WO2023048334A1 - 신규한 락토바실러스 플란타럼 probio 88, 이의 추출물 및 조성물 - Google Patents

신규한 락토바실러스 플란타럼 probio 88, 이의 추출물 및 조성물 Download PDF

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probio
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    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a novel Lactobacillus plantarum Probio 88, an extract and a composition thereof, and more particularly, inhibits replication of SARS-CoV-2 virus and production of reactive oxygen species (ROS), and is used as a treatment for coronavirus. It relates to novel Lactobacillus plantarum Probio 88, extracts and compositions thereof that can be used.
  • ROS reactive oxygen species
  • Coronaviruses have caused two large-scale pandemics in the past 20 years: Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) and Middle East Respiratory Syndrome (MERS). Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2), a highly pathogenic human coronavirus that emerged in 2019, caused a large-scale disease, COVID-19, which the World Health Organization (WHO) eventually declared a pandemic came to make a declaration. About half (40-45%) of infected people are asymptomatic, and contagiousness usually peaks before the onset of symptoms, making it difficult to contain the spread of the disease. Covid-19 can cause severe pneumonia because it can trigger an overreaction of the immune system. These symptoms are defined as a cytokine storm in which the immune system overreacts, resulting in severe respiratory distress and subsequent shutdown of multiple organs.
  • probiotics are live microorganisms that, when administered in appropriate amounts, provide health benefits to the recipient. Activates the immune system and improves resistance to infection.
  • probiotics were administered for several days, the function of probiotics to provide immunomodulatory activity was to promote inflammation (IL-6, IL-12p70, IL-17 and TNF- ⁇ ) were significantly reduced and anti-inflammatory (IL-10 and TGF- ⁇ 1) cytokines were increased.
  • viruses including coronaviruses
  • host cells also equip innate and adaptive immune responses to limit viral multiplication. It is the competition between host and virus that ultimately determines the outcome of disease progression.
  • ROS reactive oxygen species
  • Plantaricin W, D and JLA-9 were found to have high inhibitory activity against the catalytic site of the RNA-dependent RNA polymerase of SARS-CoV-2, which indicates the replication cycle of the virus. plays a major role in
  • ERK Extracellular signal-Regulated Kinase pathway
  • ERK Extracellular signal-Regulated Kinase pathway
  • viruses or their components can also activate kinases.
  • Mizutani et al. reported that SARS-CoV-infected Vero E6 cells showed enhanced ERK phosphorylation.
  • Chen showed that the SARS-CoV S protein or SARS-CoV virus-like particle could phosphorylate ERK in A549 cells.
  • MERS and HCoV-299E also modulate the ERK signaling pathway during infection.
  • the ERK pathway consists of three signaling cascades (Raf/MEK/ERK) and is important for cell growth. Because pathway activation is highly dynamic, many viruses (herpes simplex type-1 virus, influenza virus, Ebola virus, flavivirus) have been (flavivirus) and other viruses).
  • the ERK pathway is also important for maintaining inflammation during infection. Initiation and regulation of the inflammatory response is one of the key events controlled by mitogen-activated protein kinases (MAPKs).
  • MAPKs mitogen-activated protein kinases
  • the ERK pathway is one of three members of the MAPK family, along with p38 and JNK.
  • MAPK is activated upon viral invasion to produce inflammatory cytokines and chemokines.
  • SARS-CoV-2 which resembles a highly pathogenic virus, the dysregulated inflammatory response that occurs during pathogen attack is called a cytokine storm and is strongly controlled by the p38 and ERK pathways.
  • Inflammation during infection represents a protective mechanism to inhibit pathogen spread
  • the first line of defense usually includes type 1 interferons (IFN- ⁇ and IFN- ⁇ ) and the multifunctional cytokine IL-6.
  • IFN- ⁇ and IFN- ⁇ type 1 interferons
  • IFN production although delayed, is actually stimulated at significant levels.
  • the groups also reported that high amounts of viral transcripts were observed before IFN induction in cells infected with SARS-CoV-2. Therefore, it is hypothesized that a high viral load is required to initiate an IFN response.
  • the technical problem of the present invention is to inhibit SARS-CoV-2 infection and replication, reduce inflammation and intracellular accumulation of reactive oxygen species (ROS), reduce extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity, and antiviral activity It is to provide novel Lactobacillus plantarum Probio 88, extracts and compositions thereof that improve.
  • ROS reactive oxygen species
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • the present invention relates to Lactobacillus plantarum Probio 88 strain (KCTC14482BP).
  • the strain is characterized in that it is used to inhibit infection and replication of SARS-CoV-2.
  • the strain is characterized in that it is used to reduce inflammation.
  • the strain is characterized in that it is used to reduce the intracellular accumulation of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • the strain is characterized in that it is used to reduce extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity.
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • the strain is characterized in that it is used to enhance antiviral activity.
  • the extract of the present invention is a cell-free supernatant (P88-CFS) extract of Lactobacillus plantarum Probio 88 containing the Lactobacillus plantarum Probio 88 strain (KCTC14482BP).
  • P88-CFS cell-free supernatant
  • the extract is characterized in that it contains Plantarisin E (PlnE) and Plantalysin F (PlnF), and is used to inhibit infection and replication of SARS-CoV-2.
  • Plantarisin E Plantarisin E
  • Plantalysin F Plantalysin F
  • the extract is characterized in that it is used to reduce inflammation.
  • the extract is characterized in that it is used to reduce the intracellular accumulation of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • the extract is characterized in that it is used to reduce extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity.
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • the extract is characterized in that it is used to enhance antiviral activity.
  • the extract is characterized in that it is used to enhance antiviral activity.
  • composition of the present invention is characterized in that it is for treatment of coronavirus including Lactobacillus plantarum Probio 88 strain (KCTC14482BP).
  • composition may be used as a feed, feed additive, food, functional food, cosmetic composition, pharmaceutical composition or quasi-drug.
  • Lactobacillus plantarum according to the present invention ( Lactobacillus plantarum ) Plantarisin E (PlnE) produced by Probio 88 strain (KCTC14482BP); And plantarisin F (PlnF) is characterized in that it is used to inhibit infection and replication of SARS-CoV-2.
  • Lactobacillus plantarum Plantarisin E (PlnE) produced by Probio 88 strain (KCTC14482BP); And plantarisin F (PlnF) is characterized in that it is used to inhibit infection and replication of SARS-CoV-2.
  • the present invention inhibits SARS-CoV-2 infection and replication, reduces inflammation and intracellular accumulation of reactive oxygen species (ROS), reduces extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity, improves antiviral activity, It has the effect of the present invention to provide a novel Lactobacillus plantarum Probio 88, an extract and a composition thereof, which can be usefully used as a coronavirus treatment or adjuvant treatment.
  • ROS reactive oxygen species
  • ERK extracellular signal-regulated kinase
  • 1 is a graph showing the degree of inhibition of the P88-CFS extract of the present invention against SARS-CoV-2 infection.
  • Figure 2 is a graph showing the MTT assay results of (a) HCE cells, (b) HEK cells, and (c) HeLa cells for the P88-CFS extract of the present invention at different concentrations.
  • FIG. 3 (a) is a photograph of reactive oxygen species (ROS) staining by dichlorofluorescein (H2DCFDA) staining, and (b) is a graph showing quantitative fluorescence intensity measured by Image J.
  • ROS reactive oxygen species
  • H2DCFDA dichlorofluorescein
  • FIG. 4 is an immunofluorescence confocal micrograph showing the effect of P88-CFS on p-ERK protein in HEK293 cells after infection with SARS-CoV-2.
  • Figure 5 is a graph showing gene expression of inflammatory markers in HEK293 cells after infection with and without P88-CFS treatment according to the present invention, (a) IFN- ⁇ , (b) IFN- ⁇ , and (c) IL-6 Expression of was measured by qPCR and normalized to GAPDH.
  • 6 is a structural diagram showing the secondary structure of Sars-CoV-2 helicase nsp13.
  • Figure 7 is a graphic showing the molecular docking of PlnE and PlnF
  • (a) is the 3D structure of SARS-CoV-2 helicase nsp 13 (PDB ID: 6ZSL) used in molecular docking studies
  • (b) is Planta It is a construction model of lysine (PlnE)
  • (c) is a construction model for plantarisin F (PlnF)
  • (d) shows PlnE inserted into the cavity of ss-RNA and ATP binding sites
  • (e) shows that PlnF is inserted into the cavity of ss-RNA and ATP binding sites.
  • FIG. 8 is a diagram showing the bonding structures of (a) PlnE and (b) PlnF, and the hydrogen bond cut-off was set to 4.0 ⁇ .
  • FIG. 9 is a diagram showing a Ligplot+ interaction diagram of PlnE.
  • FIG. 10 is a diagram showing a Ligplot+ interaction diagram of PlnF.
  • the bacteria used in the present invention is Lactobacillus plantarum Probio 88, which was deposited with the Korean Collection for Type Cultures on March 4, 2021 under accession number KCTC 14482BP. Strains were previously extracted from kimchi. The strain contains 5 g/L of soy peptone, 5 g/L of sodium acetate, 20 g/L of yeast extract, 20 g/L of d(+)-glucose, and 2 g/L of ammonium sulfate. L, Dipotassium phosphate 2 g/L, magnesium sulfate 0.1 g/L, manganese sulfate 0.05 g/L, and Tween 80 1 g/L.
