CN102481284A

CN102481284A - 穿心莲内酯化合物用于治疗炎症和气道病症的用途

Info

Publication number: CN102481284A
Application number: CN2010800183106A
Authority: CN
Inventors: 黄玮韶
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2010-03-24
Publication date: 2012-05-30
Also published as: EP2411004A1; US20120015923A1; WO2010110748A1; EP2411004A4; SG174892A1

Abstract

我们第一次描述了穿心莲内酯衍生物例如DDAG潜在地通过抑制NF-κB活性而有效减少小鼠哮喘模型中OVA诱导的炎性细胞向BAL液的募集，IL-4、IL-5、IL-13和eotaxin的产生，血清IgE的合成，肺的嗜曙红细胞过多，粘液高分泌和AHR。此外，低剂量的DDAG和糖皮质激素组合治疗协同性地减弱小鼠哮喘模型中的炎症。这些发现支持DDAG用于治疗哮喘的治疗价值。

Description

穿心莲内酯化合物用于治疗炎症和气道病症的用途

相关申请的交叉参考

本申请要求2009年3月24日提交的美国临时专利申请号61/162,861的权益和优先权，其内容在此通过引用方式并入本文。

技术领域

本申请涉及用于治疗气道病症例如哮喘和慢性阻塞性肺病的化合物。

背景技术

气道病症例如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)折磨着很多人。目前，世界上有大约300,000,000人患有哮喘。预计发病率在2025年将上升至400,000,000。哮喘是常见的气道慢性肺病，其是复杂的，其特征在于可变的和复发性的症状、气流阻塞、支气管高反应性(支气管痉挛)和潜在的炎症。哮喘的这些特征的相互作用决定了哮喘的临床表现和严重度以及对于治疗的响应。世界范围内的哮喘的上升的发病率和流行率已经发出信号：需要开发更好的治疗剂。哮喘的病理生理学是多因素的，涉及免疫应答和反应的复杂网络。此外，暴露于不确定的环境因素可以在具有不相似的遗传背景的人中引起不同的哮喘应答。所有这些促成了哮喘之发生的不确定性，因此使哮喘的控制变得困难。

哮喘是慢性气道病症，其特征在于气道炎症、粘液高分泌和气道高反应性(AHR)¹。导致发生AHR的确切机理仍然尚未完全知晓，但是发现其与肥大细胞和嗜曙红细胞介导的炎性应答相关。累积的证据表明：这些炎性应答是由T辅助2型(Th2)细胞联同肥大细胞、B细胞和嗜曙红细胞以及多种炎性细胞因子和趋化因子介导的^1-2。IL-4对于B细胞同种型转化以合成免疫球蛋白(Ig)E是必需的。变应原诱导的肥大细胞表面上的IgE-结合的高亲和性IgE受体(FcεRI)的交联引起肥大细胞的脱粒和激活，以及炎性介导子的释放，例如组胺、白三烯和细胞因子，以及立即的支气管缩窄^3-4。IL45对于嗜曙红细胞的生长、分化、募集和存活是关键性的，其引起哮喘中的炎症、甚至是气道重塑⁵。IL-13在Th2应答的效应期、例如嗜曙红细胞炎症、粘液高分泌、AHR和气道重塑中具有关键作用⁶。此外，趋化因子、例如RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌因子，regulated on activation，normal T cells expressed and secreted)和eotaxin对于嗜曙红细胞向气道的输送具有关键意义⁷。气道嗜曙红细胞过多联同Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13可以最终导致哮喘中的AHR⁸。核因子(NF)-κB的持续激活与哮喘的发展有关。

目前，哮喘的治疗包括支气管扩张剂和抗炎剂。目前有三种用于控制哮喘的抗炎试剂，包括1)吸入的类固醇，2)半胱氨酰-白三烯受体拮抗剂和3)色甘酸钠(cromolyn)。然而半胱氨酰-白三烯受体拮抗剂和色甘酸钠的治疗效果是高度可变的，并且可能受限于患者的某些亚群。吸入的皮质类固醇辅助抑制炎症并减少气道内层的膨胀，然而，糖皮质激素的使用与大的副作用相关，并且大约5％-10％的哮喘症是类固醇抗性的。皮质类固醇抗性患者呈现出显著的管理问题，因为几乎没有替代性的抗炎治疗⁵⁸。

用于控制轻度至重度哮喘患者的一线治疗包括使用高剂量的吸入的皮质类固醇(CS)与长效β2-激动剂(LABA)的组合。具有严重的持续哮喘的患者通常需要另外的药物，例如抗-白三烯和抗-IgE治疗。糖皮质激素是最常使用的哮喘治疗剂，在具有持续哮喘的患者中，吸入的皮质类固醇已经成为一线治疗²¹。然而，有低比例(5％-10％)的哮喘患者对于糖皮质激素无应答，即使在高剂量时或有辅助治疗时也没有²²。此外，关于CS的副作用的忧虑日益增多，例如骨质疏松症、青光眼、体重增加、骨密度降低、肌肉分解、停止排卵、儿童生长滞缓和伤口难愈合效应¹⁵。由于较高剂量的LABA的处方可以导致发生不想要的副作用，所以一般推荐LABA应该与CS或茶碱一起使用以更好地治疗。虽然CS与LABA的组合是目前用于治疗哮喘的最成功的治疗法，但是副作用的发生使得需要替代性的哮喘治疗法。

慢性阻塞性肺病(COPD)是指慢性支气管炎和肺气肿，这是两种常见的共存的肺的疾病，其中气道变窄(14)。这导致进出肺的气流受限，引起呼吸气短。与哮喘不同，气流的受限可逆性低，并且通常随着时间逐渐恶化。

COPD是由有害颗粒或气体(最常见的是来自吸烟的)引起的，其引发肺中的异常炎性应答。COPD的天然进程表征为：被称作急性加重的症状的偶然性突然恶化，多数是由于感染或空气污染引起的。COPD也被称作慢性阻塞性肺病(chronic obstructive lung disease，COLD)、慢性阻塞性气道疾病(chronic obstructive airway disease，COAD)、慢性气流受限(chronic airflow limitation，CAL)和慢性阻塞性呼吸疾病(chronic obstructive respiratory disease，CORD)。

目前COPD无治愈性疗法，被证明减少死亡率的唯一措施是停止吸烟和补充氧(14)。可以通过使用支气管扩张剂、例如β₂激动剂和/或抗胆碱能剂控制COPD。β₂激动剂刺激β₂受体，抗胆碱能剂阻遏来自胆碱能神经的刺激，二者都是松驰气道附近的平滑肌、增大气流的药物。有数种β₂激动剂可用：舒喘宁或舒喘灵和特布他林是广泛使用的短效β₂激动剂，其迅速提供COPD症状的缓解。长效β₂激动剂(LABA)例如沙美特罗和福莫特罗用作维持治疗。异丙托品(Ipratropium)是最广泛使用的短效抗胆碱能处方药。在COPD中，抗胆碱能剂似乎优于β₂激动剂，然而β₂激动剂和抗胆碱能剂二者都不具有抗炎作用，并且它们不阻断COPD的进展。

穿心莲内酯是半日花烷型(labdane)二萜，其是爵床科药用植物穿心莲[Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees]的主要生物活性成分。穿心莲内酯是提取自穿心莲的茎和叶的极苦的物质。该植物在中国和印度以药用而种植，传统上作为用于普通受寒、发烧和非传染性痢疾的草药。已经证明穿心莲内酯有效抵抗一些癌症，并且也证明具有抗癌^9-10，和肝细胞保护性活性¹¹。

14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯(DDAG)C₂₀H₂₈O₄，是分离自穿心莲的另一种二萜^18-19。穿心莲内酯和14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯(DDA)的结构显示于图1。

发明内容

因此，本发明的第一方面包括控制肺细胞中的炎症的方法，包括施用一定剂量的式I。

其中

R¹和R²可以选自羟基，甲氧基，亚甲基，或者醚或酯连接的糖基团；氢，取代或非取代的、线性或支链的(C₁-C₈)烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基等；芳基，例如苯基、萘基等，所述芳基可以是取代的；杂芳基，例如吡啶基、呋喃基、硫代苯基等，所述杂芳基可以是取代的；芳烷基，例如苄基、苯乙基等，所述芳烷基可以是取代的；杂芳烷基，例如吡啶甲基、吡啶乙基、呋喃甲基、呋喃乙基等，所述杂芳烷基可以是取代的；(C₂-C₈)烷酰基，例如乙酰基、丙酰基、丁酰基等，所述(C₂-C₈)烷酰基可以是取代的；(C₃-C₈)烯酰基，例如丙烯酰基、丁烯酰基、戊烯基等，所述(C₃-C₈)烯酰基可以是取代的；芳酰基，例如苯甲酰基等，所述芳酰基可以是取代的；杂芳酰基，例如吡啶羰基、呋喃羰基等，所述杂芳酰基可以是取代的；芳烯酰基，例如苯基丙烯酰基、苯基丁烯酰基、苯基戊烯酰基等，所述芳烯酰基可以是取代的；芳烷酰基，例如苯基丙酰基、苯基丁酰基、苯基戊酰基等，所述芳烷酰基可以是取代的；磺酰基，例如甲磺酰基、苯磺酰基、对甲基苯磺酰基等，所述磺酰基可以是取代的。

