WO2019212203A1 - 인삼열매 다당체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물 - Google Patents

인삼열매 다당체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물 Download PDF

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influenza
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    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses

Definitions

  • the present disclosure describes a composition for preventing or inhibiting influenza virus infection, which includes ginseng fruit polysaccharide.
  • Influenza is called the flu because its initial symptoms are similar to those of the common cold (acute viral rhinopharyngitis), but it is a completely different cause and condition. Influenza is caused by influenza virus, unlike the common cold caused by rhinovirus, coronavirus, adenovirus, respiratory syncytial virus and the like.
  • Influenza can cause serious illnesses such as high fever, chills, myalgia, and arthralgia, and can lead to death due to the high risk of developing high fever and complications.
  • pandemic influenza caused by highly pathogenic or highly infectious new or mutant influenza virus, there is a risk of large-scale death.
  • M2 inhibitors include amantadine, rimantadine, neuraminidase (NA) inhibitors zanamivir, Relenza®, and tamilflu (osemiamivir, Tamiflu®). It acts only on influenza virus and NA inhibitors are effective against influenza A and B viruses. Tamiflu has side effects such as nausea, vomiting, abnormalities of the nervous and mental systems, and resistance to the commercially available therapeutics including Tamiflu has been reported.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a composition that effectively prevents or inhibits influenza infection without side effects.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a composition that acts as an influenza target therapeutic.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a composition capable of preventing or inhibiting influenza virus infection by blocking the infection mechanism of influenza virus.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a composition that exhibits the effect of inhibiting influenza virus infection by inhibiting neuraminidase activity.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a composition for preventing or inhibiting influenza virus infection that can act on both influenza virus type A and B.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a composition that exhibits a remarkably excellent effect of preventing or inhibiting influenza virus infection at low doses.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a composition for the prevention or suppression of influenza infection, which has no or low side effects as a natural product, is not resistant.
  • the present invention provides a composition for preventing or inhibiting influenza virus infection comprising a ginseng fruit polysaccharide.
  • the present invention may provide a composition that effectively prevents or inhibits influenza infection without side effects.
  • the present invention may provide a composition that acts as an influenza target therapeutic.
  • the present invention can provide a composition capable of preventing or inhibiting influenza virus infection by blocking the infection mechanism of influenza virus.
  • the present invention can provide a composition exhibiting the effect of inhibiting neuraminidase activity to inhibit influenza virus infection.
  • the present invention can provide a composition for preventing or inhibiting influenza virus infection that can act on both influenza virus type A and B.
  • the problem to be solved by the present invention can provide a composition that exhibits a remarkably excellent effect of preventing or inhibiting influenza virus infection at low doses.
  • the present invention may provide a composition for preventing or suppressing influenza infection, which is natural or has no side effects or low side effects, and is not resistant.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the influenza inhibition mechanism of the conventional influenza treatment, it shows a haemagglutinin inhibition (a), mRNA synthesis inhibition (b), Neuraminidase inhibition (c).
  • Fig. 2 schematically shows a reaction for detecting arabinogalactan by the ⁇ -glucosyl yarib reagent.
  • Figure 3 is a graph showing the fraction of ginseng fruit water-soluble material.
  • Figure 4 is a graph showing the chromatography results of ginseng fruit polysaccharides.
  • Figure 5 is a photograph showing the precipitation ring by ⁇ -glucosyl yarib reagent treatment of the standard material, ginseng fruit polysaccharide and red ginseng root polysaccharide.
  • Figure 6 is a graph showing the comparison of the precipitation ring area of the standard material, ginseng fruit polysaccharides and red ginseng root polysaccharides by ⁇ -glucosyl yarib reagent treatment.
  • Figure 7 is a graph confirming the neuraminidase activity inhibitory effect when NWS virus inoculation of the CVT treatment group.
  • FIG. 9 is a graph confirming the neuraminidase activity inhibitory effect upon CA virus inoculation of the CVT treatment group.
  • FIG. 10 is a graph confirming the inhibitory effect of neuraminidase activity when CA virus inoculation of the ginseng fruit polysaccharide treatment group.
  • Figure 11 is a schematic diagram showing the influenza infection experiment schedule in the animal model of Test Example 4.
  • 12 is a graph showing lung lesion index 3 days after virus inoculation.
  • Figure 13 is a graph showing the lung lesion index 5 days after virus inoculation.
  • FIG. 14 is a graph showing lung lesion index 7 days after virus inoculation.
  • Figure 15 shows the lung lesion tissue photograph three days after the virus inoculation when administered ginseng fruit polysaccharide.
  • FIG. 16 shows lung lesion tissue photographs 7 days after virus inoculation of the CVT-administered group, the positive control group and the negative control group.
  • Figure 17 shows the lung lesion tissue photograph three days after virus inoculation when administered ginseng fruit polysaccharide.
  • FIG. 18 shows lung lesion tissue photographs 7 days after virus inoculation of the CVT-administered group, the positive control group and the negative control group.
  • Figure 21 shows the RT-PCR results confirmed the virus infection level 7 days after virus inoculation.
  • a composition for preventing or inhibiting influenza virus infection comprising a ginseng fruit polysaccharide as an active ingredient.
  • Ginseng fruit polysaccharide has the effect of inhibiting the activity or infection of the influenza virus by a specific component and structure, specifically, it is excellent in the inhibitory effect of neuraminidase activity. Accordingly, the composition according to the embodiments of the present invention may exhibit a remarkably excellent effect of preventing or inhibiting influenza virus infection.
  • Influenza viruses are classified into types A, B, and C. Type A and B are common, and the most prevalent type is influenza A virus.
  • Influenza A virus is a single-standed negative-sense RNA virus that has an envelope belonging to Orthomyxoviridae. It is a surface antigen of 16 kinds of haemaglutinine (H1-H16) and nine kinds of neuraminidase Subtypes are determined by (Neuraminase) (N1-N9).
  • Figure 1 shows the influenza virus life cycle inhibition mechanism of the conventional influenza treatment amantadine (amantadine) and relenza (zanamivir, Relenza®), Tamiflu (osemiamivir, Tamiflu®), ribavirin (ribavirin).
  • Representative inhibition mechanisms of influenza virus targeting therapeutics include (a) inhibition of haemagglutinin involved in the cellular penetration of the virus, (b) inhibition of mRNA synthesis, and (c) neuraminidase inhibition for virus release. Can be mentioned.
  • the ginseng fruit polysaccharide according to an embodiment of the present invention inhibits neuraminidase activity and thus prevents influenza virus from being released from infected cells, thereby preventing other cells from being infected.
  • Ginseng fruit polysaccharide according to an embodiment of the present invention exhibits an antiviral effect by inhibiting the proliferation of influenza virus, and thus may exhibit an effect of preventing, inhibiting or treating influenza virus infection.
  • the influenza virus is an influenza virus whose infection is prevented or inhibited by the inhibitory action of the neuraminidase activity of the ginseng fruit polysaccharide, and may be, for example, one or more of influenza A virus, influenza B virus, or influenza C virus.
  • the influenza virus may be a type A influenza virus, and may be, for example, at least one of H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H6N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 or H10N7.
  • Ginseng fruit polysaccharide may be a polysaccharide component derived from the fruit portion of the ground portion of Panax ginseng CA Meyer.