  • the SARS-CoV-2 strain was obtained by isolation from oropharyngeal swabs of patients infected with coronavirus disease 2019 (COVID-19). All work on SARS-CoV-2 was conducted under Biosafety Level 3 (BSL-3) restricted conditions. Virus stocks were generated by culturing viruses in HEK293 cells at 90% confluency for 48 hours. The resulting cultures were then purified and stored at -80°C. Control samples were prepared in the same way using uninfected cells. Virus stocks were quantified by titration.
  • Lactobacillus plantarum Priobio 88 was incubated in conditioned MRS broth at 37°C for 24 hours followed by 3,500 rpm for 15 minutes Centrifuged. The generated supernatant was obtained and neutralized to pH 7.0 dmfh, and filter sterilized using a syringe filter (pore size 0.22 ⁇ m). Then, the supernatant was lyophilized and reconstituted by supplying water to 10% of the original volume. The resulting extract was prepared as P88-CFS and stored at -20°C for analysis.
  • HEK293 cells were seeded in a 96-well plate (TPP, Trasadingen, Switzerland) at a density of 4 x 104 cells per well. After 24 hours, the cells were cultured in 100 ⁇ l culture medium (penicillin (100 U/mL) and streptomycin (100 ⁇ g/mL), P88-CFS (50, 100, 150, 200 or 250 mg/ml) and Cultured with SARS-CoV-2 virus (0.1 multiplicity of infection) After incubation at 37° C. for 2 hours, the cells were washed 3 times with PBS and maintained in 100 ⁇ l of the same culture medium without the presence of virus. Positive and negative control samples were inoculated in the same manner, except that the P88-CFS was replaced with DMSO and Phosphate-Buffered Saline (PBS), respectively.Virus yield was measured using a quantitative real-time PCR method.
  • HCE Human corneal epithelial
  • HEK293 and Hela cell lines were cultured in Complete medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (HyClone Laboratories, USA), penicillin (100 U/mL) and streptomycin (100 ⁇ g/mL). ) in a humid environment of 5% CO 2 at 37°C.
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100 U/mL
  • streptomycin 100 ⁇ g/mL
  • PBS was used to replace P88-CFS in DMEM, at the end of culture the cells were washed with PBS, 5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, After treatment with 50 ⁇ l of 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) solution, the cells were incubated at 37° C. for 45 minutes. The cell supernatant was discarded, and formazan crystals were dissolved in isopropanol. Then, absorbance was measured at 570 nm. All assays were performed in triplicate. Viability was defined as the relative absorbance of P88-CFS treated cells compared to control cells.
  • MTT 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
  • ROS reactive oxygen species
  • SARS-CoV-2 was isolated from oropharyngeal swabs from patients with COVID-19.
  • Viral stocks were generated by infecting HEK293 cells at 90% confluency for 48 hours. Thereafter, the culture medium was aliquoted and stored at -80°C. Control samples were prepared in the same way using uninfected cells. Viral stock was quantified by titration. When the cells reached 60-70% confluence, the level of ROS was measured with different concentrations of P88-CFS. Media was removed and cells were washed twice with DMEM only.
  • DCFH-DA 2'-7'-dichlorodihydrofluorscein diacetate
  • HEK293 cells were cultured in complete culture medium and infected with SARS-CoV-2. Then, the cells were washed 3 times with PBS and fixed in 4% formaldehyde for 10 minutes. Cells were then permeabilized using 0.2% Triton X. Cells were then treated with a signal enhancer and then blocked using 5% normal goat serum diluted in PBS. Cells were incubated at 4°C with the primary antibody of pERK (1:100) (Cell Signaling) for 12 hours. Then, cells were washed 3 times with PBS and incubated with secondary antibody for 1 hour. Then, cells were washed with PBS, and nuclei were counterstained with DAPI (Sigma Aldrich, USA). Finally, cells were washed with PBS and pictures were taken using a fluorescence microscope equipped with a digital camera (Nikon, Japan).
  • Real-time PCR was performed in a 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems) using 2 ⁇ l of cDNA, 10 pmol of each gene-specific primer, and Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA). Detailed information describing primer sequences for rt-PCR is shown in Table 1 below.
  • BLASTP the primary sequence to form 3D structures for both Plantaricin E and Plantaricin F of L. planta-rum Probio-88 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) to search for sequence identity, and to identify appropriate templates for homology modeling. Due to the high percentage sequence identity with the target sequences plantaricins E and F, a comparative modeling approach was adopted to use plantaricins E (PlnE) and F (PlnF) (PDB IDs: 2JUI and 2RLW) as templates. SWISS-MODEL, an automated protein structure prediction server, was used, and the model with the highest QMEAN score was selected. Structural evaluation of the formed model was performed using Ramachandran pliot analysis.
  • HADDOCK2.4 Placing from Lactobacillus plantarum probio88 to SARS-CoV-2 Helicase using HADDOCK2.4, an automated protein-to-protein docking server (https://wenmr.science.uu.nl/) Protein-protein interactions of lantharicins E and F were investigated.
  • Helicase nsp13 from SARS-CoV-2 (PDB ID: 6ZSL) was selected.
  • the interacting residues for the ATP and ss-RNA binding sites are Glu537, Arg567, Arg443, His290, Arg442, Asn265, Gly439, Lys288, Ser485, Lys146, Lys139, Tyr180, His230, Tyr198, Arg212, Pro335, Arg339 and Asn516. determined and set as interface residues for docking.
  • the cluster with the lowest HADDOCK score was selected and further analyzed for binding using PRODIGY. Visual Molecular Dynamics (VMD) was used to visualize the binding action.
  • the inhibitory effect of P88-CFS was initially evaluated in HEK293 cells.
  • the cells were first infected with the SARS-COV-2 virus and then treated with P88-CFS at a concentration ranging from 50 to 250 mg/ml.
  • 1 is a graph showing the degree of inhibition of the P88-CFS extract of the present invention against SARS-CoV-2 infection. As shown in Figure 1, it was shown that the inhibition of SARS-COV-2 virus infection increased as the throughput of P88-CFS increased.
  • data are expressed as the mean ⁇ SD of three independent experiments.
  • the amount of virus in the culture supernatant was reduced compared to the untreated SARS-COV-2 infected control (0 mg/ml P88-CFS). Virus growth was significantly inhibited from 48% to 97% with increasing concentrations of P88-CFS.
  • Figure 2 is a graph showing the MTT assay results of (a) HCE cells, (b) HEK cells, and (c) HeLa cells for the P88-CFS extract of the present invention at different concentrations.
  • each data is expressed as the mean ⁇ SD for three independent experiments, *** P ⁇ 0.001 compared to control; **P ⁇ 0.01; *P ⁇ 0.05, as shown in Figure 2, P88-CFS tested against HCE, HEK and HeLa cell lines using the MTT assay for cytotoxicity showed that the metabolite was well tolerated by human cells.
  • HCE cells showed the strongest resistance to the P88-CFS extract according to the present invention
  • HeLa and HEK cells also showed strong resistance to the P88-CFS extract.
  • Cell viability greater than 80% was maintained in HCE and HeLa cells when treated with 200 mg/ml of P88-CFS extract.
  • HEK cells showed a higher sensitivity to the P88-CFS extract as culture medium containing more than 100 mg/mL of P88-CFS resulted in less than 80% cell viability.
  • the above results demonstrate that P88-CFS can inhibit the replication of highly contagious human coronaviruses without serious cytotoxic effects when administered at 100 mg/ml. Therefore, the same dose was used for all subsequent experiments.
  • FIG. 3 (a) is a photograph of reactive oxygen species (ROS) staining by dichlorofluorescein (H2DCFDA) staining
  • (b) is a graph showing quantitative fluorescence intensity measured by Image J.
  • the treated cells were stained with H2DCFDA dye for 30 minutes, washed with PBS, and fluorescence images were acquired with a confocal microscope (scale: 500 ⁇ m).
  • the present inventors further investigated the effect of P88-CFS on the intracellular accumulation of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • ROS level increased about 2.4-fold when the cells were infected with SARS-COV-2.
  • infected cells were incubated with 50, 100 and 150 mg/mL P88-CFS, ROS levels were significantly reduced by about 1.7-fold, 1.2-fold and 0.9-fold, respectively.
  • FIG. 4 is an immunofluorescence confocal micrograph showing the effect of P88-CFS on p-ERK protein in HEK293 cells after infection with SARS-CoV-2.
  • the immunofluorescence experiment is performed for DMSO (0.1%), viral titer, viral titer + 50 mg / ml, viral titer + 100 mg / ml, and viral titer + 150 mg / ml, respectively, images of pERK, DAPI and Merge. expressed.
  • p-ERK expression in HEK293 cells infected with SARS-CoV-2 was treated with 50, 100 and 150 mg/ml of P88-CFS.
  • DMSO 0.15% was used as a solvent for P88-CFS in all treatment groups.
