CN102416082A - 一种治疗失眠的中药提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种治疗失眠的中药提取物,其由半夏1-5重量份、夏枯草1-5重量份用乙醇提取制备或由半夏、夏枯草用乙醇提取后的提取液先用低极性溶剂提取,回收低极性溶剂后的提取液再用乙酸乙酯提取或由半夏、夏枯草用乙醇提取后通过大孔树脂柱;本发明中药提取物能显著抑制小鼠的自主活动,有较强的镇静安神作用,能有效的促进睡眠,对失眠有较好的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取物,特别涉及一种治疗失眠的中药提取物。
背景技术
失眠,是指无法入睡或无法保持睡眠状态,导致睡眠不足,又称入睡和维持睡眠障碍(DlMS),为各种原因引起入睡困难、睡眠深度或频度过短、早醒及睡眠时间不足或质量差等,是最常见的睡眠障碍。常见导致失眠的原因主要有环境原因、个体因素、躯体原因、精神因素、情绪因素等。而根据传统中医理论,失眠的原因主要为脏腑机能紊乱,尤其是心的温阳功能与肾的滋阴功能不能协调、气血亏虚、阴阳失调等。在国外的大多数流行病学调查结果显示,每年大约有33%的人出现过睡眠障碍,有17%的人为严重失眠,失眠严重影响人们的生活、工作及身心健康。因此,开发有效、安全的抗失眠药物,已成为一项迫切的医疗和社会问题。
现在的治疗失眠的医学手段包括:心理催眠疗法、心理仪器疗法、物理治疗和中医的药(热)熨疗法、食物疗法及药物治疗,但在疗效和治疗质量上,不尽如人意,所以现在寻找无副作用的、治疗方法简便、有效的药物已成为一个趋势。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种治疗失眠的中药提取物。
本发明另一个目的在于公开了该中药提取物的制备方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的:
一种治疗失眠的中药提取物,该提取物由半夏、夏枯草用乙醇提取制备,所述中药提取物含总生物碱以麻黄碱计为为2.8-12.2mg/g和/或熊果酸5.0-21.5mg/g;
优选的,上述乙醇提取用乙醇为50%-90%的乙醇;更优选的,上述乙醇提取用乙醇为60%-80%的乙醇;最优选为:70%或75%;
优选的,上述乙醇提取为回流提取;
优选的,原料药的组成为:半夏1-5重量份、夏枯草1-5重量份;更优选的,原料药的组成为:半夏1重量份、夏枯草1重量份。
一种治疗失眠的中药提取物的制备方法,该方法包括如下步骤:
取半夏、夏枯草,用乙醇提取;
优选的,上述乙醇提取用乙醇为50%-90%的乙醇;更优选的,上述乙醇提取用乙醇为60%-80%的乙醇;最优选为:70%或75%。
优选的,上述乙醇提取为回流提取;
优选的,原料药的组成为:半夏1-5重量份、夏枯草1-5重量份;更优选的,原料药的组成为:半夏1重量份、夏枯草1重量份。
一种治疗失眠的中药提取物,该提取物由半夏、夏枯草用乙醇提取,提取液回收乙醇,回收乙醇后的提取液先用低极性溶剂提取,回收低极性溶剂后的提取液再用乙酸乙酯提取,留取乙酸乙酯部分,回收乙酸乙酯并减压干燥,得中药提取物,所述中药提取物含总生物碱以麻黄碱计为为1.2-5.5mg/g和/或熊果酸2.5-11.0mg/g;
优选的,上述乙醇提取的乙醇为50%-90%的乙醇;更优选的,上述乙醇提取的乙醇为60%-80%的乙醇;最优选为:70%或75%;
优选的,上述乙醇提取为回流提取;
优选的,低极性溶剂为乙醚;
优选的,原料药的组成为:半夏1-5重量份、夏枯草1-5重量份;更优选的,原料药的组成为:半夏1重量份、夏枯草1重量份。
一种治疗失眠的中药提取物的制备方法,该方法包括如下步骤:
取半夏、夏枯草,用乙醇提取,提取液回收乙醇,回收乙醇后的提取液先用低极性溶剂提取,回收低极性溶剂,回收低极性溶剂后的提取液再用乙酸乙酯提取,留取乙酸乙酯部分,回收乙酸乙酯并减压干燥,即得;
优选的,上述乙醇提取用乙醇为50%-90%的乙醇;更优选的,上述乙醇提取用乙醇为60%-80%的乙醇;最优选为:70%或75%;
优选的,上述乙醇提取为回流提取;
优选的,低极性溶剂为乙醚;
优选的,原料药的组成为:半夏1-5重量份、夏枯草1-5重量份;更优选的,原料药的组成为:半夏1重量份、夏枯草1重量份。
一种治疗失眠的中药提取物,该提取物由半夏、夏枯草用乙醇提取,回收乙醇的提取液通过大孔树脂柱,先用水洗脱,洗脱液弃去,再用乙醇洗脱,洗脱液回收乙醇,得中药提取物,所述中药提取物含总生物碱以麻黄碱计为2.2-9.78mg/g和/或熊果酸4.5-19.0mg/g;
优选的,上述乙醇提取用乙醇为50%-90%的乙醇;更优选的,上述乙醇提取用乙醇为60%-80%的乙醇;最优选为:70%或75%;
优选的,上述乙醇提取为回流提取;
