CN113368156A - 一种连翘叶活性成分及其在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属中药活性成分深加工技术领域，提供一种连翘叶活性成分及其在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用。连翘叶与纯净水按照料液比为1:10混合回流提取，得到连翘叶水提物，然后将连翘叶水提物进行大孔吸附树脂洗脱，以乙醇‑水为洗脱剂，20%乙醇洗脱物即为连翘叶活性成分。所得连翘叶水提物抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活力；减慢Aβ25‑35的聚集；改善细胞活力；抗炎和抗氧化。用Ellman法对连翘叶水提物和洗脱物进行抑酶活性部位的初步筛选，筛选出胆碱酯酶活性最好的部位是20%乙醇洗脱物。相同浓度下连翘叶20%乙醇洗脱物的抑制乙酰胆碱酯酶AChE、减慢Aβ25‑35聚集、改善细胞活力、抗炎和抗氧化能力强于连翘叶水提物。

Description

一种连翘叶活性成分及其在制备抗阿尔茨海默症药物中的 应用
技术领域
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及一种连翘叶活性成分及其在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用。
背景技术
连翘叶为木犀科植物连翘（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）的叶子，呈锯齿状椭圆形。民间有将连翘嫩叶经蒸、煮、炒、晒等方法制成保健茶饮用的习惯。现代典籍《中药大辞典》中记载“连翘茎叶，味苦，性寒，功能主治为清热解毒，主治心肺积热”。2017年山西省卫计委和山西省食药监管局发布公告将连翘叶列入地方特色食品资源，并颁布其食品安全地方标准（DBS14/001-2017）。2020年连翘叶被列入山西药茶名录。连翘叶的化学成分与连翘果实非常相似，主要有苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类等，但含量不同，有些成分的含量比常作为药材原料入药的连翘果实高的多。
阿尔茨海默症（AD），俗称老年痴呆症，是一种以记忆损伤和认知障碍为主要症状的慢性神经退行性疾病。关于其发病机理的学说主要包括：Aβ（β-amyloid）级联学说、胆碱酯酶体系异常学说、氧化应激学说、神经炎症学说、微管tau蛋白异常学说等。胆碱酯酶能够水解乙酰胆碱，使其含量降低，引起AD症，因此抑制胆碱碱酶活性是治疗AD症的重要途径之一。Aβ在脑内聚集而形成斑块是AD症的病理学特征之一。此外，过量沉积的Aβ也可诱发神经产生炎症和氧化应激反应，进而刺激Aβ前体的合成并诱导和加剧Aβ的累积。最终，这些过程一起导致了细胞凋亡、学习记忆和认知损伤。多靶点、多途径是新的AD症治疗策略。
发明内容
本发明目的在于提供一种连翘叶活性成分及其在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用，为进一步明确抗AD的作用位点奠定基础。对所获得的连翘叶水提物从化学和生物角度采用多种实验方法研究其抗AD的生物活性，证明了连翘叶水提物具有一定的抗AD生物活性，为开发连翘叶抗AD的保健品或药物提供充分的理论依据。
本发明由如下技术方案实现的：一种连翘叶活性成分，连翘叶与纯净水按照料液比为1:10混合回流提取，得到连翘叶水提物，然后将连翘叶水提物进行大孔吸附树脂洗脱，以乙醇-水为洗脱剂，20%乙醇洗脱物即为连翘叶活性成分。
所述连翘水提物中活性成分包含：连翘酯苷E、连翘酯苷I、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁、连翘苷、连翘脂素。
所述活性成分的具体制备方法为：
（1）制备连翘叶水提物：按照料液比1:10将连翘叶与纯净水混合，静置浸泡0.5 h，100—110℃加热回流1 h，纱布粗滤；再加入与第一次提取时等量的纯净水继续100—110℃加热回流1 h，纱布粗滤，减压浓缩，冷冻干燥即为连翘水提物粉末；
