WO2012045198A1

WO2012045198A1 - 板蓝根多糖在制备抗流感病毒的药物中的用途

Info

Publication number: WO2012045198A1
Application number: PCT/CN2010/001581
Authority: WO
Inventors: 杨子峰; 李楚源; 王玉涛; 招穗珊; 钟南山; 林青; 王政; 秦笙; 关文达; 莫自耀; 王德勤
Original assignee: 广州白云山和记黄埔中药有限公司; 呼吸疾病国家重点实验室
Priority date: 2010-10-09
Filing date: 2010-10-09
Publication date: 2012-04-12
Also published as: CN103118686B; US20130259809A1; CN103118686A

Description

板蓝根多糖在制备抗流感病毒的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地，本发明涉及用于治疗流感病毒引起的疾病的药物组合物及其制备方法。本发明还涉及所述药物组合物在制备抗流感病毒的药物、预防制剂、保健食品以及营养制剂的用途。本发明还涉及治疗流感病毒 I起的疾病及与其并发的疾病、障碍或者病症的方法。背景技术

板蓝根（ Ri½¾: ) , 异名，靛青根（《本草便读》），蓝錠根（《分类草药性》），靛根（《中药形性经验鉴别法》），为十字花科植物菘篮和草大青的根；或爵床科植物马蓝的根茎及根；或草大青的千燥根。药性苦，寒，归心、胃经。具有清热解毒，凉血，利咽之功效。众多传统中药中，板蓝根临床治疗流感历史最为悠久。

板蓝根现有的已知成分（包括指示性成分），如吲哚类化合物、靛玉红等都不是真正的抗病毒效应成分。该中药品种的抗病毒作用及效应物^:至今始终未得到清晰、科学的认定。一般生药中板蓝根多糖含量高达 24.87%，有报道具有免疫调节、抗肿瘤等作用，而在现有各种板蓝根制剂生产过程中，多糖组分却一直被作为杂质去除。天然板蓝根多糖的组分含有葡聚糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、乳糖等等。大量报道显示多糖作为一种天然低毒性的药物，具有免疫调节增强、抗肿瘤及抗病毒等广泛的生物活性，尤其是随着对其抗病毒作用的认识深入，天然多糖已成为病毒吸附阻断剂的热点研究对象。有报道显示阴离子多糖往往具有抑制动物病毒的作用，如肝素、葡聚糖硫酸酯、戊聚糖多硫酸酯钠、天然夏枯草多糖等。从天然多糖中寻找抑制病毒的有效成分，尤其是阻断病毒吸附的有效成分是完全可能的，且具有长远的研究及开发价值。流感病毒宿主细胞表面的唾液酸受体是以唾液酸为末端的寡糖，其成分为半乳糖、 Ν-乙酰葡萄糖胺、 Ν-乙酰半乳糖胺。由于板蓝根多糖的单糖种类与唾液酸受体的组分相似，因此板蓝根多糖组分有可能模拟唾液酸受体的构象，与病毒的 RBS相互作用，从而抑制病毒对唾液酸受体的识别、结合。目前已公开的有关开发利用板蓝根的方法中，尚未见利用制备多糖用于抑制多种流感病毒亚型，尤其是抑制流感病毒吸附而阻断感染的报道。目前可用于治疗和预防流感病毒的抗病毒药物主要有神经氨酸酶抑制剂

(NAI) 奥司他韦和扎那米韦；以及 M2离子通道抑制剂金刚烷胺类，包括金刚烷胺和金刚乙胺。但以上两类化合药物有着各种副作用以及局限性，如易产生耐药性等，这也成为临床治疗及新药开发的重要问题。而抗病毒中药具有疗效稳定、毒副作用较小以及不易产生耐药性、不促使病毒变异等优点，而且药源丰富，价格低廉，因此抗病毒中药以其独特的疗效优势，在治疗病毒性疾病中发挥着不可替代的作用，特别是当人类面临病毒性疾病长期而严峻的挑战时，抗病毒中药将拥有巨大的市场和广阔的开发前景。而板蓝根就是具有抗病毒作用的中药之一。

综上所述，目前存在对板蓝根多糖、尤其是板蓝根制剂生产过程中废弃不用的多糖组分是否抑制病毒及其抑制机理进行研究和应用的需要，从而也存在对含板蓝根多糖作为抗病毒活性成分的药物组合物进行研究和应用的需要。发明内容

为了解决上述技术问题，本发明利用板蓝根提取活性多糖，明确有效抗病毒组分及其抗病毒作用机制，为板蓝根的生产工艺提供了有价值参考，也拓宽了板蓝根天然产物的开发利用途径。

为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。

除非另外说明，本文所用的术语"板蓝根多糖"是指板蓝根中的总多糖 , 由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。

除非另外说明，本文所用的术语 "活性多糖"是指具有某种特殊生理活性的多糖化合物，具有双向调节人体生理节奏的功能。具有非常重要与特殊的生理活性，参与生物体的免疫调节，参与生命细胞的各种活动，是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物。

