호산구가 존재하면 바이러스는 호산구 퍼옥시다제(EPO)의 방출을 직접 유도하지 못한다. 오히려 바이러스는 호산구가 림프구, 수지상 세포 및 대식세포(후자의 2개는 항원-제시 세포이다)의 특정 조합과 함께 인큐베이션되는 때만 EPO의 방출을 유도한다. 항원-제시 세포만은 바이러스 및 호산구와 함께 EPO 방출을 유도하지 못한다. 바이러스가 부재하면 어떤 조합에서도 EPO 방출이 일어나지 않는다. 따라서, 항원-제시 세포와 함께 배양된 바이러스가 림프구를 활성화하여 호산구로부터 EPO 방출을 유도하는 것으로 보인다. 바이러스의 UV-불활성화는 이런 효과를 막지 못한다.

호산구 기능에서의 중요성, 항-바이러스 특성, 및 측정 경험으로 인하여 EPO 방출이 매개인자 방출의 기준으로서 선택되었다. PIV 또는 RSV가 호산구와만 함께 인큐베이션되는 경우에는 EPO 방출이 보이지 않는데, 이는 직접적인 호산구 탈과립화가 불가능함을 시사한다. 유사한 음성 결과가 리노바이러스를 이용한 다른 실험들에서도 나타났다. 백혈구 공여자는 말초혈 호산구증가증을 나타내는 아토피 배경을 가진 성인들이다. PIV와 RSV는 흔한 감염이므로, 이들 공여자들은 기억 T 세포의 형태로 이 바이러스에 대한 면역을 가질 것이다. 본 모델에서는 역시 항원-제시 세포와 공-배양되었을 때만 PIV 및 RSV에 대한 반응으로서 림프구 증식이 발생한다. 도 3에 나타낸 대로, 림프구 증식은 파라인플루엔자 바이러스 및 항원-제시 세포(즉, 대식세포 및 수지상 세포)와 함께 배양 한지 6일 후에 일어났으며, 대식세포에 비해 수지상 세포에서 더욱 많은 증식이 관찰되었다. 림프구만을 사용한 피토헤마글루티닌(PHA, 5μg/ml)이 양성 대조군으로 사용되었다. 이 공-배양물에서 사이토카인(IFN-γ 및 GMCSF)의 생산이 발견되었으나, 이들의 출처나 EPO 방출 유도와의 관련성은 측정되지 않았다.

바이러스 자극에 대한 결과와 유사하게, CVT-E002는 림프구 증식을 직접 유도할 수 없지만, CVT-EOO2가 수지상 세포와 함께 배양된 경우에는 강한 증식 반응이 관찰된다(실시예 2 및 3). 림프구, CVT-E002 및 수지상 세포와 함께 배양 한지 6일 후에 림프구 증식이 일어난다. 바이러스가 들어 있는 웰에 CVT-E002가 추가되면 증식에 약간의 증가가 있을 수 있다. 유세포분석을 이용하여 세포를 특성화했을 때 CVT-E002 자극된 수지상 세포에서 HLA-DR의 발현 증가가 관찰되었다. 증식한 림프구는 CD4 양성이었고, 활성화 마커인 CD25의 증가된 발현을 나타냈다. LPS 자극이 양성 대조군으로 사용되었다. CVT-E002나 바이러스가 없을 때는 수지상 세포와 림프구의 공-배양물로부터 증식도 CD25의 상향조절도 관찰되지 않았다. CVT-E002 자극은 바이러스 감염 만에서 나타난 것과 유사한 CD4+ 림프구로부터의 CD25의 증가된 발현을 유도했다. 이 조합은 발현을 더 증강시켰다.

