CN113354643A - 一种千层塔碱化合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

一种千层塔碱化合物、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种千层塔碱化合物、其制备方法及其应用，属于天然药物化学及医药技术领域；本发明的发明人从千层塔的全草中分离得到一种新的千层塔碱化合物，并在进一步的药效研究过程中意外地发现该化合物能够显著抑制与阿尔茨海默氏病直接相关的三种促炎细胞因子的表达水平，能够显著缓解神经细胞炎症反应，具有抗神经炎症的效果；因此，本发明的式(I)结构式的千层塔碱化合物Serratinine C及其药物组合物未来具有治疗神经炎症，特别是治疗阿尔茨海默氏病的临床应用前景。

Description

一种千层塔碱化合物、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种千层塔碱化合物、其制备方法及其应用，属于天然药物化学及医药技术领域。
背景技术
神经炎症是中枢神经系统中发生的一种免疫反应，与神经退行性疾病有关，例如，阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)是一种发病进程缓慢、随着时间不断恶化的持续性神经功能障碍退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语和行为障碍等表现为症状，该病给患者和家人带来了巨大的痛苦。目前，全球约有5000万AD患者，人口老龄化将导致AD患者人数持续增加，预计2050年AD患者可能超过1亿，这将导致相关医疗保健费用大幅度的增加。目前，AD的病理机制主要有Tau蛋白假说、β淀粉样蛋白假说、胆碱能假说、神经炎性机制和代谢功能异常等。
研究表明以小胶质细胞数量增加和促炎性细胞因子水平升高为特征的慢性脑部炎症是AD的标志，β淀粉样蛋白(Aβ蛋白)沉积和Tau蛋白缠结过程均伴随炎症发生。具体来说，AD患者脑组织中高水平的促炎细胞因子可诱导炎症反应，例如，经研究表明与AD直接相关的IL-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子；IL-1β可以上调内皮细胞中APP-β蛋白的表达，研究表明IL-1β的增加与Aβ蛋白沉积有关，IL-1β的增加还可上调p38 MAPK激酶的表达水平，导致Tau蛋白磷酸化水平升高；IL-6也可上调APP-β蛋白的表达，诱导Tau蛋白磷酸化进而形成Tau蛋白缠结；TNF-α可刺激NF-B转录因子进而诱导神经炎症反应。
炎症信号增强是神经炎症的病理性特征，具体还会涉及诸如Aβ蛋白沉积、神经原纤维缠结、细胞凋亡、神经元受损以及胶质细胞异常激活，这些先天性免疫反应的异常和过度失调会进一步刺激生理过程，诱导促炎反应和神经退行性疾病。
目前，FDA批准用于治疗AD的药物有5种，除盐酸美金刚属于NMDR受体拮抗剂外，其余4种(他克林、多奈哌齐、卡巴拉汀和加兰他敏)通过抑制乙酰胆脂酶的活性活性发挥作用。但治疗AD的药物只能起到部分缓解AD的临床症状，且具有较严重的不良反应：如他克林的肝毒性较大；盐酸多奈哌齐的不良反应为肌肉痉挛、失眠、呕吐、腹泻；盐酸美金刚的不良反应有幻觉、头晕、头痛；加兰他敏的作用时间有限，对AD患者的各项指标并非均有提高作用。近年来，关于神经炎性机制的研究也越来越受关注，诸多学者也希望能够从植物中筛选能够治疗神经炎症，特别是治疗AD的药物或者先导化合物，为治疗神经炎症提供科学依据。
发明内容
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种千层塔碱化合物，其中，
所述千层塔碱化合物具有以下式(I)的结构式：
Figure BDA0003156382820000021
本发明另一方面提供了一种从植物中提取如上述千层塔碱化合物的方法，其中，
步骤1)：获取千层塔的干燥全草的粉末，且所述粉末的目数小于等于100目；
步骤2)：对所述步骤1)获取的粉末，采用甲醇进行回流提取，将获得的提取液减压浓缩后获得总浸膏；