除非另外说明，本文所用的术语"药学上可接受的载体和赋形剂 "是指那些本领域中公知用作丸剂、片剂、胶嚢剂、注射剂等中的填充剂或载体物质的物质。这些物质通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分. 有关可药用载体和赋形剂的汇编可以在《药物赋形剂手册》

( Handbook of Pharmaceutical excipients, 第 2 版，由 A . Wade 和 P . J . Weller 编辑； American Pharmaceutical Association 出版, Washington and The Pharmaceutical Press , London , 1994 ) 等工具书中找到。除非另外说明，本文所用的术语 "治疗有效量 "是指需要产生有效作用的药物的用量可以改变且最终由医务人员决定. 所考虑的因素包括给药途径、制剂的性质、接受者的体重、年龄等一般情况、所治疗疾病的性质以及严重程度等因素。

除非另外说明，本文所用的术语 "活性成分"指的是具有活性作用或具有一定治疗 /预防效果的组分，或者指某一重量的具有活性作用或具有一定治疗 /预防效果的组分。

除非另外说明，本文所用的术语 "剂型 "是指在本领域中是公知的一种剂型，其将药物制剂或组合物制备成为独立的给药单位形式，其中每一单位中包含通常单次或根据实际情况的若千次给药的剂量。本发明的目的在于，提供板蓝根多糖在治疗流感病毒引起的疾病及其并发症的新医药用途。本发明的另一个目的是提供板蓝根多糖在制备用于预防和 /或治疗流感病毒引起的疾病及其并发症的药物中的用途。本发明的又一目的是提供包含板蓝根多糖的用于抗流感病毒的组合物及其用途。本发明的再一目的是提供治疗流感病毒引起的疾病及与其并发的疾病、障碍或者病症的方法。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供板蓝根多糖在预防和 /或治疗流感病毒 I起的疾病及其并发症中的用途，其中，所述板蓝根多糖的分子量为 3000-7000Da。

其中 , 所述板蓝根多糖从板蓝根中提取，优选由包括以下步骤的方法制备：

A.将板蓝根原料加入适当倍数的蒸傭水进行煎煮，将煎煮液浓缩后使之在 50°C为 18-20波美度。

B.将 A步骤获得的浓缩液冷却至 45°C以下，加乙醇使得浓缩液含醇量达

60%或 60%以上，静置 12小时以上，使其沉淀。

C.将醇溶液通过大孔树脂柱，純水洗脱，收集洗脱液。

D.采用本领域已知方法使洗脱液脱去蛋白，将去除蛋白的溶液置于具有适当分子量的透析袋中透析。

E. 取透析袋里和 /或外的溶液，使用旋转蒸发仪蒸发至浓缩液后，利用真空冷冻干燥机将获得的组分冻千至粉末状，获得所述板蓝根粗多糖粉末组分。

优选地，所述流感病毒包括但不限于曱、乙型流感病毒和禽流感病毒；更优选地，所述流感病毒包括但不限于人流感病毒 H1N1亚型（包括新曱型 HlNl流感病毒）、 H3N2亚型、禽流感病毒 H6N2、 H7N3、 H9N2亚型以及 INF B型；

另一方面，本发明提供上述板蓝根多糖在制备用于预防和治疗流感病毒引起的疾病及其并发症的药物中的用途，其中，所述板蓝根多糖的分子量为 3000-7000Da。

优选地，所述流感病毒包括但不限于曱、乙型流感病毒和禽流感病毒；更优选地，所述流感病毒包括但不限于人流感病毒 H1N1亚型（包括新甲型 H1N1流感病毒）、 H3N2亚型，禽流感病毒 H6N2、 H7N3、 H9N2亚型，以及 INF B型；

优选地，所述药物的剂型包括但不限于口服制剂、肠胃外给药制剂、局部和吸入式给药制剂和透皮制剂；

更优选地，所述药物的剂型包括但不限于气雾剂、胶嚢剂、滴耳剂、滴眼剂、眼膏剂、凝胶剂、颗粒剂、注射剂、搽剂、洗剂、滴鼻剂、软膏剂、口服制剂、贴剂、膜剂、散剂、溶液剂、栓剂、糖浆剂、片剂和酊剂等；本发明还提供板蓝根多糖在制备用于预防流感病毒引起的疾病及其并发症的保健食品或营养制剂中的用途，其中，所述板蓝根多糖的分子量为

3000-7000Da;

所述流感病毒包括但不限于甲、乙型流感病毒；更优选地，所述流感病毒包括但不限于人流感病毒 H1N1亚型（包括新曱型 H1N1流感病毒）、 H3N2 亚型，禽流感病毒 H6N2、 H7N3、 H9N2亚型，以及 INF B型。

再一方面，本发明提供一种用于预防和 /或治疗流感病毒 ]起的疾病及其并发症的药物组合物，其中该药物组合物包含板蓝根多糖，并且其中，所述板蓝根多糖的分子量为 3000-7000Da;

优选地，所述药物组合物除包含板蓝根多糖作为活性成分外，还包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂；

