KR20150044764A - 신규한 락토바실러스 플란타럼 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 그 용도에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 Lactobacillus plantarum DK119의 내산성과 내담즙성, 항산화활성을 비롯한 실험동물 비강 투여를 통해 독감바이러스 감염에 미치는 영향에 대해 알아보고 면역성을 확인한 것이다.

Description

신규한 락토바실러스 플란타럼 및 그 용도{A novel Lactobacillus plantarum and use of the same}
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 그 용도에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 Lactobacillus plantarum DK119의 내산성과 내담즙성, 항산화활성을 비롯한 실험동물 비강 투여를 통해 독감바이러스 감염에 미치는 영향에 대해 알아보고 면역성을 확인한 것이다.
일반적으로, 유산균은 장내 정상적으로 존재하는 그람양성의 비병원성 세균으로서 면역증강, 항균, 항바이러스 효과 등을 나타낸다. 또한 항암 효과 및 면역증강 효과를 가지며, IgE 등의 과민반응에 관련된 면역글로블린의 생성을 억제한다. 최근 Lactobacillus casei가 항원에 감작된 비장세포에서 IgE의 분비를 억제한다고 밝혀져있다. 유산균의 과민반응에 대한 효과는 cytokine의 발현양을 조절함으로서 이루어지는 것으로 알려져 있으며, 이러한 유산균의 효과는 각 유산균의 혈청형이나 분리주에 따라 각각 다르게 나타난다. 따라서 국내 분리 유산균주의 효과를 검증해야 하는 필요성이 있다.
관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020040076183호는 면역활성이 높고 항암효과 및 유해 미생물 증식 억제활성이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 사케이 Probio-44에 관한 것이고, 다른 관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020070110115호는에서는 면역기능 조정제에 관한 것이다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 내산성과 내담즙성, 항산화활성 및 면역효과를 동시에 가지는 신규한 균주를 제공하는 것이다.
본 본 발명의 다른 목적은 정장제, 유산균제제, 건강보조식품, 유제품 종균제, 김치를 포함하는 발효식품 종균제 등으로 이용하여 장내 유해한 미생물을 억제하고 면역활성이 높고, 내산성과 내담즙성이 우수한 생균활성제 및 함유 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 유단백 분해능 및 면역활성을 동시에 갖는 락토바실러스 플란타럼 DK119 (Lactobacillus plantarum DK119)을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타럼 DK119는 기탁번호 KACC91781P인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 추가로 1종 이상의 다른 프로바이오틱 미생물을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 식품, 김치 접종제, 동물 의약품, 유제품, 또는 동물사료첨가제를 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 폐바이러스 및 기관지 바이러스 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 프로바이오틱 조성물에 사용하기 위한 담체는 바람직하게는 프리바이오틱, 예컨대 섬유 성분을 포함한다. 프리바이오틱은 프로바이오틱 종, 예컨대 락토바실러스 및 비피더스균을 위한 식품 공급원으로서 작용할 수 있다. 상부 위장관에서, 비피더스균은 산소 환경으로 인해 성장하지 않지만, 락토바실러스는 대사적으로 활성일 수 있다. 유기체의 효소 과정이 활성화된다면, 이들은 식품 공급원을 찾게될 것이다. 프로바이오틱으로서의 락토바실러스과 프리바이오틱, 바람직하게는 이눌린 사이의 상승적 관계로 인해 락토바실러스가 대사 활성을 겪을 수 있게 된다. 이는 이전에 주지된 바와 같이 숙주에게 유리할 수 있지만, 이는 또한 세포가 위장관내의 생리학적 작용하에 생존할 수 없음을 의미할 수 있다. 이와 같이, 상부 위장관에서 락토바실러스와 이눌린 사이의 긍정적인 상승작용 관계는 본 발명의 프로바이오틱 포함 조성물의 면역 강화 능력을 프리바이오틱이 존재하지 않는 개별 락토바실러스 균주에 비해 증진시키는 것으로 생각될 수 있지만, 이러한 상승작용 관계는 누적 생존율을 손실시킬 수 있다.