优选的,原料药的组成为:半夏1-5重量份、夏枯草1-5重量份;更优选的,原料药的组成为:半夏1重量份、夏枯草1重量份;
优选的,所述大孔树脂柱为D101型大孔吸附树脂,树脂用量以药膏量计算,相当药膏重量的的8-12倍,优选10倍;所述药膏为回收乙醇后的提取液在60℃浓缩为密度为1.1-1.4的提取物。
一种治疗失眠的中药提取物的制备方法,该方法包括如下步骤:
取半夏和夏枯草,用乙醇提取,提取液回收乙醇,提取液通过大孔树脂柱,先用水洗脱,洗脱液弃去,再用乙醇洗脱,洗脱液回收乙醇并减压干燥成干膏粉即得。
优选的,上述乙醇提取用乙醇为50%-90%的乙醇;更优选的,上述乙醇提取用乙醇为60%-80%的乙醇;最优选为:70%或75%。
优选的,上述乙醇提取为回流提取;
优选的,原料药的组成为:半夏1-5重量份、夏枯草1-5重量份;更优选的,原料药的组成为:半夏1重量份、夏枯草1重量份;
优选的,所述大孔树脂柱为D101型大孔吸附树脂,树脂用量约为药膏量的10倍。
上述半夏为法半夏。
本发明中药提取物可以按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型,例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂等制剂。
为使上述剂型能够实现,需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料,例如:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等;崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等;润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等;助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等;粘合剂包括,淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等;甜味剂包括:糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矫味剂包括:甜味剂及各种香精;防腐剂包括:尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等;基质包括:PEG6000,PEG4000,虫蜡等。
而本发明半夏、夏枯草的提取物有效部位能显著抑制小鼠的自主活动,有较强的镇静安神作用,同时还能激动HT1A受体,又能拮抗HT2A和HT2C受体,说明其在减少REM睡眠和增加深睡眠方面具有协同作用,综合表明,本发明能有效的促进睡眠,对失眠有较好的治疗作用。
附图说明
图1:本发明组分对HTR1A激动作用实验;
图2:本发明组分对HTR2A拮抗作用实验;
图3:本发明组分对HTR2C拮抗作用实验;
实验例药效学实验研究
1.1.材料
动物:健康昆明种小鼠20士2g,雌雄兼用。
药品与试剂:按照实施例1制备,提取物用75%的醇提取液回收溶剂后制备的灌胃液1g/ml;枣仁安神由北京同仁堂有限公司出品。
1.2醇提取物对正常小鼠自主活动的影响的检测方法:
1.2.1检测方法
小鼠50只,雌雄兼用,随机分成5组,每组10只,分别为阴性组(生理盐水,0.001ml/g灌胃给药),阳性组(酸枣安神液,0.0017ml/g灌胃给药),1号、2号、3号组(1、2、3号分别为75%乙醇物0.0033ml/g、0.0040ml/g、0.0050ml/g三个剂量组),分别进行测试,60分钟后记录小鼠活动,记录指标为小鼠活动次数。每只小鼠在每次实验前,均先进箱适应5min随后记录小鼠5分钟内的活动次数总和。实验统计采用组间t检验,结果见表1自主活动值。
*为与阴性的显著性差异,**为极显著差异。
1.3结论:
本发明3个剂量组在给药后,小鼠的自主活动明显少于给药前,均能抑制小鼠的自主活动,与阴性组比较有显著差异;其中2、3号还与阴性有极显著差异,且从表中看出,本发明3号抑制自主活动效果最好。
实验例2分段提取物对正常小鼠自主活动的影响
2.1试药制备
取半夏和夏枯草各1重量份,用75%乙醇提取,提取液回收乙醇后,分别用下列提取方法制备成分段提取物:
(1)在提取液中加乙醚振摇提取3次,每次1倍量,分取乙醚提取液,减压回收溶剂至干,残渣加水制成每1ml含1g生药的混合液,作为乙醚段灌胃备用;
(2)取上述乙醚提取后的水液,加乙酸乙酯振摇提取3次,每次1倍量,分取乙酸乙酯提取液,减压回收溶剂至干,残渣加水制成每1ml含1g生药的混合液,作为乙酸乙酯段灌胃备用;
(3)取上述乙酸乙酯提取后的水液,减压浓缩至每1ml含1g生药的混合液,作为水液段灌胃备用;
将上述各组进行灌胃比较。
