CN105726561A - 板蓝根多糖在制备用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物中的应用及制备的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种板蓝根多糖在制备用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物中的应用，以及一种用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物组合物，所述药物组合物中，按重量百分比计含有1％～99％的板蓝根多糖。本发明为临床治疗流感病毒性疾病提供了一种安全有效、毒副作用小的药物。

Description

板蓝根多糖在制备用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物中的应用及制备的药物
技术领域
本发明属于医药技术领域，更具体地涉及板蓝根多糖在制备用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物中的应用。本发明还涉及含有该成分的用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物组合物。
背景技术
流感是由流感病毒引起的急性呼吸系统疾病，严重威胁人类的健康。流感病毒的危害除了病毒大量复制本身造成的组织损伤外，现在的研究表明过度的炎症反应是流感病毒感染后导致疾病恶化的重要原因。虽然宿主感染流感病毒后激活免疫及炎症细胞，进而启动机体免疫反应以及炎症反应保护宿主，但失控的、过强的炎症反应则会攻击自身组织细胞，引起组织损伤疾病。如果抗原不能被及时清除，免疫应答时间延长，引起大量细胞因子或炎症介质失控性释放，造成宿主自身组织结构和生理功能的广泛损害，进而引发全身炎症反应综合征(sIRs)、多器官功能障碍综合征(MODs)，甚至死亡，研究发现过度的炎症反应与H5N1、H7N9等流感病毒感染后发展为重度肺炎甚至急性呼吸窘迫综合征(ARDS)息息相关。而目前在临床上使用的用于抑制流感病毒感染后导致的过度炎症反应的药物是糖皮质激素，但是对于激素的临床使用存在较大的争议，目前普遍认为大剂量的激素使用有益于病毒的复制，延迟病毒的排毒时间，对病死率无益。而目前在临床上常规使用的抗流感病毒药物(如神经氨酸酶抑制剂)靶点在病毒本身，对宿主没有调节作用，因此没有直接抑制流感病毒诱导的炎症的作用。
因此，开发新的抑制流感病毒诱导的炎症反应的药物，有利于解决临床问题，也是治疗流感的一个新选择。
很多中药都已经被证明有免疫调节作用，而传统中药板蓝根是其中的一种，药理研究显示板蓝根的各种成分具有抗菌、抗内毒素、抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用，在我国长期应用于流感的临床治疗，疗效显著。因此，从板蓝根中分离制备并筛选出能抑制流感病毒以及抑制流感病毒诱导的炎症反应的有效成分，发现其独特的药效机制，并获得自主知识产权，对于发掘祖国医学宝库，加大中药的开发力度具有重大的意义。
此前的研究已经从板蓝根中分离提纯得到大分子成分——板蓝根多糖，前期的研究已经发现板蓝根多糖具有抑制流感病毒吸附宿主细胞从而起到直接抗病毒的药效作用，这是板蓝根多糖靶向病毒本身起作用的结果。目前开发抑制流感病毒诱导的炎症反应的药物越来越受到关注，也是治疗流感性疾病的一个重点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种板蓝根多糖的新应用，即板蓝根多糖在制备用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物中的应用，以期为临床治疗流感病毒性疾病提供一种新途径。同时，本发明还提供含有板蓝根多糖的用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物组合物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种板蓝根多糖在制备用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物中的应用。
本发明还提供一种用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物组合物，该药物组合物其活性成分包括所述板蓝根多糖。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的板蓝根多糖可以降低流感病毒H1N1(PR8)刺激16HBE细胞6小时或者24小时后炎症因子(IP-10、MIG、IL-6等)的mRNA水平和蛋白水平，且在药物浓度为30mg/mL时既可以抑制流感病毒的子代病毒的复制，也可以抑制流感病毒诱导的炎症因子的表达；在浓度为15mg/ml和7.5mg/mL时对流感病毒的复制没有抑制作用，但是能有效的抑制炎症因子的表达。另外，本发明的板蓝根多糖能有效地抑制TLR3的表达，推测板蓝根多糖通过抑制TLR3信号通路从而抑制流感病毒诱导的炎症反应。因此本发明为临床治疗流感病毒性疾病提供了一种安全有效、毒副作用小的药物。