R³选自甲基或亚甲基；

R⁴选自羟基或羰基；

R⁵选自下列之一：羟基，烷基，甲氧基，亚甲基，或者醚或酯连接的糖基团。

在一个实施方式中，细胞是体外的。在另一个实施方式中，细胞是体内的并且向需要控制气道病症的患者施用式I。

在一个实施方式中，式I是穿心莲内酯。在另一个实施方式中，式I是14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯。

在一个实施方式中，控制炎症包括控制哮喘。在另一个实施方式中，控制炎症包括控制变应原性效应。在另一个实施方式中，控制炎症包括控制慢性阻塞性肺病(COPD)。

本发明的另一个方面包括治疗气道病症的方法，包括施用一定剂量的如上文定义的式I。在一个实施方式中，式I是用于治疗气道病症的穿心莲内酯。在另一个实施方式中，式I是用于治疗气道病症的14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯。在一个实施方式中，气道病症是哮喘加重。在另一个实施方式中，气道病症是COPD。在另一个实施方式中，治疗气道病症的方法还可以包括施用皮质类固醇。

本发明的另一方面包括如上文定义的式I的化合物用于治疗气道病症的用途。在一个实施方式中，式I是穿心莲内酯。在另一个实施方式中，式I是14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯。在一个实施方式中，该化合物可用于治疗哮喘加重的气道病症。在另一个实施方式中，该化合物可用于治疗COPD的气道病症。在另一个实施方式中，该化合物还可以包括施用皮质类固醇。

本发明的另一方面包括皮质类固醇与如上文定义的式I的组合物。在一个实施方式中，组合物的式I可以是穿心莲内酯。在另一个实施方式中，组合物的式I可以是14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯。在另一个实施方式中，组合物的皮质类固醇可以是地塞米松、布地奈德、氟替卡松、环索奈德或二丙酸倍氯米松。

在一个实施方式中，组合物可用于治疗气道病症，例如哮喘或COPD。

附图说明

通过参考本发明的数个具体实施方式的以下描述可以更好地理解本发明，如附图中所示，其中：

图1：(A)穿心莲内酯和(B)14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯(DDAG)的化学结构示意图。

图2：穿心莲内酯对于OVA诱导的炎性细胞募集和粘液高分泌的效应。(A)获自最后一次以盐水(n＝6只小鼠/组)或OVA(n＝7只小鼠/组)气雾剂刺激后24小时的致敏小鼠的BAL液中的炎性细胞计数。穿心莲内酯以剂量依赖性方式降低了获自最后一次以OVA气雾剂刺激后24小时的致敏小鼠的BAL液中的OVA诱导的炎性细胞计数(DMSO，n＝7；0.1mg/kg，n＝7；0.5mg/kg，n＝10；1mg/kg，n＝9只小鼠/组)。在最少500个细胞中进行差别化细胞计数，以鉴定嗜曙红细胞(Eos)、巨噬细胞(Mac)、嗜中性粒细胞(Neu)和淋巴细胞(Lym)。最后一次以盐水气雾剂、OVA气雾剂、OVA气雾剂+DMSO，或OVA气雾剂+1mg/kg穿心莲内酯刺激后24小时后的肺组织嗜曙红细胞过多的组织学检查(H&E染色，放大200倍)和粘液分泌的组织学检查(PAS，放大200倍)。^＊表示与DMSO对照相比具有显著差异，P＜0.05。

图3：穿心莲内酯对于BALF中的细胞因子水平的效应。在最后一次OVA气雾剂刺激后24小时收集BAL液。使用酶联免疫吸附检验(ELISA)分析IL-4，IL-5，IL-13和IFN-γ的水平。

图4：穿心莲内酯对于血清IgE的产生之效应。在最后一次OVA气雾剂刺激之后24小时收集小鼠血清。使用ELISA分析OVA特异性IgE和总IgE的水平。穿心莲内酯显著降低总IgE和OVA特异性IgE水平，这表明穿心莲内酯对于Th2应答的OVA特异性抑制。

图5：穿心莲内酯对于肺的炎症标志物的mRNA表达的效应。在最后一次OVA气雾剂刺激后24小时收集肺组织。使用TriZol试剂提取总mRNA，在2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并在UV光下显示。β-肌动蛋白用作内参。

图6：穿心莲内酯对于OVA诱导的气道高反应性的效应。在以DMSO或1mg/kg穿心莲内酯预处理后，在最后一次盐水气雾剂或OVA气雾剂刺激后24小时测定机械通风的小鼠对于静脉内醋甲胆碱的气道反应性。AHR表示为(A)肺阻力(Rl，n＝5只小鼠/处理组)和(B)动态顺应性(Cdyn，n＝5只小鼠/处理组)从基线水平的百分率变化。Rl定义为压力驱动的呼吸除以气流。Cdyn是指肺的膨胀性，定义为肺部压力变化所产生的肺的体积变化。

图7：(A)穿心莲内酯对于TNF-α刺激的正常人支气管上皮细胞的效应。在存在和不存在30μM穿心莲内酯的情况下，以10ng/ml TNF-α刺激上皮细胞5、15和30分钟，然后提取总蛋白以进行随后的免疫印迹分析。以抗-IKKβ、抗-磷酸化IKKβ(Ser¹⁸⁰)、抗-IκBα、抗-磷酸化IκBα(Ser^32/36)、抗-p65、抗-磷酸化p65(Ser⁵³⁶)或抗-β-肌动蛋白抗体探测免疫印迹，并以加强的化学发光试剂显影。(B)在存在和不存在30μM穿心莲内酯的情况下，以TNF-α刺激30分钟的上皮细胞的细胞核提取物中的p65水平的免疫印迹。通过10％的SDS-PAGE分离细胞核蛋白，以抗-p65或抗-TBP抗体探测，并使用Gel-Pro成像软件定量。TBP细胞核蛋白用作内参。使用TransAM^TM p65转录因子ELISA试剂盒，测定在存在和不存在30μM穿心莲内酯的情况下，以TNF-α刺激30分钟的上皮细胞的细胞核提取物中的p65 NF-κB的DNA结合活性。

图8：DDA对于OVA诱导的炎性细胞募集和粘液高分泌的效应。在使用卵白蛋白作为气道变应原的小鼠哮喘模型中，我们显示：DDA以剂量依赖性方式抑制卵白蛋白诱导的细胞浸润进入获自支气管肺泡灌洗液的气道。(A)获自最后一次以盐水或OVA气雾剂刺激后24小时的致敏小鼠的BAL液中的炎性细胞计数。DDA以剂量依赖性方式降低了获自最后一次以OVA气雾剂刺激后24小时的致敏小鼠的BAL液中的OVA诱导的炎性细胞计数。在最少500个细胞中进行差别化细胞计数，以鉴定嗜曙红细胞(Eos)、巨噬细胞(Mac)、嗜中性粒细胞(Neu)和淋巴细胞(Lym)。(B)最后一次以盐水气雾剂(OS)，OVA气雾剂(OO)，OVA气雾剂+DMSO(DMSO)，或OVA气雾剂+1mg/kgDDA(DDA)刺激后24小时的肺组织嗜曙红细胞过多的组织学检查(H&E，放大200倍)和粘液分泌的组织学检查(PAS，放大200倍)。