아토피/알레르기성 천식은 Th2 질환이다. CVT-E002는 Th1 반응을 생성할 수 있고(실시예 2, 도 5), 이런 Th1 지향은 Th2 반응을 억제할 수 있는 가능성을 가지며, 이로써 아토피/알레르기 질환의 치료제로서 사용될 수 있다. 마우스가 복강내 OVA 및 알럼에 의해서 항원 민감화된 다음, OVA로 시험감염되어 기도에서 알레르기 질환이 개시되는 광범하게 사용되는 아토피/알레르기성 천식 모델에서, CVT-E002가 AHR의 발생을 예방하고, 호산구성 기도 염증량을 감소시킬 수 있었다(실시예 7, 도 16a 및 16b). 대조군인 비-민감화된 동물에서는, 아토피/알레르기 질환은 나타나지 않았던 반면, 민감화되고, 위관영양법에 의해 식염수가 제공된 다음, OVA로 시험감염된 마우스에서는 호산구성 기도 염증 및 AHR로 구성된 확실한 아토피/알레르기 질환이 기도에서 발생했다. OVA로 민감화되고, 위관영양법에 의해 CVT-E002가 제공된 다음, OVA로 시험감염된 시험 마우스에서는, 흡입된 메타콜린에 따른 호산구성 기도 염증과 AHR이 모두 억제되었다.

CVT-E002는 호흡기 바이러스 감염이나 다른 자극제 및 촉발제에 의해 야기되는 천식의 치료에서 유용할 수 있다. 대부분의 성인들이 해마다 동일한 공통된 바이러스 감염에 노출되지만, 천식 환자 집단은 감소된 폐 기능을 가지고 여기에 대응한다. CVT-E002의 특성은 이러한 환자에게 유리할 수 있다. 본원 및 실시예에 설명된 대로, CVT-E002는 바이러스 복제를 억제하고 및/또는 Th1 면역반응을 지향함으로써 천식 환자에서 바이러스 감염에 대한 반응을 조절하는데 유리할 수 있다. 바이러스 복제의 억제는 이로써 염증도 및 후속되는 기도 폐쇄가 저하되기 때문에 유리하다. Th1 면역반응의 촉진은 아토피 반응에 연루되는 Th2 반응을 상쇄시키기 때문에 유리하다.

호흡기 바이러스 감염으로 인한 천식의 치료에 더하여, CVT-E002는 다른 자극제 및 촉발제에 의해 야기되는 천식의 치료에도 효과적일 수 있다. 이러한 자극제 및 촉발제는, 제한은 아니지만, 실내 알레르겐, 예를 들어 집 진드기, 털 있는 동물, 바퀴벌레 및 진균; 실외 알레르겐, 예를 들어 꽃가루 및 곰팡이; 실내 공기 오염물질, 예를 들어 담배 흡연; 실외 공기 오염물질, 예를 들어 오존, 산화질소, 산성 에어로졸 및 미립자; 직업적 노출; 음식 및 음식 첨가물; 약물, 예를 들어 아스피린 및 비-스테로이드계 항염제 및 베타-차단제; 비염; 축농증; 용종증; 위식도 역류; 호르몬 변동; 건조하고 차가운 공기; 및 운동을 포함한다.

또한, CVT-E002가 림프구 및/또는 수지상 세포 유래의 인터페론, 사이토카인의 방출을 증진시키고, 림프구와 항원-제시 세포의 상호작용에 연루된다는 점에서 CVT-E002의 면역조절 특성이 환자에게 유리할 수 있다.

상기 설명 및 이후 실시예에서, CVT-E002의 바람직한 구체예의 언급은 단지 예시일 뿐이며, 설명된 활성의 이용은 바람직한 활성을 가진 모든 인삼 분획에 적합하다는 것이 이해되어야 한다.

본 발명은 이제 하기 실시예에 의해 더 분명해질 것이다.

실시예

실시예 1 - 시험관내 바이러스 복제에 대한 CVT - E002 의 효과

시험관내 뮤린 단핵구 세포에서 바이러스 복제를 억제하는 CVT-E002의 여러 용량의 능력을 조사했다. 여러 용량(0, 10, 100 및 500μg/ml)의 CVT-E002 및 HT-1001(미국특허 제6,083,932호에 설명된 진세노사이드 Rb1 및 Rg1을 포함하는 전형적인 인삼 분획) 대조군(250-2000μg)을 PBS 버퍼에 용해하고, 완전 조직배양 배지 중에 최종 농도로 희석한 다음, 37℃에서 시험관내 RAW-264 뮤린 대식세포에 첨가했다. 24시간 또는 48시간 동안 세포를 처리한 후, 처리된 세포 배양물과 미처리된 세포 배양물을 헤르페스 단순 바이러스 타입 2(HSV-2) 또는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 노출시켰다. 플라크 분석에 의해서 바이러스 복제를 평가했다. CVT-E002 및 대조군 배양물의 상청액을 처리 후 여러 시점에서 수집하고, ELISA를 이용해서 타입 I INFs, TNFα, IL-6 및 산화질소(NO)에 대해 평가했다. 현저히 상승된 수준의 IL-6(도 8a), IFNβ(도 8b) 및 NO(도 9)가 CVT-E002로의 처리 후 용량-의존적 방식으로 RAW 세포에 의해 생산되었다. 미처리 배양물 및 대조군 처리된 배양물은 음성이었다. 사이토카인 생산과 바이러스 역가에 대한 데이터를 상관성에 대해 시험했다.