步骤3)：将所述步骤2)获得的总浸膏通过超声的方式分散溶解于pH值为2～3的酸性水溶液中，过滤，取滤液并调节其pH值至10～11；再依次采用等体积的石油醚和氯仿进行萃取，获得氯仿层萃取物；
步骤4)：将步骤3)获得的所述氯仿层萃取物进行AB-8大孔树脂柱分离纯化，所述AB-8大孔树脂柱分离纯化采用乙醇-水体系进行梯度洗脱；
所述乙醇-水体系的梯度洗脱的操作条件为，依次采用乙醇：水的体积比为0:100、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的洗脱剂进行梯度洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视，采用体积比为8：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.45的洗脱组分；
步骤5)：将步骤4)获得的所述洗脱组分，进行中性氧化铝柱层析，所述中性氧化铝柱层析采用二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱；
所述二氯甲烷-甲醇体系的梯度洗脱的操作条件为，采用二氯甲烷：甲醇的体积比从100:0至0:100的洗脱剂进行梯度洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视，采用体积比为10：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.50的洗脱组分；
步骤6)：将步骤5)获得的所述洗脱组分，进行氨基硅胶柱层析；所述氨基硅胶柱层析采用正己烷-乙酸乙酯体系进行梯度洗脱；
所述正己烷-乙酸乙酯体系的梯度洗脱的操作条件为，采用正己烷：乙酸乙酯的体积比从100:0至0:100的洗脱剂进行梯度洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视，采用体积比为8：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.60的洗脱组分；
步骤7)：将步骤6)获得的所述洗脱组分，进行Sephadex LH 20凝胶柱层析；所述凝胶柱层析采用甲醇进行洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视合并，采用体积比为6：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.50的洗脱组分；
步骤8)：将步骤7)获得的所述洗脱组分，经HPLC进行分离纯化，获得如权利要求1所述千层塔碱化合物。
优选的，在所述步骤2)中，所述甲醇的重量为所述步骤1)获取的粉末的5倍以上，回流提取三次以上，并将每一次的提取液合并后进行减压浓缩。
优选的，在所述步骤3)中，所述pH值为2～3的酸性水溶液为盐酸；所述滤液采用氢氧化钠调节其pH值至10～11。
优选的，在所述步骤3)中，依次采用石油醚和乙酸乙酯进行等体积萃取，且每种有机溶剂各萃取3次以上。
本发明还一方面提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含如上述的千层塔碱化合物和药学上接受的载体。
本发明再一方面提供了上述的千层塔碱化合物在制备治疗神经炎症药物中的应用。
优选的，所述治疗神经炎症药物为治疗阿尔茨海默氏病的药物。
本发明再一方面提供了上述的药物组合物在制备治疗神经炎症药物中的应用。
优选的，所述治疗神经炎症药物为治疗阿尔茨海默氏病的药物。
本发明涉及一种千层塔碱化合物、其制备方法及其应用，属于天然药物化学及医药技术领域；本发明的发明人从千层塔的全草中分离得到一种新的千层塔碱化合物，并在进一步的药效研究过程中意外地发现该化合物能够显著抑制与阿尔茨海默氏病直接相关的三种促炎细胞因子的表达水平，能够显著缓解神经细胞炎症反应，特别是与阿尔茨海默氏病直接相关的神经细胞炎性反应，具有抗神经炎症的效果；因此，本发明的式(I)结构式的千层塔碱化合物Serratinine C及其药物组合物未来具有治疗神经炎症，特别是治疗阿尔茨海默氏病的临床应用前景。
附图说明
图1为经处理后的BV-2神经细胞中IL-1β的mRNA相对表达水平；