图9.DDAG对于OVA诱导的炎性细胞募集和粘液高分泌的效应。(A)获自最后一次以盐水气雾剂(n＝7只小鼠/组)或OVA气雾剂(n＝7只小鼠/组)刺激后24小时的致敏小鼠的BAL液中的炎性细胞计数。DDAG以剂量依赖性方式降低了获自最后一次以OVA气雾剂刺激后24小时的致敏小鼠的BAL液中的OVA诱导的炎性细胞计数(DMSO，n＝7；0.1mg/kg，n＝8；0.5mg/kg，n＝7；1mg/kg，n＝10只小鼠/组)。在最少500个细胞中进行差别化细胞计数，以鉴定嗜曙红细胞(Eos)、巨噬细胞(Mac)、嗜中性粒细胞(Neu)和淋巴细胞(Lym)。最后一次以盐水气雾剂，OVA气雾剂，OVA气雾剂+DMSO，或OVA气雾剂+1mg/kg DDAG刺激后24小时的肺组织嗜曙红细胞过多的组织学检查(B，放大200倍)和粘液分泌的组织学检查(C，放大200倍)。进行了肺切片中的炎性细胞浸润和粘液产生的定量分析。简而言之，为了测定炎性细胞浸润的严重性，进行了支气管周的细胞计数。为了测定粘液的产生程度，使用5分制系统以不知情方式定量气道上皮中的杯状细胞增生。^＊表示与DMSO对照相比具有显著差异，P＜0.05。

图10.使用甲苯胺-蓝染色在肺组织中检测到肥大细胞(A)。在石蜡切片中计数了脱粒和完整肥大细胞的数目。通过计数具有10％的挤出粒的细胞数目来计算肺中脱粒的肥大细胞的百分率(B)。

图11.DDAG对于OVA诱导的BAL液中细胞因子和趋化因子水平以及血清的Ig的产生之效应。(A)在最后一次OVA气雾剂刺激之后24小时收集BAL液。使用ELISA分析IL-4，IL-5，IL-13，eotaxin和IFN-γ(n＝6-9只小鼠/组)。检测的下限如下：IL-1和IL-5为4pg/ml；IL-13和IFN-γ为15.6pg/ml；eotaxin为2pg/ml。(B)在最后一次OVA气雾剂刺激之后24小时收集小鼠血清。使用ELISA分析总IgE、OVA特异性IgE、OVA特异性IgG1和OVA特异性IgG2a的水平(n＝6-9只小鼠/组)。数值表示为平均值±SEM。^＊表示与DMSO对照相比具有显著差异，P＜0.05。

图12.DDAG对于OVA诱导的AHR的效应。在以DMSO或1mg/kg DDAG预处理后，在最后一次盐水气雾剂或OVA气雾剂刺激后24小时测定机械通风的小鼠对于静脉内醋甲胆碱的气道反应性。AHR表示为(A)肺阻力(Rl，n＝7-9只小鼠/处理组)和(B)动态顺应性(Cdyn，n＝7-9只小鼠/处理组)从基线水平的百分率变化。Rl定义为压力驱动的呼吸除以气流。Cdyn是指肺的膨胀性，定义为肺部压力变化所产生的肺的体积变化。^＊表示与DMSO对照相比具有显著差异，P＜0.05。(C)

图13.DDAG对于过敏性气道炎症中OVA诱导的NF-κB活性和炎性基因表达的效应。在最后一次OVA气雾剂刺激后24小时收集肺组织。使用TriZol试剂提取总mRNA。在2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并在UV光下显示。β-肌动蛋白用作内参。实验重复三次(n＝3只小鼠/组)，具有相似的结果模式。

图14.分离自经过DMSO或1mg/kg DDAG预处理、最后一次以盐水气雾剂或OVA气雾剂刺激后24小时的小鼠的肺组织的细胞核提取物中的p65NF-κB的免疫印迹(A)；在存在和不存在30μM DDAG的情况下以10ng/ml TNF-α刺激5分钟的正常人支气管上皮细胞的细胞核提取物中的p65NF-κB的免疫印迹(C)。通过10％的SDS-PAGE分离细胞核蛋白，以抗-p65或抗-TBP抗体探测，并以加强的化学发光试剂显影。TBP细胞核蛋白用作内参。实验重复三次(n＝3只小鼠/组)，具有相似的结果模式。使用TransAM p65转录因子ELISA试剂盒，测定肺组织的细胞核提取物、以及在存在和不存在30μM DDAG的情况下，以TNF-α刺激5分钟的上皮细胞的细胞核提取物的细胞核p65 DNA结合活性。数值表示为三次单独实验的平均值±SEM。^＊表示与DMSO对照相比具有显著差异，P＜0.05。(E)：在存在和不存在30μM DDAG的情况下，以10ng/ml TNF-α刺激上皮细胞12小时，然后使用TriZol试剂提取总mRNA，在2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并在UV光下显示。β-肌动蛋白用作内参。这是来自具有相似结果模式的3次单独实验的代表性凝胶。数值表示为3次独立实验的平均值±SEM。^＊表示与DMSO对照相比具有显著差异，P＜0.05。

图15.DDAG和糖皮质激素(地塞米松，Dex)对于OVA诱导的炎性细胞募集的独立或联合效应。(A)获自最后一次以OVA气雾剂(n＝4只小鼠/组)刺激后24小时的致敏小鼠的BAL液中的炎性细胞计数。低剂量的DDAG(0.1mg/kg)和低剂量的地塞米松(0.05mg/kg)显著减少获自最后一次以OVA气雾剂刺激后24小时的致敏小鼠的BAL液中的OVA诱导的炎性细胞计数。在最少500个细胞中进行差别化细胞计数，以鉴定嗜曙红细胞(Eos)、巨噬细胞(Mac)、嗜中性粒细胞(Neu)和淋巴细胞(Lym)。DDAG对于OVA诱导的BAL液中的细胞因子和趋化因子水平和血清Ig的产生的效应。(A)在最后一次OVA气雾剂刺激后24小时收集BAL液。使用ELISA分析IL-4、IL-5、IL-13和Eotaxin的水平(n＝6-9只小鼠/组)。数值表示为平均值±SEM。^＊表示与DMSO对照相比具有显著差异，P＜0.05。

具体实施方式

穿心莲和/或穿心莲内酯化合物用于有效减少小鼠哮喘模型中OVA诱导的炎性细胞向BAL液的募集，IL-4、IL-5、IL-13和eotaxin的产生，血清IgE的合成，肺的嗜曙红细胞过多，粘液高分泌和AHR。

本发明的化合物

“化合物”包括已知的穿心莲内酯化合物，其中所述化合物具有下列结构：

其中

由OR²和OR³形成的合适的环式结构可以选自-O-(CR⁷R⁸)_m-O-，其中R⁷和R⁸可以相同或不同，并且独立地代表氢、选自(C₁-C₆)烷基的取代或非取代的基团，例如甲基、乙基、正丙基等；芳基，例如苯基、萘基等，所述芳基可以是取代的；杂芳基，例如吡啶基、呋喃基、硫代苯基、吡咯基等，所述杂芳基可以是取代的；或者R⁷和R⁸一起代表′C＝O′；m代表整数1或2。R⁷和R⁸上的取代基包括羟基，卤素，例如氟、氯、溴等；硝基，氰基或氨基。

R²上的取代基可以选自氰基，羟基，硝基，巯基，卤素原子，例如氟、氯、溴等；选自线性或支链的(C₁-C₈)烷基的取代或非取代的基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基等；氨基，单或双取代的氨基；烷酰基，例如乙酰基、丙酰基、丁酰基等；硫代(C₁-C₈)烷基，例如硫代甲基、硫代乙基、硫代丙基等；(C₁-C₆)烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等；芳氧基，例如苄氧基等；酰氧基，例如乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基等；芳基，例如苯基、萘基等，所述芳基可以是单或双取代的；杂芳基，例如吡啶基、呋喃基、噻吩基等；酰胺基，例如CH₃CONH，C₂H₅CONH，C₃H₇CONH，C₄H₉CONH和C₆H₅CONH；芳烷基氨基，例如C₆H₅CH₂NH，C₆H₅CH₂CH₂NH，C₆H₅CH₂NCH₃等；烷氧基羰基氨基，例如C₄H₉OCONH，C₂H₅OCONH，CH₃OCONH等；芳氧基羰基氨基，例如C₆H₅OCONH，C₆H₅OCONCH₃，C₆H₅OCONC₂H₅，C₆H₄(CH₃)OCONH，C₆H₄(OCH₃)OCONH等；芳烷氧基羰基氨基，例如C₆H₅CH₂OCONH，C₆H₅CH₂CH₂OCONH，C₆H₅CH₂OCON(CH₃)，C₆H₅CH₂OCON(C₂H₅)，C₆H₄(CH₃)CH₂OCONH，C₆H₄(OCH₃)CH₂OCONH等；(C₁-C₈)烷基硫基，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基等；杂芳基硫基，例如吡啶硫基、呋喃硫基、硫代苯基硫基、苯并噻唑硫基、巯基嘌呤、苯并咪唑硫基、嘧啶硫基等；酰基硫基，例如乙酰硫基、丙酰硫基、丁酰硫基等；芳烷基硫基，例如asbenzylthio，苯乙基硫基、苯丙基硫基等；芳基硫基，例如苯基硫基、萘基硫基等；(C₁-C₈)烷基硒基，例如甲基硒基、乙基硒基、丙基硒基、异丙基硒基等；酰基硒基，例如乙酰基硒基、丙酰基硒基等；芳烷基硒基，例如苄基硒基、苯乙基硒基、苯丙基硒基等；芳基硒基，例如苯基硒基、萘基硒基等，或COOR，其中R代表氢或(C₁-C₆)烷基。取代基选自卤素，羟基，硝基，氰基，氨基，(C₁-C₆)烷基，芳基或(C₁-C₆)烷氧基。