TNFα 및 IFNα의 자극에 대해서도 CVT-E002를 시험했다. TNFα는 CVT-E002 및 HT-1001 처리된 그룹에서 모두 상승했다. IFNα의 결과는 신뢰할 수 없었는데, 아마도 불량한 ELISA로 인해서였을 것이다(데이터 나타내지 않음). 중요한 것은 1차 인간 단핵구/대식세포 배양물과 CVT-E002의 인큐베이션이 IL-6의 현저한 용량-의존적 생산을 유도했다는 점이다(도 10). 또한, 녹색 형광 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 VSV(VSV-GFP)를 이용하여 CVT-E002가 시험관내 바이러스 복제를 상당히 억제했음이 밝혀졌다(도 11a 및 11b).

실시예 2 - CVT - E002 에 의해 항-바이러스 활성이 유도되는 기전

수지상 세포(DCs)를 림프구와 함께 공-배양하고, 유세포분석을 이용하여 림프구를 특성화했다. LPS 자극을 양성 대조군으로 사용했다. RSV 및 PIV는 수지상 세포(DCs)의 존재하에 CD3+CD4+CD25+ T 세포의 증식을 유도하는 것으로 나타났다(도 4, 각 n=3). 림프구와 함께 배양된 미감염 DCs와 비교했을 때, RSV는 인터페론 α 및 γ, TNFα, RANTES, IL-1, 2, 4, 10, 12, 13, 및 15의 생산을 유도한다(도 5, n=1). 데이터는 각 미감염 대조군(값 1로 주어짐)에 관해 나타낸다. CVT-E002와 T 세포만은 IFNγ 및 IL-12의 방출을 유도했다. CVT-E002와 DCs만은 TNF, IFNγ, IL-1, 10, 12, 및 15의 방출을 유도했다. 바이러스를 가진 세포 배양물에 CVT-E002의 첨가는 사이토카인/케모카인 방출을 상당히 증강시켰다. 이에 더하여, 미감염 세포와 비교했을 때, CVT-E002는 바이러스 없이 DCs의 존재하에 림프구 증식을 유도할 수 있었다(도 6).

실시예 3 - 수지상 세포 기능에 대한 CVT - E002 의 효과

7일 동안 GM-CSF 및 IL-4로 처리하여 혈액 단핵구로부터 수지상 세포(DCs)를 유도했다. DCs를 5mg/ml 자기-퀀칭 DQ-오브알부민(DQ-OVA) 및 CVT-E002의 존재 또는 부재하에 인큐베이션했다. DQ-OVA는 오브알부민에 부착된 형광 염료이다. DQ-OVA의 형광은 무손상 분자일 때는 퀀칭되지만, DCs에 의한 항원 제시를 통해 변성되었을 때는 형광 염료가 방출되어 빛이 발산된다.

도 7a는 세포의 아집단을 나타낸다. "DC-형" 세포는 성숙한 수지상 세포와 크기 및 과립도가 일치하며, "비-DC"는 미성숙 DC와 분화-굴절 단핵구 및 T 세포이다. LPS-처리된 세포를 DC 성숙화에 대한 양성 대조군으로 사용했다. 크기 및 과립도를 결정하기 위한 유세포분석에서 단핵구의 아집단이 출현했으며, 이들은 성숙한 DC(DC-형)와 비교하여 미성숙 표현형(비-DC)을 나타낸다고 생각된다. 이런 인상은 CD11c 및 HLA-DR 염색에 의한 이전 경험에 기초한다(데이터 나타내지 않음).

