CN105287610B - 连翘酯苷i的应用及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了连翘酯苷Ⅰ在制备抑制合胞病毒药物中的应用，属于植物提取物的应用领域。实验证明连翘酯苷Ⅰ可以有效的抑制合胞病毒。

Description

连翘酯苷I的应用及其制备方法

技术领域

本发明属于药物用途领域，具体涉及植物提取物的应用和制备。

背景技术

连翘酯苷是从木犀科连翘属植物连翘中提取的有效成分，连翘酯苷具有抗微生物、抗病毒、抗氧化等药理作用。之前的研究发现连翘酯苷中几乎全是连翘酯苷A在起作用，但连翘酯苷A很难单独稳定存在，因此习惯上，常把含有连翘酯苷A的连翘酯苷类有效成分称作连翘酯苷。连翘酯苷A的分子式为C₂₉H₃₆O₁₅，结构式如下：

。

连翘酯苷I为棕色无定型粉末，高分辨质谱显示连翘酯苷I分子式为C₂₉H₃₆O₁₅，与连翘酯苷A的分子式相同，并且其IR、IDNMR和MS谱与连翘酯苷A也十分相似，显示连翘酯苷I与连翘酯苷A是同分异构体，不同之处主要表现在咖啡酰基与葡萄糖基的连接位置不同。结构式如下：

连翘酯苷A、连翘酯苷I在水溶液、光照、加热情况下都会发生转化，在甲醇溶液中会缓慢转化，在纯乙酸乙酯溶液中较稳定。

正是因为连翘酯苷I的不稳定，在制备或加工过程中容易发生转化，因此连翘酯苷I制备和保存比较困难，目前对于连翘酯苷I的研究还不多，因为对连翘酯苷I的具体抗菌活性还不了解。

发明内容

本发明目的是提供一种连翘酯苷Ⅰ的应用及其制备方法。

所述连翘酯苷Ⅰ在制备抑制合胞病毒药物中的应用。

为了实现上述技术方案将连翘酯苷Ⅰ制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂。

连翘酯苷Ⅰ的用量为每天22.5-90mg/kg。

一种连翘酯苷Ⅰ的制备方法，是由以下步骤制成的：

（1）、提取：取连翘叶，加10倍量水提取3次，每次1小时，得到连翘叶水提液；

（2）、纯化：将步骤（1）所得连翘叶水提液通过大孔树脂AB-8对连翘酯苷成分进行初步纯化，依次以水、20%、40%乙醇梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液；

（3）、去杂质：取步骤（2）所得20%乙醇洗脱部位，采用硅胶柱去杂质，用乙酸乙酯和无水乙醇溶剂系统进行洗脱，得到各流份，取流份5-7；

（4）、液相色谱单体分离：对步骤（3）所得的流份5-7进行分离，得到目标化合物单体溶液。

作为优选，所述连翘酯苷Ⅰ是由以下步骤制成的：

（1）、提取：取连翘叶，加10倍量水提取3次，每次1小时，得到连翘叶水提液；

（2）、纯化：将步骤（1）所得连翘叶水提液通过大孔树脂AB-8对连翘酯苷成分进行初步纯化，树脂与药材量比为1:0.8，上样速率为1BV/h，依次以水、20%、40%乙醇梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液；

（3）、去杂质：取步骤（2）所得20%乙醇洗脱部位，采用硅胶柱去杂质，用乙酸乙酯和无水乙醇溶剂系统进行洗脱，以连翘酯苷I的含量计算，上样量与硅胶用量为1:150，以乙酸乙酯为流动相洗脱10倍柱体积，一倍柱体积洗脱液为1个流份，得到10个流份，收集流份5-7；

（4）、液相色谱单体分离：对步骤（3）所得的流份5-7进行分离，流动相为甲醇:水=40:60，检测波长330 nm，流速120 mL/min，进样量：2 mL，得到目标化合物单体溶液。