  • the ginseng fruit may be a portion including fruit pulp, rind, or both flesh and rind of ginseng.
  • the ginseng fruit polysaccharide may be obtained from an extract insoluble component that is not dissolved in ethanol after ginseng fruit is extracted using ethanol.
  • the ethanol extract insoluble component can be extracted using water to separate only the water-soluble component, ginseng fruit polysaccharide contained in this water-soluble component can be used as an active ingredient.
  • the water-soluble component may be concentrated, precipitated with ethanol, and the low molecular weight component is removed to obtain the ginseng fruit polysaccharide.
  • the extract insoluble component was heated and extracted with 3-10 times the volume of water to obtain a water-soluble extract.
  • the water-soluble extract was concentrated to a solid content of 10-50% by weight, precipitated using 2-5 times the volume of ethanol, and then separated into a molecular weight cut off of 10,000-30,000 to remove low molecular weight components.
  • Ginseng fruit polysaccharide can be obtained.
  • Removal of the low molecular weight component may be performed by filtration, such as ultrafiltration using an ultrafiltration membrane, dialysis, 1-10 times repeated dissolution treatment with 50-100% ethanol in a volume of 2-10 times.
  • drying may be performed after removing the low molecular weight component. The drying may be by freezing, hot air, spraying or vacuum treatment.
  • the water treatment of the ginseng fruit may further include an enzyme treatment before water extraction.
  • the enzyme may be used as long as it is an enzyme used in food, but may be selected from, for example, amylase, protease, pectinase, lipase, cellulase, xylase, beta-glucanase, or pullulanase. .
  • the enzyme treatment can be reacted with the enzyme for 10 to 60 minutes at 40 to 60 °C, for example.
  • the ginseng fruit polysaccharide may include arabinose, galactose, galacturonic acid and glucuronic acid.
  • the total content of galacturonic acid and glucuronic acid with respect to the total weight of the polysaccharide as 0.1% by weight, 0.2% by weight, 0.3% by weight, 0.4% by weight, 0.5% by weight, 0.6% by weight, At least 0.7 wt%, at least 0.8 wt%, at least 0.9 wt%, at least 1 wt%, at least 2 wt%, at least 3 wt%, at least 4 wt%, at least 5 wt%, at least 6 wt%, at least 7 wt%, 8 wt% or more, 9 wt% or more, or 10 wt% or more, 25 wt% or less, 24 wt% or less, 23 wt% or less, 22 wt% or less, 21 wt% or less, 20 wt% or less, 19 wt% Up to 18 wt%, up to 17 wt%, up to 16 wt%, up to 15 wt%
  • the galacturonic acid is 0.1% by weight, 0.2% by weight, 0.3% by weight, 0.4% by weight, 0.5% by weight, 0.6% by weight, 0.7% by weight, 0.8% by weight, based on the total weight of the polysaccharide, At least 0.9%, at least 1%, at least 2%, at least 3%, at least 4%, at least 5%, at least 6%, at least 7%, at least 8%, at least 9%, Or at least 10 wt%, at most 20 wt%, at most 19 wt%, at most 18 wt%, at most 17 wt%, at most 16 wt%, at most 15 wt%, at most 14 wt%, at most 13 wt%, 12 wt% 11 wt% or less, 10 wt% or less, 9 wt% or less, 8 wt% or less, 7 wt% or less, 6 wt% or less, 5 wt% or less, or 4 wt% or less.
  • the content can be, for example, from 0.1 wt% to 20 wt%, from 0.1 wt% to 15 wt%, from 1 wt% to 5 wt%, from 5 wt% to 15 wt%, or from 0.5 wt% to 5 wt%.
  • the glucuronic acid is 0.1% by weight, 0.2% by weight, 0.3% by weight, 0.4% by weight, 0.5% by weight, 0.6% by weight, 0.7% by weight, 0.8% by weight, based on the total weight of the polysaccharide, At least 0.9%, at least 1%, at least 2%, at least 3%, at least 4%, at least 5%, at least 6%, or at least 7%, and at least 10%, 9% 8 wt% or less, 7 wt% or less, 6 wt% or less, 5 wt% or less, or 4 wt% or less.
  • the content can be, for example, 0.1% to 10% by weight, 0.5% to 5% by weight, or 0.1% to 5% by weight.
  • the arabinose may include 2 to 30% by weight based on the total weight of the polysaccharide.
  • the galactose may include 5 wt% to 50 wt% with respect to the total weight of the polysaccharide.
  • the ginseng fruit polysaccharide has a high ratio of arabinogalactan structure.
  • the detection of the arabinogalactan structure can use the ⁇ -glucosyl Yariv reagent ( ⁇ -glucosyl Yariv reagent).
  • ⁇ -glucosyl Yariv reagent ⁇ -glucosyl Yariv reagent
  • FIG. 2 the reaction which detects arabinogalactan with a (beta) -glucosyl yarib reagent is typically shown.
  • the ⁇ -glucosyl yarib reagent is 1,3,5-tri- ( ⁇ -glucopyranosyl-oxyphenyllazo) -2,4,6-trihydroxybenzene (4- 1,3,5-tri- ( 4- ⁇ -glucopyranosyl-oxyphenylazo) -2,4,6-trihydroxybenzene), specific for arabino- ⁇ -3,6-galactan of type II in arabinogalactan To form a red precipitate.
  • the area of the red precipitated ring formed by treating the ⁇ -glucosyl yarib reagent and the concentration of the arabinogalactan structure contained are proportionally dependent.
  • the ginseng fruit polysaccharide is 40% or more, 50% or more when the precipitation ring size produced in the standard arabino- ⁇ -3,6-galactan is set to 100%. It may exhibit a settling ring area of at least%, at least 70%, or at least 80%, and at most 90%, at most 80%, at most 70%, or at most 60%.
  • the precipitation ring area may be 50% to 90%, 50% to 80%.
  • the weight average molecular weight of the ginseng fruit polysaccharide may be 10 kDa or more.
  • the ginseng fruit polysaccharide may have a main peak at a molecular weight of 70 kDa to 80 kDa.
  • the ginseng fruit polysaccharide is a total of various polysaccharide components, and exhibits a significant influenza virus activity or infection inhibitory effect through a synergistic effect by a combination of components included, and specifically, has an excellent inhibitory effect on neuraminidase activity.
  • compositions according to embodiments of the present invention may be provided in various forms of food additives or functional foods containing the active ingredient. It can be processed into fermented milk, cheese, yogurt, juice, probiotic and health food, including the active ingredient, and can be used in the form of various other food additives.
  • composition according to the embodiments of the present invention may be a composition for health food.
  • the health food composition according to the embodiment of the present invention may include 0.0001% by weight to 99% by weight, for example, 0.01% by weight to 60% by weight, based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the health food composition according to the present embodiment is divided into 1 to several times so as to be administered in an amount of 0.001 to 500 mg / kg, for example, 0.005 to 100 mg, 0.01 to 50 mg, and 0.01 to 10 mg per 1 kg of body weight per day based on the active ingredient.
  • the composition may significantly exhibit the effects described above even with a small amount of the active ingredient as described above.
  • the health food composition may be formulated as pills, capsules, tablets, granules, caramels or drinks. In other embodiments, it may be processed in the form of a liquid, powder, granules, tablets or tea bags and the like.