형광에 의해 나타난 대로 DCs가 DQ-OVA를 통합시켰다(도 7b). 흥미로운 것은 CVT-E002가 전체적인 DQ-OVA 신호를 용량-의존적 방식으로 강화시켰다는 점이다(모든 세포 OVA+). DC-형 집단은 100% OVA-양성이지만, 미성숙 집단은 CVT-E002 후 오브알부민을 더 잘 흡수하는 것으로 보인다(비-DC OVA+, 도 7b).

CVT-E002 처리는 비-DC 집단에서 성숙한 DC-형(성숙 DC 풀)으로 단핵구의 수를 이동시킨다(도 7c 및 7d). CD11c 및 MHC II 염색에 의한 이들 집단의 예비 표현형 결정에 의해 성숙도 대 미성숙도에 대한 우리의 인상이 확인되었다. DC 사이토카인 데이터에 더하여, 이들 데이터도 CVT-E002가 DC 기능 및 성숙도를 개선한다는 것을 시사한다.

실시예 4 - 핵 인자 카파 B( NF -κB)를 활성화하고 MyD88 을 통해 신호화하는 CVT-E002의 능력

CVT-E002가 TLRs와의 상호작용을 통해 선천적 면역반응을 활성화하는지의 여부를 결정하기 위해서, NF-κB를 활성화하고 MyD88을 통해 신호화하는 CVT-E002의 능력을 시험했다. 정상 마우스(C57B1/6 야생형)와 MyD88 결여 마우스(즉, "MyD88-/-"로 지정된 MyD88 녹아웃 마우스)로부터 복막 대식세포를 분리했다.

시험관내에서 24시간 인큐베이션하여 배양 평판에 부착되도록 한 후, 대식세포를 세척하고, 다양한 용량의 CVT-E002 또는 HT-1001로 처리하고, 24시간 더 인큐베이션했다. HT-1001을 대조군으로 사용했다. 상청액을 수집하고, ELISA를 사용하여 IL-1, IL-6, IFNβ 및 NO의 생산에 대해 평가했다. CpG DNA(MyD88-의존적)와 dsRNA(TLR3의 MyD88-독립적 리간드)가 각각 양성 및 음성 대조군으로 포함되었다. 추가하여, 리포터 유전자 LacZ를 작동시키는 NF-κB 프로모터를 가진 플라스미드를 구성했다. 이 플라스미드로 트랜스펙션된 세포를 다양한 용량의 CVT-E002로 처리한 다음, 리포터 유전자 산물의 생산에 대해 평가했다.

결과는 CVT-E002가 야생형 유래의 복막 대식세포에서만 상당한 수준의 전염증성 사이토카인 IL-6과 항-바이러스 인자 타입 I INFβ 생산을 유도했고, MyD88-/- 마우스에서는 이들을 유도하지 않았음을 나타낸다(도 12, 13a 및 13b). 미처리 배양물 또는 HT-1001-처리된 배양물은 음성이었다. 이들 결과는 IL-6 및 IFNβ의 CVT-E002-유도 자극이 MyD88-의존적이며, CVT-E002가 TLRs를 통하여 척추동물 면역세포에서 전염증성 및 항-바이러스 사이토카인의 생산을 활성화한다는 것을 나타낸다.

실시예 5 - CVT - E002 에 의해 이용된 TLR 의 확인

CVT-E002의 수용체일 수 있는 TLRs를 확인하기 위해서, 개별 TLR 수용체만을 발현하는 세포를 구성했다. 이들 세포를 최적 용량의 CVT-E002 및 대조군 TLR 리간드/효현제로 시험관내에서 처리한 후, 이들 세포의 상청액을 사용하여 IL-1, IL-6, TNFα 및 NO의 생산을 측정했다. 각 개별 TLR을 발현하는 세포가 기능성이었음을 보장하기 위해서, 각 TLR에 대한 기지의 리간드/효현제를 사용한 양성 대조군이 포함되었다. 결과는 CVT-E002가 TLR4만을 통해서는 신호를 보내지 않는다는 것을 나타낸다. 24시간 CVT-E002 처리는 hTLR2, hTLR1/2, hTLR2/6 및 hTLR4 트랜스펙션된 293 세포에서 IL-8 생산을 자극했다(Pam3CSK/LPS 대조군)(도 14). 48시간 CVT-E002 처리는 hTLR2, hTLR1/2, hTLR2/6 및 hTLR4 트랜스펙션된 293 세포에서 IL-8 생산을 자극했다(Pam3CSK/LPS 대조군)(도 15). hTLR4는 hTLR4와 MDR 및 CD14의 공-발현을 나타낸다. 두 시간 기간 모두, 모든 수용체에서 IL-8 생산의 현저한 증가가 보였다.