当基团R²代表双取代的芳基时，相邻碳原子上的两个取代基形成连接基团，例如-X-CH₂-Y-、-X-CH₂-CH₂-Y-，其中X和Y可以相同或不同，并且独立地代表O、NH、S或CH₂。当R²代表的基团被多处取代时，两个相邻碳上的取代基可以形成连接基团X-(CR⁹R¹⁰)_n_Y_，其中R⁷和R⁸代表(C₁-C₅)烷基，例如甲基、乙基等；X和Y可以相同或不同，并且独立地代表CH₂，O，S，NH；并且n＝1或2。

R³选自甲基或亚甲基；

R⁴选自羟基或羰基；

该式包括下列天然存在的类似物：

14-表穿心莲内酯；异穿心莲内酯；14-脱氧-12-甲氧基穿心莲内酯；12-表-14-12-甲氧基穿心莲内酯；14-脱氧-12-羟基穿心莲内酯；和14-脱氧-11-羟基穿心莲内酯。该式还包括穿心莲内酯的衍生物。

构成本发明的一部分的药学上可接受的盐包括衍生自无机碱例如Li，Na，K，Ca，Mg，Fe，Cu，Zn，Mn的盐；有机碱例如N，N′-二乙酰基乙二胺、甜菜碱、咖啡因、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡萄糖胺、葡糖胺、海巴明(hydrabamine)、异丙基胺、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙基胺、三甲基胺、三丙基胺、氨丁三醇、二乙醇胺、葡甲胺、乙二胺、N、N′-二苯基乙二胺、N、N′-二苄基乙二胺、N-苄基苯乙基胺、胆碱、氢氧化羟乙基三甲铵、二环己基胺、二甲双胍、苯甲基胺、苯乙基胺、二烷基胺、三烷基胺、硫胺素、氨基嘧啶、氨基吡啶、嘌呤、精脒等的盐；手性碱例如烷基苯基胺、甘氨醇、苯甘氨醇等的盐；天然氨基酸例如甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，酪氨酸，胱氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，羟基脯氨酸，组氨酸，鸟氨酸，赖氨酸，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸，非天然氨基酸例如D-异构体或取代的氨基酸的盐；胍，取代的胍的盐，其中取代基选自硝基、氨基、烷基、烯基、炔基；铵或取代的铵盐和铝盐。

视情况，盐可以包括酸加成盐：硫酸盐，硝酸盐，磷酸盐，高氯酸盐，硼酸盐，氢卤酸盐，乙酸盐，酒石酸盐，马来酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，棕榈酸盐，甲磺酸盐，苯甲酸盐，水杨酸盐，羟基萘甲酸盐，苯磺酸盐，抗坏血酸盐，甘油磷酸盐，酮戊二酸盐等。

