CN112028952B - 吲哚糖苷类化合物、其制备及抗流感病毒的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了吲哚糖苷类化合物、其制备及抗流感病毒的用途，具体涉及从大青叶水提取物中分离得到的新型吲哚糖苷类化合物I以及其药学上可接受的盐，以及其在制备抗流感病毒药物或保健品中的应用；并公开了该类化合物的制备方法、以及含有该类化合物的药物组合物在制备抗流感病毒药物中的应用。

Description

吲哚糖苷类化合物、其制备及抗流感病毒的用途
技术领域
本发明涉及一种吲哚糖苷类化合物及其药学上可接受的盐、它们的制备方法、含有这类化合物的药物组合物，以及这类化合物在抗抗流感病毒方面的应用，属于医药技术领域。
背景技术
流感病毒是引起流行性感冒的病原体，是引起人类死亡的重要病因之一。流感病毒属于正粘液病毒科，根据内部蛋白抗原性的不同分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三种类型，与人类关系最密切的是甲型流感病毒，其基因组由8条单链负链RNA组成，编码至少10种蛋白：血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)、聚合酶(Polymerasebasic protein 1,PB1；Polymerase basic protein 2,PB2；Polymerase acidic protein3,PA)、核蛋白(Nucleoprotein,NP)、基质蛋白(Matrix protein 1,M1；Matrix protein 2,M2)、非结构蛋白(Non-structural protein 1,NS1；Non-structural protein 2,NS2)。流感病毒株系众多，根据病毒包膜蛋白血凝素HA和神经氨酸酶NA抗原性的不同将甲型流感病毒分为多种亚型，目前已发现17种HA和10种NA，HA和NA亚型可形成不同组合，例如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N9亚型等。
目前临床应用的抗流感药物，按作用机理主要分为两类：一类是抑制M2离子通道蛋白的金刚烷胺和金刚乙胺；另一类是抑制流感病毒释出的神经氨酸酶抑制剂，奥司他韦、扎纳米韦和帕拉米韦。统计数据显示，目前所有已上市的抗流感药物均出现了耐药病毒株，由于耐药性过于严重，美国疾病控制与预防中心已建议金刚烷胺、金刚乙胺类药物不作为临床治疗使用。除了上述抗流感药物外，多种单味和复方中药制剂，如板蓝根颗粒、双黄连口服液等，也是抗流感病毒的有效治疗药物。
十字花科(cruciferae)菘蓝属植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥叶和根分别是我国现行《药典》法定中药大青叶和板蓝根的唯一来源植物；全国多地大面积种植，以满足实际需求，主产于河北、江苏、浙江、安徽、河南、湖北、甘肃等地。大青叶和板蓝根具有相似的传统功效和临床用途，有清热解毒、凉血消斑、利咽止痛等功效，用于温邪入营、高热神昏、发斑发疹、黄疸热痢、丹毒痈肿等症[1]，以及流行性感冒、流行性腮腺炎、病毒性肝炎、单疱病毒性角膜炎、咽炎、扁平疣、红眼病、泪囊炎、水痘、麻疹等疾病治疗[2,3]。现代药理学研究显示，大青叶和板蓝根提取物具有相似的抗菌、抗炎、解热、抗病毒、抗内毒素、免疫调节和抗肿瘤等多种药理作用，但是二者的作用强度和效果存在差异；特别是有报道显示，在抗菌、解热和抗病毒等方面，大青叶的作用优于板蓝根[4]。
另外，在化学成分方面，从大青叶和板蓝根的提取物中发现了一些相同的生物碱类、黄酮类、有机酸类等成分；但从二者中也报道了一些不同结构、不同含量、乃至不同骨架的化合物[5-10]；尤其是以往的研究主要聚焦在板蓝根上，而对大青叶化学成分的研究较少，其中以乙醇提取物为主，这与它们传统以水煎煮为主的应用方式不一致。从2009年起本课题组开展了板蓝根水提取物化学成分的系统研究，及其活性初步筛选，已从板蓝根水提取物中分离到了180多种化学成分，发现了包括新骨架等新结构化合物70余个，及部分化合物的抗病毒和肝保护等活性[11-24]。基于以上研究背景和基础，本课题启动了对大青叶水提取的研究，期望通过系统深入地研究从中获得结构多样的天然产物，特别是聚焦其中的低含量和微量成分，并在抗病毒等多种药理模型上，对分离鉴定的主要成分进行了初步活性筛选，以期探寻大青叶与板蓝根化学成分及其活性之间的本质同异，获得结构多样、新颖和活性显著的化合物，为创新药物研究提供有价值的模板化合物或先导化合物，为大青叶的开发和临床应用提供实验依据。