（2）洗脱连翘粗提物，收集连翘叶活性成分：连翘叶水提物用极少量的水溶解，大孔吸附树脂装柱，硅胶拌样后干法上样；以乙醇-水为洗脱剂，分别按照水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇的梯度洗脱连翘叶粗提物；按颜色变化进行收集洗脱液，洗脱液颜色不变时，用下一个梯度的洗脱剂继续进行洗脱，各段洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得到连翘叶不同洗脱物的粉末：水洗洗脱物、20%乙醇洗脱物、40%乙醇洗脱物、60%乙醇洗脱物、80%乙醇洗脱物，其中20%乙醇洗脱物即为连翘叶活性成分。
所述大孔吸附树脂为D101大孔树脂，使用前，将D101大孔树脂在95%乙醇中浸泡24h，使其孔径充分溶胀，装入柱中，用水将其冲洗至无醇味，再加入5%盐酸溶液，用水冲洗至pH值为7，之后再加入2%氢氧化钠溶液，用水冲洗至pH值为7。
所述连翘叶水提物抑制乙酰胆碱酯酶AChE和丁酰胆碱酯酶BuChE，减慢Aβ25-35的聚集，改善细胞活力，抗炎和抗氧化；对AChE的抑制作用IC50值为720.87 μg/mL。
所述有效洗脱部位为20%乙醇洗脱物（Q2）。
所述连翘叶有效洗脱部位（20%乙醇洗脱物，Q2）抑制乙酰胆碱酯酶AChE，减慢Aβ25-35的聚集，改善细胞活力，抗炎和抗氧化；对AChE的抑制作用IC50值为559.16 μg/mL。相同浓度下连翘叶20%乙醇洗脱物的上述生物活性强于连翘叶水提物。
本发明对连翘叶进行提取分离，制备出连翘叶水提物和五个洗脱物，并通过HPLC分别对其进行成分分析；鉴定出连翘叶水提物中的7种主要成分，通过比较含量的相对值，发现洗脱物成分种类相近，但含量不同。对所获得的连翘叶水提物从化学和生物角度采用多种实验方法研究其抗AD的生物活性，结果表明：连翘叶活性成分抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活力；可以减慢Aβ25-35的聚集；能够改善细胞活力；有一定的抗炎和抗氧化活性。采用Ellman法对连翘叶洗脱物进行抑酶活性部位的初步筛选，筛选出胆碱酯酶活性最好的部位是Q2（20%乙醇洗脱物）。
附图说明
图1为连翘叶水提物的液相图；
图2为连翘叶水提物对Aβ聚集的影响；图中：A为粒径图、B为Zeta电位图，FLE代表连翘叶水提物；
图3为连翘叶水提物对细胞损伤的改善作用；图中：A为连翘叶水提物安全浓度筛选图、B为连翘叶水提物对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的改善作用；
图4为连翘叶水提物的抗炎和抗氧化活性。图中：A为连翘叶水提物对Aβ25-35诱导NO的阻断作用；B为连翘叶水提物的DPPH•清除作用；C为FRAP法研究连翘叶水提物的抗氧化活性；
图5连翘叶水提物抑制胆碱酯酶的活性；图中：A为连翘叶水提物对AChE酶活的抑制作用、B为连翘叶水提物对BChE酶活的抑制作用；
图6为洗脱物的液相图；
图7为洗脱物对AChE酶活的抑制作用；图中：A为Q2对AChE酶活的抑制作用、B为Q3对AChE酶活的抑制作用、C为Q4对AChE酶活的抑制作用；D为Q5对AChE酶活的抑制作用；
图8为Q2对Aβ聚集的影响（粒径图）；
图9为Q2对细胞损伤的改善作用；图中：A为Q2的安全浓度筛选图、B为Q2对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的改善作用；
图10为Q2的抗炎和抗氧化活性。图中：A为Q2对Aβ25-35诱导NO的抑制作用；B为Q2的DPPH•清除作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：连翘叶水提物的获得及其主要成分的检测。
（1）按照料液比1：10将连翘叶与纯净水混合，静置浸泡0.5 h，100—110℃加热回流1 h，纱布粗滤；滤渣中加入与第一次提取时等量的纯净水，100—110℃再加热回流1 h，纱布粗滤，将滤液减压浓缩，冷冻干燥即为连翘水提物粉末。
（2）将连翘叶水提物用超纯水配制成1 mg/mL的供试品溶液，采用HPLC法检测其主要成分。Agela Technologies Venusil XBP-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）色谱柱；流速：0.8mL/min；检测波长：280 nm；进样量：10 μL；流动相：甲醇（A），0.3%醋酸水溶液（B）；梯度洗脱条件：0-8 min，30%-33%（A），70%-67%（B）；8-24 min，33%-40%（A），67%-60%（B）；24-39 min，40%-52%（A），60%-48%（B）；39-55 min，52%-64%（A），48%-36%（B）。