  • composition may be administered by various methods, such as simple drinking, injection, spray or squeeze.
  • the composition may contain other ingredients and the like that can give a synergistic effect to the main effect within a range that does not impair the main effect of the present invention.
  • it may further include additives such as perfumes, pigments, fungicides, antioxidants, preservatives, moisturizers, thickeners, inorganic salts, emulsifiers and synthetic polymer materials to improve physical properties.
  • additives such as perfumes, pigments, fungicides, antioxidants, preservatives, moisturizers, thickeners, inorganic salts, emulsifiers and synthetic polymer materials to improve physical properties.
  • supplementary ingredients such as water soluble vitamins, oil soluble vitamins, polymer peptides, polymer polysaccharides and seaweed extract may be further included.
  • ingredients may be suitably selected and formulated by those skilled in the art according to the dosage form or purpose of use, and the amount thereof may be selected within a range that does not impair the object and effect of the present invention.
  • the amount of the components added may be 0.01 wt% to 5 wt%, for example, 0.01 wt% to 3 wt%, based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the composition may include a ginseng fruit polysaccharide to prevent influenza virus infection, reduce the infection or treat the influenza.
  • the composition may be a composition for the prevention or treatment of diseases caused by influenza virus infection.
  • Diseases caused by the influenza virus infection may include, but are not limited to, flu, sore throat, bronchitis and pneumonia.
  • the pharmaceutical composition may be in various oral or parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, soft or hard capsules, and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or the like. Or lactose, gelatin, or the like is mixed.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • compositions according to the embodiments of the invention may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts and may also be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable collection.
  • the salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid, formic acid acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid , Benzene sulfonic acid, toluene sulfonic acid, naphthalene sulfonic acid and the like can be used.
  • composition according to the embodiments of the present invention can be parenterally or orally administered as desired, and 0.001 to 500 mg per kg of body weight per day, for example, 0.005 to 100 mg, 0.01 to 50 mg, 0.01 to 10 mg. It may be administered in one to several times so as to be administered in an amount.
  • the dosage for a particular patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion, severity of the disease, and the like.
  • compositions according to the embodiments of the present invention such as powders, granules, tablets, soft or hard capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, ointments, creams, etc. It may be formulated and used in any form suitable for pharmaceutical preparations, including suppositories, injectables and sterile injectable solutions.
  • the ginseng fruit polysaccharide may be provided for preventing or inhibiting influenza virus infection.
  • the use may include reducing influenza infection or treating influenza, or preventing or treating a disease caused by influenza virus infection.
  • the ginseng fruit polysaccharide, its effects, dosage forms, and the like are the same as described above, and thus description thereof is omitted.
  • the ginseng fruit polysaccharide may be used to prepare a composition for preventing or inhibiting influenza virus infection comprising the ginseng fruit polysaccharide.
  • the use may include reducing influenza infection or treating influenza, or preventing or treating a disease caused by influenza virus infection.
  • the ginseng fruit polysaccharide, its effects, dosage forms, and the like are the same as described above, and thus description thereof is omitted.
  • a method for preventing influenza virus infection, a method for inhibiting influenza virus, a method for reducing influenza infection, or a method for treating influenza comprising administering the ginseng fruit polysaccharide to a subject.
  • the method may include a method for preventing or treating a disease caused by influenza virus infection.
  • the method may comprise administering to the subject a composition as described above comprising the ginseng fruit polysaccharide.
  • the ginseng fruit polysaccharide, its effects, dosage forms, and the like are the same as described above, and thus description thereof is omitted.
  • the method may comprise administering ginseng fruit polysaccharide to a subject in need of influenza virus inhibition, reduced influenza infection, or influenza treatment.
  • the administration may include administering to the subject an effective amount of ginseng fruit polysaccharide.
  • Ginseng fruit from which seeds were removed is extracted with 10 times the volume of 90% ethanol to precipitate the water-soluble components and remove the supernatant.
  • the precipitated extract insoluble component is extracted by heating at 90 ° C. for 5 hours with 20 times the volume of water.
  • the extract is concentrated to 30% by weight solids and precipitated by addition of 90% ethanol in twice the volume of the concentrate.
  • High performance liquid chromatography (HPLC) results of the precipitated water soluble components are shown in FIG. 3.
  • the precipitate was separated by ultrafiltration into 20,000 molecular weight cut off to remove low molecular weight components and freeze-dried to obtain a ginseng fruit polysaccharide having a molecular weight of 10 kDa or more having a molecular weight of 70 to 80 kDa as a main peak.
  • High performance liquid chromatography (HPLC) results of the prepared ginseng fruit polysaccharide are shown in FIG. 4.
  • Red ginseng polysaccharide was prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that red ginseng root was used instead of ginseng fruit.
  • a 0.15 M NaCl agarose plate containing 10 ⁇ g / ml of ⁇ -glucosyl yarib reagent was prepared, a well of 2.5 mm in diameter was prepared, and a solution containing 5 ⁇ g of gum Arabic and a sample diluted in concentrations was prepared. Each well was injected. The plate was allowed to stand for 15 hours in a wet state and reacted. The resulting red precipitated ring was observed to observe the presence of arabino- ⁇ -3,6-galactan. The reactivity of was compared with each other by calculating the area of the produced precipitated ring.
  • the relative content of arabino- ⁇ -3,6-galactan was measured in FIG. 6 by measuring the area of the resulting red precipitated ring.
  • the results in FIG. 6 compare the area of each sample 1000 ⁇ g / ml treatment group with respect to the standard substance 1000 ⁇ g / ml concentration treatment group.
  • the ginseng fruit polysaccharides can be confirmed to include arabinogalactan structure at a higher content of twice or more than the red ginseng polysaccharide.
  • MDCK Medin-Darby canine kidney, ATCC: CCL-34
  • ATCC CCL-34
  • a dog kidney cell line was used to confirm the antiviral effect of ginseng fruit polysaccharide.
  • MDCK cells are placed in a 96-well microplate at 1 ⁇ 10 5 / well per well, and cultured in EMEM medium (penicillin 100 units, streptomycin 100 ⁇ g, 10% FBS). When MDCK cells become monolayers, they are washed twice with EMEM medium containing only antibiotics. Dilute H1N1 strain (Influenza A virus subtype / H1N1 / pdm) to 100TCID50 and place in EP tube.
  • APGP ginseng fruit polysaccharide
  • CVT American ginseng (Panax quinquefolium) extract CVT-E002 (COLD-FX®, hereinafter "CVT") was used. After 1 hour, the reaction solution was inoculated with 3 wells per concentration to the MDCK cells, which had been previously washed, and incubated at 35 ° C. for 1 hour. After 1 hour, remove all of the medium of the plate and wash once with PBS, and then divide 100 ml of EMEM medium with antibiotics and 10 ⁇ g / mL trypsin into each well and incubate at 37 ° C. for 48-72 hours.
  • CPE cytopathic effect
  • influenza virus treatment within the range of 0.78125-3.125 mg / ml was found to inhibit the cytopathic effect (CPE) of MDCK cells.
  • Table 1 shows the SI index (Selectivity index) for each sample.
  • the CC 50 (0% cytotoxic concentration) value is the concentration at which the sample induces 50% cell death. The higher the value, the safer the substance.