본 발명의 조성물의 담체 조성물은 추가로 장 질환에 전형적인 미생물환경을 저지하는 작용을 하고, 이는 프로바이오틱 보충 이후 효과적인 콜로니화를 저해한다. 프로바이오틱은 염증, 조직 삼투압의 변화, 및 유리 양이온의 존재와 연관된 산화전 상황(이는 프로바이오틱 콜로니화를 방지함)을 특징으로 하는 환경에 종종 처한다.
그러나, 이렇게 개발된 조성물은 위장 콜로니화의 매우 높은 속도를 허용하는데, 이는 조성물이 프로바이오틱혼합물의 도착과 동시에 효과적 콜로니화를 위한 기질을 제공하기 때문이다.
프리바이오틱 성분에 관하여, 탄수화물 및 섬유, 예컨대 GOS, 자일로올리고당, 소화되지 않는 말토덱스트린, 이눌린, 이소말토올리고당, 락티톨, 락툴로스, 및 트랜스갈락토올리고당이 사용될 수 있지만, 이눌린, 프럭토스및/또는 프럭토올리고당(FOS)이 본 발명에 있어서 특히 바람직하다. 가장 바람직한 실시태양에서, 프리바이오틱 성분은 이눌린, 프럭토스 및/또는 FOS를 포함한다.
한 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 프로바이오틱 포함 조성물은 하나 이상의 프리바이오틱을 총 조성물의 약80% 이하의 양으로 포함한다. 보다 바람직한 실시태양에서, 프리바이오틱은 이눌린과 프럭토스의 조합물이다.
이눌린은 담체 조성물의 약 0 내지 약 100%의 양으로 존재하고; 보다 바람직하게는 이눌린은 담체의 약 10 내지 약 100%의 양으로 존재하고; 가장 바람직하게는 이눌린은 담체의 약 20%이다. 프럭토스는 담체 조성물의 약 1내지 약 100%의 양으로 존재하고; 보다 바람직하게는 프럭토스는 담체 조성물의 약 1 내지 약 100%의 양으로 존재하고; 가장 바람직하게는 프럭토스는 조성물의 담체의 50% 초과의 양으로 존재한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 Lactobacillus plantarum DK119를 MRS broth에 하루 배양한 생균을 사용하였고, 내산성과 내담즙성, 항산화 활성 및 면역성의 특징을 확인하였다. 면역성에 대해서는 실험동물에 대해 경구투여 효과를 관찰하였다.
본 발명은 전통발효식품에서 분리균주인 Lactobacillus plantarum DK119를 분리하여 내산성과 내담즙성, 항산화활성을 확인하고 면역효과를 밝히고 검증하는 것이다. 또한 이를 동결건조하여 발효유 등에 적용시켜 상업적 활용이 가능하도록 하고자 하였다.
또 본 발명은 정장제, 유산균제제, 건강보조식품, 유제품 종균제, 김치를 포함하는 발효식품 종균제 등으로 이용하여 장내 유해한 미생물을 억제하고 면역활성이 높고, 내산성과 내담즙성이 우수한 생균활성제 및 함유 조성물을 제공할 수 있다.
상기 목적상, 본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 생균 활성을 지니는 식품조제를 수득하기 위해 식품, 바람직하게는 밀크 또는 식이성 제품, 예를들어 요구르트에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 이는 생균 활성을 지니는 조성물, 예를 들어 적절한 비히클 및/또는 부형제와 조합된 경구 투여용의 식품보충제 또는 비-식품조제, 예를들어 영양약학 조제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 상기 본 발명의 균주는 동결건조되거나 건조된 조성물의 형태로 사용되는 것이 바람직하다.
생균 또는 영양약학 조성물에 사용되는 동결건조되거나 건조된 제품의 세균 로드(load)는 바람직하게는 108 CFU/g 이상 내지 1011 CFU/g이다.
동결건조되거나 건조된 조성물을 제조하기 위해, 젖은 균주가 액체 배지, 예를 들어 보호제, 예를들어 스킴 밀크(skimmed milk), 락토오스, 글루코오스, 효모 추출물, 감자 전분, 나트륨 글루타메이트, 이노시톨, 나트륨 시트레이트, 젤라틴, 말토덱스트린, 마그네슘 스테아레이트, 아스코르브산, 스테아르산 및 이들의 조합물이 첨가된 물 또는 멸균 생리용액에 현탁된다.