如图1所示，检测结果显示连翘叶水提物中成分包括但不局限于：1：连翘酯苷E；2：连翘酯苷I；3：松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷；4：连翘酯苷A；5：芦丁；6：连翘苷；7：连翘脂素等。
实施例2：利用动态光散射，从粒径与Zeta电位两方面研究连翘叶水提物对Aβ聚集的影响。
据文献报道，Aβ25-35从单体成为聚集体需要在37℃下孵育96 h。将1 mg Aβ25-35粉末溶于943 μL超纯水中，得到1 mM Aβ25-35储备液。将连翘叶水提物溶于超纯水中，配制成样品液，下同。实验分为9个组：Aβ25-35单体组，Aβ25-35孵育48 h组，Aβ25-35孵育96 h聚集体组，Aβ25-35与不同浓度的水提物（50、100、200 μg/mL）分别共孵育48 h和96 h。实验结果如图2所示，随着Aβ25-35孵育时间的增加（未孵育，孵育48 h，孵育96 h），粒径逐渐增大，说明Aβ25-35从单体逐渐转变成Aβ25-35聚集体。而当Aβ25-35与不同浓度的水提物（50、100、200 μg/mL）共孵育时，随着水提物浓度的增加，Aβ25-35的粒径逐渐减小。随着Aβ25-35孵育时间的增加，Zeta电位逐渐减小，而当连翘叶水提物与Aβ25-35共同孵育之后，Zeta电位又增大。因此，连翘叶水提物可以减慢Aβ25-35的聚集。
实施例3：MTT法检测细胞存活率，评价连翘叶水提物对细胞活力的作用。
于添加1/10胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养PC12细胞。取指数生长期的细胞，血球计数板计数。96孔板中，每孔中细胞个数为1×104，总体积为100 μL。连翘叶水提物安全浓度筛选实验的细胞分组：每孔中加入10 μL连翘叶水提物储备液，使其终浓度分别为25、50、100、150、200、250、300、400、500和1000 μg/mL，空白组中加入相应体积的培养基。研究连翘叶水提物对细胞损伤作用的实验分组：每孔中先加入10 μL连翘叶水提物储备液，使其终浓度分别为15、25、50、100、150、200和300 μg/mL，2 h后再加入10 μL Aβ25-35储备液，使其终浓度为5 μM，空白组中加入相应体积的培养基。各组培养24 h后，每孔中加10 μL MTT（终浓度为0.5 mg/mL），培养箱中放置4 h后，吸掉上清，每孔中加入DMSO 150 μL，振荡10min，酶标仪560 nm检测吸光度。每组平行6个孔，实验重复3次。根据公式计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(A实验组/A对照组)×100% ，其中，A实验组和A对照组分别表示实验组和对照组在560nm处的吸光度值。
如图3A所示，与空白组相比，25—300 μg/mL的连翘叶水提物对细胞存活率没有影响，即对细胞没有毒性。如图3B所示，连翘叶水提物处理细胞结果表明：与Aβ25-35组相比，50—300 μg/mL范围内，连翘叶水提物浓度依赖性地增大了细胞存活率，说明连翘叶水提物对Aβ25-35损伤的PC12细胞活力有一定的改善作用。实验数据表示mean ± SEM，与对照组比，**p<0.01，***p<0.001；与Aβ组相比，### p<0.001，##0.001＜p<0.01，NS：p>0.05。
实施例4：连翘叶水提物的抗炎和抗氧化活性。
Elisa实验检测PC12细胞的一氧化氮（NO）释放量，研究连翘叶水提物的抗炎活性。采用实施例3中“研究连翘叶水提物对细胞损伤作用的实验分组”方案。Elisa实验检测细胞培养基中一氧化氮（NO）释放量。NO试剂盒购于南京建成生物工程研究所（S0021），按照说明书进行操作，如表1。用酶标仪检测540 nm处的吸光度值。
表1 NO试剂盒实验方法
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实验结果表明，与Aβ组相比，连翘叶水提物减少了NO的含量，说明连翘叶水提物可以抑制细胞的NO产生，保护细胞（图4A）。实验数据表示mean ± SEM，***p<0.001；与Aβ组相比，### p<0.001，##0.001＜p<0.01，#0.01＜p<0.05。
采用DPPH•清除和FRAP法研究连翘叶水提物的抗氧化活性。
