CN103193836A - 一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，是从连翘花中分离纯化单体化合物连翘酯苷I和连翘酯苷A的方法；本发明采用体积分数为95%的乙醇溶液回流提取制备连翘花粗提取物，采用聚酰胺树脂柱先以水洗脱去除水溶性杂质，再用体积分数为30%的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得连翘花聚酰胺粗分离物，再采用高速逆流色谱仪对粗分离物进行分离纯化，得到纯度高于94%的连翘酯苷I和连翘酯苷A。本发明采用了合理的溶剂系统，控制了高速逆流色谱仪的主机转速、流动相流速和检测器波长等条件，用本发明方法可得到纯度较高的连翘酯苷I和连翘酯苷A。该分离条件容易控制，分离时间短，分离得到的化合物纯度高。

Description

一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及从连翘花中分离纯化单体化合物连翘酯苷I和连翘酯苷A的方法。

背景技术

连翘[(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)]，别名连壳、黄花条、黄链条花，是木犀科连翘属植物，秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”，果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”。具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功效（中国药典.一部.2010）。连翘的主要化学成分以连翘酯苷为代表的苯乙醇苷类物质和以连翘苷为代表的木脂素类物质（王曙宾，等.中草药，2011，41（6）：909；李卫建，等.中草药.2006，37（6）：921；夏伯侯，等.中国中药杂志.2010，35（16）：2110）。连翘为落叶灌木，在我国分布很广，是我国典型的药用和绿化树种之一。连翘是初春最抢眼的植物，每年三月份开花，满枝金黄，艳丽可爱。连翘花颜色鲜黄、花期较长、花量大，市场上常做为花茶饮用，气味清新优雅，用于风热感冒所引发的咽喉肿痛等症（娄玉霞，等.中国卫生检验杂志.2008，18（9）：1765）。目前对连翘不同部位的研究主要集中在叶子与果实上，而对连翘花的研究较少。

目前国内外多采用柱层析法等传统方法分离纯化连翘中的连翘酯苷I和连翘酯苷A等单体化合物（Wang,等.Molecules.2009，14（3）：1324；邹琼宇，等.中国中药杂志.2012，37（1）：57），这类方法多使用大量的氯仿、甲醇等有毒的有机溶剂，而且柱层析法的不足之处是分离周期长，回收率低，分离效果不理想。另外，由于连翘花中各主要成分极性极为相近，通常无法在较短时间内使目标化合物得到有效的分离，需借助多次重复分离而造成目标化合物损失较多。

20世纪80年代，美国国立卫生院Yiochiro Ito博士发明了不同于传统的液相色谱法的新型液－液色谱分离方法—高速逆流色谱法(high speed counter-current chromatography,HSCCC)，简称逆流色谱法（Ito Y.Journal of Chromatography A，1981，214（1）：122）。逆流色谱是一种基于样品在两个互不混溶的溶剂之间分配作用的分离技术，是分离科学技术的一个新分支。逆流色谱可以在短时间内对目标化合物实现高效分离，可以避免分离样品与固体载体表面产生化学反应而变性和可逆吸附等缺点，而且对样品的预处理要求较低，适用于粗提取物的分离（Ito Y.Journal of Chromatography A，1991，538（1）：3）。近十年来，HSCCC在植物天然活性成分的分离纯化中的得到了广泛的运用，无论是一次制备的量，还是分离纯度均得到较大幅度的提高（Sutherland IA.Journal of Chromatography A，2007，1151（1-2）：6）。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了连翘花中单体化合物的分离纯化方法，目的在于提供一种快速、高效分离连翘花中单体化合物连翘酯苷I和连翘酯苷A的新方法，即使用高速逆流色谱法从连翘花中分离制备单体化合物的方法。成品中采用高效液相色谱法测定连翘酯苷I和连翘酯苷A的纯度均达到94％以上。该方法分离条件温和，分离效率高，且分离时间短，能得到高纯度的连翘酯苷I和连翘酯苷A。

本发明提供一种从连翘花中分离纯化单体化合物连翘酯苷I和连翘酯苷A的方法，包括如下步骤：

（1）制备连翘花提取物：

取连翘花药材，样品经粉碎机粉碎,过40目筛，得干燥的连翘花粉末；以连翘花粉末与乙醇质量比1:10的比例加入体积分数为95%的乙醇溶液中，回流提取2.0-3.0h，过滤；将滤渣重复上述提取步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得连翘花提取物。

（2）提取物的进一步纯化：

将上述步骤制得的连翘花提取物加适量水混悬后，过聚酰胺树脂柱，使聚酰胺对提取液中的物质充分吸附：先用水溶液进行充分洗脱除去水溶性杂质，再用体积分数为30％的乙醇溶液洗脱，收集30％乙醇的洗脱液，减压浓缩干燥，即得聚酰胺粗分离物。

（3）高速逆流色谱分离连翘酯苷I和连翘酯苷A：

a.溶剂系统和样品溶液的配制

在分液漏斗中配制乙酸乙酯：乙醇：乙酸：水（4：1：0.25：6，v/v）两相溶剂体系,充分振摇后在室温下静置过夜。使用前分别取分液漏斗中的上相作为HSCCC的固定相，下相作为HSCCC的流动相，超声脱气30-60min。取步骤（2）中得到的聚酰胺粗分离物，用相同体积的上相和下相溶解样品，备用。

b.高速逆流色谱分离制备过程

首先将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速850rpm，再以1.5mL/min流速泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入a中的样品溶液。在280nm波长下检测，记录色谱图，根据色谱图收集流分Ⅰ和Ⅱ。

c.连翘酯苷I和连翘酯苷A的分析和鉴定

使用高效液相色谱对b中分离得到的流分Ⅰ和Ⅱ进行纯度检测：应用C18色谱柱，甲醇-水（40：60，v/v）为流动相等度洗脱，检测波长280nm，测得流分Ⅰ和Ⅱ均为单一峰，纯度均高于94%；使用¹H NMR和¹³C NMR对化合物Ⅰ和Ⅱ进行结构鉴定，确定化合物Ⅰ为连翘酯苷I，化合物Ⅱ为连翘酯苷A。