在研究中发现了具有显著抑制流感病毒H1N1复制活性的吲哚3-阿洛糖苷的C-2位与4″-羟基-3″,5″-二甲氧基苯基-1′-乙基偶联产物：(±)-2-[1′-(4″-羟基-3″,5″-二甲氧基苯基)-1′-乙基]-3-β-D-吡喃阿洛糖氧基-1H-吲哚(1)，并经手性柱HPLC拆分获得了手性单一的一对差向异构体：(+)-(R)-2-[1′-(4″-羟基-3″,5″-二甲氧基苯基)-1′-乙基]-3-β-D-吡喃阿洛糖氧基-1H-吲哚(1a)和(-)-(S)-2-[1′-(4″-羟基-3″,5″-二甲氧基苯基)-1′-乙基]-3-β-D-吡喃阿洛糖氧基-1H-吲哚(1b)，分别命名为大青叶苷C(1a)和表大青叶苷C(1b)。进一步，将1a和1b以不同比例混合，获得了一系列消旋或部分消旋的化合物，并对其进行了抗流感病毒活性评价，获得了本发明的创造性结果。
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发明内容
本发明解决的技术问题是提供一类吲哚糖苷类化合物及其药学上可接受的盐，以及其制备方法，药物组合物和该类化合物在制备抗流感病毒药物或保健品中的应用。
为解决本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面是提供了一类吲哚糖苷类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物如通式(I)所示：
Figure GDA0002219434060000041
其中，化合物结构中1′位的绝对构型选自R或S，以及R构型和S构型以任意比例组成的消旋或部分消旋化合物。
X选自O、N、S、C。
R1选自H、阿洛糖基、阿拉伯糖基、葡萄糖基、鼠李糖基、木糖基、果糖基、半乳糖基、核糖基和脱氧核糖基。
R2和R3各自独立的选自H、CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、C(CH3)3、CH2CH2CH2CH3、OH、OCH3、OCH2CH3、OCH2CH2CH3、OCH(CH3)2、OCH2CH(CH3)2、OC(CH3)3、OCH2CH2CH2CH3；
R4选自H、CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、C(CH3)3、CH2CH2CH2CH3、COCH3、苯甲酰基；
优选地，本发明的化合物选自如下群组：
Figure GDA0002219434060000042
Figure GDA0002219434060000051
本发明技术方案的第一方面还提供了一种组合物，其特征在于，所述的组合物是指所述的吲哚糖苷类化合物及其药学上可接受盐中的两个或多个化合物以任意比例混合而成的组合物。
优选的组合物选自：
Figure GDA0002219434060000052
本发明技术方案的第二方面是提供第一方面所述化合物及其药学上可接受的盐或组合物的制备方法。
大青叶饮片，用水煎煮提取2～4次，每次煮沸后继续煎煮0.3～1.0小时，过滤，合并提取液，减压回收溶剂得到棕褐色冻状浸膏。将浸膏溶解于0.8～2.0倍量水中，用大孔树脂柱色谱分离，依次用H2O、50％EtOH和95％EtOH分别洗脱，TLC监测，每个流分均洗脱至样品无明显被洗脱下来，洗脱液分别浓缩后得到A、B和C三个洗脱部分。其中，B部位溶解于水中，经MCI gel柱色谱分离，依次用H2O、30％EtOH、50％EtOH、95％EtOH和Me2CO洗脱，TLC监测，每个流分均洗脱至样品无明显被洗脱下来，得到5个组分B1-B5。
组分B2经硅胶柱色谱分离，以乙酸乙酯-甲醇1:0至0:1梯度洗脱，最后用水洗脱，TLC检测，合并相同组分，得到组分B2-1-B2-10。B2-4经硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇13:1洗脱，薄层色谱或液相色谱检测合并相同组分，分离得到B2-4-1-B2-4-6。B2-4-1经反相ODS中压柱色谱分离，甲醇-水0:100～60:40梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，得到B2-4-1-1-B2-4-1-27。