附图说明
图1A、1B分别制备实施例中板蓝根多糖70％和80％醇沉物的分子量测定图；
图2是本发明的板蓝根多糖对人气道上皮细胞(16HBE)药物毒性的测定结果图；
图3A——图3E是本发明的板蓝根多糖70％醇沉物作用24小时后抑制流感病毒介导的炎症因子的表达以及对流感病毒的子代病毒复制的抑制结果图；
图4A——图4F是本发明的板蓝根多糖80％醇沉物作用24小时后抑制流感病毒介导的炎症因子的表达以及对流感病毒的子代病毒复制的抑制结果图；
图5A、图5B是本发明的板蓝根多糖80％醇沉物作用6小时后对流感病毒介导的炎症因子表达的抑制的结果图；
图6中显示板蓝根多糖(80％醇沉物)在药物浓度为30mg/mL和15mg/mL时对病毒刺激诱导表达增加的TLR3的表达量有明显的抑制作用，在药物浓度为7.5mg/mL是抑制作用消失，呈现明显的浓度梯度依赖性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明通过实验研究了板蓝根多糖作用于宿主细胞抑制流感病毒诱导的炎症因子产生的作用，采用Real-timePCR和ELISA的方法研究药物抑制流感病毒刺激人气道上皮细胞(16HBE)后炎症因子的表达，结果显示板蓝根多糖可以降低流感病毒H1N1(PR8)刺激16HBE细胞6小时或者24小时后炎症因子(IP-10、MIG、IL-6等)的mRNA水平和蛋白水平，结果也显示在药物浓度为30mg/mL时既可以抑制流感病毒的子代病毒的复制，也可以抑制流感病毒诱导的炎症因子的表达；在浓度为15mg/ml和7.5mg/mL时对流感病毒的复制没有抑制作用，但是能有效的抑制炎症因子的表达；蛋白免疫印迹技术检测药物作用的信号通路，结果显示板蓝根多糖能有效地抑制TLR3的表达，推测板蓝根多糖通过抑制TLR3信号通路从而抑制流感病毒诱导的炎症反应。因此本发明为临床治疗流感病毒性疾病提供了一种安全有效、毒副作用小的药物。
具体地，本发明公开了一种板蓝根多糖在制备用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物中的应用。
板蓝根多糖在应用于制备用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物时，可作为单一有效成分制成抗流感病毒药物，或可将板蓝根多糖作为有效成分之一制成抗流感病毒复方药物。
所述的板蓝根多糖是指从板蓝根植株(主要是茎及根)中提取得到的多糖类物质，其制备方法可以参考现有技术文献(金迪，梁英，孙工兵等，“植物多糖提取技术的研究进展[J]”《黑龙江八一农垦大学学报》，2011，23(5)：76-79；)而进行。在本发明中，本发明的发明人对其进行了小幅的修改，所述制备方法具体包括如下步骤：准确称取一定量粉碎后的板蓝根药材，加入8～12倍质量纯水，回流提取2～4h，冷却，滤出提取液，重复上述提取过程2～4次，减压蒸馏，即得浓缩后的板蓝根多糖水提液。优选地，所述制备方法具体包括如下步骤：准确称取一定量粉碎后的板蓝根药材，加入10倍质量纯水，回流提取2h，冷却，滤出提取液，重复上述提取过程两次，减压蒸馏，即得浓缩后的板蓝根多糖水提液。
为了得到更好的效果，所述制备方法还包括下述步骤：将浓缩后的板蓝根多糖水提液，加入无水乙醇混匀，使无水乙醇的体积分数达到50％以上，冷藏后离心，收集沉淀，冷冻干燥，得到醇沉的板蓝根多糖。可依次增加无水乙醇的体积分数重复上述操作，最终得到不同醇沉浓度的板蓝根多糖粗品。优选地，所述制备方法还包括下述步骤：将浓缩后的板蓝根多糖水提液，加入无水乙醇，混匀，使无水乙醇的体积分数达到50％，4℃冷藏24h，4500r/min条件下离心10min，收集沉淀，冷冻干燥，得到50％醇沉多糖。重复上述操作，使乙醇体积分别达到60％、70％、80％、90％，最终得到不同醇沉浓度的板蓝根粗多糖。
所述的流感病毒包括但不限于甲、乙型流感病毒和禽流感病毒；甲、乙型流感病毒和禽流感病毒包括但不限于人流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型、禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亚型以及influnzaB型，人流感病毒H1N1亚型包括新甲型H1N1流感病毒。
所述的流感病毒较佳地为甲型流感病毒A/PR/8/34株，即甲型流感病毒H1N1。
进一步地，上述药物可制成药学上允许的任意剂型，例如包括但不限于胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆、口服液、吸入剂、喷雾剂、乳膏、霜剂或凝胶剂等。