  • the EC 50 (50% inhibitory concentration) value is the concentration at which the virus is 50% inhibited. Smaller values indicate better efficacy in inhibiting viruses.
  • the control group CVT shows no antiviral effect, while the ginseng fruit polysaccharide shows a high value of 7.95.
  • These figures are based on biologically known sole substances EGCG (5.6), resveratrol (2) (Kim, Y .; Narayanan, S .; Chang, KO Inhibition of influenza virus replication by plant-derived isoquercetin.Antivir.Res. 2010, 88 , 227-235.), which is significantly higher than that of the present invention, showing excellent influenza virus inhibitory effect.
  • Neuraminidase activity inhibition test was performed in accordance with the method recommended by the Standard Operating Procedure (WHO).
  • the virus strains were infected with MDCK cell lines in EMEM (Eagle's minimum essential medium) medium and then used virus cultures that activated the virus in the cells.
  • EMEM Eagle's minimum essential medium
  • the ginseng fruit polysaccharide inhibits neuraminidase activity in a concentration-dependent manner, and the ginseng fruit polysaccharide is found to be about 1/4 to 1/5 of the CVT of the IC50 positive control, which is remarkably excellent. It can be seen that it has a miniday activity inhibitory effect.
  • CVT ginseng fruit extract
  • Influenza virus inoculation was performed by anesthesia using ether, followed by inoculation of mammalian influenza virus (Influenza A virus subtype / H1N1 / NWS strain) through the nasal cavity at a dose of LD0 or LD70.
  • 11 shows a schematic of the influenza virus infection experiment.
  • the non-treated control group (Negative control) was administered without PBS and administered with PBS instead of the sample, the virus control (Virus control) is an experimental group that did not administer PBS and virus inoculation instead of the sample.
  • mice infected as described above were subjected to tissue lesion and virus re-separation experiments at 3, 3, 5, and 7 days from the time of virus inoculation below.
  • mice vaccinated with influenza virus as in Test Example 4 were sacrificed at 3, 5, and 7 days from the time of virus inoculation, and lung tissues were separated and subjected to H & E staining. Used for histopathological lesion analysis. 15-18 show lung lesion tissue photographs. The number of lesions was counted and quantified, and lung indexes calculated by using a non-treated control (Negative control) at 100% are shown in FIGS. 12 to 14.
  • the lung lesion index is relieved upon oral administration of ginseng berry polysaccharide.
  • 40 times the amount of the ginseng fruit polysaccharide dose should be treated to show an effect equivalent to that of the ginseng fruit polysaccharide.
  • mice inoculated with the influenza virus as in Test Example 4 were sacrificed at 3, 5, and 7 days from the time of virus inoculation, and RNA was extracted from the isolated lung tissue. .
  • RNA was extracted from the isolated lung tissue.
  • quantitative RT-PCR was performed to calculate the number of virus copies re-isolated, and the virus infection level was confirmed. The results are shown in FIGS. 19 to 21.

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Abstract

본 명세서는 인삼열매 다당체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물에 관하여 기술한다. 상기 인삼열매 다당체는 특정 성분 및 구조에 의하여 인플루엔자 바이러스의 활성 또는 감염 저해 효과를 나타내며, 구체적으로 뉴라미니네이즈 활성 저해 효과가 우수하다.

Description

인삼열매 다당체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물
본 명세서는 인삼열매 다당체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물에 관하여 기술한다.
인플루엔자는 감염 초기 증상이 일반 감기(급성 바이러스형 비인두염)과 유사하여 독감이라는 명칭으로 불리우나 그 원인과 병증이 전혀 상이한 질병이다. 주로 리노바이러스(rhinovirus), 코로나 바이러스(coronavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 호흡기거대세포바이러스(respiratory syncytial virus) 등에 의해서 유발되는 감기와 달리, 인플루엔자는 인플루엔자 바이러스에 의해서 유발된다.
인플루엔자는 고열, 오한, 근육통, 관절통과 같은 심각한 병증을 나타내며, 고열과 합병증 발병 위험이 높아 사망에 이를 수도 있다. 고병원성 또는 고감염성 신종 또는 변종 인플루엔자 바이러스에 의한 팬더믹 인플루엔자(pandemic influenza) 발생 시 대규모 사망 위험이 있어 이에 대한 대책이 필요한 실정이다.
인플루엔자의 치료는 인플루엔자 바이러스 자체를 타케팅하여 바이러스의 활성이나 감염 매커니즘을 직접적으로 차단하는 것에 의하여 가능하다. 인플루엔자 치료제로 M2 억제제인 아만타딘(amantadine)과 리만타딘(rimantadine), 뉴라미니데이즈(neuraminidase, NA) 억제제인 리렌자(zanamivir, Relenza®)와 타미플루(oseltamivir, Tamiflu®)가 상용되며, M2 억제제는 A형 인플루엔자 바이러스에만 작용하며, NA 억제제는 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스에 효과를 나타낸다. 타미플루의 경우 오심, 구토, 신경계나 정신계의 이상 등의 부작용을 가지고 있으며, 타미플루를 포함한 상기 상용 치료제들에 대한 내성 양상이 보고된 바 있다.
이에, 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하거나 또는 감염을 억제하여 치료하는 효과가 우수하면서 부작용과 내성이 없는 소재에 대한 요구가 존재한다.
일 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 부작용 없이 효과적으로 인플루엔자 감염을 예방 또는 억제하는 조성물을 제공하는 것이다.
다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 인플루엔자 타겟 치료제로 작용하는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 인플루엔자 바이러스의 감염 매커니즘을 차단하여 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 뉴라미니데이즈 활성을 억제하여 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형 모두에 작용 가능한 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고 하는 과제는 낮은 투여량에서 현저하게 우수한 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 천연물로서 부작용이 없거나 낮으며, 내성이 없는 인플루엔자 감염 예방 또는 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 인삼열매 다당체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물을 제공한다.
일 관점에서, 본 발명은 부작용 없이 효과적으로 인플루엔자 감염을 예방 또는 억제하는 조성물을 제공할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 인플루엔자 타겟 치료제로 작용하는 조성물을 제공할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 감염 매커니즘을 차단하여 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 뉴라미니데이즈 활성을 억제하여 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 효과를 나타내는 조성물을 제공할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형 모두에 작용 가능한 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고 하는 과제는 낮은 투여량에서 현저하게 우수한 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제 효과를 나타내는 조성물을 제공할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 천연물로서 부작용이 없거나 낮으며, 내성이 없는 인플루엔자 감염 예방 또는 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 종래 인플루엔자 치료제의 인플루엔자 저해 메커니즘을 나타낸 모식도로, 해마글루티닌(haemagglutinin) 저해 (a), mRNA 합성 저해 (b), 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 저해 (c)를 나타낸다.
도 2는 β-글루코실 야리브 시약에 의해 아라비노갈락탄을 검출하는 반응을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 인삼열매 수용성 물질의 분획을 나타낸 그래프이다.
도 4는 인삼열매 다당체의 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 표준물질, 인삼열매 다당체 및 홍삼근 다당체의 β-글루코실 야리브 시약 처리에 의한 침전환을 나타낸 사진이다.