优选地，所述药物组合物包括但不限于口服制剂、肠胃外给药制剂、局部和吸入式给药制剂和透皮制剂；

更优选地，所述药物组合物的剂型包括但不限于气雾剂、胶嚢剂、滴耳剂、滴眼剂、眼膏剂、凝胶剂、颗粒剂、注射剂、搽剂、洗剂、滴鼻剂、软膏剂、口服制剂、贴剂、膜剂、散剂、溶液剂、栓剂、糖浆剂、片剂和酊剂等；

优选地，所述药物组合物中的载体或赋形剂包括但不限于稀释剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、基质、芳香剂、甜味剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、包衣剂、成膜材料、溶剂、增溶剂、润湿剂、吸附剂、助滤剂、乳化剂、表面活性剂、助悬剂、增稠剂、增塑剂、螯合剂、透皮促进剂、气雾抛射剂、起泡剂、酸碱调节剂、緩冲剂等。

又一方面，本发明提供板蓝根多糖的制备方法如下：

B.将 A步驟获得的浓缩液冷却至 45。C以下，加乙醇使得浓缩液含醇量达 60%或 60%以上，静置 12小时以上，使其沉淀。

C.将醇溶液通过大孔树脂柱，纯水洗脱，收集洗脱液。

E. 取透析袋里和 /或外的溶液，使用旋转蒸发仪蒸发至浓缩液后，利用真空冷冻干燥机将获得的组分冻干至粉末状，获得具有适当分子量的板蓝根粗多糖粉末组分。

优选地，本发明提供板蓝根多糖的制备方法包括如下步骤：

A.将板蓝根原料加入八倍量蒸馏水进行煎煮，第一次煎煮两小时，得板蓝根煎煮液 A与药渣。将煎煮液 A过滤并倒入另一容器。往药渣加入八倍水继续煎煮 4小时，得板蓝 4艮煎煮液 B。

B.将煎煮液 B过滤并与煎煮液 A滤、液合并，浓缩至板蓝根浓缩液，波美比重计于 50。C温度下测得 18-20波美度。待冷却。

C.待板蓝根浓缩液冷却至 45。C以下，加乙醇使得浓缩液含醇量达 60% , 静置 12小时以上，使其沉淀。

D.将醇溶液通过大孔树脂柱，用純水洗脱，收集洗脱液。

E.取板蓝根粗多糖纯水溶液使用 sevag 法进行脱蛋白：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，利用 sevag试剂（氯仿：正丁醇 5: 1 ) : 板蓝根粗多糖 =5: 1的比例，剧烈振摇 20 到 30 min, 使得蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶物，从而使蛋白质分离出来，然后离心（ 4000rpm minx 1 Omin ) ，除去水层和溶剂层交界处变性蛋白，重复操作 5 次，至中层无明显变性蛋白析出。 F.取水层，放置于不同分子量的透析袋中。装有板蓝根粗多糖的透析袋放置于烧杯中，加入三蒸水，用磁力搅拌仪搅拌 24h。

G.取透析袋里和 /或外的溶液使用旋转蒸发仪蒸发至浓缩液后，利用真空冷冻干燥机将获得的组分冻干至粉末状，获得具有适当分子量的板蓝根粗多糖粉末组分。

本发明还提供所述药物组合物的制备方法，其中所述方法包括采用分子量为 3000-7000Da的板蓝根多糖作为活性成分，按照药用剂型添加辅料，以制剂学常规技术制成制剂。

再一方面，本发明进一步提供治疗流感病毒引起的疾病及其并发症的方法，其特征在于向受试者给予治疗有效量的前述药物组合物或给予治疗有效量的板蓝根多糖，其中，所述板蓝根多糖的分子量为 3000-7000Da。为了更加清楚地说明和阐述本发明的技术方案，以下将对本发明作进一步的描述：

本申请人通过对板蓝根多糖的抗流感病毒作用进行了系统的研究，发现了该多糖具有良好的抗流感病毒作用，主要针对曱乙型流感病毒，其中曱型流感病毒亚型包括了人流感病毒 H1N1亚型（包括新甲型 H1N1流感病毒）、 H3N2亚型，禽流感病毒 H6N2、 H7 3、 H9N2亚型；而对呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒等其他呼吸道病毒则无抗病毒作用。抗病毒机制为通过作用于流感病毒复制周期的早期吸附阶段，从而阻断病毒感染过程。因此本发明提供了板藍根多糖具有抗流感病毒作用的药物用途。

本发明的板蓝根多糖在医药工业上可用作抗病毒制剂及预防剂的原料。可以采用本领域所公知的方法来制备本发明的组合物或抗病毒制剂及预防剂，优选为制剂形式。这类方法包括将活性成分与构成一种或多种辅助组分的载体混合的步骤。这类辅助组分包括那些本领域中常用的组分，诸如填充剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂和湿润剂。