进一步地，本发明的药物按照重量百分比计，其中含有的板蓝根多糖可以为1％～99％，其余可为药学上可接受的载体，以便制成所需的剂型。上述的药学上可接受的载体包括但不限于填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂等。其中，填充剂具体可选择如淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、微精纤维素、碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钙等中的一种或多种。黏合剂具体可选择如羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、胶浆、糖浆、聚乙二醇、海藻酸钠、阿拉伯胶、桃胶等中的一种或多种。崩解剂具体可选择如交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲淀粉钠、酒石酸、柠檬酸、碳酸氢钠、碳酸钠、酸酐等中的一种或多种。润滑剂包括滑石粉、硬脂酸镁、液体石蜡、微粉硅胶、聚乙二醇等中的一种或多种。
本发明还提供一种用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物组合物，该药物组合物其活性成分包括上述板蓝根多糖。
进一步地，在一些具体实施方式中，该药物组合物中，按重量百分比计含有1％～99％的板蓝根多糖。
进一步地，该药物组合物可制成药学上允许的剂型，例如包括但不限于胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆、口服液、吸入剂、喷雾剂、乳膏、霜剂或凝胶剂等。为了制得所需剂型，本药物组合物中还可含有制成所需剂型所需的药学上可接受的载体，所述载体的用量可以是1％～99％，具体根据剂型需要而定。在一些具体实施方式中，文中所述的药学上可接受的载体例如可为填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂等。其中，填充剂具体可选择如淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、微精纤维素、碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钙等中的一种或多种。黏合剂具体可选择如羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、胶浆、糖浆、聚乙二醇、海藻酸钠、阿拉伯胶、桃胶等中的一种或多种。崩解剂具体可选择如交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲淀粉钠、酒石酸、柠檬酸、碳酸氢钠、碳酸钠、酸酐等中的一种或多种。润滑剂包括滑石粉、硬脂酸镁、液体石蜡、微粉硅胶、聚乙二醇等中的一种或多种。
该药物组合物中还可进一步含有其他药用许可药物，板蓝根多糖和其他药用许可药物制成抗流感病毒复方药物。
本发明还提供一种用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物，所述药物其活性成分包括前文所述的板蓝根多糖。
下面通过具体实施例和实验数据对本发明的技术方案和技术效果进行进一步阐述说明，其中需要说明的是，下述具体实施例仅用于示范性地说明技术方案，而不是对本发明进行限定。
制备实施例板蓝根多糖的提取分离和分子量分布测定
准确称取300g粉碎后的板蓝根药材，加入10倍质量纯水，回流提取2h。冷却，滤出提取液，重复上述提取过程两次，得到板蓝根水提液，减压蒸馏，使料液比达到1:2～1:3，得浓缩后的板蓝根水提液，备用。
准确量取上述浓缩后的板蓝根水提液，加入无水乙醇，混匀，使其体积分数达到50％，4℃冷藏24h，4500r/min条件下离心10min，收集沉淀，冷冻干燥，得到50％醇沉板蓝根多糖粗品。重复上述操作，使乙醇体积分数分别达到60％、70％、80％、90％，最终得到不同醇沉浓度的板蓝根多糖粗品。
精确称量冷冻干燥后的醇沉板蓝根多糖粗品样品(70％醇沉物或80％醇沉物)，溶于纯水，配制成浓度约为5mg/mL的溶液，过0.45μm的水系微孔滤膜。用凝胶色谱-蒸发光散射检测法(GPC-ELSD)进行板蓝根多糖分子量及分布测定。(GPC-ELSD检测条件如下：仪器：Agilent1200高效液相色谱系统，紫外以及蒸发光散射检测器；色谱柱：TSK-G3000PW柱；流动相：4mM甲酸铵；流速：0.6mL/min，进样量：10μL；ELSD检测温度：50℃；气体流量：1.6L/min；检测波长：210nm，280nm)。由图1A和图1B可以看出，在210nm和280nm处存在紫外吸收，说明成分较复杂，除多糖之外，还可能存在少量杂质。
表1板蓝根多糖(70％醇沉物)的分子量测定
表2板蓝根多糖(80％醇沉物)的分子量测定
试验例1板蓝根多糖在气道上皮细胞中抑制流感病毒诱导的炎症反应实验