B2-4-1-21经硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇15:1洗脱，薄层色谱或液相色谱检测合并相同组分，分离得到B2-4-1-21-1-B2-4-1-21-10；B2-4-1-21-8经反相半制备HPLC：25％乙腈水，C18色谱柱，流速3.0mL/min，分离得到化合物1：tR＝35.1min，再经HPLC手性柱：正己烷:乙醇＝73:27，AD-H色谱柱，流速1.0mL/min，制备得1a：tR＝34.1min和1b：tR＝37.8min。进一步，将1a和1b以不同比例混合，可以得到消旋或部分消旋的一系列混合物。B2-4-2经反相ODS中压柱色谱分离，甲醇-水梯度5:9～60:40洗脱，TLC检测，合并相同组分，得到B2-4-2-1-B2-4-2-28。B2-4-2-25经反相半制备HPLC：8％乙腈水，C18色谱柱，流速3mL/min，分离得到化合物2混合物：tR＝22.2min，再经HPLC手性柱：正己烷:异丙醇＝7:3，AD-H色谱柱，流速1.5mL/min制备得2a：tR＝22.3min和2b：tR＝37.2min。进一步，将2a和2b以不同比例混合，可以得到消旋或部分消旋的一系列混合物。
本发明技术方案的第三方面是提供含有第一方面所述化合物及其药学上可接受的盐或组合物的药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的本发明的吲哚糖苷类衍生物及其药学上可接受的盐，以及任选的含有药用载体。其中所述的药用载体指药学领域常用的药用载体；该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物及其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂组合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物及其药学上可接受的盐在其药物组合物中的含量通常为0.1-95％重量百分比。
本发明化合物及其药学上可接受的盐或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明化合物及其药学上可接受的盐可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明化合物及其药学上可接受的盐制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、阿洛糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、阿洛糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物及其药学上可接受的盐与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物及其药学上可接受的盐先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物及其药学上可接受的盐片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物及其药学上可接受的盐的胶囊剂。
为将本发明化合物及其药学上可接受的盐制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、阿洛糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、阿洛糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
在将本发明的吲哚糖苷类衍生物及其药学上可接受的盐或本发明的组合物用于治疗上述疾病时，其用药量可参照使用吲哚糖苷类衍生物进行治疗时的用量；在将本发明的吲哚糖苷类衍生物或本发明的组合物用作保健品，或将其加入保健品时，其用量应少于通常的治疗量。
本发明人进行了大量的药物实验，证明了本发明的吲哚糖苷类衍生物具有流感病毒复制抑制的作用，对由流感病毒引起的疾病具有良好的治疗作用，并可用作或加入保健品，有利于改善身体状况，提高免疫力。
本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
本发明技术方案的第四方面是提供第一方面所述化合物及其药学上可接受的盐或组合物和第三方面所述药物组合物在制备抗流感病毒药物中的应用。
有益技术效果：