根据本发明的药物和药物组分，可以使用药物制剂技术中已知的手段、设备、方法和工序等进行制备本发明的制剂。例如，对固体制剂如片剂而言，可以将药物的活性成分，也就是板蓝根多糖与药物载体混合均匀后一起压片，举例来说，常规的药片成分，例如玉米面粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸镁、磷酸二钙或药物学上可接受的胶质，以形成一种含有均匀分布的板蓝根多糖的固体组分。均匀分布在这里可理解成活性成分板蓝根多糖在整个组分中均一分布，从而可以很容易地被分成具有同样活性的单位剂型。本发明的药物或药物组分也可以被包衣或混合在另一组分中以提供一种緩释剂型，其中合适的包衣组分包括但不限于聚合酸以及聚合酸与例如虫胶，鲸蜡醇和 /或醋酸纤维素等材料的混合物。

还可以将本发明的药物组合物制成临床可接受的其它剂型，例如颗粒剂，胶嚢，滴丸剂，皮下给药制剂等。这些剂型都可以按照本领域的技术人员所熟知方法进行制备。例如制备颗粒剂时，所需要的药物辅料包括但不限于糊精、淀粉、乳糖、葡萄糖、甘露醇、羧甲基纤维素钠以及可以用来增加药物稳定性的表面活性剂；制备胶嚢剂时，可以采用本领域常见的包封材料；制备滴丸剂时，需要水溶性的辅料，例如聚乙二醇类中的聚乙二醇 6000、聚乙二醇 4000、聚乙二醇 300及皂类辅料；在制备皮下给药制剂如注射剂时，可以根据需要选择适当的 pH调节剂和防腐剂作为辅料。与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：

首先，在现有各种板蓝根制剂生产过程中，多糖组分一直作为杂质去除, 并没有被加以利用。本发明经过研究证明，从板蓝根中提取的板蓝根多糖，特别是分子量在 3000-7000Da的板蓝根多糖具有抗流感病毒的作用，可以用于制备医药制剂或起预防作用的保健品，拓宽了板蓝根我国这一传统中药的开发和应用范围；

其次，在目前已公开的板蓝根的开发利用中，尚未见利用从板蓝根制备的活性多糖用于抑制多种流感病毒亚型，尤其是抑制流感病毒吸附的道。本发明从板蓝根中提取活性多糖后，明确了其有效抗病毒成分及其抗病毒的作用机制，对临床应用板蓝根具有很大的参考价值；

再次，在目前已有的流感治疗和预防方法和制剂中，存在活性物质提取分离的技术缺陷，而本发明利用我国传统中药板蓝根，从中提取活性多糖作为抗流感病毒的活性成分，在临床应用和保健中具有更安全、稳定的优势。附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图 1为板蓝根多糖的分离技术路线及活性筛选；

图 2为板蓝根多糖组分 G2 ( 3500-7000Da ) 对不同流感病毒的血凝抑制作用。实施发明的最佳方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

本实验常用仪器及来源:

仪器型号厂商或公司冷冻真空干燥仪 ALPHA 1-2LD PLUS型德国 CHRIST

微型涡旋混合仪 MSI型德国 IKA

双光束紫外可见分光光度计 TU-1901 北京普析通用仪器有限责任公司透析袋 27mm [MW:3500] 美国

27mm [MW:7000] 代理：上海百赛生物科技有限公司

36m [MW:8000-14000]

高效液相色 i普 Agilent 1200型美国安捷伦科技公司可变波长检测器 VWD-G1314B型美国安捷伦科技公司蒸发光散射检测器 ELSD2000型德国 ALLTECH

ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6xl50nm, 5μπι 美国安捷伦科技公司

SRT SEC-150 300mmx7.8mm 5μηι 150A 美国赛分科技公司色谱柱填料 Sephadex-G50 GE 广州西谱仪器有限公司本实验常用试剂及来源

试剂厂商或公司

5%碳酸氢钠硅胶板、 D ( + ) - Galactose半乳糖、 D ( + ) 德国 Dr.Ehrenstorfer公司 -Xylose木糖、 L ( + ) -Arabinose阿拉伯糖、 D ( + ) -Glucose 广州西谱实验室设备有限公葡萄糖、 L ( + ) -Rhamnose Hydrate鼠李糖司购

D-葡萄糖醛酸天津一方科技有限公司

广州西谱实验室设备有限公司购

葡聚糖 T-3、葡聚糖 Τ-4、葡聚糖 Τ-6、葡聚糖 Τ-7、葡聚美国

糖 Τ-9 南京都莱生物技术有限公司购

葡聚糖 Τ-5、葡聚糖 T-10 瑞典法玛西亚

南京都莱生物技术有限公司本实验常用细胞、病毒及药材来源

细胞、病毒及药材厂商或公司狗肾细胞（MDCK ) 中国科学院典型培养物保

GN023 藏委员会细胞库曱型 H1N1 流感病毒 PR8 株（A/PR/8/34 , mm ) 美国经典培养物收藏中心

VR-1469 ( ATCC )

曱型 H1N1 流感病毒 FM1 林（A /FM1 /47； , mm)

VR-97

曱型 H3N2 流感病毒 Aichi林 ( A/Aichi/2/68 , H3N2 )

VR-0547

新曱型 H1N1 流感病毒株（ A/Guangzhou/GIRD07/09 ,

H1N1 , Genebank No.HM014332.1 )