2.2检测方法
实验动物随机分6组,每组10只,即阴性组(生理盐水0.001ml/g)、阳性组(酸枣安神液,0.0017ml/g)、乙醚段组、乙酸乙酯段组、水段组、(上述分段提取物剂量均为0.0050ml/g)6个组;分别进行测试,60分钟后记录小鼠活动,记录指标为小鼠活动次数;每只小鼠在每次实验前,均先进箱适应5min随后记录小鼠5分钟内的活动次数总和。实验统计采用组间t检验,结果见表2自主活动值。
*为与阴性的显著性差异P<0.05,**为极显著差异P<0.01;ο为与阳性的显著差异P<0.05;οο为极显著差异P<0.01。
2.3结论
从表2看出,乙酸乙酯段组能明显抑制小鼠的自主活动,与阴性组有极显著性差异,说明其有镇静作用;水段组也能抑制小鼠活动,与阴性有显著性差异,但阳性也与其有显著差异,说明其镇静作用差;乙醚段组抑制作用最弱,与阴性无差异,几乎对小鼠自主活动没有抑制作用。
且可以看出乙酸乙酯段组>水段组>乙醚段组,乙酸乙酯组明显抑制了小鼠的自主活动,表明乙酸乙酯组为本发明中主要产生药效的分段组,统计结果差异非常显著(P<0.01),咯优于阳性对照组,统计结果差异不显著(P>0.05),说明起主要作用的是乙酸乙酯萃取的组分。
实验例3大孔树脂提取物对正常小鼠自主活动的影响
3.1.材料
动物:健康昆明种小鼠20±2g,雌雄兼用。
药品与试剂:
大孔树脂组:按照实施例2制备成灌胃液1g生药/ml。
乙酸乙酯组:按实验例2的试药制备项下第(2)部分制得的乙酸乙酯灌胃液作为供试品溶液。
枣仁安神由北京同仁堂有限公司出品
3.2大孔树脂提取物对正常小鼠自主活动的影响的检测方法:
3.2.1检测方法
小鼠40只,雌雄兼用,随机分成4组,每组10只,分别为阴性组(生理盐水,0.001ml/g灌胃给药),阳性组(酸枣安神液,0.0017ml/g灌胃给药),大孔树脂组和乙酸乙酯组(剂量均为0.0050ml/g)),分别进行测试,60分钟后记录小鼠活动,记录指标为小鼠活动次数。每只小鼠在每次实验前,均先进箱适应5min随后记录小鼠5分钟内的活动次数总和。实验统计采用组间t检验,结果见表3自主活动值。
*为与阴性的显著性差异P<0.05,**为极显著差异P<0.01;
3.3结论:
大孔树脂组剂量组在给药后,小鼠的自主活动明显少于给药前,能抑制小鼠的自主活动,与阴性组比较有显著差异,其作用效果与乙酸乙酯组接近。
实验例4受体细胞模型的建立及评价实验
实验方法参照下述文献方法:[1]、匡志鹏,谢裕安,梁安民,等.pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达.中国现代医学杂志,2007,17(9):1059;[2]Gavarini S,Becamel C,Chanrion B,BockaertJ,Marin P.Molecular and functional characterization of proteins interacting withthe C-terminal domains of 5-HT2 receptors:emergence of 5-HT2“receptosomes”.Biol Cell,2004,96(5):373-381.[3]刘建巨,吴雅臻,李辉南,等.真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin的构建及其在293T细胞中的表达.中国生物制品学杂志,2006,19(2):153
4.1分子克隆技术
建立基于pcDNA3.1-hygro载体的5-HT1A和5-HT2A/2C表达载体,并测序验证。
(1)PCR扩增目的片段
将5-HT1A、5-HT2A/2C模板质粒的含量调整一致。分别取模板质粒1μL,加入10×浓度的缓冲液5μL、10mM浓度的dNTP 1μL、各自基因的上游引物(P1)和下游引物(P2)各1μL,Platium Taq DNA聚合酶0.5μL,用去离子水补足总体积至50μL,将反应混合物置于PCR仪中。PCR参数设置为:94℃预变性5分钟后,按94℃30秒,55℃305秒,72℃2分钟的条件进行35个循环,最后72℃延伸10分钟。反应结束后各取PCR产物10μL进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
(2)琼脂糖凝胶分离DNA片段的回收
在长波紫外线下用干净的刀片切下目的条带,切取时体积尽量小,将胶块下层没有DNA的部分一并切除,仅留取集中含有目的DNA的薄层胶片,并装入一个干净的1.5mL离心管中。琼脂糖凝胶中的DNA用硅胶离心柱回收纯化试剂盒进行回收和纯化。
(3)目的片段和质粒载体的酶切反应