도 6은 표준물질, 인삼열매 다당체 및 홍삼근 다당체의 β-글루코실 야리브 시약 처리에 의한 침전환 면적을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 CVT 처리 군의 NWS 바이러스 접종 시 뉴라미니데이즈 활성 저해 효과를 확인한 그래프이다.
도 8은 인삼열매 다당체 처리 군의 NWS 바이러스 접종 시 뉴라미니데이즈 활성 저해 효과를 확인한 그래프이다.
도 9는 CVT 처리 군의 CA 바이러스 접종 시 뉴라미니데이즈 활성 저해 효과를 확인한 그래프이다.
도 10은 인삼열매 다당체 처리 군의 CA 바이러스 접종 시 뉴라미니데이즈 활성 저해 효과를 확인한 그래프이다.
도 11은 시험예 4의 동물모델에서의 인플루엔자 감염 실험 스케쥴을 나타낸 모식도이다.
도 12는 바이러스 접종 후 3일 후의 폐병변지표를 나타낸 그래프이다.
도 13은 바이러스 접종 후 5일 후의 폐병변지표를 나타낸 그래프이다.
도 14는 바이러스 접종 후 7일 후의 폐병변지표를 나타낸 그래프이다.
도 15는 인삼열매 다당체를 투여한 경우 바이러스 접종 후 3일 후의 폐병변 조직 사진을 나타낸 것이다.
도 16은 CVT 투여군, 양성 대조군 및 음성 대조군의 바이러스 접종 후 7일 후의 폐병변 조직 사진을 나타낸 것이다.
도 17은 인삼열매 다당체를 투여한 경우 바이러스 접종 후 3일 후의 폐병변 조직 사진을 나타낸 것이다.
도 18은 CVT 투여군, 양성 대조군 및 음성 대조군의 바이러스 접종 후 7일 후의 폐병변 조직 사진을 나타낸 것이다.
도 19는 바이러스 접종 후 3일 후의 바이러스 감염수준을 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 20은 바이러스 접종 후 5일 후의 바이러스 감염수준을 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 21은 바이러스 접종 후 7일 후의 바이러스 감염수준을 확인한 RT-PCR 결과이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 출원의 실시예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 출원에 개시된 기술은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 출원의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 또한, 설명의 편의를 위하여 구성요소의 일부만을 도시하기도 하였으나, 당업자라면 구성요소의 나머지 부분에 대하여도 용이하게 파악할 수 있을 것이다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 출원의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.
본 발명 일 실시예에 따르면, 인삼열매 다당체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물을 제공할 수 있다. 인삼열매 다당체는 특정 성분 및 구조에 의하여 인플루엔자 바이러스의 활성 또는 감염 저해 효과를 나타내며, 구체적으로 뉴라미디네이즈 활성 저해 효과가 우수하다. 이에 따라 본 발명 실시예들에 따른 조성물은 현저하게 우수한 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제 효과를 나타낼 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 A, B, C형 등으로 분류되며, A형 및 B형이 일반적이며, 가장 유행하는 종류는 A형 인플루엔자 바이러스이다. A형 인플루엔자 바이러스는 Orthomyxoviridae에 속하는 외피막(envelope)을 가지는 single-standed negative-sense RNA 바이러스로, 표면항원인 16 종의 헤마글루티닌(Haemaglutinine) (H1~H16)와 9종의 뉴라미니데이즈(Neuraminase) (N1~N9)에 의해서 아형이 결정된다.
도 1은 종래 인플루엔자 치료제인 아만타딘(amantadine)과 리렌자(zanamivir, Relenza®), 타미플루(oseltamivir, Tamiflu®), 리바비린(ribavirin)의 인플루엔자 바이러스 생활 주기 저해 매커니즘을 나타낸다. 인플루엔자 바이러스 타게팅 치료제의 대표적 저해 매커니즘은 (a) 바이러스의 세포 침투에 관여하는 해마글루티닌(haemagglutinin) 저해, (b) mRNA 합성 저해, 및 (c) 바이러스 방출을 위한 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 저해를 들 수 있다.
본 발명 일 실시예에 따른 인삼열매 다당체는 상기 뉴라미니데이즈 활성을 저해하여 감염된 세포로부터 인플루엔자 바이러스가 방출되지 못하므로 다른 세포를 감염시키는 것을 막을 수 있다.
본 발명 일 실시예에 따른 인삼열매 다당체는 인플루엔자 바이러스의 증식을 저해하여 항바이러스 효과를 나타내며, 이에 따라 인플루엔자 바이러스 감염 예방, 억제 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
상기 인플루엔자 바이러스는 상기 인삼열매 다당체의 뉴라미니데이즈 활성 억제 작용에 의해 감염이 예방 또는 억제되는 인플루엔자 바이러스로서 예를 들어 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 또는 C형 인플루엔자 바이러스 중 하나 이상일 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스일 수 있으며, 예를 들어 H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H6N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 또는 H10N7중 하나 이상의 인플루엔자 바이러스일 수 있다.
인삼열매 다당체는 인삼( Panax ginseng C.A. Meyer)의 지상부 중 열매 부위로부터 유래한 다당 성분일 수 있다. 일 예에서, 상기 인삼열매는 인삼의 열매 과육, 과피, 또는 과육 및 과피를 모두 포함하는 부위일 수 있다.
상기 인삼열매 다당체는 인삼열매를 에탄올을 사용하여 추출한 후, 에탄올에 용해되지 않은 추출 비가용 성분으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 에탄올 추출 비가용 성분을 물을 사용하여 추출하여 수용성 성분만을 분리해낼 수 있으며, 이 수용성 성분에 포함된 인삼열매 다당체를 유효성분으로 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 수용성 성분을 농축하고, 에탄올로 침전시킨 후, 저분자량 성분을 제거하여 인삼열매 다당체를 얻을 수 있다.
예를 들어, 종자를 제거한 인삼열매를 50-100% 에탄올을 사용하여 추출한 후, 추출 비가용 성분을 부피 3-10배의 물로 가온 추출하여 수용성 추출물을 얻는다. 수용성 추출물을 고형분이 10-50 중량%가 되도록 농축하고, 여기에 부피 2-5배의 에탄올을 사용하여 침전시킨 후, 분획분자량(Molecular Weight Cut off) 10,000-30,000 으로 분리하여 저분자량 성분을 제거하여 인삼열매 다당체를 얻을 수 있다. 상기 저분자량 성분의 제거는 한외여과막을 이용한 한외여과 등의 여과, 투석, 2-10배 부피의 50-100% 에탄올로 1-10회 반복 용해 처리 등에 의해 수행할 수 있다. 일예에서, 상기 저분자량 성분 제거 후 건조를 수행할 수 있다. 상기 건조는 동결, 열풍, 분무 또는 진공 처리 등에 의할 수 있다.
일예에서, 상기 인삼열매의 수용성 성분을 물 추출하기 전에 효소 처리를 더 포함할 수 있다. 상기 효소는 식품에 사용되는 효소라면 제한없이 사용 가능하나, 예를 들어 아밀라아제, 프로테아제, 펙티나아제, 리파아제, 셀룰라아제, 자일라아제, 베타-글루카나아제, 또는 풀룰라나아제 중에서 선택될 수 있다. 상기 효소 처리는 예를 들어 40~60℃에서 10~60분간 효소와 반응시킬 수 있다.