실시예 6 - CVT - E002 의 점막 송달 효과

CVT-E002 또는 대조군을 섭식을 통한 경구 경로, 비내 경로 또는 질내 경로로 마우스에 송달했다. 이어서 마우스를 다양한 용량의 HSV-2 또는 인터페론-민감성 수포성 구내염 바이러스(VSV)로 비내 또는 질내 경로로 시험감염시켰다. 바이러스 시험감염 후 여러 시점에서, 체중 측정, 총체적 병증 모니터링, 및 플라크 분석을 이용한 폐 및 생식기 세척물 및 조직 내 시험감염 바이러스의 역가 측정에 의해서 바이러스 감염에 대한 보호작용을 평가했다(감염 후 1-3일 및 6일)(도 17a 및 17b).

실시예 7 - 기도 과민반응( AHR )의 발생을 억제하고, 호산구성 기도 염증량을 감소시키는 CVT - E002 의 능력

OVA 및 CVT-E002 + OVA 마우스에 복강내 주사에 의해서 OVA 및 알럼으로 2회 항원 민감화를 수행했고, 대조군 동물은 면역화하지 않았다. 최종 면역화 후 7일 뒤, 대조군 동물과 CVT-E002 + OVA 마우스에 7일간 연속하여 위관영양법으로 CVT-E002 화합물을 200mg/kg 제공했다. 최종 위관영양법 후 24시간 뒤, 모든 마우스를 비내 경로에 의해 50μg OVA로 2회 시험감염시켰고, 2차 시험감염 후 24시간 뒤에 AHR 및 기도 염증에 대해 평가했다. 전-신체 혈류검사기로 인핸스드 포즈(Penh)를 측정해서 메타콜린 시험감염에 따른 AHR을 결정했다(n=3); OVA 또는 대조군 그룹과 비교하여 * P < 0.05(도 16a). BAL 유체 중 호산구 수에 의해 기도 염증을 측정했다(n=3); OVA 또는 대조군 그룹과 비교하여 * P < 0.05(도 16b).

본원에 청구된 발명의 범위를 벗어나지 않고 전술한 특정 명세서에서 다양한 변형, 개조 및 변화가 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 분명할 것이다.

Claims (32)

1. Panax quinquefolius 뿌리 부분의 수용성 추출물로부터 정제된 Panax quinquefolius 분획의 유효량을 포함하는 조성물로서, 분획은 화학적 및 약학적으로 CVT-E002와 일치하는 것을 특징으로 하는, 기도 과민 반응에 의해 특징된 상태를 가진 대상에서 기도 과민 반응을 예방, 치료, 또는 완화하는데 사용하기 위한 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상태는 알레르기인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상태는 천식인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 분획은 CVT-E002인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 조성물은 Toll-유사 수용체로부터의 신호 전달을 조정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, Toll-유사 수용체는 Toll-유사 수용체 2인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 5 항에 있어서, Toll-유사 수용체는 Toll-유사 수용체 2와 Toll-유사 수용체 6의 헤테로다이머인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 5 항에 있어서, Toll-유사 수용체는 Toll-유사 수용체 2와 Toll-유사 수용체 1의 헤테로다이머인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 5 항에 있어서, Toll-유사 수용체는 Toll-유사 수용체 4인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 다른 의약 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. Panax quinquefolius의 분획 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물로서, 분획은 Panax quinquefolius 뿌리 부분의 수용성 추출물로부터 정제되고 화학적 및 약학적으로 CVT-E002와 일치하는 것을 특징으로 하는, 기도 과민 반응에 의해 특징된 상태를 가진 대상에서 기도 과민 반응을 예방, 치료, 또는 완화하는데 사용하기 위한 조성물.
12. 제 11 항에 있어서, 상태는 알레르기 또는 천식인 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 분획은 CVT-E002인 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제

Images