依据NEB公司提供的酶切反应体系,分别取适量质粒pCDNA3.1/hygro+和回收获得的目的DNA片段各2μg,10×浓度的缓冲液5μL,100×浓度的BSA 0.5μL,相应内切酶各1μL,37℃条件下孵育2小时进行双酶切反应。孵育结束后电泳鉴定酶切效率。琼脂糖凝胶分离回收酶切后的DNA片段,定量后备用。
(4)连接反应
取酶切后的目的DNA片段7μL、质粒pcDNA3.1-hygro 1μL、10×Ligation缓冲液1μL和T4 Ligase 1μL,混合后置于4℃下过夜。
(5)连接产物转化感受态细胞筛选阳性克隆
取制备好的感受态细胞E.coli DH5α或Top10 100μL,加入连接产物10μL,轻轻混匀,冰上放置30分钟,42℃水浴热休克90秒,迅速插入冰中,冰浴3分钟。加入LB培养基500mL,37℃,150rpm振荡培养1小时,取200μL铺于含有Amp抗性的LB固体培养基上。37℃培养过夜至菌落直径为1~2mm。
(6)PCR鉴定重组菌落——菌落PCR(Colony PCR)
于0.2mL离心管中加入无菌去离子水50μL,从转化平板上挑取直径大于1mm的若干单菌落转移至离心管中,置99℃水浴5分钟,使细胞裂解和DNase变性,12,000rpm离心1分钟,去除细胞碎片,取上清液1μL至新的0.2mL离心管中,4℃保存备用。
准备反应混合液,每个反应包含以下材料和试剂:无菌水20μL、dNTP(2.5mM)1μL、上游引物(5μM)1μL、下游引物(5μM)1μL、10×Taq缓冲液2μL、Taq DNA聚合酶1μL和细胞裂解上清液1μL,终体积为20μL。
将上述成分混匀后,置PCR仪中进行反应,设置的PCR反应参数为:94℃预变性5分钟后,按94℃30秒,55℃30秒,72℃2分钟的条件进行30个循环,最后72℃延伸10分钟。反应结束后各取PCR产物10μL,加入0.2个体积的6×Gel缓冲液,进行1%琼脂糖凝胶电泳分析,用琼脂糖电泳对PCR产物进行分析。从中选取阳性克隆提取质粒。
(7)质粒DNA的小量制备
挑取单个菌落接种于含相应抗生素的3mL LB培养基中,37℃振荡培养过夜。用离心柱质粒小提试剂盒回收(Axygen公司)。
本实验中用到的宿主菌和含有重组质粒的转化单克隆菌株保存方法有两种:一种是在菌液中混入甘油,-80℃低温冻存,用于较长时间内保存菌种;第二种是将涂布的平板封口存放于4℃,可以在一个月内使用。
(8)重组质粒的酶切鉴定
在0.2mL离心管中加入质粒DNA 5μL、10×酶切缓冲液2μL、内切酶1μL和BSA 0.2μL,补加去离子水至20μL,混匀后37℃下孵育2小时,以天根公司Marker3作为分子量标准,用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。
(9)DNA片段的序列分析
将酶切鉴定证明含有插入片段的重组质粒DNA进行序列测定。测序结果用BLAST软件比对。
(10)HEK293细胞系的转染和筛选
在含10%胎牛血清的DMEM培养基中,37℃,5%CO2条件下传代培养HEK293细胞,取对数生长期细胞进行实验。在35mm2细胞培养皿瓶内以3×106的密度接种细胞,继续培养16~24小时,待细胞长至80%~90%融合时即可进行转染。用无血清培养液更换细胞培养基,用OPI-MEM分别将质粒10μg(5-HT2A/2C为单质粒转染,5-HT1A为Ga15共转染)和脂质体试剂(Lipofectamine2000)20μL稀释至500μL,室温孵育5分钟。然后将质粒DNA与脂质体的稀释液混合,室温静置20分钟,再将脂质体-DNA混合物加至细胞培养基中,37℃,5%CO2条件下培养4~6小时,换成含有10%胎牛血清的DMEM培养基,继续培养24小时。
按照以上的操作说明,将以上质粒分别转染HEK293细胞,培养24小时后传代,加入相应抗生素筛选。
将质粒pEGFP-N1转染HEK293细胞,作为转染效率的阳性对照。同时设立瞬时转染对照。
(11)抗性克隆的抗生素筛选
转染后24小时,细胞以1∶20~1∶30比例传代至60mm2培养皿,分别加入hygromycin,终浓度为150μg/mL。每3天更换一次培养基,37℃,5%CO2条件下培养14天后,根据克隆团形成情况加入刺激剂并挑选阳性克隆。
4.2细胞模型验证
(1)量效关系、时间效应关系测试
HEK293稳定转染的细胞系以每孔4×104细胞密度接种于96孔板,继续培养24小时后,用无血清培养液更换细胞培养基,同时加入系列稀释浓度的样品,每个浓度均加复孔,利用FlexStation检测钙流变化及荧光变化,得出化合物与细胞活性间的量效关系。
(2)细胞密度,DMSO、血清敏感度测试
HEK293稳定转染的细胞系以每孔递增的细胞密度接种于96孔板,37℃,5%CO2条件下继续培养24小时后,用无血清培养液更换细胞培养基,同时加入刺激剂,利用FlexStation检测钙流变化及荧光变化。