图2为经处理后的BV-2神经细胞中IL-6的mRNA相对表达水平；
图3为经处理后的BV-2神经细胞中TNF-α的mRNA相对表达水平；
图4为经处理后的HEB神经细胞中IL-1β的mRNA相对表达水平；
图5为经处理后的HEB神经细胞中IL-6的mRNA相对表达水平；
图6为经处理后的HEB神经细胞中TNF-α的mRNA相对表达水平；
图7为经处理后的HMC3神经细胞中IL-1β的mRNA相对表达水平；
图8为经处理后的HMC3神经细胞中IL-6的mRNA相对表达水平；
图9为经处理后的HMC3神经细胞中TNF-α的mRNA相对表达水平。
具体实施方式
本发明一方面提供了一种千层塔碱化合物，其中，
所述千层塔碱化合物具有以下式(I)的结构式：
Figure BDA0003156382820000051
本发明的发明人在天然药物的研究过程中意外地从千层塔的全草中提取到了一个新的化合物，即上述式(I)结构的化合物。
关于千层塔，为石松科石杉属植物蛇足石杉(Lycopodium serratum Thunb)的全草。其为多年生草本，根须状，茎直立或下部平卧，高约15-40cm，1至数回两叉分枝；顶端常具生殖芽，落地成新苗；叶纸质，略成四行疏生，具短柄；叶片披针形，长1-3cm，宽2-4mm，先端锐尖，基部渐狭，楔形，边缘有不规则尖锯齿，中脉明显；孢子叶和营养叶同形，绿色。孢子囊横生于叶腋，肾形，淡黄色，光滑，横裂。千层塔一般生长于林荫下湿地或沟谷石上，分布于我国东北、长江流域、浙江、福建、广东、广西、四川、贵州、和云南等地。其主要有清热解毒、燥湿敛疮、止血定痛散瘀等功效。千层塔的全草有一定的毒性，中毒时可出现头昏、恶心、呕吐等症状。
现代临床研究表明，千层塔的提取物，对于治疗精神分裂症、重症肌无力及老年性记忆功能减退有显效或改善作用。然而，目前对千层塔的提取物的化学成分及药理活性的报道比较少。
本发明的发明人从千层塔的全草中分离得到的式(I)结构的化合物，是一种新的化合物，从未有过文献报道；发明人对其进行结构鉴定和分析，其属于千层塔碱化合物，并将其命名为Serratinine C。之后在进一步的药效研究过程中意外地发现，本发明的式(I)结构的化合物具有明显的抗神经炎症作用，具有治疗神经炎症，特别是治疗阿尔茨海默氏病的临床应用前景。
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
以下实施例中采用的仪器与试剂：
核磁共振仪：Brucker AVANCE DRX-400，500，600型
质谱仪：Finnigan MAT 95 70eV；
高效液相色谱仪：Agilent 1100，带四元泵，自动进样器和DAD检测器；
柱层析填料：柱层析硅胶(200-300，300-400目)与硅藻土均为青岛海洋化工厂产品；
RP-C18反相硅胶柱：
Figure BDA0003156382820000061
RP-18(40-63μm)，Merck公司；
层析硅胶板：HSGF254硅胶板，烟台江友硅胶开发有限公司产品；
植物来源：
千层塔药材购于湖北省恩施市，全株暗绿色，高15-40厘米；根须状，茎直立或下部平卧；叶纸质，椭圆状披针形。2-4回二叉分枝，叶缘具粗齿，经西北大学生命科学学院郭斌研究员鉴定为石松科石杉属植物蛇足石杉(千层塔，Lycopodium serratum Thunb.)全株药材，该中药标本存放于西北大学生命科学院(编号：17-03-10)。
实施例1
从千层塔中提取千层塔碱化合物的方法
步骤1)：获取千层塔的干燥全草，粉碎过筛，获得目数小于等于100目的粉末(19Kg)。
步骤2)：对步骤1)获取的粉末，采用甲醇进行回流提取，将获得的提取液减压浓缩后获得总浸膏。
一般来说，回流提取的溶剂的量远大于样品的量。
在本申请的一个具体实施方案中，甲醇的重量为步骤1)获取的粉末的5倍以上，回流提取三次以上，并将每一次的提取液合并后进行减压浓缩。
具体在本实施例中，甲醇的重量为步骤1)获取的粉末的10倍左右，加热回流提取，反复提取4次，每次约2h，过滤后合并滤液，65℃下减压浓缩得到的总浸膏约5.5kg。