  • Cells were fixed for 12 hours after infection and confocal images were collected. Cell nuclei are represented as dots (scale bar: 5 ⁇ m).
  • the MAPK/ERK pathway is an important pathway used by many viruses during pathogenesis.
  • Phosphorylated ERK (p-ERK) is often associated with the presence of viral infection.
  • p-ERK Phosphorylated ERK
  • expression of p-ERK was widely observed in both the cell nucleus and cytoplasm in virus-infected HEK293 cells without any treatment, whereas in mock cells treated with 0.1% DMSO Almost not detected.
  • 50 mg/ml P88-CFS did not block p-ERK expression, treatment with 100 and 150 mg/ml P88-CFS drastically reduced ERK phosphorylation in SARS-CoV-2 infected cells.
  • Figure 5 is a graph showing gene expression of inflammatory markers in HEK 293 cells after infection with and without P88-CFS treatment according to the present invention, (a) IFN- ⁇ , (b) IFN- ⁇ , and (c) IL- Expression of 6 was measured by qPCR and normalized to GAPDH. All experiments were repeated three times and statistical analysis was performed by t-test. Data are expressed as mean ⁇ SD of three independent experiments (*P ⁇ 0.05 compared to virus-infected cells; #P ⁇ 0.05 compared to control). Finally, to evaluate the correlation between viral infection and inflammation, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ and IL-6 were used in this study as one of the proinflammatory cytokines.
  • the mRNA expression of IFN- ⁇ , IFN- ⁇ and IL-6 in the SARS-CoV-2 infected cells was significantly increased compared to the control group.
  • mRNA expression levels of these pro-inflammatory cytokines were significantly reduced.
  • P88-CFS treated cells showed significant reductions of IFN- ⁇ , IFN- ⁇ and IL-6 by 2.2-fold, 1.5-fold and 1.7-fold, respectively.
  • FIG. 6 is a structural diagram showing the secondary structure of Sars-CoV-2 helicase nsp13.
  • the interacting residues for ss-RNA and ATP binding are the upper cluster (Ser485, Lys146, Lys139, Tyr180, His230, Tyr198, Arg212, Pro335, Arg339, Asn516) and the lower cluster (Glu537, Arg567, Arg443, His290, Arg442, Asn265, Gly439, Lys288).
  • the antiviral activity of L. plantarum Probio88 of the present invention was further evaluated using an in-silico molecular docking approach.
  • the strain was found to produce the plantarisins PlnE and PlnF with 33 and 34 amino acid residues, respectively.
  • the constructed models of PlnE and PlnF are composed of single helix chains, and their backbone structure was evaluated using Ramachandran pliot by measuring the psi( ⁇ ) and phi( ⁇ ) angles of the backbone.
  • Ramachandran plot statistical analysis indicated that 84% of the residues from PlnE and 92.9% of the PlnF construction model were in the most preferred regions.
  • Table 2 below is a comparison of Ramachandran plot analysis for Plantarisin E and F construction models and templates.
  • Region of Plot Plantaricin E Plantaricin F Built model template (PDB ID: 2JUI) Built model template (PDB ID: 2RLW) No. of residues % No. of residues % No. of residues % No. of residues % Residue in most favorite regions 21 84.0 21 84.0 26 92.9 25 89.3 Residue in additional allowed region 4 16.0 4 16.0 One 3.6 2 7.1 Residue in generously allowed regions 0 0.0 0 0.0 One 3.6 One 3.6 Residue in disallowed regions 0 0.0 0 0.0 0 0.0 0.0 Total 25 100 25 100 28 100 34 100
  • the main function of helicase involved the release of self-annealed ss-RNA using ATP as an energy source. Therefore, the peripheral residues and ATP binding sites of ss-RNA acting as active residues were applied as HADDOCK protein-protein docking binding site parameters.
  • Figure 7 is a graphic showing the molecular docking of PlnE and PlnF
  • (a) is the 3D structure of SARS-CoV-2 helicase nsp 13 (PDB ID: 6ZSL) used in molecular docking studies
  • (b) is Planta It is a construction model of lysine (PlnE)
  • (c) is a construction model for plantarisin F (PlnF)
  • (d) shows PlnE inserted into the cavity of ss-RNA and ATP binding sites
  • (e) shows that PlnF is inserted into the cavity of ss-RNA and ATP binding sites.
  • FIG. 8 is a diagram showing the bonding structures of (a) PlnE and (b) PlnF, and the hydrogen bond cut-off was set to 4.0 ⁇ .
  • PlnE such as Val35, Gly32, and Phe31 formed several hydrogen bonds with Gln537, Arg443, and Lys 288 at the ATP binding site of SARS-CoV-2 nsp 13.
  • Gln537 and Arg443 have recently been reported by Newman and co-workers as major sites of ATP hydrolysis.
  • Gly43 located at the N-terminus of PlnE formed a hydrogen bond interaction with one of the ss-RNA interface residues, that is, Arg212 of SARS-CoV-2 nsp 13.
  • FIG. 9 is a diagram showing a Ligplot+ interaction diagram of PlnE
  • FIG. 10 is a diagram showing a Ligplot+ interaction diagram of PlnF.
  • hydrophobic interactions known to contribute primarily to protein-protein interactions, dominate in both PlnE and F interactions with SARS-CoV-2 nsp13 helicase. .
  • plantarum Probio88 demonstrated antiviral activity using both PlnE and PlnF in an in-silico molecular docking approach.
  • the high binding affinity and formation of hydrogen bonds showed that the binding of PlnE and PlnF to helicase could act as a blocker by preventing the binding of ss-RNA to helicase.
  • the use of ATP by helicases for the unwinding process may fail because the ATP binding site is occupied by the C-terminus of plantalysin.
  • hydrophobic interactions one of the major contributors to protein-protein interactions, were found to be dominant in both PlnE and PlnF interactions with helicases.
  • the SARS-CoV-2 inhibitory activity demonstrated with P88-CFS according to the present invention demonstrates that probiotics can be used as an integrated therapeutic approach with vaccines and other antiviral agents to inhibit the spread of highly infectious pathogens.
  • natural supplements such as probiotics have been proven safe for decades, along with many other promising health benefits.
  • Probiotics may not have distinct antiviral mechanisms like commercially available drugs.
  • the results of this study support the valuable insight that probiotics are promising candidates for preventing exacerbation of COVID-19 infection.
  • Lactobacillus plantarum Probio 88 according to the present invention is used as a supplement for treatment of SARS-CoV-2 by mixing it with grain flour used as raw material in feed, or by mixing carriers or additives to make tablets, capsules, etc. It can be used as a probiotic, or by mixing a certain amount with raw materials used in cosmetics, it can be used in various fields such as pharmaceuticals, foods, feeds, and cosmetics according to conventional methods in the art.

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주와 이를 포함하는 추출물 및 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 균주, 추출물 및 조성물은 SARS-CoV-2 감염 및 복제를 억제하고, 염증 및 활성산소(ROS)의 세포내 축적량을 감소시키며, 세포외신호조절키나아제(ERK) 활성을 감소시키고, 항바이러스 활성을 향상시키며, 코로나바이러스 치료제 또는 보조치료제로 유용하게 사용될 수 있다는 발명의 효과를 가진다.

Description

신규한 락토바실러스 플란타럼 PROBIO 88, 이의 추출물 및 조성물
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타럼 Probio 88, 이의 추출물 및 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SARS-CoV-2 바이러스의 복제 및 활성산소(ROS)의 생성을 억제하고, 코로나바이러스의 치료제로 사용될 수 있는 신규한 락토바실러스 플란타럼 Probio 88, 이의 추출물 및 조성물에 관한 것이다.
코로나바이러스들(CoVs)은 과거 20년간 2회의 대규모 팬데믹(Pandemics) 즉, 사스(SARS: Severe Acute Respiratory Syndrome) 및 메르스(MERS:Middle East Respiratory Syndrome)를 유발하여 왔다. 2019년에 새롭게 등장한 고병원성 인간 코로나바이러스인 SARS-CoV-2(Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2)는 대규모 질병인 코비드19(COVID-19)를 유발하여 결국 WHO(World Health Organization)는 팬데믹 선언을 하기에 이르렀다. 감염자들의 약 절반(40-45%)은 무증상이고, 전염성은 보통 증상 초기 이전에 최고점에 달하기 때문에 질병 확산을 억제하는데 어려움을 초래한다. 코비드19는 면역계에 과민성반응을 유발할 수 있기 때문에 심각한 폐렴을 초래할 수 있다. 이러한 증상은 면역계가 과도하게 반응하는 사이토카인 폭풍(Cytokine storm)으로 정의하고, 이는 심각한 호흡곤란과 이어지는 다기관들(Multiple organs)의 기능폐쇄를 유발한다.