HEK293稳定转染的细胞系以每孔4×104细胞密度接种96孔板,37℃,5%CO2条件下继续培养24小时后,用无血清培养液更换细胞培养基,同时加入不同浓度的DMSO(终浓度分别为0.1%、1%、5%、10%),每个浓度均加复孔,利用FlexStation检测钙流变化及荧光变化。
(3)冻存前后细胞稳定性测试
HEK293稳定转染的细胞系传代5、10、15、20、30代的细胞,每个浓度均加复孔,利用FlexStation检测钙流变化及荧光变化。
4.3本发明组分的活性检测
对于5-HT受体的不同亚型,激动HTR1A,拮抗HTR2A/2C,或者同时激动HTR1A和拮抗HTR2A/2C条件下都能起到一定促进睡眠的功能;实验过程中考察本发明组分激动HTR1A受体或拮抗HTR2A/2C受体,具体细胞实验设计方案见表4。
表4细胞实验设计方案
(上表中的浓度均为仪器最终检测时的浓度。对于HTR1A激动实验,仪器最终检测的浓度为化合物初始浓度的1/500,对于HTR2A/2C的拮抗实验,仪器最终检测的浓度为化合物初始浓度的1/100,后期所有实验的浓度关系均同上。)
4.4本发明组分对HTR1A的激动作用
取本发明组分干膏粉(实施例3制备),用DMSO溶解,制成浓度分别为200,100,50,17,5,0.5mg/mL的溶液,各吸取1μL加入到含HBSS 99μL的化合物板中;96孔板用Matrigel包被,每孔Matrigel用量为40μL,室温下放置15min后,吸去Matrigel,HEK293/G15/5-HT1A细胞系以每孔4×104的细胞密度接种于96孔板,置37℃,5%CO2条件下培养24小时。用Fluo-8染色缓冲液(缓冲液组成为fluo-8 20μL,50×red-dye 200μL,20×probenicid 50μL,HBSS 10mL)100μL更换细胞培养基,37℃,5%CO2条件下放置30min,同时设立HBSS对照组和无细胞对照组(无细胞对照组化合物的初始浓度为200mg/mL,其他试剂用量和操作步骤均与各个实验组相同)。将化合物板和细胞板放入Flexstation仪器中,测定各个实验组的荧光强度(RFU),结果如图1所示。
从图1结果中可知,本发明组分对5-HT1A受体有一定的激动效果。在低浓度(0.01mg/mL以下)时与阴性对照组相比无显著差别,但随着浓度的升高,其激动效果也逐渐明显,显示出了与5-HT对照组相当的活性。激动作用明显的实验组的RFU值均远远大于无细胞的对照组,说明荧光强度是由细胞受到刺激作用后产生的,排除了化合物自身假阳性的可能。
4.5本发明组分对HTR2A的拮抗作用
取本发明组分干膏粉(实施例3制备),用DMSO溶解,制成浓度为200,100,50,17,5,0.5,0.05mg/mL的化合物溶液;96孔板用Matrigel包被,每孔Matrigel用量为40μL,室温下放置15min,HEK293/5-HT2A细胞系以每孔4×104的细胞密度接种于96孔板,置37℃、5%CO2条件下培养24小时。用Fluo-8染色缓冲液99μL更换细胞培养基,37℃、5%CO2条件下放置20min,将化合物溶液和HBSS各1μL加入至各自对应的细胞孔中,10分钟后向各个细胞孔加入1μM的5-HT溶液。整个实验保证在避光的条件下操作。利用钙流检测方法测定各个实验组的荧光强度(RFU),结果如图2所示。
从结果中可知,本发明组分对5-HT2A受体也有一定的拮抗效果。在低浓度(0.05mg/mL以下)时与对照组相比无显著差别,但随着浓度的升高,其拮抗效果也逐渐明显。
4.6本发明组分对HTR2C的拮抗作用
取本发明组分干膏粉(实施例3制备),用DMSO溶解,制成浓度为200,100,50,17,5,0.5,0.05mg/mL的化合物DMSO液;96孔板用Matrigel包被,每孔Matrigel用量为40μL,HEK293/5-HT2C细胞系以每孔4×104的细胞密度接种于96孔板,置37℃、5%CO2条件下培养24小时。用Fluo-8染色缓冲液99μL更换细胞培养基,37℃、5%CO2条件下放置20min,将化合物溶液和HBSS各1μL加入至各自对应的细胞孔中,10分钟后向各个细胞孔加入1μM的5-HT溶液。利用钙流检测方法测定各个实验组的荧光强度(RFU),结果如图3所示。
从结果中可知,本发明组分对5-HT2C受体也有一定的拮抗效果。在低浓度(0.05mg/mL以下)时与对照组相比无显著差别,但随着浓度的升高,其拮抗效果也逐渐明显。
受体生物学效应表明,本发明组分既能激动HT1A受体,又能拮抗HT2A和HT2C受体,表明其在减少REM睡眠和增加深睡眠方面具有协同作用,治疗失眠作用前景广阔。
实验例5含量测定实验研究
5.1总生物碱含量测定实验
5.1.1对照品的配制
取盐酸麻黄碱对照品溶液(19.2μg/ml)2ml置50ml分液漏斗中,加入pH 5.4的柠檬酸盐缓冲液10ml,0.1%溴麝香草酚蓝2ml,振荡混匀,精密加入10ml氯仿,振摇1min,静置10min,取下层氯仿层,在415nm下测定。