1.1实验材料
1.1.1药物受试样品：板蓝根多糖(70％或80％醇沉物)。
1.1.2细胞人气道上皮细胞(16HBE)和狗肾上皮细胞(MDCK)购自中国科学院上海细胞库。
1.1.3病毒株普通甲型H1N1流感病毒(A/PR/8/34，H1N1)购自ATCC，以Reed-Muench法测定其感染复数(M.O.I)，以M.O.I＝1作为病毒滴度感染细胞。
1.1.4试剂DMEM培养基(批号：8114176)；PBS(批号：20150122)，胎牛血清(批号：10099)均购自GIBCO公司；TPCK(批号：20140220)购自广州捷倍斯公司。ELISA试剂盒购买自RayBio公司，CatELH-IP-10；ELH-CCL-5。Reat-timePCR试剂购买自TaKarRa公司，Cat#RR390A。
1.2实验方法
1.2.116HBE细胞培养
将正常人气道上皮细胞(16HBE)接种于100mm培养皿内，用10％DMEM高糖培养基，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下在细胞孵育箱中进行培养，待细胞生长进入对数增殖期时，收集细胞。对收集的细胞进行计数后，以每孔2×105个/mL的密度接种于直径15.6mm的24孔板细胞培养皿中，24小时后显微镜下观察细胞贴壁、生长良好。换1％DMEM高糖培养基将细胞饥饿培养24小时后进行下一步病毒和药物刺激实验，加刺激物时，将细胞培养基换成不含胎牛血清的培养基。
1.2.2病毒和药物刺激
细胞贴壁24小时后，PBS冲洗2遍，用不含血清的DMEM将甲型流感病毒H1N1(PR8)稀释至M.O.I＝1，每孔加入0.5mL病毒液，37℃贴壁2小时。用不含胎牛血清但是含0.4μg/mL胰蛋白酶(即TPCK酶，Tosyl-phenylalaninechloromethyl-ketone-treated，SIGMA产品)的DMEM稀释药物，每孔加入1mL，作用6小时或者24小时后收集细胞上清液和细胞RNA。
1.2.3检测药物对16HBE细胞毒性试验(MTT法)
16HBE细胞以每孔2×105个/mL的密度接种于直径6.94mm的96孔板细胞培养皿中，24小时后显微镜下观察细胞贴壁、生长良好。不含血清的DMEM2倍梯度稀释药物，作用48小时后，MTT法(同上述)检测药物毒性。
1.2.4细胞上清液病毒滴度的测定
以细胞病变抑制法(CytopathicEffectReductionMethod)研究板蓝根多糖(70％或80％醇沉物)对流感病毒子代病毒产生的抑制作用。用含1.5μg/mLTPCR酶的MEM对细胞上清液进行10倍梯度稀释，加到狗肾细胞(MDCK)中，48小时后观察细胞的病变。记算出TCID50/100μL。
1.2.5细胞培养基中炎症因子蛋白ELISA方法检测
按照ELISA试剂盒产品说明书操作
①试剂取出平衡至室温，加入样品，室温孵育2.5小时或者4℃过夜；
②Washingbuffer冲洗4次；
③加入稀释好的biotinylatedantibdy100μL室温作用1小时；
④Washingbuffer冲洗5次，加入稀释好的Streptavidinsolution100μL，室温作用45分钟；
⑤加入TMB显色液，室温反应30分钟；加入500μL的StopSolution终止反应，全波长酶标仪读数(450nm)，根据标准曲线计算出样品中炎症因子蛋白的含量。
1.2.616HBE细胞中RNA的提取
①在每个孔中加入1mL的Trizol裂解液，然后收集细胞RNA。12000g，4℃的条件下离心10min，取上清于1.5ml的离心管；
②在上清液中加入200μL氯仿，用手上下震荡，使之充分混匀成乳液状，室温孵育3min。12000g，4℃的条件下离心15min，然后小心取出离心管置于冰上，避免摇晃，用吸头慢慢吸取上层澄清液(300μL)，避免吸到中间白色蛋白层，置于一新的离心管中；
③向管内加入0.5mL异丙醇，混匀，室温孵育10min。再置于离心机内12000g，4℃的条件下离心10min；
④弃除上层清液，加入事先配好的75％乙醇(用DEPC水和100％的无水乙醇配)，震荡，置于离心机内7500g，4℃的条件下离心5min。倒掉上层乙醇，并保持离心管处于倒置状态，待乙醇刚好挥发干；
⑤待乙醇干燥后，加入适量的DEPC水(视提取出来的RNA的量而定)。提供逆转录使用。
1.2.7RT-PCR反应
①使用RNA检测的仪器，依次检测提取好的样品中的RNA的浓度。
②按照检测结果，将样品稀释至适合的浓度。
③配好RT-PCR的反应体系，上机。按照之前设计好的程序反应。反应结束后，将cDNA于-80℃保存。
注：RT-PCR反应的条件为
37℃15min
85℃5s
4℃forever
1.2.8QPCR反应
①取出RT-PCR反应的产物，探针法检测。
②配好反应体系，加入反应孔中，然后加入样品，混匀，上机反应。
③QPCR反应的条件
95℃30s，
95℃5s(40个反应循环)
60℃40s.