为了选择更佳的制备工艺，做了以下工艺研究：

一、提取工艺研究：

1、连翘叶中连翘酯苷I、A含量测定：

采用《中华人民共和国药典》2010年版一部“连翘”项下含量测定方法对连翘叶中连翘酯苷I、A进行含量测定，测定结果见表1，图谱见图1、2、3。

结果表明，连翘叶中连翘酯苷I和连翘酯苷A的含量分别为0.15%和2.11%，其中连翘酯苷A含量远高于药典中规定的连翘果实含量（0.25%）。

2、连翘叶提取溶剂考察：

采用水、30%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇对连翘叶提取溶剂进行考察。结果发现：水提取液中连翘酯苷A转化为连翘酯苷I和另一连翘酯苷类物质（命名为连翘酯苷H），所以连翘酯苷I的含量最高。30%乙醇提取液中连翘酯苷A略有转化，50%、60%、70%、80%乙醇提取液中连翘酯苷A转化均不明显。结论：以连翘酯苷I提取率为指标，优选水提取。

3、连翘叶提取正交试验：

以连翘酯苷I提取率为指标，采用4因素3水平正交试验法，考察提取时的溶剂用量、提取时间和提取次数。根据正交试验及验证试验结果得到最优工艺参数为：10倍量水提取3次，每次1小时。

4、连翘叶提取放大试验：

根据正交实验选择的工艺对连翘叶进行提取：连翘叶约500 g用水提取，溶媒用量为10倍，回流提取3次，每次1 h。经提取，提取液中连翘酯苷I和连翘酯苷A的含量分别为0.71%和0.94%，提取率分别为48.05%和44.52%。经计算，提取液中含连翘酯苷I 3.68 g，连翘酯苷A 4.87 g。提取液图谱见图4。

二、大孔树脂富集工艺：

连翘酯苷成分的初步纯化多采用大孔树脂，其中AB-8大孔树脂的吸附率及解析率均最高，前期预试验也证明AB-8大孔树脂分离连翘酯苷效果好。

连翘叶水提液直接过AB-8大孔树脂柱，树脂与药材量比为1:0.8（g/g），上样速率为1BV/h，考察不同浓度乙醇的洗脱率，洗脱速率1BV/h，收集不同洗脱部分：水洗液部分、20%乙醇洗脱部分、40%乙醇洗脱部分。各洗脱部分连翘酯苷I、A含量、洗脱率见表2，图谱见图5、6。

由表2可知，20%乙醇洗脱基本上能将大部分目标化合物洗脱出来。因此，后续工艺暂以20%洗脱部分进行化合物分离。由图6可知经大孔树脂初步纯化后，样品中仍有许多杂质，连翘酯苷I和连翘酯苷A的纯度还很低，分别为16%和30%，因此需要再经过硅胶柱分离除去杂质。

三、硅胶柱分离工艺：

硅胶柱分离连翘酯苷成分多用乙酸乙酯和甲醇系统。为降低毒性，我们采用乙酸乙酯和无水乙醇溶剂系统进行洗脱。

连翘酯苷20%乙醇洗脱部位采用硅胶柱色谱分离，以连翘酯苷I的含量计算，上样量与硅胶用量为1:150（g/g）。以乙酸乙酯为流动相洗脱10倍柱体积，一倍柱体积洗脱液为1个流份，经过高效液相色谱检测各流份的纯度，收集只含有连翘酯苷I和连翘酯苷A两种成分的流份。结果表明流份5-7符合要求，编号为样品1、2、3，三个样品中两个峰总含量均在80-90%。样品1、2、3的连翘酯苷I、A含量见表3，图谱见图7-9。

四、制备液相分离：

采用汉邦制备液相色谱对硅胶柱分离到的样品1、2、3进行单体分离。经过色谱条件摸索，最终确定色谱条件如下：流动相为甲醇:水=40:60，检测波长330 nm，流速120 mL/min，进样量：2 mL。制备过程采取套针循环进样，如图10所示：

经制备可得到连翘酯苷I和连翘酯苷A的单体溶液。

为了研究连翘酯苷I的抗病毒作用，作了如下研究：

第一部分

一、研究内容

评价药物体外安全性

测试连翘的2个样品（A为纯度90%的连翘酯苷I，B为纯度90%的连翘酯苷I、连翘酯苷A、连翘酯苷H的混合物，下面的样品A、B均同）。以MTT法评价受试样品体外对细胞的毒性，确定药物的安全浓度范围。采用Reed-Muench法计算药物半数细胞毒性浓度(TC₅₀)。