药学上可接受的溶剂化物可以是水合物或包括结晶的其它溶剂，例如醇。

本发明的特别有用的化合物包括：3，19-二乙酰基-12-(N-苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12α-(N-苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12β-(N-苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；14-脱氧-12-(O-甲基苯基甘氨醇)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；14-脱氧-12α-(O-甲基苯基甘氨醇)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；14-脱氧-12β-(O-甲基苯基甘氨醇)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(N-4-甲氧基苄氨基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(N-4-甲氧基苄氨基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(N-4-甲氧基苄氨基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12-(N-2-氯代苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12α-(N-2-氯代苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12β-(N-2-氯代苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(O-甲基脯氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(O-甲基脯氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(O-甲基脯氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(O-甲基苯基丙氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(O-甲基苯基丙氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(O-甲基苯基丙氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(O-甲基-3-苯基异丝氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(O-甲基-3-苯基异丝氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(O-甲基-3-苯基异丝氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(O-甲基甲硫氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(O-甲基甲硫氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(O-甲基甲硫氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(O-甲基苯基甘氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(O-甲基苯基甘氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(O-甲基苯基甘氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(O-甲基丙氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(O-甲基丙氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(O-甲基丙氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(O-甲基甘氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(O-甲基甘氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(O-甲基甘氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(O-甲基硒甲硫氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(O-甲基硒甲硫氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(O-甲基硒甲硫氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(N-咪唑基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(N-咪唑基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(N-咪唑基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(N-甲基哌嗪基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(N-甲基哌嗪基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(N-甲基哌嗪基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-吗啉代穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-吗啉代穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-吗啉代穿心莲内酯，3，19-二乙酰基-12-(N-乙酰基哌嗪基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12α-(N-乙酰基哌嗪基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12p-(N-乙酰基哌嗪基)-14-脱氧穿心莲内酯；12-(N-苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；12α-(N-苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；12β-(N-苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；14-脱氧-12-(O-甲基苯基甘氨醇)穿心莲内酯；14-脱氧-12α-(O-甲基苯基甘氨醇)穿心莲内酯；14-脱氧-12β-(O-甲基苯基甘氨醇)穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12-(甲基苯基丙氨醇)穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12α-(甲基苯基丙氨醇)穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12β-(甲基苯基丙氨醇)穿心莲内酯；12-(N-苄氨基)-14-脱氧-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；12α-(N-苄氨基)-14-脱氧-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；12β-(N-苄氨基)-14-脱氧-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；14-脱氧-12-(O-甲基苯基丙氨醇)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；14-脱氧-12α-(O-甲基苯基丙氨醇)-3，19-O-(1-苯基乙基丙氨醇)穿心莲内酯；14-脱氧-12β-(O-甲基苯基丙氨醇)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；14-脱氧-12-(O-甲基脯氨醇)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；14-脱氧-12α-(O-甲基脯氨醇)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；14-脱氧-12β-(O-甲基脯氨醇)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；3，19-O-苯亚甲基-12-(N-苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-O-苯亚甲基-12α-(N-苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-O-苯亚甲基-12β-(N-苄氨基)-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12-(O-甲基甲硫氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12α-(O-甲基甲硫氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12β-(O-甲基甲硫氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12-(O-甲基苯基甘氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12α-(O-甲基苯基甘氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12β-(O-甲基苯基甘氨醇)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(N-1，2，4-三唑基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(N-1，2，4-三唑基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(N-1，2，4-三唑基)穿心莲内酯；14-脱氧-12-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；14-脱氧-12α-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；14-脱氧-12β-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(4-甲氧基-2-甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(4-甲氧基-2-甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(4-甲氧基-2-甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(4-羟基-2-甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(4-羟基-2-甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(4-羟基-2-甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(2-巯基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(2-巯基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(2-巯基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(3，4-二甲氧基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(3，4-二甲氧基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(3，4-二甲氧基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12-苯胺基-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12α-苯胺基-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12β-苯胺基-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(2-甲基-4-磺酸甲酯苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(2-甲基-4-磺酸甲酯苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(2-甲基-4-磺酸甲酯苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(N-四唑基氨基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(N-四唑基氨基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(N-四唑基氨基)穿心莲内酯；14-脱氧-12-(3，4-二甲氧基苯胺基)穿心莲内酯；14-脱氧-12α-(3，4-二甲氧基苯胺基)穿心莲内酯；14-脱氧-12β-(3，4-二甲氧基苯胺基)穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12α-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12β-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；14-脱氧-12-(2-甲基苯胺基)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；14-脱氧-12α-(2-甲基苯胺基)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；14-脱氧-12β-(2-甲基苯胺基)-3，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；3，19-O-苯亚甲基-14-脱氧-12-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-O-苯亚甲基-14-脱氧-12α-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-O-苯亚甲基-14-脱氧-12β-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12-苯胺基-14-脱氧-8，17-环氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12α-苯胺基-14-脱氧-8，17-环氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12β-苯胺基-14-脱氧-8，17-环氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12α-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12β-(2，3-二甲基苯胺基)穿心莲内酯；14-脱氧-12-(N¹-尿嘧啶)穿心莲内酯；14-脱氧-12α-(N¹-尿嘧啶)穿心莲内酯；14-脱氧-12β-(N¹-尿嘧啶)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-[N-(1，2-二氢-2-嘧啶酮)氨基]-1-穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-[N-(1，2-二氢-2-嘧啶酮)氨基]-1-穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-[N-(1，2-二氢-2-嘧啶酮)氨基]-1-穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(N¹-尿嘧啶)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(N¹-尿嘧啶)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(N¹-尿嘧啶)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-[N¹(5-氯尿嘧啶)]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α；-[N¹-(5-氯尿嘧啶)]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-[N-(5-氯尿嘧啶)]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-[N¹-(5-溴尿嘧啶)]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-[N¹-(5-溴尿嘧啶)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-[N¹-(5-溴尿嘧啶)]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-[N¹-(5-氟尿嘧啶]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-[N¹-(5-氟尿嘧啶]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-[N-(5-氟尿嘧啶)]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-[N¹-(5-碘尿嘧啶)]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α(5-碘尿嘧啶)]穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-[N¹-(5-碘尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-12-[N-(1，2-二氢-2-嘧啶酮)氨基]穿心莲内酯；14-脱氧-12α-[N-(1，2-二氢-2-嘧啶酮)氨基]穿心莲内酯；14-脱氧-12β-[N-(1，2-二氢-2-嘧啶酮)氨基]穿心莲内酯；14-脱氧-12-[NI-(5-氟尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-12α-[N-(5-氟尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-12β-[N¹-(5-氟尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-12-[N¹-(5-溴尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-12α-[N¹-(5-溴尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-12β-[N¹-(S-溴尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-12-[N¹-(5-碘尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-12α-[N¹-(5-碘尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-12β-[N¹-(5-碘尿嘧啶)]穿心莲内酯；14-脱氧-8，17-环氧-12-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-8，17-环氧-12α-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-8，17-环氧-12β-苯硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-苯硒基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-苯硒基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-苯硒基穿心莲内酯；12-(C-苯酰基甲基)-14-脱氧-13，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；12α-(C-苯酰基甲基)-14-脱氧-13，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯；12β-(C-苯酰基甲基)-14-脱氧-13，19-O-(1-苯基亚乙基)穿心莲内酯，14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12-乙硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12α-乙硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12β-乙硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-苯硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-苯硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-苯硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-乙酰硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-乙酰硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-乙酰硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-乙硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-乙硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-乙硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12-苄基-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12α-苄基-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12β-苄基-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(1，1′-二羧酸二乙酯甲基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(1，1′-二羧酸二乙酯甲基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(1，1′-二羧酸二乙酯甲基)穿心莲内酯；14-脱氧-12-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-12α-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-12β-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-12-乙硫基穿心莲内酯；14-脱氧-12α-乙硫基穿心莲内酯；14-脱氧-12β-乙硫基穿心莲内酯；14-脱氧-12-苯硒基穿心莲内酯；14-脱氧-12α-苯硒基穿心莲内酯；14-脱氧-12β-苯硒基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12α-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-异亚丙基-12β-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-(1-苯基亚乙基)-12-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-(1-苯基亚乙基)-12α-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-(1-苯基亚乙基)-12β(3-苯硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-(1-苯基亚乙基)-12-乙硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-O-(1-苯基亚乙基)-12α-乙硫基穿心莲内酯；14-脱氧-3，19-)-O-(1-苯基亚乙基)-12β-乙硫基穿心莲内酯；3，19-O-苯亚甲基-14-脱氧-12-苯硫基穿心莲内酯；3，19-O-苯亚甲基-14-脱氧-12α-苯硫基穿心莲内酯；3，19-O-苯亚甲基-14-脱氧-12β-苯硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12-苯硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12α-苯硫基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-8，17-环氧-12β-苯硫基穿心莲内酯；12-肉桂酰氧基-14-脱氧穿心莲内酯；12α-肉桂酰氧基-14-脱氧穿心莲内酯；12β-肉桂酰氧基-14-脱氧穿心莲内酯；12-肉桂酰氧基-14-脱氧-8，17-环氧穿心莲内酯；12α-肉桂酰氧基-14-脱氧-8，17-环氧穿心莲内酯；12β-肉桂酰氧基-14-脱氧-8，17-环氧穿心莲内酯；14-脱氧-12-羟基穿心莲内酯；14-脱氧-12α-羟基穿心莲内酯；14-脱氧-12β-羟基穿心莲内酯；12-乙酰氧基-3，19-二乙酰基-14-脱氧穿心莲内酯；12α-乙酰氧基-3，19-二乙酰基-14-脱氧穿心莲内酯；12β(3-乙酰氧基-3，19-二乙酰基-14-脱氧穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-甲氧基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-甲氧基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-甲氧基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-(2-乙酰氧基-3-N-乙酰氨基-3-苯基丙酰氧基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-(2-乙酰氧基-3-N-乙酰氨基-3-苯基丙酰氧基)穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-(2-乙酰氧基-3-N-乙酰氨基-3-苯基丙酰氧基)穿心莲内酯；12-(N-Boc甘氨酰氧基)-14-脱氧-8，17-环氧-3，19-二丙酰基穿心莲内酯；12α-(N-Boc甘氨酰氧基)-14-脱氧-8，17-环氧-3，19-二丙酰基穿心莲内酯；12β-(N-Boc甘氨酰氧基)-14-脱氧-8，17-环氧-3，19-二丙酰基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12-巯基苯并噻唑基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12α-巯基苯并噻唑基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-14-脱氧-12β-巯基苯并噻唑基穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12-(N，N-苄氯乙酰基)氨基-14-脱氧-12-穿心莲内酯；3，19-二乙酰基-12α-(N，N-苄氯乙酰基)氨基-14-脱氧-12-穿心莲内酯和3，19-二乙酰基-12β-(N，N-苄氯乙酰基)氨基-14-脱氧-12-穿心莲内酯。

可以通过从植物穿心莲(爵床科)中分离来制备本发明的化合物。或者，可以使用本领域已知的方法合成该化合物。

治疗方法

“治疗(treatment)”和“治疗(treat)”及其同义词是指治疗性处理和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目标是阻止或减缓(减轻)气道病症。气道病症可以包括哮喘、哮喘加重、慢性阻塞性肺病(COPD)和本领域技术人员已知的其它气道病症。

如本文使用的化合物的“治疗有效量”是能够治疗、预防或至少减缓(减轻)气道病症的活性试剂的量。药物组合物中的本发明的拮抗剂的剂量和施用可以由临床药理学或药代动力学领域的普通技术人员来确定。治疗性施用的化合物或组合物的有效量将取决于例如治疗目标、施用途径和哺乳动物的状况。因此，治疗者需要视需要滴定剂量并修改施用途径以获得最佳的治疗效果。常见的日剂量可能是大约10ng/kg至最多100mg/kg哺乳动物体重或更高的剂量/天，优选大约1μg/kg/天至10mg/kg/天。

为了本发明目的的“受试者”包括人和其它动物，特别是哺乳动物。因此，本发明的方法适用于人类治疗和兽医应用。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，在优选的实施方式中，受试者是人。

“治疗有效量”是指：当施用至患者时，缓解疾病症状的本发明的化合物的量。构成“治疗上有效量”的本发明的化合物的量将根据化合物、疾病状态和其严重性、待治疗的患者的年龄和体重等因素而变化。治疗上有效的量可以由本领域普通技术人员根据他们的知识和本公开内容常规地确定。

本发明的组合物

可以以药物组合物的形式施用根据本发明产生的化合物，以治疗气道病症。

因此，本发明还涉及组合物，其包括药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明的化合物。如本文使用，如果化合物能够影响气道炎症的测定参数，则其是治疗上有效的。

在优选的实施方式中，化合物和组合物适应于通过吸入方式经由气道直接施用至肺。用于通过吸入施用的组合物可以采取可吸入粉末组合物或液体或粉末喷雾剂的形式，并且可以使用粉末吸入器装置或气雾剂分散装置以标准形式施用。此类装置是熟知的。对于通过吸入施用，粉末化制剂通常包含活性化合物与惰性固体粉末化稀释剂，例如乳糖或淀粉。可吸入的干燥粉末组合物可以以明胶等材料的胶囊和药筒中的形成呈现，或层压的铝箔的罩泡物，以用于吸入器或吹入器中。每个胶囊或药筒一般可包含20pg-10mg的活性化合物。或者，本发明的化合物可以以不含赋形剂的形式呈现。