코비드19의 심각성 및 진행상황에서의 면역 규제의 중요성을 고려할 때, 프로바이오틱스의 개입은 SARS-CoV-2 감염시 자체 면역조절능력에 기인하는 잠재적 치료제로서 고려되어왔다. "프로바이오틱스는 적절한 양을 투여할 때 투여대상자에게 건강상 이점을 제공하는 살아있는 미생물이다."라고 규정할 때, 바이오틱스는 주로 젖산 박테리아로 이루어진 건강기능식품으로, 음식으로 사용된 긴 역사를 가지기 때문에 면역계를 활성화시키고, 감염 저항성을 향상시킨다. 심각한 패혈증을 가지는 100명의 어린이들이 포함된 무작위 추출, 이중맹검법 및 위약조절 실험에서 몇일동안 프로바이오틱스를 투여하였을 때, 면역조절 활성을 제공하는 프로바이오틱스의 기능은 염증촉진(IL-6, IL-12p70, IL-17 및 TNF-α)을 상당히 감소시키고 항염증(IL-10 및 TGF-β1) 사이토카인을 증가시키는 결과를 보여주었다. 이러한 사실은 만성적인 낮은 수준의 염증을 가지는 중년 및 노년 성인들에게 단백질 투여가 IL-6 및 C 반응성 단백질 수치를 감소시켰다는 것을 보여주는 최근 메타분석(Meta-analysis)에 의해 더욱 확증된다. 프로바이오틱스는 SARS-CoV-2에 의해 유발된 과잉반응성 감염 상태를 선천적 및 후천적 면역계의 조절을 통해 잠재적으로 균형을 잡는 것에 의해서 폐 기능의 악화를 방지할 수 있다.
바이러스성 질환에서 프로바이오틱스를 사용하는 마이크로바이옴(Microbiome) 조절의 이점은 많은 연구 즉, 락토바실러스(Lactobacilli) 및 비피더스균(Bifidobateria)의 일부 종들이 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 리노바이러스(Rhinovirus), 호흡기세포융합바이러스(Respriratory syncytial virus), 아데노바이러스(Adenovirus) 및 폐렴바이러스(Pneumovirus)에 방어적 기능을 가진다는 사실로부터 증명되어 왔다. 안티바이러스제로서의 프로바이오틱의 사용은 수십년동안 수경재배, 가금 및 가축 산업에서는 일상적인 것이다. 본 발명자의 이전 연구에서, 락토바실러스 플란타럼 프로바이오38(Lacrobacillus plantarum Probio-38) 및 엘 살리바리우스 프로바이오37(L. salivarius Probio-37)은 TGEV(Transmissible GastroEnteritis coronaVirus)에 대하여 항바이러스 활성을 가진다는 것이 발견되었다. 70명의 코비드19 양성 환자들을 포함하는 인체 임상실험에서, 젖산 박테리아의 다수 종들로 이루어진 구강 세균요법은 코비드19 환자들의 임상 상태에서 통계학적으로 중요한 효과를 보여주었다. 72시간 내에, 박테리아치료를 받은 거의 모든 환자들은 치료를 받지 아니한 과반수 정도의 환자들과 비교할 때 설사병 및 다른 증상들에 대하여 차도를 보여주었다. 진행하는 호흡부전(Respitory failure)의 예측된 위험은 구강 박테리아치료를 받은 환자들에 있어서 8배 낮은 수치를 보여주었다. 중환자시설(ICU: Intensive Care Unit)로 이송된 환자들 및 사망자들의 유병률은 구강 박테리아치료를 받지 아니한 환자들에서 더 높았다. 호흡기 및 장(enteric) 바이러스들에 대한 항바이러스 치료제로서의 프로바이오틱의 사용은 의학에서의 새로운 개념으로 광범위하게 검토되어왔고, SARS-CoV-2에 대하여 프로바이오틱스의 사용에 새롭게 주목하고 있다. 본 연구는 생체외(in-vitro) 및 인실리코(in-silico) 연구를 이용하여 바이러스 복제 및 면역 조절에서의 프로바이오틱 대사물질의 효율을 평가하는데 주목적을 가진다.
코로나바이러스를 포함한 대부분의 바이러스들은 자손을 생산하기 위한 복제 기계로 숙주 세포를 장악하는 것과 유사한 메커니즘을 사용한다. 이러한 과정은 일반적으로 부착과 진입, 복제물의 전사, 및 복제 전사 복합체의 조합 이후에 게놈 복제와 전사, 구조 단백질의 전사, 및 최종적으로 비리온(Virion) 조합 및 방출을 포함한다. 대응책으로, 숙주 세포도 선천적이고 적응적 면역 반응을 갖추어 바이러스 증식을 제한한다. 궁극적으로 질병 진행의 결과를 결정짓는 것은 숙주와 바이러스간의 경쟁이 된다.
자연적으로, 숙주 세포 방어 메커니즘은 바이러스 진입이 감지되면 식세포의 활성화와 함께 자발적으로 개시된다. 식세포의 활성화는 세포가 활성산소(ROS: Reactive Oxygen Species)를 생성하도록 촉발하고 ROS가 COVID-19의 발병기전에 중요한 역할을 한다는 축적된 증거가 제안되었다. ROS는 해로운 영향에 대해서 잘 알려져 있지만, 정상적인 세포 기능에 필수적인 중요한 매개체의 일부이기도 하다. 바이러스 감염 동안 ROS의 과잉 생산을 조절하는 능력은 질병의 중증도를 악화시킬 수 있다. 상승된 수준의 ROS는 또한 종양 괴사 인자(TNF) 및 인터루킨-1 사이토카인과 같은 산화촉진 사이토카인의 발현을 상향조절하는 것으로 알려져 있고, 이는 궁극적으로 ROS 생성을 더욱 증가시킬 것이다. 이러한 반복되는 주기는 결국 조직 손상을 일으키고, 생명을 위협할 수 있는 사이토카인 폭풍을 유발한다. 과도한 ROS는 또한 인플루엔자-엔자 바이러스 감염과 같은 다른 호흡기 바이러스 감염에서 폐 손상의 주요 원인이다. 따라서, ROS 수준을 조절하는 것이 바이러스 감염에 대한 병리학적 숙주 반응을 유도하는 중요한 과정 중 하나라는 점은 주목할만한 가치가 있다.
또한, 세포 내에서 바이러스 복제를 억제한 후 염증 요인을 제거하면 COVID-19 환자에게 가장 치명적인 요인인 사이토카인 폭풍도 예방할 수 있다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 프로바이오틱스가 면역 조절, 항박테리아 및 항바이러스의 특성을 발휘한다는 것은 오랫동안 알려져 왔으므로, 이러한 살아있는 유익한 박테리아가 SARS-CoV-2 감염에 대한 잠재적 보조 요법 또는 예방법으로서 지지되어 왔다는 것은 놀라운 일이 아니다. 특히 한국과 같은 국가에서 상대적으로 낮은 COVID-19 사망률과 병행하여 김치와 같은 발효 배추 제품이 COVID-19 중증도를 완화하는 데 도움이 되는 중요한 식습관으로 주목을 받아왔다. 호흡기 및 위장 점막 조직에서 항바이러스 면역 반응을 조절하는 것 이외에도, 김치에서 발견되는 풍부한 종들 중 하나인 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)은 여러 호흡기 병원체들에 대한 항바이러스 화합물로 박테리오신(plantaricin)을 생산하는 것으로 보고되었다. 다른 인실리코(in-silico) 연구에 따르면, Plantaricin W, D 및 JLA-9는 SARS-CoV-2의 RNA 의존성 RNA 중합효소의 촉매 부위에 대해 높은 억제력을 갖는 것으로 밝혀졌고, 이는 바이러스의 복제 주기에서의 주요한 역할을 수행한다.
바이러스 감염 중 증가된 ROS 수준은 또한 인간 코로나바이러스의 발병에 중요한 ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase) 경로를 활성화하는 것으로 보고되었다. ROS 이외에도 바이러스 또는 그 구성 요소도 키나아제를 활성화할 수 있다. Mizutani et al.은 SARS-CoV에 감염된 Vero E6 세포가 강화된 ERK 인산화를 보여주었다고 발표한 바 있다. 이와 대조적으로 Chen의 또 다른 연구는 SARS-CoV S 단백질 또는 SARS-CoV 바이러스 유사 입자가 A549 세포에서 ERK를 인산화할 수도 있다고 발표한 바 있다. 유사하게도, MERS 및 HCoV-299E도 감염된 동안 ERK 신호 전달 경로를 조절하였다. ERK 경로는 3개의 신호 캐스케이드(Raf/MEK/ERK)로 이루어지고, 세포 성장에 중요하다. 경로 활성화는 매우 역동적이므로, 바이러스 전사, 입자 생성, 복제를 비롯한 다양한 목적을 위해 많은 바이러스들(단순포진 1형 바이러스(herpes simplex type-1 virus, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스(Ebola virus), 플라비바이러스(flavivirus) 및 기타 바이러스들)에 의한 이용 대상이 된다.
바이러스 지원 역할을 수행하는 것 이외에, ERK 경로는 감염 중에 염증을 유지하는 데에도 중요하다. 염증 반응의 개시 및 조절은 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)에 의해 제어되는 주요 이벤트 중 하나이다. 상기 ERK 경로는 p38 및 JNK와 함께 MAPK 계열의 세 개의 구성들 중 하나이다. MAPK는 바이러스 침입 시 활성화되어 염증성 사이토카인 및 케모카인을 생성한다. 고병원성 바이러스와 유사한 SARS-CoV-2의 경우, 병원체 공격 시 발생하는 조절 장애 염증 반응을 사이토카인 폭풍(cytokine storm)이라고 하고, p38 및 ERK 경로에 의해 강력하게 제어된다.