确认药物体外抗多种呼吸道病毒的活性

以多种呼吸道病毒作为研究对象（具体病毒种类见表4，均为呼吸疾病国家重点实验室保存的标准毒株，或已作鉴定分型的临床分离株），按照病毒类别进行分组筛选，评价送试样品对呼吸道病毒的抑制作用，用Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

经广谱筛选有效的抗病毒药物，进一步明确体外抗病毒环节和特点

利用直接、治疗及预防3种策略，以及单个感染复制周期模型，以细胞病变法，评价对经体外药效筛选有效毒株的抑制作用环节（吸附，脱壳或核释放等）。

第二部分 实际完成情况

第一节 连翘抗病毒活性的筛选

一、材料与方法

1、实验材料

1.1药材

供试样品A、样品B和样品C，(C为纯度90%连翘酯苷A)均是连翘中分离得到的化合物和组分，由河北以岭药业研究院提供，样品A、样品B和样品C的主要成分及含量均大于90%，编号：F-R-001. 阳性对照药物利巴韦林购自广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，批号：L20120325。

1.2仪器

BS 224S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司

HERAcell150i恒温CO₂培养箱，美国Thermo公司

BHC-1300IIA/B3二级生物安全柜，苏州净化设备有限公司

LeicaDM3000倒置显微镜，徕卡公司

LeicaDB000B生物显微镜，徕卡公司

AL201电子天平，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司

MultiScanMK3型酶标仪，美国thermo公司

SIGMAJ-26冷冻离心机，德国SIGMA公司

1.3实验试剂

MEM培养基、胎牛血清（澳洲产地）均购自Gibco公司

青霉素/链霉素溶液(10000IU/mL)购自中国医学科学院生物医学工程研究所

Trypsin胰蛋白酶，TPCK胰酶，PBS，MTT试剂盒均购自美国Sigma公司

1.4细胞

狗肾细胞（Madin-Darby Canine Kidney，MDCK）引自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；人喉癌细胞（human laryngeal carcinoma，HEp-2）；猴肾细胞（Rhesusmonkey kidney cell，LLc-MK2）；非洲绿猴肾细胞(Verda Reno,Vero）均引自美国经典培养物收藏中心（American Tissue Culture Collection，ATCC）。

1.5病毒株

甲1型流感病毒PR8株（A/PR/8/34，H1N1）；甲1型流感病毒FM1株（A/FM/1/47，H1N1)；甲3型流感病毒Aichi株（A/Aichi/2/68，H3N2）均购自ATCC。甲1型季节性流感病毒株（A/Guangzhou/GIRD02/2009，H1N1）、乙型流感病毒（B/Guangzhou/GIRD08/09）、副流感病毒1、2、3型（PIV1、2、3）为本室临床分离株；甲6、7、9型禽流感病毒（A/Duck/Guangdong/2009，H6N2，A/Duck/Guangdong/1994,H7N3，A/Chicken/Guangdong/1996，H9N2）由华南农业大学兽医学院陈教授惠赠，上述病毒均以9～11日龄鸡胚扩增，收获尿囊液，测定其相应血凝效价。以Reed-Muench(Reed Lj and H, 1938)法测定其半数感染量（TCID₅₀）作为病毒滴度。

其它呼吸道病毒：呼吸道合胞病毒（RSV，long株）购自ATCC；肠道病毒71（EV71）、单纯疱疹病毒（HSV-1）、 腺病毒（ADV）及偏肺病毒均为本室临床分离株。以Reed-Muench法测定其半数感染量（TCID₅₀）作为病毒滴度，用于细胞病变抑制法。

2、实验方法

2.1药物毒性试验（MTT）

按2×10⁵ cell/ml的细胞浓度将HEp-2细胞接种到96孔板，待细胞长成单层后（约24h），弃去培养液，并用1×PBS洗涤细胞2次，然后加入不同稀释度(2倍稀释)的药物100µL/孔，空白对照和正常细胞对照加入100µL/孔MEM，37℃，5％CO₂继续培养2～5天，随后每孔加MTT溶液（5mg/mL）20µL，置37℃，5％CO₂温箱中继续孵育4小时。吸弃上清液，每孔加100µL二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。按照下列公式计算抑制率，并用Reed-Muench法计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(TC₅₀)。计算抑制率＝[（正常组平均OD值－空白组平均OD值）－（给药组的平均OD值－空白组的平均OD值）]/（正常组的平均OD值－空白组的平均OD值）×100％