可吸入组合物可以被包装以进行单元剂或多剂递送。例如，可以按照类似于下列文献中描述的方式包装组合物以进行多剂递送：GB2242134、US6632666、US5860419、US5873360和US5590645(都诠释了″Diskus″装置)，或GB2178965、GB2129691、GB2169265、US4778054、US4811731和US5035237(诠释了″Diskhaler″装置)，或EP 69715(″Turbuhaler″装置)，或GB 2064336和US4353656(″Rotahaler″装置)。

用于通过吸入向肺表面递送的喷雾组合物可以配制为含水溶液或悬浮液或作为从加压包递送的气雾剂，例如计量式剂量吸入器(MDI)，使用适宜的液化推进剂。加压的MDI中的药物通常是储存在含有推进剂的加压罐中的溶液中，虽然其也可以是悬浮液。

适合于吸入的气雾剂组合物可以以悬浮液或溶液的形式呈现，通常含有活性化合物和适宜的推进剂，例如碳氟化合物或含氢氯氟烃，或其混合物，特别是氢氟烷烃，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，尤其是1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-七氟正丙烷及其混合物。

气雾剂组合物可以任选含有另外的通常与此类组合物相关的赋形剂，例如，表面活性剂，例如油酸或卵磷脂和助溶剂，例如乙醇。加压的制剂一般可以包含于罐中(例如铝罐)，所述罐以计量阀封闭并装配入提供了口的执行器中。

用于通过吸入施用的药物理想地具有受控的粒度。用于向支气管系统吸入的最佳粒度通常是1-10μm，优选为2-5μm。当被吸入而到达小的气道时，具有大于20μm的颗粒一般就太大了。为了达到这些粒度，活性成分的颗粒可以经历尺寸减小过程，例如微粉化。可以通过风筛或通过筛子分离理想的尺寸级分。优选地，颗粒将是晶体。当使用赋形剂例如乳糖时，赋形剂的通常粒度将比活性成分的粒度大得多。

可以使用含水或非含水介质并加入试剂例如增稠剂、缓冲盐或酸或碱(以调节pH)、等渗调节剂或抗氧化剂来配制鼻内喷雾剂。

可以使用含水介质并加入试剂例如酸或碱、缓冲盐、等渗调节剂或抗微生物剂来配制用于通过雾化来吸入的溶液。可以通过过滤或在高压灭菌器中加热来对其进行灭菌，或者呈现为无菌产物。雾化器以产自含水制剂的雾的形式提供气雾剂。

在一个具体的实施方式中，从干燥粉末吸入器施用组合物。

在另一个实施方式中，通过气雾剂分散装置、优选联合吸入室例如″Volumatic″(RTM)吸入室来施用组合物。

适合于可注射用途的本发明的药物形式包括无菌含水溶液(其中水溶性的)或分散液和用于即时制备无菌可注射溶液的无菌粉末和/或一种或多种载体。或者，可以通过封装在脂质体中来递送可注射溶液，以辅助它们跨越细胞膜的运输。组合物必须在制备和储存条件下是稳定的，并且必须以抗微生物例如细菌和真菌的污染/破坏作用的方式储存。

载体可以是溶剂或分散介质，包括例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其适宜的混合物和植物油。可以通过例如使用包被物例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适宜的流动性。预防本发明的组合物中的微生物的作用是通过加入抗细菌剂和/或抗真菌剂例如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现的。在很多情况下，优选加入等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长的吸收。

通过将所需量的活性化合物掺入含有以上所列的数种其它成分(视需要)的合适溶剂中、然后通过过滤灭菌来制备无菌的可吸入或可注射溶液。一般地，通过将多种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和来自上文列举的那些的所需的其它成分的无菌介质中来制备分散液。在用于制备无菌可吸入或可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，以从之前经无菌过滤的溶液产生活性成分加任何其它所需成分的粉末。

当活性成分、特别是本发明范围内考虑到的小分子被适当地保护时，可以通过口服施用它们，例如使用惰性稀释剂或使用可食用载体，或者可以将其封装在硬或软壳明胶胶囊中，或者可以将其压缩为片剂，或者可以将其直接掺入膳食的食物中。对于口服治疗性施用，可以将活性化合物掺入赋形剂，并以可摄取的片剂、口腔片剂、锭剂、胶囊、西也剂、悬浮液、糖浆、糯米纸剂等形式使用。此类组合物和制剂应该含有至少1％重量的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分率可以变化，并且可以方便地在单元重量的大约5％至大约80％内。此类治疗上有用的组合物中的活性化合物的量是：将获得合适的剂量的量。根据本发明的优选组合物或制剂配制为：剂量单元形式包含大约0.1μg至20g活性化合物。

药片、锭剂、药丸、胶囊等还可以含有粘合剂，例如树胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶。它们还可以含有赋形剂，例如磷酸氢二钙。它们还可以含有崩解剂，例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等。它们还可以含有润滑剂，例如，硬脂酸镁。它们还可以含有甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精。它们还可以含有调味剂，例如胡椒薄荷、冬青油或樱桃调味剂。

当剂量单元形式是胶囊时，除了以上类型的物质之外，其还可以含有液体载体。

多种其它物质可以呈现为包被物或修饰剂量单元的物理形式。例如，可以以虫漆、糖或二者包被药片、药丸或胶囊。糖浆或西也剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的尼铂金甲酯和尼铂金丙酯、染料和调味剂例如樱桃或橙调味剂。当然，用于制备任何剂量单元形式的任何物质都必须是药学上纯的并且在所使用的量时是实质上无毒的。此外，可以将活性化合物掺入到缓释配制物和制剂中。

为此，可以将活性成分置于控制活性成分的释放的基质中。优选地，基质包括选自下列的物质：液体、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚己酸内酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚己酸内酯、聚乳酸、聚酐、聚丙交酯-共聚-乙交酯、聚氨基酸、聚氧化乙烯、丙烯酸封端的聚氧化乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯腈、聚磷腈、聚原酸酯、乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)，以及它们的组合和其它聚合物，例如美国专利号6,667,371；6,613,355；6,596,296；6,413,536；5,968,543；4,079,038；4,093,709；4,131,648；4,138,344；4,180,646；4,304,767；4,946,931中公开的那些，以上每篇文献明确通过引用方式全文并入本文。优选地，基质持续释放药物。

药学上可接受的载体和/或稀释剂也可以包括任意和所有的溶剂、分散介质、包被物、抗细菌剂和/或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂在药学活性物质中的使用是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则它们在治疗性组合物中的使用都被考虑到。

也可以将补充性活性成分掺入到组合物中。优选地，这些补充性活性成分是抗炎剂，例如吸入的类固醇、半胱氨酰-白三烯受体拮抗剂和色甘酸钠和/或支气管扩张剂，例如β₂激动剂和/或抗胆碱能剂。一些吸入的类固醇可以包括地塞米松、布地奈德

氟替卡松

环索奈德二丙酸倍氯米松

或本领域已知的其它的。β₂激动剂可以包括舒喘宁、舒喘灵、特布他林、沙美特罗或福莫特罗。抗胆碱能剂可以包括异丙托品(Ipratropium)。

特别有利的是以剂量单元的形式配制胃肠外组合物以易于施用和剂量的均一性。如本文使用的剂量单元形式是指适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单元剂量的物理离散单元，每个单元含有预先确定的量(所述的量经计算为产生所需要的治疗效果)的活性物质与所需的药学载体。本发明的剂量单元形式由下列因素确定并直接依赖于下列因素：(a)活性物质的独特特性和所要达到的具体治疗效果；和(b)复合物领域内在的局限性，例如用于治疗活的受试者中的疾病的活性物质，所述受试者具有这样的疾病状况：其中身体健康被破坏，如本文所详细公开。

为了方便和有效施用，使用合适的药学上可接受的载体以剂量单元形式配制有效量的主要活性成分。单元剂量形式可以例如包含0.5μg至大约2000mg的量的主要活性化合物。按比例表示，活性化合物一般以大约0.5pg/ml至大约2000mg/ml载体存在。在含有补充性活性成分的组合物的情况下，通过参考所述成分的常用剂量和施用方式来确定剂量。

化合物或组合物可以是包含剂量单元形式和使用说明书的治疗试剂盒的形式。

优选地，穿心莲内酯或14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯(DDAG)可以替代糖皮质激素或降低糖皮质激素的剂量：通过单独使用DDAG或通过DDAG与糖皮质激素组合来治疗哮喘。

优选实施方式

我们提出使用穿心莲内酯化合物例如穿心莲内酯和DDA(DDAG)以补充或替代在气道病症例如哮喘加重中口服类固醇。

我们描述了穿心莲内酯在哮喘中的通过抑制核因子-κB途径的新的抗炎作用。核因子(NF)-κB的持续激活与哮喘的发展有关。穿心莲内酯，药用植物穿心莲的主要活性成分，在本文中被证明抑制NF-κB活性。穿心莲内酯通过抑制以OVA致敏并刺激、产生气道炎症的BALB/c小鼠中的NF-κB信号途径而减弱过敏性哮喘。