季节性曱型 H1N1 流感病毒株本室临床分离林

( A/Guangzhou/GIRD02/2009 , H1N1 )

乙型流感病毒 ( B/Guangzhou/GIRD08/09 )

曱型流感病毒 ( A/Duck/Guangdong/2009 , H6N2 ) 华南农业大学兽医学院陈

Η7Ν3 ( A/Duck/Guangdong/1994, H7N3 ) 建新教授惠赠

H9N2 ( A/Chicken/Guangdong/1996, H9N2 )

板蓝根药材 GAP药材产地：安徽阜阳实施例 1 板蓝根多糖粉末的制备

按如下方法制备进行体外抗病毒活性测定的板蓝根多糖粉末：

1、板蓝根水提物的制备

( 1 )取板蓝根 GAP药材 10kg用 8倍水量煎煮 2次，第 1次 2小时，第

2次 4小时，得板蓝根煎煮液。

( 2 )将板蓝根煎煮液过滤，滤液合并，浓缩至 18~20波美度（ 50摄氏度测），得板蓝根浓缩液。

( 3 )将板蓝根浓缩液冷却至 45 V以下，加乙醇至含醇量达 60% , 静置 12小时以上使沉淀。

( 4 )取醇溶液，通过大孔树脂，依次用水、 20%乙醇、 40%乙醇、 60% 乙醇、 80%乙醇、 100%乙醇等不同极性溶剂洗脱，得不同极性溶剂洗脱液。

( 5 )将不同极性溶剂洗脱液釆用细胞病变抑制法（ CPE法 )进行体外抗病毒活性测定，得到活性成分为水洗脱液（S-03 ) 。

( 6 )按上述方法制备的水洗脱液即为板蓝根粗多糖溶液。

2、板蓝根多糖的分离 ( 1 )取多糖百分含量为 70%板蓝根粗多糖溶液使用 sevag 法进行除蛋白，根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，利用 sevag试剂（氯仿：正丁醇 5: 1 ) ：板蓝根粗多糖 =5: 1的比例，剧烈振摇 20 到 30 分钟，使得蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶物，从而使蛋白质分离出来，然后离心

OOOrpm/minxlOmin )，除去水层和溶剂层交界处变性蛋白，重复操作 5 次，至中层无肉眼明显可见的变性蛋白析出。

( 2 )取水层，放置于不同分子量的透析袋中，透析袋的分子量分别为 <3500Da、 3500-7000Da、 7000-14000Da和 >14000Da。将装有板蓝根粗多糖的透析袋放置于烧杯中，加入三蒸水，用磁力搅拌仪搅拌 24小时。

( 3 )取透析袋内、外的溶液各 2mL, 分别加入质量浓度为 0.05g/mL 的 _α—萘酚溶液 l.OmL, 摇匀，再垂直快速加入 5. OmL浓 H₂SO₄, 充分振摇，静置 5min后，观察颜色变化。反应后可观察到在 α-萘酚与浓硫酸之间层出现紫色环，说明此溶液含有糖类。

( 4 )把透析袋内、外的粗多糖溶液，分别使用旋转蒸发仪蒸发至浓缩液后，利用真空冷冻干燥机将四个不同分子量的组分冻千至粉末状，得板蓝根不同分子量的粗多糖粉末，包括粉末 Gl ( <3500Da ) 、 G2 ( 3500-7000Da ) 、 G3 ( 7000-14000Da ) 和 G4 ( >14000Da ) 。

实施例 2 板蓝根多糖不同组分的体外抗病毒活性初筛

将分离纯化得到的四个不同分子量的多糖组分，进行了体外抗病毒活性初筛。

1、实猃材料

同前（细胞、病毒及药材来源）

2、实验方法

以细胞病变抑制法（Cytopathic Effect Reduction Method)在治疗、保护和病毒吸附三种试验策略下进一步确认板蓝根多糖不同组分对流感病毒的抑制作用。

( 1 ) 治疗模式：

在 24 孔细胞培养板内使用含 10%灭活血清（FBS )的 MEM培养基，进行 MDCK细胞培养，待长成 80%融合度；

设定阳性药物（病毒唑）和测定的不同浓度药物即实施例 1的不同分子量的板蓝根多糖；

在 37°C， 5%CO₂环境下进行病毒吸附细胞 2小时；向 24 孔细胞培养板内培养的 MDCK细胞中分別加入阳性药物（病毒唑）、不同浓度 ( 起始浓度 Gl-4: lOmg/mL, 2倍稀释 ) 的测定药物（除阴性对照外） , 然后在 37°C， 5%CO₂环境下培养。