5.1.2供试品方法:
称取按照实施例3制备的提取物0.2g,放入三角瓶中,加入氨水1ml、氯仿20ml,振摇3次,静置1h,超声1h,过滤,氯仿洗残渣3次(第一次用10ml,第二次和第三次均用5ml),合并滤液,置分液漏斗中,0.3mol/L H2SO4萃取3次(第一次用10ml,第二次和第三次均用5ml),合并滤液,用6mol/LNaOH调节pH>12,氯仿再萃取3次(第一次用20ml,第二次和第三次均用10ml),合并滤液,无水硫酸钠1g脱水,过滤定容至50ml。取10ml氯仿液,置于干燥的50ml分液漏斗中,加10ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH=5.4),加0.1%溴麝香草酚蓝2mL,加入10mL氯仿,振摇1min,静置10min,分取氯仿层,在415nm处进行检测。
5.1.3阴性对照试验
取2ml水置50ml分液漏斗中,加入pH5.4的柠檬酸盐缓冲液10ml,0.1%溴麝香草酚蓝2ml,震荡混匀,精密加入10ml氯仿,振摇1min,静置10min,取下层氯仿层,测定,结果空白溶液在415nm处无干扰。
5.1.4线型关系考察
精密吸取盐酸麻黄碱对照品溶液(19.2μg/ml)1、2、3、4、5ml置50ml分液漏斗中,加入pH5.4的柠檬酸盐缓冲液10ml,0.1%溴麝香草酚蓝2ml,振荡混匀,精密加入10ml氯仿,振摇1min,静置10min,取下层氯仿层,待测。以对进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。其回归方程为:Y=0.059X+0.061,相关系数r=0.9990。结果表明,盐酸麻黄碱在1.92~9.6μg范围内线性关系良好。结果见表5。
表5总生物碱含量测定线性关系考察结果
5.1.5精密度实验
将待测样品液在波长415nm处进行测定,连续测5次,记录吸光度值,计算相对标准偏差(RSD)为1.17%。见表6。
表6总生物碱含量测定的精密度实验结果
结果:从表看出,仪器精密度良好。
5.1.6稳定性试验
取上述供试品溶液,将待测样品液在波长415nm处进行测定,并在室温下每隔1h测定一次,连续测RSD为2.57%。见表7。
表7总生物碱含量测定稳定性实验结果
结果:从表看出,5小时内结果稳定。
5.1.7重复性试验
按照最佳提取工艺分别制备6批供试品溶液,在波长415nm处进行测定,数据见表8,计算含量,为1.8157mg/g,RSD为2.52%,表明重现性良好。
表8总生物碱含量测定重复性实验结果
结果:从表8看出,重复性良好。
5.1.8加样回收率试验
取本发明组分粉末(按照实施例3方法制备)0.1g,6份,置具塞锥形瓶中,分别加入盐酸麻黄碱对照品0.19mg,按“供试品溶液的制备”条同法操作,结果,平均加样回收率为100.94%,RSD为2.96%。
5.1.9样品含量测定
按照实施例3制备方法制备的本发明提取物含总生物碱以麻黄碱计为1.82mg/g,同法测得按照实施例2大孔树脂制备方法制备的提取物含总生物碱以麻黄碱计为3.26mg/g。
5.2熊果酸HPLC定量方法的研究
5.2.1色谱分析条件:
色谱柱:Dikma Diamonsil C18(150x4.6mm);
流动相:甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠(89∶11);
流速:1mL/min;
柱温:25℃;
进样量:10μl
色谱柱的理论塔板数按熊果酸计算,应不低于4000。
5.2.2线型关系考察
对照品的制备:取熊果酸对照品,加甲醇制成每1ml约含1mg的溶液,即得。
精密吸取熊果酸对照品甲醇溶液(1.07mg/ml)2、4、6、8、10μl,注入高效液相色谱仪,记录峰面积。以对进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。其熊果酸的回归方程为:Y=377.48X+1.3989,相关系数r=0.9996。结果表明,熊果酸标准品在2.14~10.7μg范围内线性关系良好。结果见表9。
表9熊果酸HPLC定量方法的线性关系考察
5.2.4供试品制备方法
精密称量本发明干膏粉(按实施例3方法制备)1g,置锥形瓶中,精密加入1%冰醋酸氯仿溶液30ml,超声提取2次,每次30分钟,滤过,残渣和滤器加适量上述溶剂洗涤,洗涤液与滤液合并,蒸干,残渣加无水乙醇溶解并定量转移到10ml容量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,摇匀,0.45μm滤膜滤过,作为供试品溶液。
测定:吸取供试品溶液10μL,记录色谱图。见图9~10。