본 발명은 전통발효식품에서 분리균주인 Lactobacillus plantarum DK119를 분리하여 내산성과 내담즙성, 항산화활성을 확인하고 면역효과를 밝히고 검증하였으며, 또한 이를 동결건조하여 발효유 등에 적용시켜 상업적 활용이 가능하도록 하고자 하였다.
도 1은 전통발효식품에서 분리균주인 Lactobacillus plantarum DK119의 16s-rRNA Sequencing 분석 동정 결과 도면, Sequencing 분석은 macrogen Inc.에 의뢰하였고 DNA 염기서열을 NCBI의 BLAST를 이용하여 GenBank database 와 비교하여 균을 동정한 결과 DK119 Lactobacillus plantarum %ID : 99% 로 확인되었다.
도 2는 DK119의 유단백질 분해 활력 측정 도면,균주의 유단백질 분해능을 측정하기위해 1.6% skim milk, 1.5% agar powder를 증류수에 혼합하여 petri dish에 적절량을 pouring하여 굳힌 agar의 중앙 부분을 첨공하고 sample 150l을 주입후, 37에서 48시간 배양 후 지름을 측정하였다.탈지유 한천 배지 상에서 상업용 균주와 DK119에 생성된 환을 비교한 결과 상업용 균주보다 유단백질 분해능이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
도 3은 DK119의 FRAP assay 도면,선발유산균의 FeSO4 철 이온의 환원력을 측정하기 위해 균주를 FRAP 시약을 사용하여 흡광도를 측정하고 Fe2+의 농도를 FeSO4의 표준곡선에 대입하여 환산하였다. 도면 3와 같이 DK119의 환원력은 control에 비해 높게 나타났다.
도 4는 DK119의 DPPH radical scavenging activity 도면,선발 유산균의 DPPH radical 소거활성을 측정하기 위해 Rivero-Prez M.D 등(2008)의 방법을 일부 수정하여 실험하였다. DKL 균주의 DPPH radical 소거활성이 60% 이상의 소거활성능이 나타났다.
도 5는 DK119의 Cold shock 도면,DK119 저온에서의 저장성 실험을 위하여 4일 동안 -20℃에서 보관하며 24시간 간격으로 유산균수를 측정하였다. 유산균 수를 측정한 결과 모든 균주가 108(CFU/mL) 이상의 수준을 유지하는 것을 확인할 수 있었고 1% glycerol을 넣어준 모든 균주는 109(CFU/mL) 이상의 수준을 유지하는 것을 확인하였으며, 1% glycerol 첨가시 동결건조에 효과가 있을 것이라 사료된다.
도 6은 DK119를 이용한 유청발효음료의 pH와 TA 최적 발효 조건 도면, 60℃에서 가온한 증류수 45mL과 skim milk 5g을 넣고 혼합하여 95에서 15분간 살균 후, 40℃에서 냉각한 뒤 DK119 균주 1mL을 접종후 4시간 간격으로 적정산도(TA)와 pH를 측정하였다.매일 4시간 마다 얻은 sample로 pH와 T.A 를 측정하였다. 산도가 매 시간마다 상승했다.
도 7은 DK119 (109CFU/mouse)의 경구투여가 실험동물에서 독감 바이러스 감염에 대한 보호효과에 대한 도면, 유산균을 투여하지 않은 바이러스 감염군은 20%이상의 체중 감소 및 부분적 생존율(50%)을 보인 반면 109CFU/mouse로 유산균을 경구투여한 군은 약 10-15%의 체중 감소 및 100% 생존율을 보였다.
도 8은 DK119 (108CFU/mouse)의 경구투여가 실험동물에서 독감 바이러스 감염에 대한 보호효과에 대한 도면, 108CFU/mouse로 유산균을 경구투여한 군은 약 10-15%의 체중 감소 및 100% 생존율을 보였다.