步骤3)：将步骤2)获得的总浸膏通过超声的方式分散溶解于pH值为2～3的酸性水溶液中，过滤，取滤液并调节其pH值至10～11；再依次采用等体积的石油醚和氯仿进行萃取，获得氯仿层萃取物。
具体在本实施例中，在步骤3)中，pH值为2～3的酸性水溶液为盐酸；滤液采用氢氧化钠调节其pH值至10～11。
步骤4)：将步骤3)获得的氯仿层萃取物进行AB-8大孔树脂柱分离纯化，AB-8大孔树脂柱分离纯化采用乙醇-水体系进行梯度洗脱；
乙醇-水体系的梯度洗脱的操作条件为，依次采用乙醇：水的体积比为0:100、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的洗脱剂进行梯度洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视，采用体积比为8：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.45的洗脱组分。
进行步骤4)的梯度洗脱后，对获得的多组洗脱液进行TLC检视，并将相同/相近似的组分进行合并。在本实施例中，采用体积比为8：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，获得了7个组分(按照Rf值由低到高，依次命名为Fr.A～G)，同时对它们进行碘化铋钾显色实验；其中，显色效果最强的，即含生物碱浓度最高的，为Rf值为0.45的洗脱组分(Fr.D)，具体在本实施例中获得了约219g的Fr.D洗脱组分，取该洗脱组分进行下一步的分离纯化。
步骤5)：将步骤4)获得的Fr.D洗脱组分，进行中性氧化铝柱层析，中性氧化铝柱层析采用二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱；
二氯甲烷-甲醇体系的梯度洗脱的操作条件为，采用二氯甲烷：甲醇的体积比从100:0至0:100的洗脱剂进行梯度洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视，采用体积比为10：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.50的洗脱组分。
进行步骤5)的梯度洗脱后，对获得的多组洗脱液进行TLC检视，并将相同/相近似的组分进行合并。在本实施例中，采用体积比为10：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，获得了6个组分(按照Rf值由低到高，依次命名为Fr.D1～6)，同时对它们进行碘化铋钾显色实验；其中，显色效果最强的，即含生物碱浓度最高的，为Rf值为0.50的洗脱组分(Fr.D4)，具体在本实施例中获得了约64g的Fr.D4洗脱组分，取该洗脱组分进行下一步的分离纯化。
步骤6)：将步骤5)获得的Fr.D4洗脱组分，进行氨基硅胶柱层析；氨基硅胶柱层析采用正己烷-乙酸乙酯体系进行梯度洗脱；
正己烷-乙酸乙酯体系的梯度洗脱的操作条件为，采用正己烷：乙酸乙酯的体积比从100:0至0:100的洗脱剂进行梯度洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视，采用体积比为8：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.60的洗脱组分；
进行步骤6)的梯度洗脱后，对获得的多组洗脱液进行TLC检视，并将相同/相近似的组分进行合并。在本实施例中，采用体积比为8：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，获得了5个组分(按照Rf值由低到高，依次命名为Fr.D41～45)，同时对它们进行碘化铋钾显色实验；其中，显色效果最强的，即含生物碱浓度最高的，为Rf值为0.60的洗脱组分(Fr.D43)，具体在本实施例中获得了约18g的Fr.D43洗脱组分，取该洗脱组分进行下一步的分离纯化。
步骤7)：将步骤6)获得的Fr.D43洗脱组分，进行Sephadex LH 20凝胶柱层析；所述凝胶柱层析采用甲醇进行洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视合并，采用体积比为6：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.50的洗脱组分；