감염 동안의 염증은 병원체 확산을 억제하는 보호 메커니즘을 나타내고, 제1 방어선은 일반적으로 1형 인터페론(IFN-α 및 IFN-β)과 다기능 사이토카인 IL-6을 포함한다. 많은 연구들은 SARS-COV-2가 IFN 반응을 약화시킬 수 있음을 보여주었지만, 최근 발견에 따르면 IFN 생산이 지연되기는 했지만 실제로 상당한 수준에서 자극되고 있는 것으로 나타났다. 상기 그룹들은 또한 SARS-CoV-2에 감염된 세포들에서 IFN 유도 전에 많은 양의 바이러스 전사체가 관찰되었다고 보고했다. 따라서, IFN 반응을 시작하려면 높은 바이러스 부하가 요구되는 것으로 가정된다. 이러한 발견은 또한 증상이 시작된 직후 COVID-19 사례에서 높은 바이러스 부하가 감지되었다는 관찰과 일치한다. 본 발명자들은 이러한 유전자들의 낮은 발현이 본 발명에 따른 P88-CFS로 처리된 후 세포에서 더 적은 양의 바이러스 증식에 기인할 수 있다는 가설로부터 출발하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 기술적 과제는 SARS-CoV-2 감염 및 복제를 억제하고, 염증 및 활성산소(ROS)의 세포내 축적량을 감소시키며, 세포외신호조절키나아제(ERK) 활성을 감소시키고, 항바이러스 활성을 향상시키는 신규한 락토바실러스 플란타럼 Probio 88, 이의 추출물 및 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주(KCTC14482BP)에 관한 것이다.
여기서, 상기 균주는 SARS-CoV-2의 감염 및 복제를 억제하기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 균주는 염증을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 균주는 활성산소(ROS)의 세포내 축적량을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 균주는 세포외신호조절키나아제(ERK) 활성을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 균주는 항바이러스 활성을 향상시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 추출물은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주(KCTC14482BP)를 포함하는 락토바실러스 플란타럼 Probio 88의 무세포상청액(P88-CFS) 추출물이다.
여기서, 상기 추출물은 플란타리신E(PlnE) 및 플란타리신F(PlnF)를 포함하고, SARS-CoV-2의 감염 및 복제를 억제하기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 염증을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 활성산소(ROS)의 세포내 축적량을 감소시키기 위해 사용 하는 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 세포외신호조절키나아제(ERK) 활성을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 항바이러스 활성을 향상시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 추출물은 항바이러스 활성을 향상시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 조성물은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주(KCTC14482BP)를 포함하는 코로나바이러스 치료용인 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 조성물은, 사료, 사료첨가제, 식품, 기능성 식품, 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 의약외품으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주(KCTC14482BP)가 생산하는 플란타리신E(PlnE); 및 플란타리신F(PlnF)는 SARS-CoV-2의 감염 및 복제를 억제하기 위해 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 SARS-CoV-2 감염 및 복제를 억제하고, 염증 및 활성산소(ROS)의 세포내 축적량을 감소시키며, 세포외신호조절키나아제(ERK) 활성을 감소시키고, 항바이러스 활성을 향상시키며, 코로나바이러스 치료제 또는 보조치료제로 유용하게 사용될 수 있는 신규한 락토바실러스 플란타럼 Probio 88, 이의 추출물 및 조성물을 제공하는 발명의 효과를 가진다.
도 1은 SARS-CoV-2 감염에 대한 본 발명의 P88-CFS 추출물의 억제도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 서로 다른 농도의 본 발명의 P88-CFS 추출물에 대한 (a) HCE 세포, (b) HEK 세포 및 (c) HeLa 세포의 생존율을 나타낸 MTT 분석결과 그래프이다.
도 3 (a)는 디클로로플루오르세인(H2DCFDA) 염색에 의한 활성산소(ROS)의 염색 사진이고, (b)는 이미지 J에 의해 측정된 정량적 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 SARS-CoV-2 감염 후 HEK293 세포에서 p-ERK 단백질에 대한 P88-CFS의 영향력을 나타낸 면역형광 공초점 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 P88-CFS의 처리 유무에 따른 감염 후 HEK293 세포에서 염증성 마커의 유전자 발현을 나타낸 그래프로, (a) IFN-α, (b) IFN-β 및 (c) IL-6의 발현을 qPCR로 측정하고 GAPDH로 정규화하였다.
도 6은 Sars-CoV-2 헬리카제 nsp13을 2차 구조로 표현한 구조도이다.
도 7은 PlnE 및 PlnF의 분자 도킹을 나타낸 그래픽으로, (a)는 분자도킹연구에 사용된 SARS-CoV-2 헬리카제 nsp 13(PDB ID: 6ZSL)의 3D 구조이고, (b)는 플란타리신(PlnE)의 구축 모델이며, (c)는 플란타리신 F(PlnF)에 대해 구축 모델이고 (d)는 PlnE가 ss-RNA 및 ATP 결합 부위의 공동(cavity)에 끼워진 모습을 나타낸 것이며, (e)는 PlnF가 ss-RNA 및 ATP 결합 부위의 공동에 끼워져 있는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 (a) PlnE 및 (b) PlnF의 결합 구조를 보여주는 도면으로, 수소 결합 컷오프(cut-off)는 4.0 Å으로 설정하였다.
도 9는 PlnE의 Ligplot+ 상호작용 다이어그램을 나타낸 도면이다.
도 10은 PlnF의 Ligplot+ 상호작용 다이어그램을 나타낸 도면이다.
본 발명의 상술한 목적, 특징 및 장점들은 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명함으로써 더욱 명백해질 것이다. 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로 기술되는 것은 아니고, 본 발명의 범위는 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.
이하, 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
실시예
1. 박테리아 균주, 배지 및 성장 조건
본 발명에 사용된 박테리아는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88로, 대한민국 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁번호 KCTC 14482BP로 2021. 03. 04.자에 기탁되었다. 균주는 김치로부터 사전에 추출하였다. 상기 균주는 소이펩톤(Soy peptone) 5g/L, 아세트산나트륨(Sodium acetate) 5g/L, 효모추출물 20g/L, d(+) 글루코스(d(+)-glucose) 20g/L, 황산암모늄 2g/L, 인산이포타슘(Dipotassium phosphate) 2g/L, 황산마그네슘 0.1g/L, 황산망간(Manganese sulfate) 0.05g/L 및 트윈80(Tween 80) 1g/L을 포함하는 조정된 MRS(Modified de Man-Rogosa-Sharpe) 배지를 사용하여 37℃에서 18시간 동안 배양되었다. 상기 배양된 균주를 25% 글리세롤(-45℃)에 보관하였고, 실험 분석 전 1% 접종원(Inoculum)을 사용하여 3회 연속으로 활성화시켰다. 여기서, 모든 화학물질들은 달리 언급하지 아니하는 한 Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다.
2. SARS-CoV-2 바이러스
SARS-CoV-2 균주는 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)에 감염된 환자의 구인두 면봉 표본으로부터 분리하여 획득하였다. SARS-CoV-2에 대한 모든 작업은 생물안전 3단계(BSL-3)의 제한된 조건하에서 수행되었다. 바이러스 스톡(Stocks)은 HEK293 세포 내 바이러스들을 90% 컨플루언시(confluency)로 48시간 동안 배양하여 생성하였다. 그 후, 생성된 배양물들을 정제하여 -80℃에서 보관하였다. 조작샘플들은 미감염된 세포들을 사용하여 동일한 방식으로 준비하였다. 바이러스 스톡은 적정(Titration)하여 수량화하였다.
3. 락토바실러스 플란타럼 Probio 88의 CFS(P88-CFS) 추출물 제조
무세포상청액(CFS: Cell-Free Supernatant)를 생성하기 위해, 락토바실러스 플란타럼 Priobio 88을 조정된 MRS 브로스(MRS broth) 내에서 37℃로 24시간 동안 배양한 후, 3,500rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 발생한 상청액을 획득하여 pH 7.0dmfh 중화하였고, 주사기 필터(Syringe filter)(pore size 0.22㎛)를 사용하여 필터 살균하였다. 이후에, 상기 상청액을 동결건조하고, 원래 부피의 10%에 물을 공급하여 복원하였다. 발생한 추출물을 P88-CFS로 제조하고, 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다.
4. SARS-CoV-2 복제의 생체외(In vitro) 억제
먼저 HEK293 세포들을 96웰 플레이트(TPP, Trasadingen, Switzerland)에 웰당 4 x 104 세포의 밀도로 시딩(seeding)하였다. 24시간 후, 상기 세포들을 바이러스 감염을 위해 100㎕ 배양 배지(페니실린(100U/mL)와 스트렙토마이신(100㎍/mL), P88-CFS(50, 100, 150, 200 또는 250 mg/ml) 및 SARS-CoV-2 바이러스(0.1 감염 다중도)로 배양하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 상기 세포들을 PBS로 3회 세척하고, 바이러스가 존재하지 않는 동일한 배양 배지 100㎕ 내에서 유지하였다. 상기 P88-CFS를 각각 DMSO 및 PBS(Phosphate-Buffered Saline)로 대체한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 양성 및 음성 대조군 샘플을 각각 접종하였다. 바이러스 수율은 정량적 실시간 PCR 방법을 사용하여 측정하였다.