5.2.5精密度试验
取同一供试品溶液,连续进样6次,记录色谱峰图,见表10。计算相对标准偏差(RSD)为1.94%。
表10熊果酸HPLC定量方法的精密度实验
结论:精密度良好。
5.2.6溶液中稳定性试验
取上述供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、24小时进样,记录色谱峰面积。结果见表11,表明样品液在24小时内稳定,RSD为2.79%。
表11熊果酸HPLC定量方法溶液中稳定性实验结果
结论:稳定性良好。
5.2.7重复性试验
分别制备6批供试品溶液,记录色谱峰面积,数据见表12,计算含量,为3.5514mg/g,RSD为2.57%。
表12熊果酸HPLC定量方法的重复性实验(mg/g)
结论:表明重现性良好。
5.2.8加样回收率试验
取按照实施例3方法制备的本发明0.5g,6份,置具塞锥形瓶中,分别加入熊果酸对照品1.86mg,按“供试品溶液的制备”同法操作,精密吸取10μL进样,记录色谱图,数据见表13。平均加样回收率为99.06%,RSD为2.76%。
表13熊果酸HPLC定量方法的回收率试验
5.2.9样品含量测定
测定样品三批,结果见表14,本发明含熊果酸计为2.4~12.2mg/g。
表14样品含量测定结果
按照实施例3制备方法制备的本发明提取物含熊果酸为3.69mg/g,同法测得按照实施例2制备方法制备的本发明大孔树脂提取物含熊果酸为6.37mg/g,参照药品限度制定常规,本发明含熊果酸为2.4~12.2mg/g。
下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果
具体实施方式
实施例1:提取物的制备
取半夏20g夏枯草20g,用10倍量75%乙醇回流提取,提取液回收乙醇,减压干燥成干膏粉,即得本发明中药提取物,总生物碱含量以麻黄碱计4.05(mg/g),熊果酸含量7.18(mg/g)。
实施例2:提取物的制备
取半夏20g和夏枯草20g,用8倍量70%乙醇回流提取,提取液回收乙醇,回收乙醇后的提取液通过D101型大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,洗脱液弃去,再用70%乙醇8倍量洗脱,洗脱液回收乙醇并减压干燥成干膏粉,即得本发明中药提取物,总生物碱含量以麻黄碱计1.82(mg/g),熊果酸含量3.69(mg/g)。
实施例3:提取物的制备
取半夏20g夏枯草20g,用9倍量75%乙醇回流提取,提取液回收乙醇后加乙醚振摇提取3次,每次1倍量,弃去乙醚液,弃去乙醚液的提取液再加乙酸乙酯振摇提取3次,每次1倍量,分取乙酸乙酯提取液,回收溶剂并干燥成干膏粉,即得本发明中药提取物,总生物碱含量以麻黄碱计3.26(mg/g),熊果酸含量6.37(mg/g)。
实施例4:片剂
取半夏15g和夏枯草20g,用8倍量70%乙醇回流提取,提取液回收乙醇,回收乙醇后的提取液通过D101型大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,洗脱液弃去,再用70%乙醇洗脱,洗脱液回收乙醇并减压干燥成干膏粉,按照常规片剂制备方法,加入常规片剂辅料,制成本发明片剂。
实施例5:胶囊剂
取半夏18g夏枯草20g,用12倍量80%乙醇回流提取,提取液回收乙醇后加乙醚振摇提取3次,每次1倍量,弃去乙醚液,弃去乙醚液的提取液再加乙酸乙酯振摇提取3次,每次1倍量,分取乙酸乙酯提取液,回收溶剂并干燥成干膏粉,按照常规胶囊剂制备方法,加入常规胶囊剂辅料,制成本发明胶囊剂。
实施例6:颗粒剂
取半夏15g和夏枯草16g,用15倍量60%乙醇回流提取,提取液回收乙醇,回收乙醇后的提取液通过D101型大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,洗脱液弃去,再用70%乙醇洗脱,洗脱液回收乙醇并减压干燥成干膏粉,按照常规颗粒剂制备方法,加入常规颗粒剂辅料,制成本发明颗粒剂。
实施例7:口服液
取半夏16g夏枯草16g,用7倍量80%乙醇回流提取,提取液回收乙醇后加乙醚振摇提取3次,每次1倍量,弃去乙醚液,弃去乙醚液的提取液再加乙酸乙酯振摇提取3次,每次1倍量,分取乙酸乙酯提取液,回收溶剂并干燥成干膏粉,按照常规口服液剂型制备方法,加入常规口服液剂型辅料,制成本发明口服液。
实施例8:丸剂
取半夏18g和夏枯草15g,用10倍量75%乙醇回流提取,提取液回收乙醇,回收乙醇后的提取液通过D101型大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,洗脱液弃去,再用70%乙醇洗脱,洗脱液回收乙醇并减压干燥成干膏粉,按照常规丸剂制备方法,加入常规丸剂辅料,制成本发明丸剂。
实施例9:实施例3含量测定
对照品的配制