进行步骤7)的梯度洗脱后，对获得的多组洗脱液进行TLC检视，并将相同/相近似的组分进行合并。在本实施例中，采用体积比为6：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，获得了6个组分(按照Rf值由低到高，依次命名为Fr.D431～436)，同时对它们进行碘化铋钾显色实验；其中，显色效果最强的，即含生物碱浓度最高的，为Rf值为0.50的洗脱组分(Fr.D435)，具体在本实施例中获得了约240mg的Fr.D435洗脱组分，取该洗脱组分进行下一步的分离纯化。
步骤8)：将步骤7)获得的Fr.D435洗脱组分，进行HPLC进行分离纯化。
具体在本实施例中，采用pre-HPLC获得13.09mg白色粉末。
产品鉴定
将上述实施例1获得的白色粉末进行产品鉴定。
实施例1获得的白色粉末，可溶于甲醇、氯仿和丙酮等溶剂。
实施例1获得的化合物，ESI-MS质谱中[M+Na]+m/z 480.32及[M+K]+496.30，提示其相对分子质量为457；高分辨质谱m/z 458.2845[M+H]+(calcd.for C27H40O5N)提示其分子式为C27H39O5N。
实施例1获得的化合物的13C NMR(200MHz)和1H NMR谱(800MHz)的结果参见下表1：
表1
Figure BDA0003156382820000091
Figure BDA0003156382820000101
表1中的1H NMR谱结果可以看出，在高场显示4个甲基氢质子信号δH0.88(3H,d,J＝6.9Hz)、1.20(3H,s)、1.23(3H,s)和δH 1.51(3H,s)，低场区显示1个氢质子信号δH 5.81(1H,s)。
表1中的13C NMR结果，结合DEPT数据显示，实施例1获得的化合物有27个碳，其中4个甲基碳(δC 18.5,25.1,25.7和δC 30.2)、11个亚甲基碳、6个次甲基碳(含1个双键碳信号)和7个季碳(含2个羰基碳)信号。
发明人将以上信息与已知化合物Serratinine进行比较。
已知化合物Serratinine的结构式参加下式(II)：
Figure BDA0003156382820000111
数据显示，实施例1的化合物的结构，具有与上述已知化合物Serratinine相同的部分，此外还多出了11个碳，其中包含2个不饱和季碳(δC 182.2和δC171.4)、1个不饱和次甲基碳(δC 112.8)、3个饱和次甲基碳和2个亚甲基碳和3个甲基碳信号。
HSQC谱中显示δH 0.88(3H,d,J＝6.9Hz)与δC 16.88相关，δH 1.17(1H,m)与δC32.2(C-14)相关，δH 1.20(3H,s)与δC 25.1相关，δH 1.23(3H,s)与δC 30.2相关，δH 1.51(3H,s)与δC 25.7相关，δH 5.81(1H,s)与δC 112.8相关，δH 3.98(1H,dd,J＝7.4,3.7Hz)与δC63.4相关，δH 1.88-1.90(2H,m)与δC 50.1相关，δH1.28(1H,m)和δH 2.35(1H,ddd,J＝11.5,4.0,2.1Hz)分别与δC 48.3相关。
HMBC谱中显示δH 5.81(1H,s)与2个不饱和碳(δC 182.2和171.4)和季碳δC 86.9均存在相关性，提示存在α,β-不饱和结构。δC 63.4与δH 2.35(1H,ddd,J＝11.5,4.0,2.1Hz)、1.88-1.90(2H,m)、1.23(3H,s)、1.28(1H,m)及与δH1.17(C-14,1H,m)均存在相关性，提示取代基与实施例1化合物的C-13位相连。
此外，1H-1H COSY和NOESY谱中显示C-8位氢质子(3.56,1H,d,J＝2.9Hz)与C-15位氢质子(δH 2.09,1H,m)相关，提示实施例1化合物的C-8位羟基和C-15位甲基在同侧。
综合以上全部信息，获得了实施例1化合物具有式(I)的化学式结构：