상기 인삼열매 다당체는 아라비노즈, 갈락토즈, 갈락투론산 및 글루쿠론산을 포함할 수 있다.
일예에서, 상기 다당체 총 중량에 대하여 갈락투론산 및 글루쿠론산을 합계 함량으로 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 0.3 중량% 이상, 0.4 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 0.6 중량% 이상, 0.7 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 0.9 중량% 이상, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상이고, 25 중량% 이하, 24 중량% 이하, 23 중량% 이하, 22 중량% 이하, 21 중량% 이하, 20 중량% 이하, 19 중량% 이하, 18 중량% 이하, 17 중량% 이하, 16 중량% 이하, 15 중량% 이하, 14 중량% 이하, 13 중량% 이하, 12 중량% 이하, 11 중량% 이하, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 또는 4 중량% 이하로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 함량은 0.1 중량% 내지 25 중량%, 또는 0.5 중량% 내지 20 중량%일 수 있다.
상기 갈락투론산은 다당체 총 중량에 대하여 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 0.3 중량% 이상, 0.4 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 0.6 중량% 이상, 0.7 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 0.9 중량% 이상, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상이고, 20 중량% 이하, 19 중량% 이하, 18 중량% 이하, 17 중량% 이하, 16 중량% 이하, 15 중량% 이하, 14 중량% 이하, 13 중량% 이하, 12 중량% 이하, 11 중량% 이하, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 또는 4 중량% 이하로 포함할 수 있다. 상기 함량은 예를 들어 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 15 중량%, 1 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 또는 0.5 중량% 내지 5 중량%일 수 있다.
상기 글루쿠론산은 다당체 총 중량에 대하여 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 0.3 중량% 이상, 0.4 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 0.6 중량% 이상, 0.7 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 0.9 중량% 이상, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 또는 7 중량% 이상이고, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 또는 4 중량% 이하로 포함할 수 있다. 상기 함량은 예를 들어 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.5 중량% 내지 5 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%일 수 있다.
일 예에서, 상기 아라비노즈는 다당체 총 중량에 대하여 2 중량% 내지 30 중량%로 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 갈락토즈는 다당체 총 중량에 대하여 5 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 인삼열매 다당체는 아라비노갈락탄(arabinogalactan) 구조를 높은 비율로 포함한다. 아라비노갈락탄 구조의 검출은 β-글루코실 야리브 시약(β-glucosyl Yariv reagent)을 이용할 수 있다. 도 2에 β-글루코실 야리브 시약에 의해 아라비노갈락탄을 검출하는 반응을 모식적으로 나타낸다. β-글루코실 야리브 시약은 1,3,5-tri-(β-글루코피라노실-옥시페닐라조)-2,4,6-트리하이드록시벤젠(4- 1,3,5-tri-(4-β-glucopyranosyl-oxyphenylazo)-2,4,6-trihydroxybenzene)로, 아라비노갈락탄 중 II형의 아라비노-β-3,6-갈락탄(arabino-β,6-galactan)과 특이적으로 반응하여 적색 침전을 형성한다. β-글루코실 야리브 시약을 처리하여 생성되는 적색 침전환의 면적과 아라비노갈락탄 구조의 함유 농도는 농도의존적으로 비례한다. 상기 인삼열매 다당체는 동일농도의 표준 아라비노-β-3,6-갈락탄(arabino-β,6-galactan)에서 생성되는 침전환 크기를 100%로 할 때 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상이고, 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하 또는 60% 이하 크기의 침전환 면적을 나타낼 수 있다. 예를 들어 상기 침전환 면적은 50% 내지 90%, 50% 내지 80% 일 수 있다.
상기 인삼열매 다당체의 중량평균분자량은 10 kDa 이상일 수 있다. 상기 인삼열매 다당체는 분자량 70 kDa 내지 80 kDa에서 주 피크(peak)를 가질 수 있다.
상기 인삼열매 다당체는 다양한 다당 성분의 총합체로서, 포함되는 성분들의 조합에 의한 상승효과를 통하여 현저한 인플루엔자 바이러스의 활성 또는 감염 저해 효과를 나타내며, 구체적으로 뉴라미디네이즈 활성 저해 효과가 우수하다.
본 발명 실시예들에 따른 조성물은 상기 유효성분을 포함하는 다양한 형태의 식품 첨가제 또는 기능성 식품으로 제공될 수 있다. 상기 유효성분을 포함하는 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 및 건강식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 조성물은 건강 식품용 조성물일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 건강식품용 조성물은 상기 유효성분을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001중량% 내지 99중량%, 예를 들어 0.01 중량% 내지 60중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 실시예에 따른 건강식품용 조성물은 유효성분 기준 하루에 체중 1 ㎏당 0.001~500 ㎎, 예를 들어 0.005~100 ㎎, 0.01~50mg, 0.01~10mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유효성분을 상기 와 같은 소량 사용으로도 상술한 효과를 유의하게 나타낼 수 있다.
구체예에서, 상기 건강 식품용 조성물은 환제, 캅셀제, 정제, 과립제, 캬라멜제 또는 드링크제 등으로 제형화할 수 있다. 다른 구체예에서, 액제, 분말, 과립, 정제 또는 티백 등의 형태로 가공될 수도 있다.
상기 조성물은 단순 음용, 주사 투여, 스프레이 방식 또는 스퀴즈 방식 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 본 발명의 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.01중량% 내지 5 중량%, 예를 들어 0.01중량% 내지 3중량% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명 일 실시예에서, 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
본 실시예에서, 상기 조성물은 인삼열매 다당체를 포함하여 인플루엔자 바이러스 감염을 예방, 감염 감소 또는 인플루엔자를 치료할 수 있는 조성물일 수 있다.
일예에서, 상기 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 조성물일 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환은 독감, 인후염, 기관지염 및 폐렴 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명 실시예들에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.
본 발명 실시예들에 따른 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.001~500 ㎎, 예를 들어 0.005~100 ㎎, 0.01~50mg, 0.01~10mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명 실시예들에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 피부 외용제, 좌제, 주사제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명 다른 실시예에 따르면, 상기 인삼열매 다당체의 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제 용도를 제공할 수 있다. 상기 용도는 인플루엔자 감염 감소 용도 또는 인플루엔자를 치료하는 용도, 또는 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 용도 또는 치료용도를 포함할 수 있다. 인삼열매 다당체와 효과, 투여 형태 등에 관하여는 상술한 바와 같으므로 기재를 생략한다.
본 발명 또 다른 실시예에 따르면, 상기 인삼열매 다당체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 또는 억제용 조성물을 제조하기 위한 인삼열매 다당체의 용도일 수 있다. 상기 용도는 인플루엔자 감염 감소 용도 또는 인플루엔자를 치료하는 용도, 또는 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 용도 또는 치료용도를 포함할 수 있다. 인삼열매 다당체와 효과, 투여 형태 등에 관하여는 상술한 바와 같으므로 기재를 생략한다.
본 발명 또 다른 실시예에 따르면, 상기 인삼열매 다당체를 대상에 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 방법, 인플루엔자 바이러스 억제 방법, 인플루엔자 감염 감소 방법, 또는 인플루엔자 치료 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환의 예방 방법 또는 치료 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 인삼열매 다당체를 포함하는 상술한 바와 같은 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 인삼열매 다당체와 효과, 투여 형태 등에 관하여는 상술한 바와 같으므로 기재를 생략한다.