本发明的发明人在对传统中药大青叶的活性成分研究过程中，通过活性跟踪的方法从大青叶中分离得到了具有明显抗流感病毒作用的吲哚3-阿洛糖苷的C-2位与4″-羟基-3″,5″-二甲氧基苯基-1′-乙基偶联产物：2-[1′-(4″-羟基-3″,5″-二甲氧基苯基)-1′-乙基]-3-β-D-吡喃阿洛糖氧基-1H-吲哚(1)，并经手性柱HPLC拆分获得了手性单一的一对差向异构体：(+)-(R)-2-[1′-(4″-羟基-3″,5″-二甲氧基苯基)-1′-乙基]-3-β-D-吡喃阿洛糖氧基-1H-吲哚(1a)和(-)-(S)-2-[1′-(4″-羟基-3″,5″-二甲氧基苯基)-1′-乙基]-3-β-D-吡喃阿洛糖氧基-1H-吲哚(1b)，分别命名为大青叶苷C(1a)和表大青叶苷C(1b)。进一步，将1a和1b以不同比例混合，获得了一系列消旋或部分消旋的化合物，并对其进行了抗流感病毒活性评价。其中，1a和1b以1:1混合得到的外消旋物对流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)具有抑制活性，其IC50为64.7μM，与阳性药利巴韦林(IC50:54.3μM)活性相当。对比同时获得的葡萄糖基取代的化合物2，以及2a和2b的活性结果，表明该类型化合物在不同手性纯度的情况下会具有不同的活性强度，这对开发手性抗流感病毒药物或保健品具有重要开发价值和深入研究意义。
具体实施方式
下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：活性化学成分的制备
大青叶饮片100kg，用水煎煮提取3次，每次半小时，合并提取液，减压回收溶剂得到棕褐色冻状浸膏42Kg。将浸膏溶解于50L水中，用19kg大孔树脂柱色谱分离，依次用200LH2O、425L 50％EtOH和250L 95％EtOH洗脱，洗脱液分别浓缩后得到A、B和C三个洗脱部分。其中，B部位3.7Kg溶解于水中，经20L MCI gel柱色谱分离，依次用50L H2O、100L 30％EtOH、100L 50％EtOH、80L 95％EtOH和30L Me2CO洗脱，得到5个组分B1-B5。
组分B2(1724g)经5.0Kg硅胶柱色谱分离，以乙酸乙酯-甲醇100:0-0:100梯度洗脱，最后用水洗脱，得到组分B2-1-B2-10。B2-4(200g)经2.0Kg硅胶柱色谱分离：二氯甲烷-甲醇13:1，共1.5L，洗脱得到B2-4-1-B2-4-6。B2-4-1(15g)经反相ODS中压柱色谱分离，甲醇-水0:100－60:40梯度洗脱，得到B2-4-1-1-B2-4-1-27。B2-4-1-21(1.5g)经硅胶柱色谱：二氯甲烷-甲醇15:1，共800mL洗脱，分离得到B2-4-1-21-1-B2-4-1-21-10；B2-4-1-21-8(60mg)经反相半制备HPLC：25％乙腈水，C18色谱柱，流速3.0mL/min分离得到1(20mg,tR＝35.1min)，再经HPLC手性柱制备：正己烷:乙醇＝73:27，AD-H色谱柱，流速1.0mL/min，分离得1a(5.0mg,tR＝34.1min)和1b(3.5mg,tR＝37.8min)。进一步，将1a和1b以不同比例混合，可以得到消旋或部分消旋的一系列混合物。B2-4-2(20g)经反相ODS中压柱色谱分离，甲醇-水5:95－60:40梯度洗脱，得到B2-4-2-1-B2-4-2-28。B2-4-2-25(30mg)经反相半制备HPLC分离：8％乙腈水，C18色谱柱，流速3mL/min，分离得到2(12mg,tR＝22.2min)，再经HPLC手性柱制备：正己烷:异丙醇＝7:3，AD-H色谱柱，流速1.5mL/min,220nm，分离得到2a(4.0mg,tR＝22.3)和2b(3.5mg,tR＝37.2min)。进一步，将2a和2b以不同比例混合，可以得到消旋或部分消旋的一系列混合物。
Figure GDA0002219434060000091
化合物1a:白色无定型粉末；[α]20 D+8.6(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(4.57),226(4.55),282(4.01)nm；CD(MeOH)210(Δε+20.7),236(Δε-24.8),285(Δε+5.24)nm；IRνmax 3373,2932,1699,1616,1518,1459,1426,1326,1218,1115,1041,941,910,837,797,735cm-1；1H NMR(CD3OD,600MHz)数据,见表1；13C NMR(CD3OD,150MHz)数据,见表1；(+)-ESIMS m/z 498[M+Na]+；(+)-HR-ESIMS m/z 476.1929[M+H]+(C24H30NO9计算值476.1915).