도 9는 비강을 통한 DK119 (109CFU/mouse)과 독감 바이러스의 혼합 투여가 독감 바이러스의 치사 감염에 대해 보호효과 도면,높은 농도의 유산균(109CFU/mouse)과 독감 바이러스 혼합물을 투여한 실험군은 초기에 10~15%의 몸무게 감소를 보이지만 다시 정상수준으로 회복되었다. 반면, 독감바이러스만을 투여한 군은 100% 사망률을 보였다. 유산균과 독감 바이러스 혼합물 투여군의 초기 체중 감소는 상대적으로 높은 유산균 투여량에 의한 것으로 추정된다.
도 10은 비강을 통한 DK119 (108CFU/mouse)과 독감 바이러스의 혼합 투여가 독감 바이러스의 치사 감염에 대해 보호효과 도면,동일 조건에서 낮은 농도의 유산균(108CFU/mouse)과 독감 바이러스 혼합물을 비강으로 투여한 실험군에서는 20%이상의 체중 감소를 보이고 생존율은 50%로 나타났다. 한편, 독감 바이러스 단독 투여군은 100%의 사망률을 보였다.
도 11은 DK119 (109CFU/mouse)과 독감 바이러스 혼합물 투여전 비강을 통한 DK119 (107CFU/mouse)의 전처치가 독감 바이러스 감염에 대해 유의적 개선효과 도면,유산균 전처치 군에서 감염 2일 후 일시적으로 약간의 체중감소를 보인 후 다시 증가하였으며, 이러한 결과는 유산균의 전처치가 독감 바이러스 감염에 대해 대단히 유의적으로 보호효과가 있음을 보여주는 것이다.유산균을 전처치한 실험군의 모든 동물이 감염으로부터 생존하였으며 체중감소 또한 근소한 것으로 나타났다.(약 5~7%)감염에 따른 체중감소가 획기적으로 줄어든 결과는 비강을 통한 유산균의 전처치가 유산균(109CFU/mouse)과 독감 바이러스 혼합물만을 투여 한 결과와 비교하여서(도 9) 더욱 개선된 효과가 있음을 보여주는 것이다.
도 12는 DK119 (108CFU/mouse)과 독감 바이러스 혼합물 투여전 비강을 통한 DK119 (107CFU/mouse)의 전처치가 독감 바이러스 감염에 대해 유의적 개선효과 도면,유산균 비강 전처치의 감염에 대한 우수한 보호효과를 확인하기 위하여, 108CFU/mouse의 유산균을 독감 바이러스(A/PR8)와 유산균(108CFU/mouse) 혼합물 투여 4일 전과 1일 전 2회 투여하였다.비강을 통한 유산균 전처치 실험군의 모든 동물이 바이러스 감염으로부터 100%생존하였으며, 감염 6~7일에 약간의 체중감소(6~9%)만을 보였다.결론적으로, 바이러스 감염 전 유산균의 전처치(108CFU/mouse)는 같은 농도의 유산균과 독감 바이러스와 혼합 투여 시 초래된 체중감소 결과와 비교하여서(도.10) 탁월한 개선효과를 나타났다.
도 13은 DK119 (108~9CFU/mouse)과 독감 바이러스 혼합물의 비강투여가 항바이러스 사이토카인인 인터페론감마(interferon-gamma)에대해 끼치는 영향 도면,유산균 투여의 유효 효과 기전을 이해하기 위하여 독감 바이러스 감염 4일째 기관지폐포액에서 사이토카인 농도를 측정하였다. 항바이러스 사이토카인인 인터페론 감마(IFN-γ) 농도가 독감바이러스 감염군과 비교하여 유산균 투여군의 기관지폐포 세척액, 폐추출물 및 혈액에서 증가하였다.따라서, 유산균 투여가 항바이러스 사이토카인 생성을 증가하여 염증반응을 예방하는 것으로 추정된다.
도 14는 DK119 (108~9CFU/mouse) 투여가 폐 바이러스 농도에 끼치는 영향 도면,폐의 바이러스 농도는 독감 바이러스에 대한 보호효과를 평가하는 중요 지표이다. 독감 바이러스 감염 4일째 유산균 투여군 및 투여하지 않은 실험동물 군에서 폐 바이러스 농도를 측정하였다.유산균을 투여하지 않은 독감 바이러스 감염군에서 폐 바이러스 농도가 높게 나타났다.즉, 유산균 경구투여(109CFU/mouse)또는 비강투여(108CFU/mouse)는 약 5~10배 폐바이러스 농도를 감소시켰다.반면, 저농도의 유산균 경구투여 군(108CFU/mouse)에서는 독감 바이러스 감염군과 비교하여 폐 바이러스 농도에 변화가 없었다.고농도의 유산균(109CFU/mouse) 비강투여 군에서는 바이러스가 검출되지 않았다.