2.2病毒滴度测定

病毒用无血清培养基10倍稀释为10^-1~10^-9九个梯度。待宿主细胞长至单层检测相应的病毒，弃培养基，用1×PBS洗涤细胞2次，然后加入不同稀释度的病毒稀释液，100μl/孔，每个滴度4个重复，同时设置细胞对照组，置37℃，5％CO₂培养箱中孵育2小时后，弃去上清液，加入病毒维持培养液，37℃，5％CO₂培养2-5天，观察并记录细胞病变（CPE）。细胞出现病变程度按以下6级标准记录，具体见表5。

用0.5%鸡红细胞50µL，加细胞上清50µL，于微量凹板中，30分钟后观察结果，同时设生理盐水对照4孔。血凝结果分别以+，++，+++，++++，-表示：

++++：一层红血球均铺于孔底者；

+++：基本同上，但边缘不整齐有下垂趋向者；

++：血球于孔底形成一个环状，四周有小凝集块者；

+：血球于孔底形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝集块者；

-：血球于孔底形成一个小团，光滑圆润，边缘齐整者。

用Reed-Muench法计算50％组织细胞半数感染量（TCID₅₀）。

2.3药物体外对多种流感病毒亚型的活性确认

以细胞病变抑制法评价连翘样品（A、B）抗流感病毒活性。待测药物溶解于MEM培养基中，配成最大无毒浓度，连续倍比（2倍）稀释成七个浓度。根据细胞生长特性，将MDCK、LLc-MK2细胞稀释到合适浓度分别接种到96孔板，待细胞长至单层（约24h），弃去培养液，以1×PBS洗涤细胞2次。加入含100TCID₅₀的病毒稀释液，加入量为100µL/孔，每个浓度4孔，37℃,5%CO₂培养箱中孵育2小时后，弃去病毒液，加入含待测药物成分的培养基，34℃,5%CO₂培养箱中孵育48小时，观察并记录细胞病变，用Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

2.4药物体外对多种呼吸道病毒（非流感）的活性确认

以细胞病变抑制法对连翘样品（A、B）进行抗病毒活性检测。待测药物溶解于MEM培养基中，配成最大无毒浓度，连续倍比稀释成八个浓度。根据HEp-2、Vero、Vero-E6细胞各自的生长特性，按合适浓度接种到96孔板上培养，待细胞长成单层后（约24h），弃去培养液，以1×PBS洗涤细胞2次。加入含100TCID₅₀的病毒稀释液，加入量为100µL/孔，每个浓度4孔，37℃,5%CO₂培养箱中孵育2小时后，弃去病毒液，加入含待测药物成分的培养基，34℃,5%CO₂培养箱中培养2~5天，观察并记录细胞病变，细胞出现病变的程度同前，用Reed-Muench法计算半数抑制浓度（IC₅₀）。

第二节 连翘提取物及其单体体外抗呼吸道合胞病毒作用

一、实验材料与方法1.2.1

1.1实验材料 同第一节

1.2实验方法

1.2.1连翘体外对呼吸道合胞病毒（RSV）的抑制作用

以细胞病变法在直接、治疗及预防三种策略确认连翘A、B、C样品对呼吸道合胞病毒（RSV）的抑制作用。

（1）. 直接作用模式： 采用100TCID₅₀的RSV与不同浓度的药物同时加入HEp-2细胞，100μl/孔，设立药物组、正常组和病毒组对照，置35℃，5%CO₂继续培养2~5天。具体策略如下：

（2）. 治疗模式：采用100TCID₅₀的RSV病毒吸附96孔HEp-2细胞2小时，吸弃上清液，加入不同浓度药物（除阴、阳性对照外）100μl/孔，设立药物组、正常组和病毒组对照，置35℃、5%CO₂环境下培养2~5天。