( 2 )保护模式：

在 24 孔细胞培养板内，培养 MDCK细胞（同治疗模式所釆用的细胞及其条件 ) ；

向培养的 MDCK细胞中加入药物（同治疗模式所采用的阳性药物和测定药物及其浓度），孵育 2小时；

进行病毒吸附 2小时（同治疗模式所采用的病毒及实验条件）；

换含 TPCK胰酶的无血清 MEM, 在 37°C、 5%CO₂环境下培养。

( 3 ) 直接作用模式：

病毒与不同浓度的药物 37°C孵育 1小时后接种于细胞中，置于 4°C 孵育 1小时，吸弃上清，换含 TPCK的无血清培养基 37°C培养 8小时。

在不同模式下，培养 24小时和 48小时后在倒置显微镜下观察细胞病变 ( CPE ) 。试验时设阳性药对照、正常细胞对照及病毒对照。当病毒对照出现" ++"则终止实验，细胞出现病变程度按以下 6级标准记录： - 为细胞生长正常，无病变出现；士为细胞病变少于整个单层细胞的 10%; +为细胞病变约占整个单层细胞的 25%; + +为细胞病变约占整个单层细胞的 50%; + + +为细胞病变约占整个单层细胞的 75%: + + + +为细胞病变约占整个单层细胞的 75%以上。用 Reed-Muench法计算半数抑制浓度 (IC₅。)，并以选择指数 SI表示 ( SI=TC₅。/IC₅。， TC₅。为药物半数有毒浓度 ) , SI>2表示低毒高效； SI: 1 ~ 2 表示高毒低效； S 1表示无效。

2、体外抗流感病毒活性初筛结果

以细胞病变抑制法在治疗、保护和病毒吸附三种试验策略下 , 使用流感病毒 A/PR/8/34株，进一步确认板蓝根多糖不同组分 Gl、 G2、 G3、 G4对流感病毒的抑制作用，结果只有 G2具有明显的体外抗病毒作用。样品名称 TC50

IC₅₀ SI IC₅₀ SI IC₅₀ SI

G1 27.5 >10 <1 10 <1 >10 <1

G2 14.5 >10 <1 2.5 5.8 0.625 23.2

G3 6.9 >10 <1 >10 <1 >10 <1

G4 10.0 >10 <1 >10 <1 >10 <1 选择指数（S I ) , S I >2表示低毒有效； S I=1 ~ 2表示高毒低效； S I < 1表示无效。 A: 保护模式； B: 治疗模式； C: 直接模式; 实施例 3 板蓝才艮多糖组分 G2的毒性试验 ( MTT法）

1、实验方法

常规制备 MDCK细胞，接种到 96孔板， 24小时后待细胞长成单层后，弃去培养液，设置毒性试验孔、空白对照孔和正常细胞对照孔，除细胞培养液外，各孔中加入情况如下：

( 1 ) 空白孔：无细包生长，加入 100μΙ7孔 MEM;

( 2 )正常细胞对照孔：正常细胞生长，加入 ΙΟΟμΐν孔 MEM、相同浓度的药物溶解介^: ( MEM ) ；

( 3 )毒性试验孔：正常细胞生长，不同稀释度（2倍稀释）的板蓝根多糖组分 G2 ΙΟΟμΐν孔， 37 °C , 5 % C02继续培养 36-48小时之后，每孔加 20μΙ^ MTT溶液（ 5mg/mL ) ，置 37 °C， 5 % CO₂温箱中继续孵育 4小时。吸弃培养上清液，每孔加 ΙΟΟμ 二曱基亚砜（DMSO), 低速振荡 lOmin, 使结晶物充分融解。选择 570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。按照下列公式计算抑制率：

抑制率 = [ (正常 -空白 ) - (给药 -空白） ]/ (正常 -空白） χ ΐοο % 并用 Reed-Muench法计算 50 %毒性浓度为药物半数有毒浓度 (TC₅。)。

2、药物毒性试验结杲

药物样品对病毒宿主细胞的毒性试验是抗病毒药效评价的前提，利用 MTT法测得受试样品 G2的药物半数有毒浓度 ( TC₅。）为 14.5mg/mL。实施例 4 板蓝根多糖组分 G2的抗流感病毒药效确认

1、实验方法

以空斑减少实验（ Plaque Reduction Assay )在治疗、保护和病毒吸附三种试验策略下进一步确认板蓝根多糖组分 G2对流感病毒的抑制作用。

经过不同模式处理（同上）的细胞单层细胞上加入 1.5mL琼脂糖营养物，内含 0.2%BSA, 0.8%Agar和 0.3%DEAE-Dextran, 置 34°C、 5 % CO2条件下培养 3天，以福尔马林緩冲结晶紫溶液 (0.1 % )固定和染色并计算空班形成单位（PFU/mL ) 。用 Reed-Muench法计算半数抑制浓度 (IC₅。)，并以选择指数 SI表示， SI=TC₅Q/IC₅₀。

2、抗流感病毒药效结果

以空斑减少实验在治疗、保护和病毒吸附三种试验策略下进一步确认板蓝根多糖组分 G2对流感病毒的抑制作用。结果见表 1 : 表 1 板蓝根多糖组分 G2抗流感病毒药效病毒亚型毒林 IC₅₀ 治疗指数（SI )