于无水乙醇中配制0.1 mM的DPPH•储备液，现用现配。于50 %乙醇中配制系列浓度梯度的连翘叶水提物样品溶液。将100 μL不同浓度的连翘叶水提物溶液与100 μL DPPH•储备液混合均匀后加入96孔板中，放在黑暗环境下反应25 min，用酶标仪检测520 nm处的吸光度值。每组3个复孔，实验平行重复3次。拟合不同浓度的连翘叶水提物吸光度值曲线，从图4B可以看出，连翘叶水提物浓度依赖性地清除DPPH•自由基。
配制pH为3.6的300 mM醋酸钠缓冲液、10 mM 三吡啶基三嗪（TPTZ）溶液、20 mMFeCl3溶液，按照10:1:1的体积比混合即得到FRAP工作液。将5 μL不同浓度的连翘叶水提物溶液与180 μL FRAP工作液混匀后加入96孔板中，37 ℃下放置10 min，用酶标仪检测593nm处的吸光度值。每组3个复孔，实验重复3次。FeSO4标准曲线方程为Ｙ=1.454X-0.0099，0.1—0.6 mg/mL，R2＝0.999，通过该标准曲线换算得出各浓度下样品的FRAP值，由图4C可知，在0.25—0.65 mg/mL浓度内，连翘叶水提物的总抗氧化能力随其浓度的增大而增大。DPPH•清除和FRAP法实验都表明连翘叶水提物具有一定的抗氧化能力。
实施例5：采用改良的Ellman方法，研究连翘叶水提物的抑制胆碱酯酶活性。
AChE和BChE分别为乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。按照表2所示的实验方案进行实验。
表2：测定胆碱酯酶活性实验设计（μL）
Figure DEST_PATH_IMAGE004
将PBS、酶液（终浓度为0.07 U/mL）、不同浓度的样品液、溶剂以及DTNB（终浓度为1mM）混合，涡旋混匀。于96孔板中每孔加入95 μL混合溶液，每组3个复孔，将各孔混合液振荡均匀后，37℃孵育15 min后向每个孔中加入Asch或Bsch（终浓度为2.86 mM）溶液，37℃孵育25 min，最后加入4% SDS溶液，终止反应。酶标仪412 nm下测吸光度值A，平行三次实验。根据公式计算抑制率：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
连翘叶水提物对AChE和BChE的抑制活性如图5所示，随着浓度的增大，连翘叶水提物对AChE和BChE的抑制作用均逐渐增强，且对AChE的抑制作用（IC50为720.87 μg/mL）大于BChE（IC50 为1196.97 μg/mL）。
实施例6：连翘叶水提物的进一步提取并用HPLC检测成分。
将D101大孔树脂在95%乙醇中浸泡24 h，使其孔径充分溶胀，装入柱中，用水将其冲洗至无醇味，再加入5%盐酸溶液，用水冲洗至pH值为7，之后再加入2%氢氧化钠溶液，用水冲洗至pH值为7。将连翘叶水提物用尽可能少的水溶解，硅胶拌样后干法上样。以乙醇-水为洗脱剂，按照水、20%、40%、60%和80%的顺序梯度洗脱连翘叶水提物。按颜色变化进行收集洗脱液，当洗脱液颜色变浅到不变时，用下一个梯度的洗脱剂继续进行洗脱，将各段洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得到连翘叶的不同洗脱物粉末：Q1（水洗洗脱物）、Q2（20%乙醇洗脱物）、Q3（40%乙醇洗脱物）、Q4（60%乙醇洗脱物）、Q5（80%乙醇洗脱物）。
将连翘叶的不同洗脱物用色谱甲醇配制成1 mg/mL的供试品溶液，采用实施例1中的液相条件进行分析，检测结果如图6所示，通过比较发现，这几个洗脱物的化学成分和连翘叶水提物相似，含量上却存在差异。
实施例7：连翘叶洗脱物抑制AChE活性检测。
采用实施例5中的方法。连翘叶洗脱物溶于DMSO配成不同浓度样品液。采用改良的Ellman方法，研究连翘叶洗脱物的抑制AChE酶活性。如图7所示，结果表明：随着浓度的增大，Q2、Q3、Q4和Q5对AChE的抑制作用都随之增强。不同洗脱物抑酶活性的IC50值见表3。通过比较IC50值大小，可以得出对AChE酶活性的抑制力从大到小顺序为：Q2＞连翘叶水提物＞Q3＞Q5＞Q4，其中Q2洗脱物的抑酶活性最好。
表3 洗脱物抑制AChE酶活的IC50值
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实施例8：连翘叶洗脱物Q2对Aβ聚集的影响。