5. 세포 생존력 분석
인간 각막 상피(HCE), HEK293 및 Hela 세포주를 10% 소 태아 혈청(FBS)(HyClone Laboratories, USA), 페니실린(100 U /mL) 및 스트렙토마이신(100μg/mL)으로 보충된 완전 배지(Complete medium) 내에서 37℃의 5% CO2의 습한 분위기의 환경으로 배양하였다. MTT 분석 전에 상기 세포들을 웰당 4 × 104 세포 밀도로 96웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 후, 세포를 37℃ 및 5% CO2의 환경에서 48시간 동안 다양한 농도의 P88-CFS(50, 100, 150, 200 또는 250mg/ml)를 포함하는 DMEM으로 처리하였다. 조정을 위해, DMEM 내 P88-CFS를 대체하기 위해 PBS를 사용하였고, 배양 종료시 상기 세포들을 PBS로 세척하고, 5 mg/ml 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드(MTT) 용액의 50㎕으로 처리한 후 37℃에서 45분간 배양하였다. 상기 세포 상층액을 버리고, 포마잔 크리스탈(formazan crystals)을 이소프로판올에 용해시켰다. 그 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 분석은 3회씩 수행하였다. 생존률은 대조군 세포와 비교하여 P88-CFS 처리된 세포의 상대적인 흡광도로 정의하였다.
6. 세포 내 활성산소(ROS)의 결정
세포들은 완전 배지내 6웰 플레이트에서 배양되었고, SARS-CoV-2로 처리되었다. SARS-CoV-2는 COVID-19 환자의 구인두 면봉 표본으로부터 분리하였다. 바이러스 스톡은 48시간 동안 90% 컨플루언시에서 HEK293 세포를 감염시켜 생성되었다. 그 후, 배양액을 분취하여 -80℃에서 보관하였다. 대조군 샘플들은 미감염된 세포들을 사용하여 동일한 방식으로 제조하였다. 바이러스 스톡은 적정에 의해 정량화되었다. 상기 세포들이 60-70% 컨플루언스(Confluence)에 도달했을 때, ROS의 수준은 P88-CFS의 다른 농도로 측정되었다. 배지를 제거하고, 세포들을 DMEM만으로 2회 세척하였다. 그 후, 세포들을 37℃에서 30분간 DMEM내 10 μM 2'-7'-디클로로디하이드로플루오르세인 디아세테이트(DCFH-DA, Sigma Aldrich)로 배양하였다. 그 후, 세포들을 PBS로 2회 세척하고, DCFDA 처리된 세포들의 형광 강도를 형광 현미경으로 측정하였다.
7. 헬라세포(Hela cells)의 면역세포화학
HEK293 세포들을 완전 배양 배지에서 배양하고 SARS-CoV-2에 감염시켰다. 그 후, 상기 세포들을 PBS로 3회 세척하고, 4% 포름알데히드에서 10분 동안 고정시켰다. 그 후, 0.2% Triton X를 사용하여 세포들을 투과화시켰다. 그 후, 세포들을 신호 증강제로 처리한 후 PBS에 희석된 5% 정상 염소 혈청(normal goat serum)을 사용하여 차단하였다. 세포들은 12시간 동안 pERK(1:100)(Cell Signaling)의 1차 항체와 함께 4℃에서 배양되었다. 그 후, 세포들을 PBS로 3회 세척하고 이차 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포들을 PBS로 세척하고, 핵을 DAPI(Sigma Aldrich, USA)로 대조염색하였다. 최종적으로 PBS로 세포들을 세척하고 디지털 카메라(Nikon, Japan)가 장착된 형광현미경을 사용하여 사진을 촬영하였다.
8. 정량적 실시간 PCR
제조사의 지시에 따라 트리아졸 시약(Invitrogen)을 사용하여 HEK293 세포에서 전체 RNA를 추출하였다. 상기 RNA 농도는 나노드랍(NanoDrop)을 사용하여 측정하였고, RNA는 -80℃에서 디에틸 파이로카보네이트(diethyl pyrocarbonate) 처리된 물에 보관하였다. 또한, 총 부피가 25㎕인 반응 혼합물에 RNA 1㎍을 랜덤 프라이머(Promega)로 프라이밍한 후, 72℃에서 5분간, 그리고 37℃에서 60분간 역전사시켰다. 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 2㎕의 cDNA, 10pmol의 각 유전자 특이적 프라이머 및 Power SYBR® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. rt-PCR에 대한 프라이머 서열을 설명하는 자세한 정보는 하기 표 1과 같다.
Target Primer Directions Sequences (5 -> 3)
GAPDH Forward
Reverse		 CAC CAC CAA CTG CTT AGC AC
CCC TGT TGC TGT AGC CAA AT
IFN α Forward
Reverse		 GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG
AAA GAG GTT GAA GAT CTG CTG GAT
IFN β ForwardReverse CTC CAC TAC AGC TCT TTC CAT
GTC AAA GTT CAT CCT GTC CTT
IL-6 Forward
Reverse		 AAC TCC TTC TCC AGA AGC GCC
GTG GGG CGG CTA CAT CTT T
9. 인실리코(In-silico) 분자 도킹을 이용한 락토바실러스 플란타럼 프로바이오88의 항바이러스 활성
락토바실러스 플란타럼 프로바이오88(L. planta-rum Probio-88)의 플란타리신 E(Plantaricin E)와 플란타리신 F(Plantaricin F) 모두에 대한 3D 구조를 형성하기 위해 1차 서열을 BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 적용하여 서열 동일성을 검색하고, 상동성 모델링을 위한 적절한 템플릿(Template)을 식별하였다. 표적 서열 플란타리신 E 및 F 와의 높은 비율의 서열 동일성으로 인해, 비교 모델링 접근 방식을 채택하여 플란타리신 E(PlnE) 및 F(PlnF)(PDB ID:2JUI 및 2RLW)를 템플릿으로 사용하였다. 자동화된 단백질 구조 예측 서버인 SWISS-MODEL을 사용하였고, QMEAN 점수가 가장 높은 모델을 선택하였다. 형성된 모델의 구조적 평가는 라마찬드란 플롯(Ramachandran pliot) 분석을 사용하여 수행하였다.
자동화된 단백질-단백질 도킹 서버(https://wenmr.science.uu.nl/)인 HADDOCK2.4를 사용하여 락토바실러스 플란타럼 프로바이오88로부터 SARS-CoV-2 헬리카제(Helicase)까지의 플란타리신 E 및 F의 단백질-단백질 상호작용을 조사했다. SARS-CoV-2(PDB ID: 6ZSL)로부터의 헬리카제 nsp13이 선택되었다. ATP 및 ss-RNA 결합 부위에 대한 상호작용 잔기, 즉 Glu537, Arg567, Arg443, His290, Arg442, Asn265, Gly439, Lys288, Ser485, Lys146, Lys139, Tyr180, His230, Tyr198, Arg212, Pro335, Arg339 및 Asn516이 결정되었고, 도킹을 위한 인터페이스 잔기들로 설정하였다. HADDOCK 점수가 가장 낮은 클러스터를 선택하고, PRODIGY를 사용하여 결합에 대해 추가 분석하였다. 상기 결합 작용을 시각화하기 위해 Visual Molecular Dynamics(VMD)를 사용하였다.
실험 결과
P88-CFS의 억제 효과는 HEK293 세포들에서 초기에 평가되었다. 여기서, 상기 세포들을 먼저 SARS-COV-2 바이러스에 감염시킨 후 50 내지 250 mg/㎖ 범위의 농도에서 P88-CFS로 처리하였다. 도 1은 SARS-CoV-2 감염에 대한 본 발명의 P88-CFS 추출물의 억제도를 나타낸 그래프이다. 도 1에 도시된 바와 같이, P88-CFS의 처리량이 증가함에 따라 SARS-COV-2 바이러스 감염에 대한 억제도가 증가하는 것을 보여주었다. 여기서, 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시하였다. qPCR에 의해 결정된 바이러스 RNA 카피에 기초하여, 배양 상청액에서의 바이러스 양은 미처리 SARS-COV-2 감염 대조군(0 mg/ml P88-CFS)과 비교하여 감소되었다. 바이러스의 성장은 P88-CFS의 농도가 증가함에 따라 48%에서 97%로 상당히 억제되었다.