步骤（2）中所述的聚酰胺树脂柱为PA6或PA66型聚酰胺树脂。

本发明采用了合理的溶剂系统，控制了高速逆流色谱仪的主机转速、流动相流速和检测器波长等条件，用本发明方法可得到纯度较高的连翘酯苷I和连翘酯苷A。该分离条件容易控制，分离时间短，分离得到的化合物纯度高。

具体实施方式

本发明中未限制体积分数的乙酸、乙醇、甲醇体积分数均为100%，即纯溶剂。

实施例1

（1）制备连翘花提取物：

取连翘花药材，样品经粉碎机粉碎,过40目筛；乙醇称取干燥的连翘花粉末200g，加入10倍重量的体积分数为95%的乙醇中，回流提取2.5h，过滤；将滤渣重复上述步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得连翘花提取物。

（2）提取物的进一步纯化：

将上述步骤制得的连翘花提取物加适量水混悬后，过聚酰胺树脂柱，使聚酰胺对提取液中的物质充分吸附：先用水溶液进行充分洗脱除去水溶性杂质，再用体积分数为30％的乙醇溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，即得聚酰胺粗分离物6g。

（3）高速逆流色谱分离连翘酯苷I和连翘酯苷A：

a.溶剂系统和样品溶液的配制

在分液漏斗中配制乙酸乙酯：乙醇：乙酸：水（4：1：0.25：6，v/v）两相溶剂体系,充分振摇后在室温下静置过夜。使用前分别取分液漏斗中的上相（作为HSCCC的固定相）和下相（作为HSCCC的流动相），超声脱气30min。取步骤（2）中聚酰胺粗分离物，用1mL上相和1mL下相溶解样品，备用。

b.高速逆流色谱分离制备过程

用最大流速（9.99mL/min）将溶剂系统的上相泵入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速850rpm，再以1.5mL/min流速泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入a中的样品溶液，同时在出液端接紫外检测器，在280nm波长处对流出液连续检测，记录色谱图，根据色谱图收集流分Ⅰ和Ⅱ。

c.连翘酯苷I和连翘酯苷A的分析和鉴定

使用高效液相色谱仪对b中分离得到的流分Ⅰ和Ⅱ进行纯度检测：应用Symmetry C18色谱柱（250mm×4.6mm i.d.,5μm），甲醇-水（40：60，v/v）为流动相等度洗脱，检测波长为280nm，测定温度为室温。测得流分Ⅰ和Ⅱ均为单一峰，纯度分别为94.3％和98.1％。将流分Ⅰ和Ⅱ挥干，得化合物Ⅰ褐色粉末7.9mg，化合物Ⅱ褐色粉末35.0mg。使用¹H NMR和¹³CNMR对单体化合物Ⅰ和Ⅱ进行结构鉴定并与文献数据对比，确定化合物Ⅰ为连翘酯苷I，化合物Ⅱ为连翘酯苷A。

Claims (9)

1.一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤： 

（1）取连翘花药材，样品经粉碎机粉碎,过40目筛，得干燥的连翘花粉末；以连翘花粉末与乙醇质量比1:10加入体积分数为95%的乙醇，回流提取2.0-3.0h，过滤；将滤渣重复上述步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得连翘花提取物； 

（2）将上述步骤制得的连翘花提取物加适量水混悬后，过PA6或PA66型聚酰胺树脂柱，使聚酰胺树脂对提取液中的物质充分吸附：先用水溶液进行充分洗脱除去水溶性杂质，再用体积分数为30％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，即得聚酰胺粗分离物； 

（3）在分液漏斗中配制两相溶剂系统,该溶剂系统由乙酸乙酯、乙醇、乙酸和水组成，其中乙酸乙酯：乙醇：乙酸：水为4：1：0.25：6v/v，配好后充分振摇，在室温下静置过夜；使用前分别取分液漏斗中的上相作为HSCCC的固定相，下相作为HSCCC的流动相，超声脱气30-60min；取步骤（2）中的聚酰胺粗分离物，用相同体积的上相和下相溶解样品； 

（4）将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速为850rpm，然后以1.5mL/min的流速泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入（3）中的样品溶液；在280nm波长下检测，记录色谱图，根据色谱图收集得到单体化合物连翘酯苷I和连翘酯苷A。 

2.根据权利要求1所述的一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于步骤（1）中所述连翘花粉末与加入的乙醇重量比为1：10。 

3.根据权利要求1所述的一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于步骤（1）中回流提取2.0-3.0h。 

4.根据权利要求1所述的一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于步骤（2）中使用体积分数为30％乙醇溶液洗脱。 

5.根据权利要求1所述的一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于步骤（2）中所述的聚酰胺树脂为PA6，PA66型聚酰胺树脂。 

6.根据权利要求1所述的一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于步骤（3）中所述溶剂系统由乙酸乙酯、乙醇、乙酸、水组成，其中乙酸乙酯：乙醇：乙酸：水为4：1：0.25：6，v/v。

7.根据权利要求1所述的一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于步骤（3）中超声脱气30-60min。

8.根据权利要求1所述的一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于步骤（4）中所述高速逆流色谱仪的主机转速为850rpm。

9.根据权利要求1所述的一种连翘花中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于步骤（4）中所述高速逆流色谱仪的流动相流速为1.5mL/min。