도 15는 DK119 (108~9CFU/mouse) 비강투여가 기관지폐포 세척액의 수지상세포 농도에 끼치는 영향,유산균 투여가 면역세포에 미치는 효과를 측정하기 위해 감염시키지 않은 mouse에 108CFU/mouse 또는 109CFU/mouse의 유산균을 비강투여하고 기관지폐포 세척액에서 수지상세포의 표현형(phenotype)을 측정하였다. 유산균 투여 4일째에 mouse를 희생하고 기관지폐포 세척액을 취한 후 수지상세포에 특이적인 marker(CD 11b, CD11c)를 이용하여 측정하였다. 유산균 비강투여군에서 유산균을 투여하지 않은 군과 비교하여 CD11c+ 표현형 수지상세포 농도가 증가하였다.유산균 투여는 숙주면역에서 가장 중요한 세포형 중의 하나인 수지상 세포의 증가를 통해 독감 바이러스 감염에 대한 보호효과를 개선하는 것으로 사료된다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1:유산균 분리
Lactobacillus plantarum DK119 동정
(1) API - kit
가정에서 제조한 배추김치에서 분리한 유산균을 배양하여 API 50 CHL medium에 McFarland standard 2의 탁도로 현탁하여 API 50 CHL strips에 접종한 뒤, 무든 tube에 mineral oil을 첨가하고 37℃에서 48시간 배양 후, Apiweb program (http://apiweb.biomerieux.com, Biomerieux)에서 결과를 확인하였다. 확인 결과 Lactobacillus plantarum %ID : 99.8%로 확인되었다(표 1).
상기 본 발명의 균주는 대한민국 수원시 소재 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2013년 9월4일에 기탁번호 KACC91781P로 기탁했다
Sample name Species % ID
DK119 Lactobacillus plantarum 99.8
표 1은 API 키트로 LAB를 동정한 표
(2) 16s- rRNA sequence
본 발명의 균주의 Sequencing 분석은 macrogen Inc.에 의뢰하였고 DNA 염기서열을 NCBI의 BLAST를 이용하여 GenBank database 와 비교하여 균을 동정한 결과 DK119 Lactobacillus plantarum %ID : 99% 로 확인되었다(도1).
실시예 2: DK119의 의 내산성 & 내담즙성
pH 2.0 MRS broth 용액과 1.0% Oxgall broth 9mL에 각각 균주를 배양한 broth 1mL을 주입(37℃/1h, 2hr) 후, 1시간 경과, 2시간 경과시 샘플링하여 균수를 측정하였다. 그 결과 1시간 경과, 2시간 경과시, pH2.0조건에서 108(CFU/mL)이상으로 control과 비슷한 수준을 유지하여 내산성이 높은것으로 나타났다(표 2). 1.0% Oxgall을 첨가한 유산균 또한 108(CFU/mL)이상으로 control과 비슷한 수준을 유지
하여 내담즙성이 높은것으로 나타났다(표3).
Name Control 1% Oxgall pH 2.0
DK119 6.0x108 2.0x108 3.0x108
표 2는 DK119의 내산성과 내담즙성(37℃, 1hr) 표
Name Control 1% Oxgall pH 2.0
DK119 1.0x108 4.0x108 2.0x108
표 3은 DK119의 내산성과 내담즙성(37℃, 2hr) 표
실시예 3: DK119의 유단백질 분해능 ( Proteolysis activity )
본 발명의 균주의 유단백질 분해능을 측정하기위해 1.6% skim milk, 1.5% agar powder를 증류수에 혼합하여 petri dish에 적절량을 pouring하여 굳힌 agar의 중앙 부분을 첨공하고 sample 150μl을 주입후, 37℃에서 48시간 배양 후 지름을 측정하였다.탈지유 한천 배지 상에서 상업용 균주와 DK119에 생성된 환을 비교한 결과 상업용 균주보다 유단백질 분해능이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 항산화능
(1) FRAP assay
선발유산균의 FeSO4 철 이온의 환원력을 측정하기 위해 균주를 FRAP 시약을사용하여 흡광도를 측정하고 Fe2+의 농도를 FeSO4의 표준곡선에 대입하여 환산하였다. DK119의 환원력은 control에 비해 높게 나타났다.