Figure BDA0003156382820000121
经Scifinder数据库检索，实施例1化合物为首次分离的新化合物，发明人将其命名为Serratinine C。
效果数据
发明人意外发现上述式(I)结构的千层塔碱化合物(Serratinine C)的具有抗神经细胞炎症的生物学活性，并进行了下述实验进行效果验证。
实验准备：三种神经细胞的培养，具体的，BV-2神经细胞采用高糖DMEM培养液，HEB和HMC3神经细胞采用低糖DMEM培养液；培养液均补充10％FBS、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)，并在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养。
1、细胞毒性实验
将上述三种神经细胞，按照2×105个/孔铺至96孔板，每孔添加120μL各自的培养基，培养约24h；
模型组：加入LPS(脂多糖)诱导24h，LPS加入后的终浓度为lμg/mL；
药物处理组：加入LPS(lμg/mL)诱导的同时，加入60μL的实施例1化合物(式(I)结构的千层塔碱化合物Serratinine C，其加入后的终浓度为20μM)，处理24h；
溶剂组：将药物处理组的60μL实施例1化合物替换成60μL的DMSO溶剂，处理24h；
空白对照组：将药物处理组的60μL实施例1化合物替换成60μL各自对应的细胞培养基，处理24h；
之后收集细胞培养液，采用CCK8试剂检测细胞活力，检测波长为450nm。
实验结果显示：三种神经细胞的活性在上述的各组之间均无显著性差异(
Figure BDA0003156382820000132
n＝6，p>0.05)，表明式(I)结构的千层塔碱化合物Serratinine C(20μM)对细胞活力无显著性影响。
2、NO和ROS释放量的检测
将上述三种神经细胞按照2×105个/孔铺至48孔板，加入300μL培养基/孔，次日进行LPS药物处理，具体的：
模型组：LPS药物处理(加入LPS后的终浓度为lμg/mL)，诱导24h；
给药组：除了与模型组一样加入LPS药物以外，还向48孔板中加入实施例1化合物(加入后的终浓度为20μM)，诱导24h；
收集细胞培养液，离心，取上清液；分为多份，分别加入NO和ROS检测试剂，常温静置反应10min后酶标仪540nm下检测OD值，根据标曲计算细胞上清液中的NO和ROS的含量，结果参见表2。
表2
Figure BDA0003156382820000131
Figure BDA0003156382820000141
从上表2中可以看出，三种神经细胞的结果中，给药组的NO释放量分别为7.7±0.30、9.3±0.61和6.2±0.64μmol/L，与对应的模型组的NO释放量数据(15.34±0.23、15.34±0.43和19.8±0.47μmol/L)相比，有显著差异(P<0.05)，分别下调至模型组的约0.50倍、0.61倍和0.31倍。
三种神经细胞的结果中，给药组的ROS释放相对水平数据，与对应的模型组的数据相比，有显著差异(P<0.05)，分别下调至模型组的约0.53倍、0.62倍和0.31倍。
上述两方面的实验结果均说明本申请的式(I)化合物能够显著抑制脂多糖诱导巨噬细胞产生的炎症反应，具有抗神经炎症的生物学活性。
3、qRT-PCR技术分析基因表达
将上述三种神经细胞，按照2×105个/孔铺至96孔板，每孔添加120μL各自的培养基，然后再加入60μL的实施例1化合物(式(I)结构的千层塔碱化合物Serratinine C，加入后的终浓度为20μM)，作用24h；
药物处理组：加入LPS(lμg/mL)诱导的同时，加入60μL的实施例1化合物(其加入后的终浓度为20μM)，处理24h；
药物对照组：将药物处理组的LPS替换成相同体积的PBS缓冲液；
溶剂处理组：加入LPS(lμg/mL)诱导的同时，加入60μL的DMSO溶剂，处理24h；
溶剂对照组：将溶剂组的LPS替换成相同体积的PBS缓冲液；
之后，收集细胞培养液，离心，取细胞沉淀；采用qRT-PCR技术分析经药物处理后的细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α(促炎细胞因子)的mRNA表达水平；该实验中，以GAPDH作为管家基因；β-actin作为PCR内参基因。