穿心莲内酯抑制支气管肺泡灌洗液中的OVA诱导的总细胞计数、嗜曙红细胞计数和IL-4、IL-5和IL-13的水平，并降低OVA特异性IgE的血清水平。穿心莲内酯减弱了OVA诱导的肺组织的嗜曙红细胞过多和肺组织中的气道粘液的产生，E-选择素、几丁质酶、MucSac和可诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达，以及对于醋甲胆碱的气道高反应性。在人肺上皮细胞中，穿心莲内酯阻断了TNF-α诱导的抑制性κB(IκB)激酶-β(IKKβ)的磷酸化，以及下游的IκBα分解，NF-κB的p65亚基的磷酸化，p65的核转位和DNA结合活性。我们的发现暗示了穿心莲内酯在治疗哮喘中的潜在治疗价值，其可以在IKKβ激活的水平通过抑制NF-κB途径而发挥作用。

我们首次描述了DDAG潜在地通过抑制NF-κB活性有效减少小鼠哮喘模型中OVA诱导的炎性细胞向BAL液的募集，IL-4、IL-5、IL-13和eotaxin的产生，血清IgE的合成，肺的嗜曙红细胞过多，粘液高分泌和AHR。此外，在单独给予时不显示任何抗炎效应的剂量，低剂量的DDAG和糖皮质激素的组合治疗协同性地减弱了小鼠哮喘模型中的炎症。这些发现支持DDAG在治疗哮喘中的治疗价值。

我们提出使用穿心莲内酯或14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯(DDA)作为控制剂来治疗哮喘。另外，5％-10％的哮喘者不能通过目前的药物治疗得到良好控制，他们需要在加重时口服类固醇。我们提出使用穿心莲内酯或DDA在哮喘加重时补充口服类固醇或替代口服类固醇。

穿心莲内酯用于治疗气道病症的用途

穿心莲内酯通过抑制NF-κB途径而治疗哮喘的新的抗炎作用。在我们的使用卵白蛋白作为气道变应原的小鼠哮喘模型中，我们显示穿心莲内酯以剂量依赖性方式抑制了卵白蛋白诱导的细胞向获自支气管肺泡灌洗液的气道的浸润，并在福尔马林固定的肺中观察到，如图2所示。

穿心莲内酯能够抑制卵白蛋白诱导的BAL液中的细胞因子的产生(图3)和血清IgE水平(图4)。这表明穿心莲内酯可能具有抗过敏症和抗炎活性。

此外，穿心莲内酯能够抑制卵白蛋白诱导的促炎性粘附分子和生物标志物的表达(图5)。小鼠中的气道高反应性的临床末端点也能被穿心莲内酯阻断(图6)。穿心莲内酯在哮喘中的抗炎作用的机理可能与其对于核因子-κB信号途径的抑制效应相关(图7)。使用Gel-Pro成像软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)定量了IKKβ和磷酸化的IKKβ的蛋白带。β-肌动蛋白用作内参。(右上)在存在和不存在30μM穿心莲内酯的情况下，以TNF-α刺激30分钟的上皮细胞的细胞核提取物中p65水平的免疫印迹。通过10％的SDS-PAGE分离细胞核蛋白并以抗-p65或抗-TBP抗体探测。TBP细胞核蛋白用作内参。(右下)使用TransAM^TM p65转录因子ELISA试剂盒测定在存在和不存在30μM穿心莲内酯的情况下，以TNF-α刺激30分钟的上皮细胞的细胞核提取物中p65 NF-κB的DNA结合活性。

穿心莲内酯降低了BAL液中卵白蛋白诱导的嗜曙红细胞计数，并且抑制了肺切片中E-选择素和VCAM-1染色(图2至7)。穿心莲内酯抑制了BAL液中OVA诱导的嗜曙红细胞和淋巴细胞计数和TNF-α及GM-CSF的水平。我们的发现揭示了穿心莲内酯的数个抗哮喘性质，包括：使用H&E染色证明其抑制细胞炎症、向气道的浸润；使用PAS染色证明其抑制气道中的黏液分泌；抑制BAL液中的Th2细胞因子(IL-4，IL-5，IL-13和eotaxin)的水平，血清IgE水平(总IgE，OVA特异性IgE，IgG1和IgG2a)，气道高反应性，如气道阻力和动态顺应性所反映，以及促炎性标志物基因表达，包括ICAM-1，VCAM-1，E-选择素，AMCase，YKL-40，YM1，YM2，MUC5ac和inOS。我们还通过显示IKKβ磷酸化、IkB磷酸化、IkBα分解、p65细胞核转位和p65-DNA结合的抑制而证明了穿心莲内酯的新的作用机理。我们提供了关于穿心莲内酯如何在哮喘中发挥作用的详细描绘。我们还证明了穿心莲内酯的潜在抗过敏症的作用。

DDAG在治疗气道病症中的用途

另外，我们的数据证明了DDAG(14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯)在哮喘中的抗炎效应。

DDAG以剂量依赖性方式抑制支气管肺泡灌洗液(BALF)中回收的卵白蛋白诱导的总细胞计数、嗜曙红细胞计数和IL-4、IL-5及IL-13水平的升高，并降低了卵白蛋白特异性IgE的血清水平。其减弱了卵白蛋白诱导的肺组织的嗜曙红细胞过多和肺组织中的气道粘液的产生，E-选择素、几丁质酶、COX-2、IL-17、IL-33和Muc5ac的mRNA表达，以及对于醋甲胆碱的气道高反应性。在正常人支气管上皮细胞中，DDAG阻断了TNF-α诱导的p65细胞核转位和DNA结合活性。类似地，DDAG阻断了来自卵白蛋白刺激的小鼠的肺组织的细胞核提取物中的p65细胞核转位和DNA结合活性。

另外，低剂量的地塞米松组合协同性地抑制了BALF中卵白蛋白诱导的总细胞计数、嗜曙红细胞计数和IL-4、IL-5、IL-13、甚至是Eotaxin的水平。

在使用卵白蛋白作为气道变应原的小鼠哮喘模型中，我们证明DDA以剂量依赖性方式抑制了卵白蛋白诱导的细胞向获自支气管肺泡灌洗液的气道的浸润(图8A)，并在福尔马林固定的肺中观察到，如图8B所示。

数种炎性标志物基因表达谱被DDA抑制，DDA对于气道高反应性具有抑制效应。

我们提出使用穿心莲内酯和DDA作为抗炎试剂以控制哮喘。

以卵白蛋白致敏并刺激的BALB/c小鼠产生气道炎症。分析支气管肺泡灌洗液中的总细胞计数和差别化细胞计数，以及细胞因子和趋化因子水平。还测定了血清IgE水平。检查了肺组织中的细胞浸润和粘液高分泌，以及炎性生物标志物的表达。通过直接气道阻力分析监视气道高反应性。

DDAG引起对于体内OVA刺激的肺中，以及体外正常人支气管上皮细胞中p65细胞核转位和κB DNA结合活性的显著抑制。BAL液中IL-4、IL-5、IL-13和eotaxin的降低可能是由于DDAG对于炎性和气道驻留细胞中NF-κB的抑制。DDAG对于气道嗜曙红细胞过多的减少可能是由于降低的IL-13、eotaxin、RANTES和E-选择素表达，这是由NF-κB的抑制继发而来的。

DDAG引起的血清总IgE和OVA特异性IgE的降低可能是由于通过NF-κB的抑制而对B细胞激活的抑制性效应。因此，观察到DDAG引起气道高反应性的降低。虽然DDAG活性不如类固醇高，但当低剂量的DDA与低剂量的类固醇组合使用时，显示出显著的协同性抗炎效应。

DDAG抑制OVA诱导的炎性细胞募集和粘液的产生

在最后一次OVA或盐水气雾剂刺激之后24小时收集BAL液，进行总细胞计数和差别化细胞计数。相对于盐水气雾剂对照，OVA的吸入显著增加了总细胞计数和嗜曙红细胞计数，轻微但仍显著地(P＜0.05)增加了巨噬细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞的计数。相对于DMSO介质对照，DDAG(0.1，0.5和1mg/kg)以剂量依赖性方式显著降低了BAL液中的总细胞计数和嗜曙红细胞计数(图9A)。在高剂量(1mg/kg)，DDAG也降低巨噬细胞和淋巴细胞计数。