FRAP 용액은 300mM Acetate buffer (ph3.6) (Sigma, U.S.A) 50mL 과 10mM 2,4, 6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ, in 40mM HCL) (Sigma, U.S.A) 5mL, 20mM FeCl36H2O (Iron() chloride hexahydrate 97% A.C.S reagent) (Sigma, U.S.A)
5mL 을 혼합하여 제조하여 사용하였다.
FRAP 용액 1.2mL에 증류수 20μL과 유산균배양액 또는 positive control (Ascrobic acid, α-tocopherol)의 상등액 40μL을 혼합하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 593nm에서 흡광도를 측정하였다. Control은 sample 대신 증류수를 이용하였고 FeSO4 농도별 흡광도의 기울기를 구한 후, sample 의 흡광도에 대입하여 계산하였다.
(2) DPPH assay
선발 유산균의 DPPH radical 소거활성을 측정하기 위해 Rivero-Prez M.D 등(2008)의 방법을 일부 수정하여 실험하였다. DKL 균주의 DPPH radical 소거활성이 60% 이상의 소거활성능이 나타났다.
37℃에서 24시간 동안 배양한 균주에 TCA (Sigma, U.S.A) 100μL 처리
(3,000rpm에서 10분간 원심 분리)하여 상등액을 사용하였다.
2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH, Sigma, U.S.A)시약 7.8mg을 100mL 의
에탄올에 녹여 제조하여 사용하였고 DPPH 용액 1mL에 에탄올 50μL과 유산균배양
액 또는 positive control (Ascrobic acid, a-tocoperol)의 상등액 100L 을 혼합후, 37℃에서 30분간 반응 후 515nm에서 흡광도를 측정하였다. Control은 sample 대
신 Ethanol 을 이용하였다.
전자공여능 (%) 은 다음과 같은 식으로 산출하였다.
전자공여능 (%) = (1-sample O.D-/대조구 O.D)x100
실시예 5: Cold shock
본 발명의 DK119 저온에서의 저장성 실험을 위하여 4일 동안 -20℃에서 보관하며 24시간 간격으로 유산균수를 측정하였다. 표 4와 같이 유산균 수를 측정한 결과 모든 균주가 108(CFU/mL) 이상의 수준을 유지하는 것을 확인할 수 있었고 표 6과 같이 1% glycerol을 넣어준 모든 균주는 109(CFU/mL) 이상의 수준을 유지하는 것을 확인하였으며, 1% glycerol 첨가시 동결건조에 효과가 있을 것이라 사료된다.
Step 방법 조건
1 Step 37℃/24h 배양하고 계수 -40℃/24h cold shock
2 Step 37℃ 해동하고 계수 -40℃/24h cold shock
3 Step 37℃ 해동하고 계수 -40℃/24h cold shock
4 Step 37℃ 해동하고 계수 -40℃/24h cold shock
표 4는 DK119의 Cold shock 조건
1 Step 2 Step 3 Step 4 Step
DK119 4.0x109 1.0x109 1.8x109 2.7x109
표 5는 MRS broth에서 DK119의 Cold shock 생균수
1 Step 2 Step 3 Step 4 Step
DK119 2.0x109 2.0x109 2.0x109 2.0x109
표 6은 MRS broth에 1% glycerol 첨가시 DK119의 Cold shock 생균수
실시예 6: 발효유
60℃에서 가온한 증류수 45mL과 skim milk 5g을 넣고 혼합하여 95℃에서 15분간 살균 후, 40℃에서 냉각한 뒤 DK119 균주 1mL을 접종후 4시간 간격으로 적정산도(TA)와 pH를 측정하였다.