④引物序列
IP-10(人)：L：5'-GAAATTATTCCTGCAAGCCAATTT-3'
R：5'-TCACCCTTCTTTTTCAT-TGTAGCA-3'
探针引物：5'-FAM-TCCACGTGTTGAGATCA-3'MGB
MIG(人)：L：5'-TCTTGCTGGTTCTGATTGGAGTG-3'
R：5'-GATAGTCCCTTGGTTGGTGCTG-3'
探针引物：5'-FAM-CAGGAACAGCGACCCTTTCTCACTACTGG-3′BHQ-1
CCL5(人)：L：5'-CAGCAGTCGTCTTTGTCACC-3'
R：5'-GTTGATGTACTCCCGAACCC-3'
探针引物：5'-FAM-CGCCAAGTGTGTGCCAACCC-3′TAMRA
IL-6(人)：L：5'-CGGGAACGAAAGAGAAGCTCTA-3'
R：5'-CGCTTGTGGAGAAGGAGTTCA-3'
探针引物：5'-FAM-TCCCCTCCAGGAGCCCAGCT-3′TAMRA
内参(GAPDH)：L：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'
R：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'
探针引物：5′-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3′TAMRA
1.3实验结果
1.3.1药物对16HBE细胞药物毒性
MTT法检测药物作用于16HBE细胞48小时后，30mg/mL浓度以下对16HBE细胞无毒性。具体数值见图2。
1.3.2板蓝根多糖(70％醇沉物)作用24小时后抑制流感病毒诱导的炎症因子的表达以及对流感病毒的子代病毒复制的抑制
药物浓度在30mg/mL，15mg/mL和7.5mg/mL均对病毒诱导的炎症因子的产生有抑制作用。对炎症因子IP-10、IL-6、CCL-5等的mRNA水平的抑制作用最为明显，在药物浓度为7.5mg/mL对IP-10的mRNA水平的抑制率约10倍(和病毒组相比较)(图3A)；对IL-6的mRNA水平的抑制率约3倍(和病毒组相比较)(图3B)；对CCL-5的mRNA水平的抑制率也约为3倍(和病毒组相比较)(图3C)。炎症因子蛋白水平的检测也显示，药物在浓度为30mg/mL和15mg/mL对IP-10的蛋白水平有明显的抑制作用，但是浓度为7.5mg/mL时对IP-10的蛋白水平没有抑制作用(图3D)。图3E显示，在药物浓度为30mg/mL和15mg/mL时对流感病毒的子代病毒的复制有抑制作用，但是浓度为7.5mg/mL时对子代病毒的复制没有抑制作用。上述病毒组是指：仅给予病毒刺激，没有加任何药物干预的实验组；“30”是指病毒刺激+30mg/mL的药物干预；“15”是指病毒刺激+15mg/mL的药物干预；“7.5”是指病毒刺激+7.5mg/mL的药物干预；实验中对照组设置为：没有经过任何处理的“正常组”。
以上结果表明检测药物——板蓝根多糖(70％醇沉物)能有效的抑制流感病毒以及流感病毒诱导的炎症反应。
1.3.3板蓝根多糖(80％醇沉物)作用24小时后抑制流感病毒诱导的炎症因子的表达以及对流感病毒的子代病毒复制的抑制
药物浓度在30mg/mL，15mg/mL和7.5mg/mL均对病毒诱导的炎症因子的mRNA水平有抑制作用。对炎症因子IP-10、IL-6、MIG、CCL-5等的mRNA水平的抑制作用最为明显，在药物浓度为7.5mg/mL对IP-10的mRNA水平的抑制率约5倍(图4A)；对IL-6的mRNA水平的抑制率约2倍(图4B)；对MIG的mRNA水平的抑制率也约为1.5倍(图4C)；对CCL-5的mRNA水平的抑制率约为5倍(和病毒组相比较)(图4D)。炎症因子蛋白水平的检测也显示，药物在浓度为30mg/mL和15mg/mL对IP-10的蛋白水平有明显的抑制作用，但是浓度为7.5mg/mL时对IP-10的蛋白水平没有抑制作用(图4E)。图4F显示，在药物对流感病毒的子代病毒的复制没有抑制作用。上述病毒组是指：仅给予病毒刺激，没有加任何药物干预的实验组；“30”是指病毒刺激+30mg/mL的药物干预；“15”是指病毒刺激+15mg/mL的药物干预；“7.5”是指病毒刺激+7.5mg/mL的药物干预；实验中对照组设置为：没有经过任何处理的“正常组”。
以上结果表明检测药物——板蓝根多糖(80％醇沉物)的药效主要体现在对流感病毒诱导的炎症反应有抑制作用，但是对流感病毒的复制没有抑制作用。