（3）. 预防模式:不同浓度药物加入96孔HEp-2细胞内孵育2小时，吸弃上清液，加入100TCID₅₀的RSV病毒吸附2小时，吸弃上清液，换含2%FBS的维持培养基，100μl /孔，设立药物组、正常组合病毒组对照，置35℃、5%CO₂环境下培养2~5天。

1.3 数据处理

实验数据以

表示，SPPS12.0软件进行统计。

二、结果分析与讨论

1．体外抗流感病毒的活性

1.1样品A和样品B的细胞毒性作用

药物样品对病毒宿主细胞的毒性实验是抗病毒药效评2价的前提，利用MTT法测得连翘样品A和B对MDCK、HEp-2、LLc-MK2、Vero、Vero-E6细胞的药物半数有毒浓度（TC₅₀），见表6，本研究中的药效实验均在最大无毒浓度下进行。

1.2体外对多种流感病毒亚型的抑制作用

在治疗模式中，样品A和样品B对多种流感亚型（甲1型：FM1、PR8、09年新甲流、以及季流H3N2(Aichi株)、低致病性禽流感H6N2、H7N3及H9N2;乙型流感），均未显示出其抗病毒的作用，见表7。

1.3体外对非流感病毒的抑制作用

进一步通过CPE法探讨样品A和样品B对其他呼吸道病毒的抑制作用。实验结果表明样品A和样品B对呼吸道合胞病毒具有较显著的抑制作用，而对其他呼吸道病毒均未显示出抗病毒作用（表8）。

注：结果均为两次独立实验。

2、连翘酯苷Ⅰ体外对呼吸道合胞病毒的抗病毒活性

在预防模式、治疗模式以及直接模式三种实验策略下确认样品A和样品B对呼吸道合胞病毒的作用。结果（表9）显示连翘样品A和样品B直接和治疗两种模式对呼吸道合胞病毒具有较好的抗病毒活性，同时预防模式也显示了一定的抗病毒作用。

3、连翘酯苷Ⅰ与连翘酯苷A体外对呼吸道合胞病毒的抗病毒活性

在预防模式、治疗模式以及直接模式三种实验策略下确认样品A和样

品B对呼吸道合胞病毒的作用。结果（表10）显示连翘酯苷Ⅰ样品A和样品B直接和治疗两种模式对呼吸道合胞病毒具有较好的抗病毒活性，且优于连翘酯苷A

三、小结

经CPE法筛查证实样品Ａ和样品Ｂ仅对呼吸道合胞病毒（RSV）具有抑制作用。利用直接、治疗和预防三种策略，以细胞病变抑制法，发现两样品在直接、治疗和预防模式均有不同程度的抑制作用，直接模式的IC₅₀分别为0.79μg/ml、1.25μg/ml；治疗模式的IC₅₀的平均值分别为2.4μg/ml±0.188、2.57±0.29μg/ml；预防模式IC₅₀分别为125μg/ml、210μg/ml，而对其他多种呼吸道病毒，包括甲、乙型流感病毒、腺病毒、肠道病毒71、Ⅰ型单纯疱疹病毒、副流感病毒、均未发现有抑制作用。

通过上述实验，证明连翘酯苷Ⅰ可以有效的抑制合胞病毒，而且效果优于连翘酯苷A，也优于连翘酯苷Ⅰ、连翘酯苷A、连翘酯苷H的混合物。

附图说明

图1是连翘酯苷I对照品色谱图；

图2是连翘酯苷A对照品色谱图；

图3是连翘叶药材色谱图；

图4是连翘叶水提取液色谱图（13min为连翘酯苷I，29min为连翘酯苷H，33min为连翘酯苷A）；

图5是水洗液色谱图；

图6是20%乙醇洗脱液色谱图；

图7是流份5色谱图（13min连翘酯苷I，32min连翘酯苷A，）；

图8是流份6色谱图（13min连翘酯苷I，32min连翘酯苷A，）；

图9是流份7色谱图（13min连翘酯苷I，32min连翘酯苷A，）；

图10是制备液相色谱图（第一个峰为连翘酯苷I，第二个峰为连翘酯苷A，每两个峰为一个循环制备过程，最后一个峰为洗柱峰）。

具体实施方式

实施例1：

所述连翘酯苷Ⅰ是由以下步骤制成的：

（1）、提取：称取连翘叶500g，加10倍量水回流提取3次，每次1小时，得到连翘叶水提液；

（2）、纯化：将步骤（1）所得连翘叶水提液通过大孔树脂AB-8对连翘酯苷成分进行初步纯化，树脂与药材量比为1:0.8（g/g），上样速率为1BV/h，依次以水、20%、40%乙醇梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液；