0h 4h 8h 12h 16h 20h 24h
pH 6.39 6.28 6.19 5.92 5.39 5.11 4.80
T.A 0.22 0.27 0.34 0.39 0.55 0.66 0.85
Count
(CFU/mL)		 1.0x108 8.0x108 4.0x109 1.0x109 4.0x109 - -
표 7은 유청용액에 DK119 첨가시 산도와 pH, 생균수 변화
매일 4시간 마다 얻은 sample로 pH와 T.A 를 측정하였다. 산도가 매
시간마다 상승했고, 108 (CFU/mL) 이상의 수준을 유지하는 것을 확인할 수
있었다.
실시예 7:독감 바이러스 감염 및 숙주 면역반응에 미치는 영향
(1)유산균 DK119의 경구투여가 실험동물에서 독감 바이러스 감염에 대한 보호효과
유산균의 독감 바이러스에 대한 보호효과는 실험동물의 체중 변화 및 생존율 측정을 통해 알아보았다.
본 발명은 Lactobacillus plantarum DK119를 MRS broth에 하루 배양한 생균을 사용하였고, 실험동물에 대해 경구투여 효과를 관찰하였다.
경구투여량은 1일 1회 109CFU또는 108CFU/mouse(n=6/군)로 하였으며, 투여기간은 독감 바이러스 감염 전 10일 및 감염 후 14일 동안 지속적으로 투여하였다.
독감 바이러스 감염은 influenza virus A/PR8(H1N1)을 2x50% mouse lethal dose(2xLD50)로 비강투여하여 유발하였다.
DK119 유산균의 독감 바이러스에 대한 보호효과는 실험동물의 체중 변화 및 생존율 측정을 통해 알아보았다.
DK119 유산균을 투여하지 않은 바이러스 감염군은 20%이상의 체중 감소 및 부분적 생존율(50%)을 보인 반면 109CFU/mouse 또는 108CFU/mouse로 유산균을 경구투여한 군은 약 10-15%의 체중 감소 및 100% 생존율을 보였다.
(2)비강을 통한 DK119 유산균과 독감 바이러스의 혼합 투여가 독감 바이러스의 치사 감염에 대해 보호효과
독감 바이러스는 호흡기 병원체로 폐조직이 바이러스 증식의 주요 부위다. 따라서 유산균의 폐조직에 대한 보호효과를 알아보고자 유산균과 독감바이러스를 비강을 통해 동시에 혼합투여하고 효과를 측정하였다.
바이러스 감염군은 비강을 통해 influenza virus A/PR8(H1N1)을 2xLD50로 단독으로 투여하고, DK119 투여 군은 109CFU또는 108CFU/mouse(n=6/군)의 DK119와 독감 바이러스 혼합물을 비강을 통해 1회 투여하였다.
높은 농도의 유산균(109CFU/mouse)과 독감 바이러스 혼합물을 투여한 실험군은 초기에 10~15%의 몸무게 감소를 보이지만 다시 정상수준으로 회복되었다(도 9). 반면, 독감바이러스만을 투여한 군은 100% 사망률을 보였다. 유산균과 독감 바이러스 혼합물 투여군의 초기 체중 감소는 상대적으로 높은 유산균 투여량에 의한 것으로 추정된다. 이어서, 동일 조건에서 낮은 농도의 유산균(108CFU/mouse)과 독감 바이러스 혼합물을 비강으로 투여한 실험군에서는 20%이상의 체중 감소를 보이고 생존율은 50%로 나타났다. 한편, 독감 바이러스 단독 투여군은 100%의 사망률을 보였다.
(3) DK119와 독감 바이러스 혼합물 투여전 비강을 통한 DK119의 전처치가 독감 바이러스 감염에 대해 유의적 개선효과
DK119의 전처치가 독감 바이러스에 대해 보호효과를 나타내는지 알아보고자 본 실험을 수행하였다.
DK119의 전처치 효과는 먼저, 낮은 농도의 유산균(107CFU/mouse)을 1회 바이러스 감염 전 비강을 통해 투여하고 이어서, DK119(109CFU/mouse)와 독감 바이러스 혼합물을 투여하여 감염을 유발하여 알아보았다.