化合物1b:白色无定型粉末；[α]20 D-35.6(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(4.62),227(4.37),282(3.77)nm；CD(MeOH)210(Δε-13.7),236(Δε+18.4),287(Δε-3.37)nm；IRνmax 3375,2927,1966,1616,1518,1459,1426,1325,1218,1115,1039,941,910,837,797,736cm-1；1H NMR(CD3OD,600MHz)数据,见表1；13C NMR(CD3OD,150MHz)数据，见表1；(+)-ESIMS m/z 498[M+Na]+,(-)-ESIMS m/z 474[M-H]-；(+)-HR-ESIMS m/z 476.1928[M+H]+(C24H30NO9计算值476.1915).
化合物2a:白色无定型粉末；[α]20 D+4.7(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(4.67),227(4.40),283(3.85)nm；CD(MeOH)210(Δε+13.9),235(Δε-29.5),284(Δε+5.78)nm；IRνmax 3359,2971,2932,1701,1617,1518,1459,1427,1326,1220,1157,1115,1072,941,901,838,750cm-1；1H NMR(CD3OD,600MHz)数据,见表1；13C NMR(CD3OD,150MHz)数据，见表1；(+)-ESIMS m/z 498[M+Na]+；(-)-ESIMS m/z 474[M-H]-；(+)-HR-ESIMS m/z476.1922[M+H]+(C24H30NO9计算值476.1915).
化合物2b:白色无定型粉末；[α]20 D-22.4(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(4.51),226(4.38),281(3.79)nm；CD(MeOH)211(Δε-10.8),236(Δε+22.3),284(Δε-4.11)；IRνmax3352,2972,2931,1702，1616,1518,1459,1426,1326,1220,1157,1116,1075,1047,941,880,837,749cm-1；1H NMR(CD3OD,600MHz)数据,见表1；13C NMR(CD3OD,150MHz)数据，见表1；(+)-ESIMS m/z 498[M+Na]+；(-)-ESIMS m/z 474[M-H]-；(+)-HR-ESIMS m/z476.1925[M+H]+(C24H30NO9计算值476.1915).
表1化合物的NMR数据a
Figure GDA0002219434060000101
a化合物1a-2b的NMR数据是在CD3OD测定，1H NMR是600 MHz测定，13C NMR是150 MHz测定。化学位移数据的归属是通过DEPT、1H-1H COSY、gHSQC和gHMBC实验进行的。
1H NMR数据归属中括号内的数值表示偶合常数。
实施例2：抗流感病毒活性评价
(1)流感病毒的制备
甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的制备方法如下：将病毒储液接种于9日龄鸡胚的尿囊腔和羊膜腔，35℃培养鸡胚2-3天后，收获尿囊液和羊水中的病毒，离心后分装，并于-70℃保存。以MDCK细胞(犬肾细胞)为病毒感染细胞，DMEM+0.2％BSA+2μg/mlTPCK为病毒维持液，用病毒维持液将病毒液作10倍梯度稀释，并接种于MDCK细胞，每个梯度设3个复孔，于37℃培养3天后，观察细胞病变(Cytopathic Effects,CPE)，并按照Reed-Muench方法计算病毒半数细胞感染量(50％Tissue Culture Infectious Dose,TCID50)。
(2)化合物抗流感病毒活性的检测