（3）、去杂质：取步骤（2）所得20%乙醇洗脱部位，采用硅胶柱去杂质，用乙酸乙酯和无水乙醇溶剂系统进行洗脱，以连翘酯苷I的含量计算，上样量与硅胶用量为1:150（g/g），以乙酸乙酯为流动相洗脱10倍柱体积，一倍柱体积洗脱液为1个流份，得到10个流份，收集流份5-7；

（4）、液相色谱单体分离：对步骤（3）所得的流份5-7进行分离，流动相为甲醇:水=40:60，检测波长330 nm，流速120 mL/min，进样量：2 mL，得到目标化合物单体溶液。然后浓缩干燥得到连翘酯苷Ⅰ。

实施例2：片剂制备

称取连翘酯苷Ⅰ100g，加入微晶纤维素100g，乳糖200g，充分混匀，加入交联羧甲基纤维素钠，混合均匀，用24目筛制粒，70℃烘干，整粒，加入1%硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片片剂。

实施例3：胶囊剂制备

称取连翘酯苷Ⅰ100g，加入微晶纤维素50g，加入交联聚维酮10g，乳糖130g，充分混匀，加入5%聚维酮K30水溶液30ml，再加水15ml，充分搅拌，混合均匀，用24目筛制粒，70℃烘干，整粒，加入1%硬脂酸镁，混匀，装入胶囊得1000粒胶囊。

实施例4：颗粒剂制备

称取100g连翘酯苷Ⅰ原料，加入蔗糖500g，糊精2500g，充分混匀，加水180ml，充分搅拌，混合均匀，用24目筛制粒，70℃烘干，整粒，分装成500袋。

实施例5：滴丸剂制备

称取1000g聚乙醇6000，70℃水浴熔化，加入1000g连翘酯苷Ⅰ原料，边加边搅拌，加完充分搅拌，滴制成丸，制成1000粒滴丸。

Claims (5)

1.连翘酯苷Ⅰ作为唯一活性成分在制备抑制合胞病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于连翘酯苷Ⅰ的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于连翘酯苷Ⅰ的用量为每天22.5-90mg/kg。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于连翘酯苷Ⅰ是由以下步骤制成的：

（1）、提取：取连翘叶，加10倍量水提取3次，每次1小时，得到连翘叶水提液；

（2）、纯化：将步骤（1）所得连翘叶水提液通过大孔树脂AB-8对连翘酯苷成分进行初步纯化，依次以水、20%、40%乙醇梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液；

（3）、去杂质：取步骤（2）所得20%乙醇洗脱部位，采用硅胶柱去杂质，用乙酸乙酯和无水乙醇溶剂系统进行洗脱，得到各流份，取流份5-7；

（4）、液相色谱单体分离：对步骤（3）所得的流份5-7进行分离，得到目标化合物单体溶液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述连翘酯苷Ⅰ是由以下步骤制成的：

（1）、提取：取连翘叶，加10倍量水提取3次，每次1小时，得到连翘叶水提液；

（2）、纯化：将步骤（1）所得连翘叶水提液通过大孔树脂AB-8对连翘酯苷成分进行初步纯化，树脂与药材量比为1:0.8，上样速率为1BV/h，依次以水、20%、40%乙醇梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液；

（3）、去杂质：取步骤（2）所得20%乙醇洗脱部位，采用硅胶柱去杂质，用乙酸乙酯和无水乙醇溶剂系统进行洗脱，以连翘酯苷I的含量计算，上样量与硅胶用量为1:150，以乙酸乙酯为流动相洗脱10倍柱体积，一倍柱体积洗脱液为1个流份，得到10个流份，收集流份5-7；

（4）、液相色谱单体分离：对步骤（3）所得的流份5-7进行分离，流动相为甲醇:水=40:60，检测波长330 nm，流速120 mL/min，进样量：2 mL，得到目标化合物单体溶液。

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