1.3.4板蓝根多糖(80％醇沉物)作用6小时后对流感病毒诱导的炎症因子表达的抑制
药物作用6小时后，药物能有效的抑制IP-10和MIG的mRNA表达水平，但是药物浓度为7.5mg/mL时对炎症因子的表达的抑制作用较弱。具体数值见图5A、图5B。上述病毒组是指：仅给予病毒刺激，没有加任何药物干预的实验组；实验中对照组设置为：没有经过任何处理的“正常组”。
试验例2板蓝根多糖(80％醇沉物)抑制TLR3受体的表达
2.1实验材料
2.1.1药物受试样品：板蓝根多糖(80％醇沉物)。
2.1.2细胞人气道上皮细胞(16HBE)购自中国科学院上海细胞库。
2.1.3病毒株普通甲型H1N1流感病毒(A/PR/8/34，H1N1)购自ATCC，以Reed-Muench法测定其感染复数(M.O.I)，以M.O.I＝1作为病毒滴度感染细胞。
2.1.4试剂DMEM培养基(批号：8114176)；PBS(批号：20150122)，胎牛血清(批号：10099)均购自GIBCO公司。RIPA裂解液购自美国sigma公司。NP蛋白一抗购自SANTACRUZBIOTECHNOLOGY公司(sc-80481)。GADPH一抗购自CellSignalling公司(#2118)。山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗购自美国KPL公司。
2.2实验方法
2.2.116HBE细胞培养
将正常人气道上皮细胞(16HBE)接种于100mm培养皿内，用10％DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO2，饱和湿度条件下在细胞孵育箱中进行培养，待细胞生长进入对数增殖期时，收集细胞。对收集的细胞进行计数后，以每孔3×105个/mL的密度接种于6孔板细胞培养皿中，24小时后显微镜下观察细胞贴壁、生长良好。换1％DMEM高糖培养基将细胞饥饿培养24小时后进行下一步病毒和药物刺激实验，加刺激物时，将细胞培养基换成不含胎牛血清的培养基。
2.2.2病毒和药物刺激
细胞贴壁24小时后，PBS冲洗2遍，用不含血清的DMEM将甲型流感病毒H1N1(PR8)稀释至M.O.I＝1，每孔加入0.5mL病毒液，37℃贴壁2小时。用不含胎牛血清但是含0.4μg/mLTPCR酶的DMED稀释药物，每孔加入1mL，作用24小时后收集细胞蛋白裂解液进行蛋白免疫印迹检测。
2.2.3细胞裂解液蛋白浓度检测(BCA法)
①按照说明书配备好BSA标准品(产品中附带)；
②制备BCA工作液(WR)：使用下述公式来确定所需的工作液总体积：(标准品的个数+待测蛋白质样品的个数)×(实验重复次数)×(用于每个样品的工作液的体积)＝所需的工作液的体积；
③取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各10μL，加入到微孔板中(检测范围＝125～2000μg/ml)；
④在每一个孔中加入200μL工作液(样品与工作液的比例是1:20)，并在振荡器上震荡30s，使其充分混合；
⑤将微孔板密封，在37℃孵育30min；
⑥将微孔板冷却到室温，使用全波长酶标仪读数，测量样品在562nm波长的吸光值；
⑦将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的吸光值；
⑧将BSA标准品在562nm处经过空白校正的平均吸光值对其浓度(μg/ml)作图，绘制标准曲线。按照标准曲线计数待测样品中蛋白质的浓度。
2.2.4TLR3蛋白免疫印迹实验
①RIPA裂解液提取细胞蛋白；
②电泳：100V10min；150V50min，或者将溴酚蓝跑至底部；
③转膜：分离出分离胶，根据目的蛋白片段大小切胶，并剪好PVDF膜和滤纸(大小为滤纸＞PVDF膜＞胶)，用甲醇活化PVDF膜，将活化后的PVDF膜同滤纸一起放入电转液中，按照“海绵—滤纸—凝胶—PDF膜—滤纸—海绵”的顺序放置好，制作“三明治”夹(注意每层之间不能有气泡同时注意电极方向)。将制作好的“三明治”夹放入电转槽中。同时在槽中放入冰袋降温，以防电转时产热过高。转膜条件：300mA，80min；
④封闭：电转完毕后，将膜取出，作好标记后置于5％牛奶封闭液中，一般常温封闭1小时或4℃过夜；
⑤一抗孵育：封闭结束后，用2.5％的抗体稀释液将目的蛋白一抗稀释(1:1000)，常温孵育2h或4℃过夜；