일 예에서, 상기 방법은 인플루엔자 바이러스 억제, 인플루엔자 감염 감소, 또는 인플루엔자 치료를 필요로 하는 대상에 인삼열매 다당체를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여는 인삼열매 다당체의 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[제조예 1] 인삼열매 다당체의 제조
종자를 제거한 인삼열매를 10배 부피의 90% 에탄올로 추출하여 수용성 성분을 침전시키고 상등액을 제거한다. 침전된 추출 비가용 성분을 부피 20배의 물로 90℃ 5시간 가온 추출한다. 추출물을 고형분이 30중량%가 되도록 농축하고, 농축물의 부피 2배의 90% 에탄올을 가하여 침전시킨다. 침전된 수용성 성분의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 결과를 도 3에 나타낸다. 침전물을 한외여과를 통해 분획분자량(Molecular Weight Cut off) 20,000으로 분리하여 저분자량 성분을 제거하고 동결 건조하여 70 내지 80kDa의 분자량을 주 피크(peak)로 하는 분자량 10kDa 이상의 인삼열매 다당체를 얻었다. 제조된 인삼열매 다당체의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 결과는 도 4에 나타낸다.
[제조예 2] 홍삼 다당체의 제조
인삼열매 대신 홍삼근을 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 홍삼 다당체를 제조하였다.
[시험예 1] 아라비노갈락탄의 검출
아라비노-β-3,6-갈락탄의 존재를 확인하기 위한 β-글루코실 야리브 시약(β-glucosyl Yariv reagent; Biosupplies, Parkville, Australia)와의 반응성 검토는 Holst와 Clarke의 방법(Van Holst GJ, Clarke AE. Quantification of arabinogalactan-protein in plant extracts by single radial gel diffusion. Anal. Chem. 148: 446-450 (1985) )에 따라 라디칼 겔 확산법(Single radical gel diffusion)으로 측정하였다.
β-글루코실 야리브 시약 10㎍/㎖를 함유한 0.15M NaCl 아가로즈 평판을 조제하고, 직경 2.5mm의 well을 만들어, 농도별로 희석한 표준 물질인 gum Arabic과 시료 5㎍을 함유한 용액을 well에 각각 주입하였다. 상기 평판을 습윤 상태에서 15시간 정치시켜 반응시키고, 생성된 붉은색 침전환을 관찰하여 아라비노-β-3,6-갈락탄의 존재 유무를 관찰하였고, 시료와 β-글루코실 야리브 시약과의 반응성은 생성된 침전환의 넓이를 계산하여 상호 비교하였다. 시료로는 도 5에 나타난 바와 같이 표준물질 62.5, 125, 250, 500 및 1000 ㎍/㎖, 제조예 1 및 제조예 2의 다당체를 각각 100, 500 및 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용하였다.
생성된 붉은색 침전환의 면적을 측정하여 아라비노-β-3,6-갈락탄의 상대 함량을 도 6에 나타내었다. 도 6의 결과는 표준물질 1000㎍/㎖ 농도 처리군에 대하여 각 시료 1000㎍/㎖ 처리군의 면적을 비교한 것이다.
도 6의 결과에서, 인삼열매 다당체는 홍삼 다당체 대비 2배 이상의 고함량으로 아라비노갈락탄 구조를 포함하는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 2] 인삼열매 다당체의 인플루엔자 바이러스 증식 억제 평가
개의 신장세포주인 MDCK(Madin-Darby canine kidney, ATCC: CCL-34)를 이용하여 인삼열매 다당체의 항바이러스 효과를 확인하였다.
96-well 마이크로플레이트(microplate)에　MDCK　세포를 각　well　당　1×10 5/well이 되도록 넣고, EMEM 배지(penicillin 100 units, streptomycin 100㎍, 10% FBS)에서 배양한다. MDCK　세포가　단층(monolayer)이 되면 항생제만 포함하는　EMEM　배지로　2회 세척한다. H1N1균주(Influenza A virus subtype/H1N1/pdm)를　100TCID50이 되도록 희석하여　EP　튜브에 담아 둔다.　여기에 시료로서 상기 제조예 1의 인삼열매 다당체(APGP)를 농도별로 희석하여 각 튜브에 넣은 후　4℃에서　1시간 동안 반응 시킨다. 양성 대조군 시료로 미국 인삼 (Panax quinquefolium) 추출물인 CVT-E002(COLD-FX®, 이하 “CVT”)를 사용하였다. 1시간 후 상기 반응액을 미리 세척한　MDCK　세포에 한 농도 당　3 well씩 각각 접종하여　35℃에서　1시간 동안 배양한다. 1시간 후 플레이트의 배지를 모두 제거하고　PBS로　1회 세척 후,　항생제와　10㎍/mL　트립신이 첨가된　EMEM배지를 각　well에　100ml씩 분할하고　37℃에서　48-72시간 배양한다.　
H1N1 균주 감염하고 시료를 무처리한 대조군에서 완전히 세포병변효과(Cytopathic effect, CPE)가 나타날 때까지　48~72시간 배양하고,　도립현미경으로 매일 세포 상태를 관찰한다.　세포병변효과는 감염에 의한 세포 라운딩(rounding), 탈리(detachment) 후 사멸(death)을 포함한다. 배양48~72시간 후 세포 생존률을 알아보기 위하여　Cell Counting kit-8(Dojin, Kumanoto, Japan, tetrazolium salt WST-8)을 각　well당　10ml　씩 넣고　35℃에서　2시간 반응시킨 후　450nm에서 흡광도를 측정하였다.
인삼열매 다당체의 경우　0.78125-3.125 mg/ml　　범위 내에서 인플루엔자 바이러스를 처리 한 경우 MDCK 세포의 세포병변효과(Cytopathic effect, CPE)가 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.
시료 CC 50 (mg/ml) EC 50 (mg/ml) SI (CC 50/EC 50)
Cold-Fx (CVT) 7.50±1.91 N/A N/A
APGP 4.69±1.10 0.59±0.36 7.95
상기 표 1은 시료 별 SI 지수(Selectivity index)를 나타낸다. CC 50 (50% cytotoxic concentration)값은 시료가 50% 세포 사멸을 유도하는 농도로서, 수치가 클수록 안전한 물질에 해당하고, EC 50 (50% inhibitory concentration)값은　바이러스가　50% 억제되는 농도로서, 수치가 작을수록 바이러스를 억제하는 효능이 우수한 것을 나타낸다.
SI 지수가 클수록 바이러스 증식 억제 효과가 우수한 것이며, 대조군인 CVT의 경우 항바이러스 효과가 전혀 나타나지 않는 반면 인삼열매 다당체의 경우 7.95의 높은 수치를 나타낸다. 이러한 수치는 생물학적으로 알려진 단독 물질인 EGCG (5.6), 레스베라트롤 (2) (Kim, Y.; Narayanan, S.; Chang, K.O. Inhibition of influenza virus replication by plant-derived isoquercetin. Antivir. Res. 2010, 88, 227-235.)의 경우보다도 현저히 높은 값으로, 우수한 인플루엔자 바이러스 억제 효과를 나타내는 점을 알 수 있다.