H1N1 (PR8) 0.39^c 37

H1N1 (FM1) 2.52 ^c 5.75

H1N1 (S-OIV) 4.3 ^c 3.4

H1N1 (Isolate) 1.25 ^c 11.6

H3N2 ( Aichi ) 2.85 ^c 5

H6N2 (GD) 5 ^C 2.9

H7N3 (GD) 3.96 ^c 3.6

H9N2 (GD) 3.91 ^c 3.7

INF B (Isolate) 3.63 ^c 4

A: 保护模式 B: 治疗模式 c: 直接模式

SI>2表示低毒高效； SI: 1 ~ 2表示高毒低效； S 1表示无效实施例 5 板蓝才艮多糖組分 G2的流感病毒血凝抑制实验

1、实验方法

取一定量抗凝鸡血后，用生理盐水洗涤 3次，用无菌生理盐水配成 0.5% 鸡红细胞悬液。于 96孔板中加入系列稀释 (2倍)的 G2样品 ΙΟΟμί, 于每孔中加入 50μ 4个血凝单位（HAU ) 的流感病毒悬液，置 4°C 45min后，加入 50μ /孔的 0.5%鸡红细胞悬液，摇匀置 4°C冰箱 30-60min后观察结果。

2、流感病毒血凝抑制实验结果

实验结果见图 2。

G2在血凝抑制试验中对不同亚型流感病毒抹的血凝素有不同程度的抑制作用。而对同样有血凝素的副流感病毒却无抑制作用，显示了其对流感病毒的特异性作用。实施例 6 板蓝 4艮多糖组分 G2对其他呼吸道病毒（非流感病毒）抑制作歷

1、材料和实验方法

( 1 ) 细胞：

狗肾细胞（MDCK ) 、人喉癌细胞（HEp-2 ) 、猴肾细胞（LLC-MK₂ )分别引自美国经典培养物收藏中心（ ATCC )及中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

( 2 ) 病毒株：

腺病毒（ADV ) 、呼吸道合胞病毒 ( SV )和副流感病毒 3型（PIV-3 ) 购自 ATCC。

( 3 ) 实验方法：

每株病毒以 100TCID₅。的病毒量感染相应宿主细胞，加入倍比（2倍）稀释的板蓝根多糖组分 G2 ΙΟΟμί, 置 5%CO₂, 37°C 48小时后观察结果，细胞出现病变的程度同实施例 1 , 用 Reed-Muench法计算半数抑制浓度 (IC₅₀)。

2、对其他呼吸道病毒（非流感病毒）抑制作用结果

结果见表 2。

表 2: 板蓝根多糖 G2对其他呼吸道病毒抑制作用

病毒类型宿主细胞板蓝根多糖组分 G2

DNA病毒腺病毒（ ADV ) HEp-2 IC₅₀ >10

SI <1 NA病毒呼吸道合胞病毒 HEp-2 IC₅₀ >10

( RSV ) SI <1 副流感病毒 3 IC₅₀ >10

( PIV-3 ) LLC-MK2 SI <1 实验结果表明板蓝根多糖组分 G2抗病毒作用表现为直接作用模式，对多种亚型的流感病毒具有明显的体外抑制作用，且对不同亚型流感病毒的血凝素均有不同程度抑制作用，从而抑制病毒吸附宿主细胞，显示出了良好的体外抗病毒作用。

由于对其他呼吸道病毒（非流感病毒）无抑制作用，显示出了对抑制流感病毒的特异性。

Claims

权利要求

1、板蓝冲艮多糖在预防和 /或治疗流感病毒引起的疾病及其并发症中的用途，其中，所述板蓝根多糖的分子量为 3000-7000Da。

2、如权利要求 1所述的用途，其中，所述板蓝根多糖从板蓝根中提取，优选由包括以下步骤的方法制备：

A.将板蓝根原料加入适当倍数的蒸微水进行煎煮，将煎煮液浓缩后使之在 50°C为 18-20波美度；

B.将 A步骤获得的浓缩液冷却至 45。C以下，加乙醇使得浓缩液含醇量达 60%或 60%以上，静置 12小时以上，使其沉淀；

C.将醇溶液通过大孔树脂柱，纯水洗脱，收集洗脱液；

D.使洗脱液脱去蛋白，将去除蛋白的溶液置于具有适当分子量的透析袋中透析；

E. 取透析袋里和 /或外的溶液，使用旋转蒸发仪蒸发至浓缩液后，利用真空冷冻干燥机将获得的组分冻干至粉末状，获得所述板蓝根粗多糖粉末组分。

3、如权利要求 1所述的用途，其中，所述流感病毒包括但不限于曱、乙型；巟感病毒和禽感病毒；

优选地，所述流感病毒包括但不限于人流感病毒 H1N1亚型（包括新曱型 H1N1流感病毒）、 Η3Ν2亚型、禽流感病毒 Η6Ν2、 Η7 3、 Η9Ν2亚型以及 INF Β型。

4、板蓝根多糖在制备用于预防和 /或治疗流感病毒引起的疾病及其并发症的药物中的用途，其中，所述板蓝根多糖的分子量为 3000-7000Da;

优选地，所述流感病毒包括但不限于曱、乙型流感病毒和禽流感病毒；更优选地，所述流感病毒包括但不限于人流感病毒 H1N1亚型（包括新曱型 H1N1流感病毒）、 H3N2亚型、禽流感病毒 H6N2、 H7N3、 H9N2亚型以及 INF B型。