⑥二抗孵育：一抗孵育结束后，用TBST洗液洗膜3次，每次10min，然后加入二抗稀释液(1:3000)，常温孵育1h；TBST洗液洗膜3次，每次10min；
⑦曝光：按体积1:1配制ECL发光液A和B，使用仪器Tanon-5200曝光。
2.3实验结果
板蓝根多糖(80％醇沉物)在药物浓度为30mg/mL和15mg/mL时对病毒刺激诱导表达增加的TLR3的表达量有明显的抑制作用，在药物浓度为7.5mg/mL时抑制作用消失，呈现明显的浓度梯度依赖性。结果提示，板蓝根多糖(80％醇沉物)抑制流感病毒诱导的炎症反应的机制在于对病毒诱导的TLR3通路的抑制(参见图6)。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.板蓝根多糖在制备用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为板蓝根多糖在制备具有抑制流感病毒诱导的炎症因子产生的作用的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的流感病毒为甲型流感病毒A/PR/8/34株。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括板蓝根多糖和药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述载体选自淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、微精纤维素、碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钙、羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、胶浆、糖浆、聚乙二醇、海藻酸钠、阿拉伯胶、桃胶、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲淀粉钠、酒石酸、柠檬酸、碳酸氢钠、碳酸钠、酸酐、滑石粉、硬脂酸镁、液体石蜡、微粉硅胶和聚乙二醇中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆、口服液、吸入剂、喷雾剂、乳膏、霜剂或凝胶剂。
7.权利要求1所述板蓝根多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：称取一定量的板蓝根药材，加入8～12倍质量纯水，回流提取2～4h，冷却，滤出提取液，重复上述提取过程2～4次，减压蒸馏，即得浓缩后的板蓝根多糖水提液；将浓缩后的板蓝根多糖水提液，加入无水乙醇混匀，使无水乙醇的体积分数达到50％以上，冷藏后离心，收集沉淀，冷冻干燥，得到醇沉的板蓝根多糖。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：称取一定量粉碎后的板蓝根药材，加入10倍质量纯水，回流提取2h，冷却，滤出提取液，重复上述提取过程两次，减压蒸馏，即得浓缩后的板蓝根多糖水提液；将浓缩后的板蓝根多糖水提液，加入无水乙醇混匀，使无水乙醇的体积分数达到50％以上，4℃冷藏24h，4500r/min条件下离心10min，收集沉淀，冷冻干燥，得到醇沉的板蓝根多糖。
9.一种用于预防或治疗流感病毒诱导的炎症性疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，按重量百分比计含有1％～99％的板蓝根多糖。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有药学上可接受的载体，所述载体选自淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、微精纤维素、碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钙、羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、胶浆、糖浆、聚乙二醇、海藻酸钠、阿拉伯胶、桃胶、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲淀粉钠、酒石酸、柠檬酸、碳酸氢钠、碳酸钠、酸酐、滑石粉、硬脂酸镁、液体石蜡、微粉硅胶和聚乙二醇中的一种或多种。
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