DK119 전처치 군에서 감염 2일 후 일시적으로 약간의 체중감소를 보인 후 다시 증가하였으며, 이러한 결과는 DK119의 전처치가 독감 바이러스 감염에 대해 대단히 유의적으로 보호효과가 있음을 보여주는 것이다.
DK119를 전처치한 실험군의 모든 동물이 감염으로부터 생존하였으며 체중감소 또한 근소한 것으로 나타났다.(약 5~7%)감염에 따른 체중감소가 획기적으로 줄어든 결과는 비강을 통한 DK119의 전처치가 DK119(109CFU/mouse)와 독감 바이러스 혼합물만을 투여 한 결과와 비교하여서 더욱 개선된 효과가 있음을 보여주는 것이다.
(4)DK119와 독감 바이러스 혼합물의 비강투여가 항바이러스 사이토카인인 인터페론감마(interferon-gamma)를 증가시킴.
DK119 투여의 유효 효과 기전을 이해하기 위하여 독감 바이러스 감염 4일째 기관지폐포액에서 사이토카인 농도를 측정하였다.
항바이러스 사이토카인인 인터페론 감마(IFN-γ) 농도가 독감바이러스 감염군과 비교하여 DK119 투여군의 기관지폐포 세척액, 폐추출물 및 혈액에서 증가하였다.
따라서, DK119 투여가 항바이러스 사이토카인 생성을 증가하여 염증반응을 예방하는 것으로 추정된다.
(5)DK119 투여가 폐 바이러스 농도를 감소시킴.
폐의 바이러스 농도는 독감 바이러스에 대한 보호효과를 평가하는 중요 지표이다. 독감 바이러스 감염 4일째 DK119 투여군 및 투여하지 않은 실험동물 군에서 폐 바이러스 농도를 측정하였다.
DK119를 투여하지 않은 독감 바이러스 감염군에서 폐 바이러스 농도가 높게 나타났다.즉, DK119 경구투여(109CFU/mouse)또는 비강투여(108CFU/mouse)는 약 5~10배 폐바이러스 농도를 감소시켰다.
반면, 저농도의 DK119 경구투여 군(108CFU/mouse)에서는 독감 바이러스 감염군과 비교하여 폐 바이러스 농도에 변화가 없었다.
고농도의 DK119 유산균(109CFU/mouse) 비강투여 군에서는 바이러스가 검출되지 않았으며, 이는 향후 연구를 통한 확인이 요구된다.
(6)DK119 비강투여가 기관지폐포 세척액의 수지상세포 농도를 증가시킴.
DK119 유산균 투여가 면역세포에 미치는 효과를 측정하기 위해 감염시키지 않은 mouse에 108CFU/mouse 또는 109CFU/mouse의 유산균을 비강투여하고 기관지폐포 세척액에서 수지상세포의 표현형(phenotype)을 측정하였다.
DK119 투여 4일째에 mouse를 희생하고 기관지폐포 세척액을 취한 후 수지상세포에 특이적인 marker(CD 11b, CD11c)를 이용하여 측정하였다.
DK119 비강투여군에서 유산균을 투여하지 않은 군과 비교하여 CD11c+ 표현형 수지상세포 농도가 증가하였다.
DK119 유산균의 투여는 숙주면역에서 가장 중요한 세포형 중의 하나인 수지상 세포의 증가를 통해 독감 바이러스 감염에 대한 보호효과를 개선하는 것으로 사료된다.
농업생명공학연구원 KACC91781 20130904

Claims (6)

  1. 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 유단백 분해능 및 면역활성을 동시에 갖는 락토바실러스 플란타럼 DK119 (Lactobacillus plantarum DK119).

  2. 제 1항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타럼 DK119는 기탁번호 KACC91781P인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼 DK119.
  3. 제 1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 추가로 1종 이상의 다른 프로바이오틱 미생물을 포함하는 조성물.
  5. 제 1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 포함하는 식품, 김치 접종제, 동물 의약품, 유제품, 또는 동물사료첨가제.
  6. 제 1항 또는 제2항의 균주를 유효성분으로 포함하는 폐바이러스 및 기관지 바이러스 억제용 조성물.


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