5、如权利要求 4所述的用途，其中，所述药物的剂型包括但不限于口服制剂、肠胃外给药制剂、局部和吸入式给药制剂和透皮制剂；优选地，所述药物的剂型包括但不限于气雾剂、胶嚢剂、滴耳剂、滴眼剂、眼膏剂、凝胶剂、颗粒剂、注射剂、搽剂、洗剂、滴鼻剂、软膏剂、口服制剂、贴剂、膜剂、散剂、溶液剂、栓剂、糖浆剂、片剂和 ST剂等。

6、板蓝根多糖在制备用于预防流感病毒引起的疾病及其并发症的保健食品或营养制剂中的用途，其中，所述板蓝根多糖的分子量为 3000-7000Da;

优选地，所述流感病毒包括但不限于甲、乙型流感病毒；更优选地，所述流感病毒包括但不限于人流感病毒 H1N1亚型（包括新曱型 H1N1流感病毒）、 H3N2亚型、禽流感病毒 H6N2、 H7N3、 H9N2亚型以及 INF B型。

7、一种用于预防和 /或治疗流感病毒引起的疾病及其并发症的药物组合物，其中，所述药物组合物包含分子量为 3000-7000Da的板蓝根多糖；

优选地，所述流感病毒包括但不限于曱、乙型流感病毒和禽流感病毒；更优选地，所述流感病毒包括但不限于人流感病毒 H1N1亚型（包括新曱型 H1N1流感病毒）、 H3N2亚型，可感染人的禽流感病毒 H6N2、 H7N3、 H9N2 亚型，以及 INF B型。

8、如权利要求 7所述的药物组合物，其中，所述药物组合物除包含板蓝根多糖作为活性成分外，还包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂；

更优选地，所述药物组合物的剂型包括但不限于气雾剂、胶囊剂、滴耳剂、滴眼剂、眼膏剂、凝胶剂、颗粒剂、注射剂、搽剂、洗剂、滴鼻剂、软膏剂、口服制剂、贴剂、膜剂、散剂、溶液剂、栓剂、糖浆剂、片剂和酊剂等；

9、板蓝根多糖的制备方法，所述方法包括如下步骤: A.将板蓝根原料加入适当倍数的蒸傭水进行煎煮，将煎煮液浓缩后使之为 18-20波美度；

B.将 A步驟获得的浓缩液冷却至 45。C以下，加乙醇使得浓缩液含醇量达 60%或 60%以上，静置 12小时以上，使其沉淀；

C.将醇溶液通过大孔树脂柱，純水洗脱，收集洗脱液；

D.采用本领域已知方法使洗脱液脱去蛋白，将去除蛋白的溶液置于具有适当分子量的透析袋中透析；

10、如权利要求 9所述的板蓝根多糖的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：

A.将板蓝根原料加入八倍量蒸熘水进行煎煮，第一次煎煮两小时，得板蓝根煎煮液 A与药渣；将煎煮液 A过滤并倒入另一容器，往药渣加入八倍水继续煎煮 4小时，得板蓝煎煮液 B;

B.将煎煮液 B过滤并与煎煮液 A滤液合并，浓缩至板蓝根浓缩液，波美比重计于 50。C温度下测得 18-20波美度，待冷却；

C.待板蓝根浓缩液冷却至 45。C以下，加乙醇使得浓缩液含醇量达 60%, 静置 12小时以上，使其沉淀；

D.将醇溶液通过大孔树脂柱，用纯水洗脱，收集洗脱液；

E.取板蓝根粗多糖纯水溶液使用 sevag 法进行脱蛋白：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，利用 sevag试剂（氯仿：正丁醇 5: 1 ) ：板蓝根粗多糖 =5: 1的比例，剧烈振摇 20 到 30 分钟，使得蛋白质与氯仿 -正丁醇生成凝胶物，从而使蛋白质分离出来，然后离心（ 4000rpm/minx lOmin ) , 除去水层和溶剂层交界处变性蛋白，重复操作 5 次，至中层无明显变性蛋白析出；

F.取水层，放置于不同分子量的透析袋中，装有板蓝根粗多糖的透析袋放置于烧杯中，加入三蒸水，用磁力搅拌仪搅拌 24h;

G.取透析袋里和 /或外的溶液使用旋转蒸发仪蒸发至浓缩液后，利用真空冷冻干燥机将获得的组分冻千至粉末状，获得具有适当分子量的板蓝根粗多糖粉末组分。

1 1、如权利要求 7所述的药物组合物的制备方法，其中，所述方法包括采用分子量为 3000-7000Da的板蓝根多糖作为活性成分，按照药用剂型添加辅料，以制剂学常规技术制成制剂。

12、治疗流感病毒引起的疾病及其并发症的方法，其中，所述方法包括向受试者给予如权利要求 7所述的治疗有效量的药物组合物或给予治疗有效量的板蓝根多糖；并且所述板蓝根多糖的分子量为 3000-7000Da。