도 2는 서로 다른 농도의 본 발명의 P88-CFS 추출물에 대한 (a) HCE 세포, (b) HEK 세포 및 (c) HeLa 세포의 생존율을 나타낸 MTT 분석결과 그래프이다. 여기서, 각각의 데이터는 3개의 독립적인 실험에 대한 평균±SD로 표시하였고, 대조군과 비교하여 *** P < 0.001; ** P < 0.01; *P<0.05이다, 도 2에 도시된 바와 같이, 세포 독성에 대한 MTT 분석을 사용하여 HCE, HEK 및 HeLa 세포주에 대해 테스트한 P88-CFS는 대사산물이 인간 세포들에 의해 잘 견디는 것으로 나타났다. 세포독성 정도에 대한 가이드라인(ISO 10993-5)에 따르면, 세포 생존률 80% 초과는 세포독성이 없는 것으로 간주하고, 80~60%는 약한 것으로 간주하며, 40% 미만은 강한 세포독성으로 간주한다. (a) HCE 세포는 본 발명에 따른 P88-CFS 추출물에 대해 가장 강력한 내성을 보여주었고, (b) HeLa 및 (b) HEK 세포도 P88-CFS 추출물에 대해 강한 내성을 보여주었다. 200mg/㎖의 P88-CFS 추출물로 처리시 HCE 및 HeLa 세포에서 80% 초과의 세포 생존율이 유지되었다. 그러나, 100 mg/㎖ 초과의 P88-CFS를 포함하는 배양 배지가 80% 미만의 세포 생존율의 결과를 보여주었기 때문에 HEK 세포는 P88-CFS 추출물에 대해 더 높은 민감도를 나타내었다. 상기 결과들은 P88-CFS가 100mg/㎖로 투여될 경우 심각한 세포독성 효과 없이 고전염성의 인간 코로나바이러스의 복제를 억제할 수 있다는 것을 증명한다. 따라서, 모든 후속 실험에 동일한 용량이 사용되었다.
도 3 (a)는 디클로로플루오르세인(H2DCFDA) 염색에 의한 활성산소(ROS)의 염색 사진이고, (b)는 이미지 J에 의해 측정된 정량적 형광 강도를 나타낸 그래프이다. 도 3(a)의 사진은 처리 세포들을 30분 동안 H2DCFDA 염색으로 염색하고 PBS로 세척한 후 공초점 현미경(스케일: 500 μm)으로 형광 이미지를 획득하였다. 본 발명자는 활성산소(ROS)의 세포 내 축적에 대한 P88-CFS의 영향을 추가적으로 조사하였다. 참고로, ROS는 ROS의 과다축적이 질병 중증도를 악화시킬 수 있는 COVID-19의 발병기전에 중요한 역할을 한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 세포들이 SARS-COV-2에 감염되면 ROS 수준이 약 2.4배 크게 증가하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 감염된 세포를 50, 100 및 150 mg/㎖ P88-CFS와 함께 배양했을 때 ROS 수준은 각각 약 1.7배, 1.2배 및 0.9배로 상당히 감소하였다.
도 4는 SARS-CoV-2 감염 후 HEK293 세포에서 p-ERK 단백질에 대한 P88-CFS의 영향력을 나타낸 면역형광 공초점 현미경 사진이다. 여기서, 면역형광에 대한 실험은 DMSO(0.1%), viral titer, Viral titer+50㎎/㎖, Viral titer+100㎎/㎖ 및 Viral titer+150㎎/㎖에 대하여 각각 pERK, DAPI 및 Merge의 이미지를 표현하였다. 구체적으로, SARS-CoV-2에 감염된 HEK293 세포에서 p-ERK 발현을 50, 100 및 150 mg/㎖의 P88-CFS로 처리하였다. DMSO(0.1%)는 모든 처리 그룹에서 P88-CFS에 대한 용매로 사용되었다. 세포들은 감염 후 12시간 동안 고정되었고, 공초점 이미지를 수집하였다. 세포핵은 점으로 표현된다(스케일 바: 5 ㎛). MAPK/ERK 경로는 발병기전에 많은 바이러스에 의해 사용되는 중요한 통로이다. 인산화된 ERK(p-ERK)는 종종 바이러스 감염의 존재와 관련이 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 어떠한 처리도 하지 않은 바이러스에 감염된 HEK293 세포에서 p-ERK의 발현은 세포핵과 세포질 모두에서 광범위하게 관찰되는 반면에, 0.1% DMSO를 처리한 모의세포(mock cell)에서는 거의 검출되지 아니하였다. 50 mg/㎖의 P88-CFS가 p-ERK의 발현을 차단하지는 않았지만, 100 및 150 mg/㎖의 P88-CFS로 처리하면 SARS-CoV-2 감염 세포에서 ERK의 인산화가 급격히 감소하였다.
도 5는 본 발명에 따른 P88-CFS의 처리 유무에 따른 감염 후 HEK 293 세포에서 염증성 마커의 유전자 발현을 나타낸 그래프로, (a) IFN-α, (b) IFN-β 및 (c) IL-6의 발현을 qPCR로 측정하고 GAPDH로 정규화하였다. 모든 실험은 3회 반복하였고 통계적 분석은 t-test로 수행하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시하였다(바이러스 감염 세포와 비교하여 *P<0.05 ; 대조군과 비교하여 #P<0.05). 최종적으로 바이러스 감염과 염증의 상관관계를 평가하기 위해, IFN-α, IFN-β 및 IL-6은 전염증성 사이토카인들(proinflammatory cytokines) 중 하나로 본 연구에 사용되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 상기 SARS-CoV-2 감염 세포에서 IFN-α, IFN-β 및 IL-6의 mRNA 발현이 대조군(control)에 비해 상당히 증가하였다. SARS-CoV-2에 동시에 감염되고, 10mg/㎖의 P88-CFS로 처리된 세포들에서는 이러한 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현 수준이 엄청나게 감소하였다. 감염된 세포(Infected)와 비교하여, P88-CFS 처리된 세포(Infected +)는 IFN-α, IFN-β 및 IL-6에서 각각 2.2배, 1.5배 및 1.7배의 유의미한 감소를 보여주었다. 이러한 발견들은 본 발명에 따른 P88-CFS 추출물이 항바이러스 활성을 가질 뿐만 아니라 세포로의 바이러스 침투에 의해 유발되는 염증 반응을 조절한다는 것을 시사한다.
도 6은 Sars-CoV-2 헬리카제 nsp13을 2차 구조로 표현한 구조도이다. 여기서, ss-RNA와 ATP 결합에 대한 상호작용 잔기는 각각 상부 클러스터(Ser485, Lys146, Lys139, Tyr180, His230, Tyr198, Arg212, Pro335, Arg339, Asn516) 및 하부 클러스터(Glu537, Arg567, Arg443, His290, Arg442, Asn265, Gly439, Lys288)이다. 인실리코(in-silico) 분자 도킹 접근법을 사용하여 본 발명의 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) Probio88의 항바이러스 활성을 추가로 평가하였다. 전체 게놈 서열에 기초하여, 균주는 각각 33 및 34개 아미노산 잔기를 갖는 플란타리신 PlnE 및 PlnF를 생산하는 것으로 밝혀졌다. PlnE 및 PlnF의 구축된 모델은 단일 나선 사슬로 구성되고, 그 골격 구조는 상기 골격의 psi(Ψ) 및 phi(Φ) 각도를 측정하여 라마찬드란 플롯(Ramachandran pliot)을 사용하여 평가하였다. 도 6 및 하기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 라마찬드란 플롯 통계 분석은 PlnE로부터의 잔기의 84%와 PlnF 구축 모델의 92.9%가 가장 바람직한 영역에 존재한다는 것을 나타내었다. 하기 표 2는 플란타리신 E 및 F 구축 모델 및 템플릿에 대한 라마찬드란 플롯 분석의 비교이다.
Region of Plot
Plantaricin E Plantaricin F
Built model Template
(PDB ID: 2JUI) 		Built model Template
(PDB ID: 2RLW)
No. of residues % No. of residues % No. of residues % No. of residues %
Residue in most favoured region 21 84.0 21 84.0 26 92.9 25 89.3
Residue in additional allowed region 4 16.0 4 16.0 1 3.6 2 7.1
Residue in generously allowed regions 0 0.0 0 0.0 1 3.6 1 3.6
Residue in disallowed region 0 0.0 0 0.0 0 0.0 0 0.0
Total 25 100 25 100 28 100 34 100
상기 결과는 상관관계를 잘 반영하였고, NMR 방법, 즉 2JUI 및 2RLW를 사용하여 설명되는 템플릿 구조와 비교하여 품질이 우수하였다. Sars-CoV-2 헬리카제 nsp13에 대한 플란타리신 E 및 F의 결합 친화도는 단백질-단백질 도킹 접근법을 사용하여 평가되었다. 헬리카제의 주요 기능은 ATP를 에너지원으로 사용하는 self-annealed ss-RNA의 분리 과정이 수반되었다. 따라서, 활성 잔기로 작용하는 ss-RNA의 주변 잔기와 ATP 결합 부위를 HADDOCK 단백질-단백질 도킹 결합 부위 파라미터로 적용하였다.