采用实施例2中的方法。实验结果如图8所示，当Aβ25-35与200 μg/mL的Q2共孵育2天时，Aβ25-35孵育组的颗粒直径为120.50 nm，共孵育组的颗粒直径降至90.36 nm。当Aβ25-35与200 μg/mL的Q2共孵育4天时，Aβ25-35孵育组的颗粒直径为155.41 nm，共孵育组的颗粒直径降至95.33 nm。与同浓度水提物比较，Q2抑制Aβ聚集的作用更加明显。
实施例9：连翘叶洗脱物Q2对细胞活力的作用。
采用实施例3中的方法。实验结果如图9A所示，与空白组相比，50—500 μg/mL的Q2对细胞存活率没有明显影响，即对细胞没有明显毒性。如图9B所示，与Aβ25-35组相比，50—300 μg/mL Q2预处理细胞，增大了细胞存活率，说明Q2对Aβ25-35损伤的PC12细胞活力有一定的改善作用。相同浓度下，Q2对细胞活力的改善作用强于水提物。实验数据表示mean ±SEM，与对照组比，*p<0.05，***p<0.001；与Aβ组相比，##0.001＜p<0.01；NS：p>0.05。
实施例10：连翘叶洗脱物Q2的抗炎和抗氧化活性。
采用实施例4中的方法。如图10A所示，与Aβ组相比，Q2减少了NO的含量，说明Q2可以抑制细胞产生过量NO，保护细胞。从图10B可以看出，Q2浓度依赖性地清除DPPH•自由基。总之，Q2具有一定的抗炎和抗氧化活性。相同浓度下，Q2的抗炎和抗氧化能力强于水提物。实验数据表示mean ± SEM，与对照组比，***p<0.001；与Aβ组相比，#0.01<p<0.05，##0.001＜p<0.01，### p<0.001。
最后应说明的是：以上各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种连翘叶活性成分，其特征在于：连翘叶与纯净水按照料液比为1:10混合回流提取，得到连翘叶水提物，然后将连翘叶水提物进行大孔吸附树脂洗脱，以乙醇-水为洗脱剂，20%乙醇洗脱物即为连翘叶活性成分。
2.根据权利要求1所述的一种连翘叶活性成分，其特征在于：所述连翘水提物中活性成分包含：连翘酯苷E、连翘酯苷I、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁、连翘苷、连翘脂素。
3.根据权利要求1或2所述的一种连翘叶活性成分，其特征在于：所述活性成分的具体制备方法为：
（1）制备连翘叶水提物：按照料液比为1：10将连翘叶与纯净水混合，静置浸泡0.5 h，100—110℃加热回流1 h，纱布粗滤；滤渣中再加入与第一次提取时等量的纯净水继续于100—110℃加热回流1 h，纱布粗滤，将滤液减压浓缩，冷冻干燥即为连翘水提物粉末；
（2）洗脱连翘叶水提物，收集连翘叶活性成分：连翘叶水提物用水溶解，大孔吸附树脂装柱，硅胶拌样后干法上样；以乙醇-水为洗脱剂，分别按照水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇的顺序梯度洗脱连翘叶粗提物；按颜色变化进行收集洗脱液，洗脱液颜色不变时，用下一个梯度的洗脱剂继续进行洗脱，各段洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，即得到连翘叶不同洗脱物的粉末：水洗洗脱物、20%乙醇洗脱物、40%乙醇洗脱物、60%乙醇洗脱物、80%乙醇洗脱物，其中20%乙醇洗脱物即为连翘叶活性成分。
4.根据权利要求3所述的一种连翘叶活性成分，其特征在于：所述大孔吸附树脂为D101大孔树脂，使用前，将D101大孔树脂在95%乙醇中浸泡24 h，使其孔径充分溶胀，装入柱中，用水将其冲洗至无醇味，再加入5%盐酸溶液，用水冲洗至pH值为7，之后再加入2%氢氧化钠溶液，用水冲洗至pH值为7。
5.权利要求1或2所述的连翘叶活性成分制备抗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于：所述连翘叶水提物抑制乙酰胆碱酯酶AChE和丁酰胆碱酯酶BChE，减慢Aβ25-35的聚集，改善细胞活力，抗炎和抗氧化；对AChE的抑制作用IC50值为720.87 μg/mL。
6.根据权利要求1所述的连翘叶20%乙醇洗脱物制备抗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于：所述连翘叶20%乙醇洗脱物抑制乙酰胆碱酯酶AChE，减慢Aβ25-35的聚集，改善细胞活力，抗炎和抗氧化；对AChE的抑制作用IC50值为559.16 μg/mL。
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