qRT-PCR总反应体系为20μL：1μL cDNA模板，正向和反向引物各1μL，10μL的SyberGreenSuperMix，加ddH2O至体积20μL。反应条件：预变性90℃，1min；进入循环，变性90℃，20s；退火60℃，20s；延伸60℃，20s，循环60次。
基因扩增所需的引物序列见下表3。
表3
Figure BDA0003156382820000151
BV-2神经细胞处理后的结果参见图1-3，图1为经处理后的BV-2神经细胞中IL-1β的mRNA相对表达水平；图2为经处理后的BV-2神经细胞中IL-6的mRNA相对表达水平；图3为经处理后的BV-2神经细胞中TNF-α的mRNA相对表达水平；
HEB神经细胞处理后的结果参见图4-6，图4为经处理后的HEB神经细胞中IL-1β的mRNA相对表达水平；图5为经处理后的HEB神经细胞中IL-6的mRNA相对表达水平；图6为经处理后的HEB神经细胞中TNF-α的mRNA相对表达水平；
HMC3神经细胞处理后的结果参见图7-9，图7为经处理后的HMC3神经细胞中IL-1β的mRNA相对表达水平；图8为经处理后的HMC3神经细胞中IL-6的mRNA相对表达水平；图9为经处理后的HMC3神经细胞中TNF-α的mRNA相对表达水平。
附注：图1至9中，“DMSO+PBS”的标注表示：“溶剂对照组”，“DMSO+LPS”的标注表示：“溶剂处理组”，“Drug+PBS”的标注表示：“药物对照组”，“Drug+LPS”的标注表示：“药物处理组”。
附注：关于图1至9的数据统计(X±SD，n＝6)，***p<0.001，****p<0.0001，ns表示无显著性差异。
从上述图1-9的结果可以看出，qRT-PCR法测定三种神经细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α(与AD直接相关的促炎细胞因子)的表达水平及其mRNA含量，结果显示LPS诱导细胞中三种促炎细胞因子的mRNA含量明显升高，而Serratinine C可明显下调三种促炎细胞因子的mRNA含量，表明Serratinine C可缓解LPS引起的神经细胞炎性反应，特别是能够缓解了与AD直接相关的神经细胞炎性反应。
另外，发明人还采用ELISA的方法分析了经药物处理后的细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α(与AD直接相关的促炎细胞因子)的mRNA表达水平；ELISA的实验结果与qRT-PCR实验结果基本相同，这也进一步验证了qRT-PCR实验结果的准确性。
本领域技术人员在获知了本申请的式(1)化合物及其抗神经炎症的生物学活性的基础上，能够将本申请的式(I)结构式的千层塔碱化合物Serratinine C与药学上接受的常规载体进行组合，作为抗神经炎症的药物组合物，特别是作为治疗阿尔茨海默氏病的药物组合物。
炎症信号增强是神经炎症的病理性特征，会涉及诸如Aβ蛋白沉积、神经原纤维缠结、细胞凋亡、神经元受损以及胶质细胞异常激活，这些先天性免疫反应的异常和过度失调会进一步刺激生理过程，诱导促炎反应和神经退行性疾病。我们的实验结果表明Serratinine C能够显著抑制与阿尔茨海默氏病直接相关的三种促炎细胞因子的表达水平，能够显著缓解神经细胞炎症反应，特别是与AD直接相关的神经细胞炎性反应，其具有抗神经炎症的效果；基于上述实验结果和本申请发明人的发现，可以合理预测本申请的式(I)结构式的千层塔碱化合物Serratinine C及其药物组合物未来具有治疗神经炎症，特别是治疗阿尔茨海默氏病的临床应用前景。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种千层塔碱化合物，其特征在于：
所述千层塔碱化合物具有以下式(I)的结构式：
Figure FDA0003156382810000011
2.一种从植物中提取如权利要求1所述千层塔碱化合物的方法，其特征在于：
步骤1)：获取千层塔的干燥全草的粉末，且所述粉末的目数小于等于100目；