[시험예 3] 인삼열매 다당체의 뉴라미니데이즈 억제 분석
인플루엔자 바이러스와 같이 바이러스의 증식에 바이러스 표면의 뉴라미니데이즈(NA) 단백질 시스템을 이용하는 바이러스들에 대한 항바이러스 활성을 측정하는 한 가지의 지표로써 사용된다. 뉴라미니데이즈(neuraminidase)　활성억제시험은　WHO (Standard operating procedure)에서 추천하는 방법에 준거하여 실시하였다.　
2종의 포유류 유래 H1N1 바이러스 균주 NWS (A/NWS/33) 및 CA (A/California/07/2009) 를 사용하여 뉴라미니데이즈 억제 IC50으로 효소 억제 활성을 분석하였다. 상기 바이러스 균주는 EMEM(Eagle's minimum essential medium) 배지 내에서 MDCK 세포주에 감염시킨 후 그 세포에서 바이러스를 활성화 시킨 바이러스 배양액을 사용하였다. 시료로서 제조예 1의 인삼열매 다당체(APGP)를 사용하고, 양성 대조군으로 미국 인삼 (Panax quinquefolium) 추출물인 CVT-E002(COLD-FX®, 이하 “CVT”)를 사용하여 시료 농도별 뉴라미니데이즈 활성 억제도를 분석하였다.
농도별 시료액(APGP, CVT) 10㎕와 바이러스 배양액 50㎕를 실온에서 45분간 반응시킨 후, 200μM MUNANA 기질(2'-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid,) 50㎕를 첨가한 후 1시간 반응시킨 다음,　　83% 에탄올에 0.14 M NaOH이 녹여진 정지액 100 ㎕을 첨가하여 반응을 종료시키고,　spectrofluorophotometer(ABI/Perkin Elmer Biosystems)로　Ex. 360 nm/Em. 440 nm에서　fluorescence를 측정하여 효소활성억제율을 산출하였다.　시료를 첨가하지 않은 무처리 대조군의　fluorescence　값을　100%로 하여 억제율(%)를 도 7 내지 도 10에 나타낸다.
도 7 내지 도 10의 결과에서, 인삼열매 다당체는 뉴라미니데이즈 활성을 농도의존적으로 억제하며, 인삼열매 다당체는 IC50 값이 양성 대조군인 CVT 대비 약 1/4~1/5로 나타나 현저하게 우수한 뉴라미니데이즈 활성 억제 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
[시험예 4] 동물 모델에서 인플루엔자 바이러스 감염 실험
7주령 마우스(SPF BALB/c mouse)에 마우스용 존대(zonde)를 사용하여 시료인 인삼열매 추출물(APGP) 0.5mg/kg, 5mg/kg, 50mg/kg, 양성 대조군 시료인 미국 인삼 (Panax quinquefolium) 추출물인 CVT-E002(COLD-FX®, 이하 “CVT”) 200mg/kg를 경구 투여하였다. 시료는 바이러스 접종 14일 전에 투여하고, 바이러스 접종 전 까지 하루에 1회씩 투여하였다. 인플루엔자 바이러스 접종은 에테르를 이용하여 마취한 뒤에 포유류인플루엔자 바이러스(Influenza A virus subtype/H1N1/NWS strain)를　LD0　또는　LD70의 용량으로 비강을 통해 접종 실시하였다. 도 11에 인플루엔자 바이러스 감염 실험 스케쥴을 모식도로 나타낸다. 무처리 대조군(Negative control)은 시료 대신 PBS를 투여하고 바이러스 접종 없이 진행한 것이며, 바이러스 대조군(Virus control)은 시료 대신 PBS 투여 및 바이러스 접종을 하지 않은 실험군이다.
상기와 같이 감염시킨 마우스를 이하의 바이러스 접종 시점으로부터 3일(3dpi), 5일(5dpi) 및 7일(7dpi) 시점에서의 조직 병변 및 바이러스 재분리율 실험에 제공하였다.
[시험예 5] 동물모델에서의 조직병리학적 병변분석
상기 시험예 4에서와 같이 인플루엔자 바이러스를 접종시킨 마우스를 바이러스 접종 시점으로부터 각각 3일(3dpi), 5일(5dpi) 및 7일(7dpi) 시점에서 희생시키고, 폐 조직을 분리하여 H&E 염색을 통해 조직병리학적 병변 분석에 사용하였다. 도 15 내지 도 18은 폐 병변 조직 사진을 나타낸다. 병변 수를 카운트하여 수치화하였고, 이를 무처리 대조군(Negative control)을 100%로 하여 산출한 폐병변 지표(Lung index)를 도 12 내지 도 14에 나타낸다.
도 12 내지 도 14의 결과에서, 인삼열매　다당체의 경구 투여시 폐병변지표가 완화되는 것을 확인할 수 있다. 특히 양성 대조군인 CVT의 경우 인삼열매 다당체 투여량의 40배에 달하는 양을 처리하여야 인삼열매 다당체와 동등한 수준의 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
[시험예 6] 바이러스 재분리율 분석
상기 시험예 4에서와 같이 인플루엔자 바이러스를 접종시킨 마우스를 바이러스 접종 시점으로부터 각각 3일(3dpi), 5일(5dpi) 및 7일(7dpi) 시점에서 희생시키고, 분리한 폐 조직에서 RNA를 추출한다. 추출된 RNA로 cDNA 합성 Kit를 이용하여 cDNA 라이브러리 구축 후, quantitative RT-PCR을 수행하여 재분리된 바이러스 copy 수를 산출하고, 바이러스 감염 수준을 확인하였다. 결과를 도 19 내지 도 21에 결과를 나타낸다.
도 19 내지 도 21의 결과에서 인삼열매　다당체의 투여 시 바이러스 감염 수준이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있다. 특히, 도 19의 인삼열매 다당체 5, 50mg/kg/day 투여군의 경우에 바이러스 접종으로부터 3일까지 바이러스 감염이 전혀 발생하지 않는 것이 나타나며, 이로부터 인삼열매 다당체가 우수한 인플루엔자 바이러스 감염 예방 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 나아가, 양성 대조군인 CVT의 경우 인삼열매 다당체 투여량의 40배에 달하는 양을 처리하여야 인삼열매 다당체와 동등한 수준의 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. 인삼열매 다당체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인삼열매 다당체는 아라비노즈, 갈락토즈, 갈락투론산 및 글루쿠론산을 포함하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 갈락투론산 및 글루쿠론산을 상기 인삼열매 다당체 총 중량에 대하여 0.1 중량% 내지 25 중량%로 포함하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인삼열매 다당체는 β-글루코실 야리브 시약(β-glucosyl Yariv reagent) 처리 시 표준 아라비노-β-3,6-갈락탄(arabino-β-3,6-galactan)을 100%으로 할 때, 40 % 이상의 반응을 나타내는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인삼열매 다당체는 인삼열매의 에탄올 비가용 분획 중 수용성 성분 유래인 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 인삼열매 다당체는 인플루엔자의 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 활성을 억제하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 인플루엔자는 H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H6N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 또는 H10N7 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 건강기능식품용인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약학 조성물인, 조성물.
PCT/KR2019/005081 2018-05-02 2019-04-26 인삼열매 다당체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 억제용 조성물 WO2019212203A1 (ko)

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