感染前一天，按每孔3×104个细胞的密度将MDCK细胞接种于96孔板，细胞培养基为DMEM+10％FBS(GIBCO)，细胞培养条件为37℃，5％CO2。感染当天，MDCK细胞应长至孔面积的90-100％，吸弃原细胞培养液，用1×PBS溶液(pH7.4)洗细胞2次，用无血清DMEM培养基洗1次。将甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)稀释至100×TCID50，100μl/孔感染细胞，同时设未感染细胞对照组和病毒对照组，于37℃孵育2小时后弃去病毒液，用1×PBS溶液(pH7.4)洗细胞2次，用无血清DMEM培养基洗细胞1次。用病毒维持液稀释化合物，100μl/孔加至检测孔，每组设4个复孔，于37℃，5％CO2培养3天后，采用两种方法检测化合物的抗流感病毒活性。①观察细胞病变(CPE)，并按照Reed-Muench方法计算化合物不同浓度下对流感病毒所致细胞病变的抑制率及化合物的半数抑制浓度(50％InhibitoryConcentration,IC50)。②CPE观察结束后，应用CellTiter-Glo试剂盒(Promega)检测各孔细胞的活力，并计算化合物不同浓度下对流感病毒所致细胞病变的抑制率及IC50。
(3)实验结果
本发明研究了实施例化合物的抗流感病毒活性，结果发现1a和1b以1:1混合得到的外消旋物对流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)具有抑制活性，其IC50为64.7μM，与阳性药利巴韦林(IC50:54.3μM)活性相当(表2)。此结果表明，此类化合物对甲型流感病毒复制有良好的抑制作用，同时手性纯度对活性结果具有明显的影响。
表2化合物对流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)感染活性评价结果
Figure GDA0002219434060000111

Claims (4)

1.一种组合物，其特征在于，所述的组合物选自：
Figure FDA0004141146770000011
。
2.权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述组合物的制备方法如下：
大青叶饮片，用水煎煮提取2～4次，每次煮沸后继续煎煮0.3～1.0小时，过滤，合并提取液，减压回收溶剂得到棕褐色冻状浸膏；将浸膏溶解于0.8～2.0倍量水中，用大孔树脂柱色谱分离，依次用H2O、50％EtOH和95％EtOH分别洗脱，TLC监测，每个流分均洗脱至样品无明显被洗脱下来，洗脱液分别浓缩后得到A、B和C三个洗脱部分；其中，B部位溶解于水中，经MCI gel柱色谱分离，依次用H2O、30％EtOH、50％EtOH、95％EtOH和Me2CO洗脱，TLC监测，每个流分均洗脱至样品无明显被洗脱下来，得到5个组分B1-B5；
组分B2经硅胶柱色谱分离，以乙酸乙酯-甲醇1:0至0:1梯度洗脱，最后用水洗脱，TLC检测，合并相同组分，得到组分B2-1-B2-10；B2-4经硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇13:1洗脱，薄层色谱或液相色谱检测合并相同组分，分离得到B2-4-1-B2-4-6。
B2-4-1经反相ODS中压柱色谱分离，甲醇-水0:100～60:40梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，得到B2-4-1-1-B2-4-1-27；B2-4-1-21经硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇15:1洗脱，薄层色谱或液相色谱检测合并相同组分，分离得到B2-4-1-21-1-B2-4-1-21-10；B2-4-1-21-8经反相半制备HPLC：25％乙腈水，C18色谱柱，流速3.0mL/min，分离得到化合物1：tR＝35.1min，再经HPLC手性柱：正己烷:乙醇＝73:27，AD-H色谱柱，流速1.0mL/min，制备得1a：tR＝34.1min和1b：tR＝37.8min)；进一步，将1a和1b以不同比例混合，可以得到消旋的混合物。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含有效剂量的权利要求1所述的组合物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
4.权利要求1所述的组合物在制备预防、缓解和/或治疗流感病毒药物中的应用。
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