도 7은 PlnE 및 PlnF의 분자 도킹을 나타낸 그래픽으로, (a)는 분자도킹연구에 사용된 SARS-CoV-2 헬리카제 nsp 13(PDB ID: 6ZSL)의 3D 구조이고, (b)는 플란타리신(PlnE)의 구축 모델이며, (c)는 플란타리신 F(PlnF)에 대해 구축 모델이고 (d)는 PlnE가 ss-RNA 및 ATP 결합 부위의 공동(cavity)에 끼워진 모습을 나타낸 것이며, (e)는 PlnF가 ss-RNA 및 ATP 결합 부위의 공동에 끼워져 있는 것을 나타낸 것이다. 도 7 및 하기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, PlnE 및 PlnF의 길게 확장된 나선 구조로 인해 SARS-CoV-2 헬리카제 nsp13에 대한 PlnE 및 F의 결합은 각각 -17.4 kcal/mol 및 -15.6 kcal/mol의 결합 친화도로 ss-RNA 및 ATP 결합 부위에 걸쳐 분포하였다. 하기 표 3은 PlanE 및 PlanE에 관련된 상호 작용 수를 나타내는 분자 도킹 결과 요약이다.
Analysis Types of Plantaricin
E F
Binding Interaction
G, (kcal/mol) -17.4 -15.6
Kd (M) at 37℃ 5.8E-13 1.0E-11
Number of interaction
Hydrogen Bonding 15 12
Hydrophobics 16 23
도킹 결과, PlnE 및 PlnF의 N-말단은 ATP 결합 부위에 결합된 반면, PlnE 및 PlnF의 C-말단은 헬리카제 nsp 13의 ss-RNA 결합 부위에 부착된 것으로 나타났다.
도 8은 (a) PlnE 및 (b) PlnF의 결합 구조를 보여주는 도면으로, 수소 결합 컷오프(cut-off)는 4.0 Å으로 설정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, Val35, Gly32 및 Phe31과 같은 PlnE는 SARS-CoV-2 nsp 13의 ATP 결합 부위에서 Gln537, Arg443 및 Lys 288와 함께 여러 수소 결합을 형성하였다. Gln537과 Arg443은 최근 Newman과 공동연구자들에 의해 ATP 가수분해의 주요 부위로 보고된바 있다. 또한, PlnE의 N-말단에 위치한 Gly43은 ss-RNA 인터페이스 잔기 중 하나, 즉 SARS-CoV-2 nsp 13의 Arg212와 수소 결합 상호작용을 형성하였다. 이와 유사하게, PlnF의 경우, 수소 결합 형성이 His290이 있는 Asn30과 SARS-CoV-2 nsp13의 Lys288, Arg442가 있는 Ser24 및 SARS-CoV-2 nsp13의 Asn265 사이에 수소 결합 형성이 존재하였다. SARS-CoV-2 nsp13의 ss-RNA 결합 부위는 Arg212 및 Asn516과 2개의 수소 결합을 형성함으로써 PlnF의 N-말단에서 Gly48 및 Phe49에 의해 점유되었다.
도 9는 PlnE의 Ligplot+ 상호작용 다이어그램을 나타낸 도면이고, 도 10은 PlnF의 Ligplot+ 상호작용 다이어그램을 나타낸 도면이다. 도 9 및 도 10에 도시된 바와 같이, SARS-CoV-2 nsp13 헬리카제와의 PlnE 및 F 상호작용 모두에서 단백질-단백질 상호작용에 주요하게 기여하는 것으로 알려진 소수성 상호작용이 지배적이라는 것을 확인할 수 있었다.
상기 내용으로부터 SARS-CoV-2 감염 세포들을 본 발명에 따른 P88-CFS로 처리하면 감염 후 대부분의 바이러스들은 근절되고, 그 효과는 P88-CFS 추출물의 농도가 증가할수록 더 좋은 것으로 확인되었다. 바이러스 복제의 감소와 동시에, P88-CFS는 바이러스 침입의 중요한 단계적 발현인 염증 및 ERK 활성을 감소시켰다. IFN-α, IFN-β 및 IL-6의 유전자 발현은 SARS-CoV-2에 감염되었을 때 상당히 증가되었고, 이러한 유전자들의 발현은 P88-CFS의 존재시 더 낮았다. SARS-CoV-2가 HeLa 세포를 감염시 ERK를 활성화시키는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) Probio88은 인실리코(in-silico) 분자 도킹 접근법에서 PlnE와 PlnF를 모두 사용하여 항바이러스 활성을 입증했다. 높은 결합 친화도와 수소 결합의 형성은 헬리카제에 대한 PlnE와 PlnF의 결합이 헬리카제에 대한 ss-RNA의 결합을 방지함으로써 차단제 역할을 할 수 있음을 보여주었다. 이와 관련하여, ATP 결합 부위가 플란타리신의 C-말단에 의해 점유되기 때문에 풀림 과정(unwinding process)을 위해서 헬리카제에 의한 ATP를 이용하는 것은 실패할 수도 있다. 게다가, 프로테인-단백질 상호작용에 주요하게 기여하는 것들 중 하나인 소수성 상호작용은 헬리카제와의 PlnE 및 PlnF 상호작용 모두에서 지배적인 것으로 밝혀졌다. 이것은 헬리카제에 대한 플란타리신의 결합을 직접적으로 유추할 수는 없지만 단백질 결합 안정성을 유지할 가능성을 부여한다. 코로나바이러스의 감염성은 바이러스 부착 및 숙주 세포 진입을 촉진하는 스파이크 단백질에 크게 의존한다. 그러나, 코로나바이러스 종들 사이에는 스파이크 단백질의 구조에 큰 변이성이 존재하고, 유전적 돌연변이로 인한 SARS-CoV-2 자체의 여러 변이체들은 더욱 그러하다. 반대로, 헬리카제 nsp13은 모든 코로나바이러스 종들 중에서 고도로 보존된 비구조적 단백질이다. 이는 이 효소를 표적으로 하는 치료제가 SARS-CoV-2, 그 변이체 및 SARS-CoV 및 MERS-CoV와 같은 밀접하게 관련된 코로나바이러스 종들에 대해 더 많이 적용할 수 있음을 의미한다. 이는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Probio88이 SARS-CoV-2의 변종 균주에 대해 보호 가능하다는 것을 증명한다.
본 발명에 따른 P88-CFS로 입증된 SARS-CoV-2 억제 활성은 프로바이오틱스가 고감염성 병원체의 확산을 억제하기 위해 백신 및 기타 항바이러스제와 함께 통합 치료 접근법으로 사용될 수 있음을 입증하였다. 중요하게도, 프로바이오틱스와 같은 천연 보충제는 다른 많은 유망한 건강상의 이점과 함께 수십 년 동안 안전한 것으로 입증되었다. 프로바이오틱스(Probiotics)는 상용 약물과 같은 뚜렷한 항바이러스 메커니즘을 가지고 있지 않을 수 있다. 그러나 본 연구의 결과는 프로바이오틱스가 COVID-19 감염의 악화를 예방할 수 있는 유망한 후보라는 귀중한 통찰력을 뒷받침한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 본 출원이 그 기술적 사상 또는 필수적 특징을 변경하지 아니하고 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이고 한정적인 것이 아니라는 것을 이해할 것이다. 본 출원의 보호범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미, 범위 및 그 균등개념으로부터 도출될 수 있는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 권리범위에 포함되는 것으로 해석하여야할 것이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 Probio 88은 SARS-CoV-2의 치료보조제로서 사료에 원료에 쓰이는 곡물가루와 혼합하여 사용하거나, 담체 또는 첨가제 등을 혼합하여 정제, 캡슐 등의 의약품, 식품용 생균제로 활용하거나, 화장품에 사용되는 원료에 일정양을 혼합함으로써 의약품, 식품, 사료, 화장품 등 다양한 분야에 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 활용할 수 있다.

Claims (17)

  1. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주(KCTC14482BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 SARS-CoV-2의 감염 및 복제를 억제하기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 염증을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 활성산소(ROS)의 세포내 축적량을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 균주는 세포외신호조절키나아제(ERK) 활성을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 균주는 항바이러스 활성을 향상시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주.
  7. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주(KCTC14482BP)를 포함하는 락토바실러스 플란타럼 Probio 88의 무세포상청액(P88-CFS) 추출물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 플란타리신E(PlnE) 및 플란타리신F(PlnF)를 포함하고, SARS-CoV-2의 감염 및 복제를 억제하기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼 Probio 88의 무세포상청액(P88-CFS) 추출물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 염증을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼 Probio 88의 무세포상청액(P88-CFS) 추출물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 활성산소(ROS)의 세포내 축적량을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼 Probio 88의 무세포상청액(P88-CFS) 추출물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 세포외신호조절키나아제(ERK) 활성을 감소시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼 Probio 88의 무세포상청액(P88-CFS) 추출물.
  12. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 항바이러스 활성을 향상시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼 Probio 88의 무세포상청액(P88-CFS) 추출물.
  13. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 항바이러스 활성을 향상시키기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼 Probio 88의 무세포상청액(P88-CFS) 추출물.
  14. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주(KCTC14482BP)를 포함하는 코로나바이러스 치료용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은, 사료, 사료첨가제, 식품, 기능성 식품, 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 의약외품인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. SARS-CoV-2의 감염 및 복제를 억제하기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주(KCTC14482BP)가 생산하는 플란타리신E(PlnE).
  17. SARS-CoV-2의 감염 및 복제를 억제하기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio 88 균주(KCTC14482BP)가 생산하는 플란타리신F(PlnF).
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