步骤2)：对所述步骤1)获取的粉末，采用甲醇进行回流提取，将获得的提取液减压浓缩后获得总浸膏；
步骤3)：将所述步骤2)获得的总浸膏通过超声的方式分散溶解于pH值为2～3的酸性水溶液中，过滤，取滤液并调节其pH值至10～11；再依次采用等体积的石油醚和氯仿进行萃取，获得氯仿层萃取物；
步骤4)：将步骤3)获得的所述氯仿层萃取物进行AB-8大孔树脂柱分离纯化，所述AB-8大孔树脂柱分离纯化采用乙醇-水体系进行梯度洗脱；
所述乙醇-水体系的梯度洗脱的操作条件为，依次采用乙醇：水的体积比为0:100、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的洗脱剂进行梯度洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视，采用体积比为8：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.45的洗脱组分；
步骤5)：将步骤4)获得的所述洗脱组分，进行中性氧化铝柱层析，所述中性氧化铝柱层析采用二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱；
所述二氯甲烷-甲醇体系的梯度洗脱的操作条件为，采用二氯甲烷：甲醇的体积比从100:0至0:100的洗脱剂进行梯度洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视，采用体积比为10：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.50的洗脱组分；
步骤6)：将步骤5)获得的所述洗脱组分，进行氨基硅胶柱层析；所述氨基硅胶柱层析采用正己烷-乙酸乙酯体系进行梯度洗脱；
所述正己烷-乙酸乙酯体系的梯度洗脱的操作条件为，采用正己烷：乙酸乙酯的体积比从100:0至0:100的洗脱剂进行梯度洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视，采用体积比为8：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.60的洗脱组分；
步骤7)：将步骤6)获得的所述洗脱组分，进行Sephadex LH 20凝胶柱层析；所述凝胶柱层析采用甲醇进行洗脱，对获得的洗脱液进行TLC检视合并，采用体积比为6：1的二氯甲烷：甲醇混合溶剂作为展开剂，取碘化铋钾显色为黄色，且Rf值为0.50的洗脱组分；
步骤8)：将步骤7)获得的所述洗脱组分，经HPLC进行分离纯化，获得如权利要求1所述千层塔碱化合物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
在所述步骤2)中，所述甲醇的重量为所述步骤1)获取的粉末的5倍以上，回流提取三次以上，并将每一次的提取液合并后进行减压浓缩。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
在所述步骤3)中，所述pH值为2～3的酸性水溶液为盐酸；所述滤液采用氢氧化钠调节其pH值至10～11。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
在所述步骤3)中，依次采用石油醚和乙酸乙酯进行等体积萃取，且每种有机溶剂各萃取3次以上。
6.一种药物组合物，其特征在于：
所述药物组合物包含如权利要求1所述的千层塔碱化合物和药学上接受的载体。
7.如权利要求1所述的千层塔碱化合物在制备治疗神经炎症药物中的应用。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于：所述治疗神经炎症药物为治疗阿尔茨海默氏病的药物。
9.如权利要求6所述的药物组合物在制备治疗神经炎症药物中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于：所述治疗神经炎症药物为治疗阿尔茨海默氏病的药物。
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