取盐酸麻黄碱对照品溶液(19.2μg/ml)2ml置50ml分液漏斗中,加入pH5.4的柠檬酸盐缓冲液10ml,0.1%溴麝香草酚蓝2ml,振荡混匀,精密加入10ml氯仿,振摇1min,静置10min,取下层氯仿层,在415nm下测定;
供试品的制备:
称取为0.2g的本品放人三角瓶中,加入氨水1ml、氯仿20ml,振摇3次,静置1h,超声1h,过滤,氯仿洗残渣3次(第一次用10ml,第二次和第三次各为5ml),合并滤液,置分液漏斗中,0.3mol/L H2SO4萃取3次(第一次用10ml,第二次和第三次各为5ml),合并滤液,用6mol/L NaOH调节pH>12,氯仿再萃取3次(第一次用20ml,第二次和第三次各为10ml),合并滤液,无水硫酸钠1g脱水,过滤定容至50ml。取10ml氯仿液,置于干燥的50ml分液漏斗中,加10ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH=5.4),加0.1%溴麝香草酚蓝2mL,加入10mL氯仿,振摇1-3min,静置5-15min,分取氯仿层,在415nm处进行检测;
线型关系
精密吸取盐酸麻黄碱对照品溶液(19.2μg/ml)1、2、3、4、5ml置50ml分液漏斗中,加入pH5.4的柠檬酸盐缓冲液10ml,0.1%溴麝香草酚蓝0.1%溴麝香草酚蓝2ml,振荡混匀,精密加入10ml氯仿,振摇1min,静置10min,取下层氯仿层,待测,以对进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。其回归方程为:Y=0.059X+0.061,相关系数r=0.9990;
测定方法:测得中药提取物含总生物碱以麻黄碱计为3.8mg/g。
实施例10:实施例3含量测定
对照品的制备:取熊果酸对照品,加甲醇制成每1ml约含1mg的溶液,即得。
供试品的制备:
称量本品1g,置锥形瓶中,精密加入1%冰醋酸氯仿溶液30ml,超声提取2次,每次30分钟,滤过,残渣和滤器加适量上述溶剂洗涤,洗涤液与滤液合并,蒸干,残渣加无水乙醇溶解并定量转移到10ml容量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,摇匀,0.45μm滤膜滤过,作为供试品溶液;
精密吸取熊果酸对照品甲醇溶液(1.07mg/ml)2、4、6、8、10μl,注入高效液相色谱仪,记录峰面积。以对进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。其熊果酸的回归方程为:Y=377.48X+1.3989,相关系数r=0.9996;
测定:吸取供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,测得熊果酸为3.75mg/g。
Claims (10)
1.一种治疗失眠的中药提取物,其特征在于该提取物由半夏、夏枯草用乙醇提取,回收乙醇后的提取液先用低极性溶剂提取,回收低极性溶剂后的提取液再用乙酸乙酯提取,留取乙酸乙酯部分,回收乙酸乙酯得中药提取物;所述中药提取物含总生物碱以麻黄碱计为1.2-5.5mg/g和/或熊果酸2.5-11.0mg/g。
2.如权利要求1所述的提取物,其特征在于低极性溶剂为乙醚。
3.一种治疗失眠的中药提取物,其特征在于该提取物由半夏、夏枯草用乙醇提取,回收乙醇后的提取液通过大孔树脂柱,先用水洗脱,洗脱液弃去,再用乙醇洗脱,洗脱液回收乙醇,得中药提取物;所述中药提取物含总生物碱以麻黄碱计为2.2-9.78mg/g和/或熊果酸4.5-19.0mg/g。
4.一种治疗失眠的中药提取物,其特征在于该提取物由半夏、夏枯草用乙醇提取制备,所述中药提取物含总生物碱以麻黄碱计为2.8-12.2mg/g和/或熊果酸5.0-21.5mg/g;。
5.如权利要求1-4所述任一提取物,其特征在于乙醇为50%-90%的乙醇。
6.如权利要求5所述的提取物,其特征在于原料药的组成为:半夏1-5重量份、夏枯草1-5重量份;所述半夏为法半夏。
7.如权利要求1-4所述任一提取物在制备具有镇静安神作用药物中的应用。
8.一种治疗失眠的中药提取物的制备方法,其特征在于该提取物由半夏、夏枯草用乙醇提取,回收乙醇后的提取液先用低极性溶剂提取,回收低极性溶剂后的提取液再用乙酸乙酯提取,留取乙酸乙酯部分,回收乙酸乙酯得中药提取物。
9.一种治疗失眠的中药提取物的制备方法,其特征在于该提取物由半夏、夏枯草用乙醇提取,回收乙醇后的提取液通过大孔树脂柱,先用水洗脱,洗脱液弃去,再用乙醇洗脱,洗脱液回收乙醇,得中药提取物。
10.一种治疗失眠的中药提取物的制备方法,其特征在于该提取物由半夏、夏枯草用50%-90%的乙醇提取制备。
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