还在最后一次OVA或盐水气雾剂刺激之后24小时收集了肺组织。相对于盐水气雾剂刺激，OVA气雾剂刺激诱导了炎性细胞向支气管周和血管周结缔组织的显著浸润。相对于DMSO对照，DDAG(1mg/kg)显著减少了富含嗜曙红细胞的白细胞浸润(图9B)。另一方面，OVA刺激的小鼠在支气管中产生了显著的杯状细胞增生和粘液高分泌，而盐水刺激的小鼠则没有。OVA诱导的粘液高分泌被DDAG(1mg/kg)显著阻抑(图9C)。显示了DDAG减少OVA刺激的小鼠的肺组织中的脱粒的肥大细胞的数目(图10)。

DDAG降低OVA诱导的BAL液中Th2细胞因子水平和血清Ig的产生

相对于盐水气雾剂对照，OVA的吸入在致敏小鼠中引起了BAL液中IL-4、IL-5、IL-13和eotaxin水平的显著增加(图11A)。与此相反，在OVA刺激的小鼠中，BAL液中的IFN-γ(一种Th1细胞因子)稍有下降。相对于DMSO对照，DDAG以剂量依赖性方式显著(P＜0.05)降低了BAL液中的IL-4、IL-5和IL-13的水平，以及eotaxin的水平(程度稍低)(图11A)。值得注意的是：浓度为1mg/kg的DDAG显著上调了BAL液中的IFN-γ水平。该发现暗示，在我们的OVA诱导的小鼠哮喘模型中，DDAG能够改变以Th2为主导的免疫活性。

为了进一步评价DDAG是否能够在体内改变正在发生的OVA特异性Th2应答，使用ELISA测定了总IgE、和OVA特异性IgE、IgG1和IgG2a的血清水平。相对于盐水刺激的小鼠，在OVA刺激的小鼠中观察到血清总IgE、OVA特异性IgE和OVA特异性IgG1水平的显著升高，而OVA特异性IgG2a水平则不是这样(图11B)。即使在最低的剂量(0.1mg/kg)，DDAG也强烈抑制OVA特异性IgE水平，并且也抑制总IgE和OVA特异性IgG1的血清水平，抑制程度低于前者；在较高剂量时具有显著性效应(图11B)。DDAG对于OVA特异性IgG2a的血清水平没有影响，这表明DDAG引起Th2应答的特异性抑制。

DDAG减少小鼠中OVA诱导的AHR

为了研究DDAG对于响应于浓度渐增的醋甲胆碱的AHR的效应，我们测定了机械通风的小鼠中的Rl和Cdyn。Rl定义为压力驱动的呼吸除以气流。Cdyn是指肺的膨胀性，定义为肺部压力变化所产生的肺的体积变化。OVA刺激的小鼠产生AHR，其通常通过高Rl和低Cdyn来反映(图12)。DDAG(1mg/kg)显著降低OVA刺激的小鼠响应于醋甲胆碱的Rl并恢复Cdyn，这说明体内的免疫介导的气道病理学被改变。相对于盐水气雾剂对照，OVA的吸入显著增加总的脱粒的肥大细胞计数。相对于DMSO介质对照，DDAG(1mg/kg)显著降低甲苯胺-蓝染色的肺切片中的总的脱粒的肥大细胞计数(图12C)。

DDAG抑制过敏性气道炎症中OVA诱导的炎性基因表达和NO的产生

OVA气雾剂刺激显著上调下列的肺mRNA水平：粘附分子E-选择素，其对于炎性细胞例如嗜曙红细胞和淋巴细胞的肺募集具有关键意义；几丁质酶家族成员，包括酸性哺乳动物几丁质酶(AMCase)、Ym1、Ym2和YKL-40，它们最近被证明在气道炎症和重塑中具有关键作用^26-28；Muc5ac，其对于粘液高分泌是必不可少的²⁹。已知IL-33募集、激活并增强Th2T细胞功能³⁰；IL-17已被证明诱导eotaxin从气道平滑肌细胞的释放，在体外IL-17和IL-17F二者都能诱导炎性介导子从人嗜曙红细胞的释放³¹。以DDAG(1mg/kg)预处理引起过敏性气道中E-选择素、AMCase、Ym-2、YKL-40、Muc5ac、COX2、IL-17和IL-33的强烈抑制(图13A)。响应于炎性刺激，在气道中会产生高浓度的一氧化氮(NO)，并且使炎性应答持续进行。DDAG还降低血清硝酸盐、亚硝酸盐水平(图13B)，其为体内NO的终产物。

DDAG抑制过敏性气道炎症中OVA诱导的NF-κB的功能和正常人支气管上皮细胞中TNF-α诱导的NF-κB的激活

为了验证DDAG在OVA刺激的小鼠中的抗炎性效应是通过NF-κB的抑制而介导的，我们检测了在最后一次OVA或盐水气雾剂刺激之后24小时获得的肺组织中的NF-κB的p65亚基的细胞核转位和p65 DNA结合活性。相对于盐水气雾剂对照，OVA刺激显著增加了肺组织的细胞核提取物中p65亚基的水平，并增强了细胞核p65DNA结合活性(图14A和14B)。DDAG(1mg/kg)显著(P＜0.05)降低细胞核p65的量和DNA结合活性至基础水平，这说明DDAG可能通过抑制NF-κB活性而发挥其抗炎作用。

为了在相关的人气道细胞类型中进一步研究DDAG的抗炎作用机理，我们研究了DDAG对于正常原代人支气管上皮细胞中TNF-α诱导的NF-κB的激活以及细胞因子的mRNA表达的效应。TNF-α在哮喘中具有重要作用^32-33，并且是人气道上皮细胞的强刺激剂³⁴。观察到细胞核p65水平和p65DNA结合活性的急剧上升(图14C和14D)。DDAG显著降低了p65细胞核转位和DNA结合活性(图14A-14D)。此外，穿心莲内酯显著地阻断了正常人支气管上皮细胞中TNF-α诱导的IL-6、IL-8和RANTES mRNA表达的上调(图14E)。

低剂量的DDAG和地塞米松协同性抑制OVA诱导的炎性细胞募集并降低OVA诱导的BAL液中的Th2细胞因子水平

为了研究DDAG与糖皮质激素在OVA诱导的气道炎症中的组合效应，在最后一次OVA或盐水气雾剂刺激之后24小时收集BAL液，进行总细胞计数和差别化细胞计数。相对于OVA致敏和刺激但未处理的小鼠(作为阳性对照)，最低剂量的DDAG(0.1mg/kg)与低剂量的地塞米松(0.05mg/kg)的组合显著降低了BAL液中总细胞计数和嗜曙红细胞计数(图15A)。相对于作为对照的单独的地塞米松，DDAG与低剂量类固醇的组合以剂量依赖性方式显著性(P＜0.05)降低了BAL液中IL-4、IL-5和IL-13、甚至eotaxin的水平(图15B至E)。

讨论

已经在人和动物哮喘模型中观察到了过敏性气道炎症中的持续的NF-κB的激活^35-38。在NF-κB激活中，T和B淋巴细胞和肥大细胞中的抗原受体激活达到顶峰^39-40。另外，TNF-α对于气道上皮细胞的刺激引发NF-κB依赖性基因表达³⁴。有多种靶向NF-κB信号途径的治疗策略已经在实验性哮喘模型中显示出有益效果，例如NF-κB特异性引诱寡核苷酸⁴¹，p65-特异性反义寡核苷酸⁴²和IKKβ-选择性小分子抑制剂⁴³。

我们的发现揭示了，在体内在OVA刺激的肺中，DDAG对于p65细胞核转位和κB DNA结合活性的显著性抑制。更具体而言，我们的体外的TNF-α刺激的正常人支气管上皮细胞的免疫印迹分析显示：穿心莲内酯降低了p65的细胞核转位，并减少了p65κB寡核苷酸结合。综合起来，我们证明了药用植物穿心莲的主要活性成分穿心莲内酯和DDAG能够有效抑制小鼠中OVA诱导的Th2介导的过敏性气道炎症的多个方面，其潜在是通过抑制NF-κB活性进行的。由于这些化合物具有如式I的相同的基本结构(见图1A和B)，所以推测起来其它具有如式I的相同基本结构的化合物对于气道炎症也具有相似的效应。

Th2细胞因子在过敏性气道炎症的病理发生中具有必不可少的作用^1-2，NF-κB是Th2细胞分化的关键转录因子⁴⁴。IL-4、IL-5和IL-13可以由多种肺驻留细胞、例如支气管上皮细胞、组织肥大细胞和肺泡巨噬细胞以及浸润的炎性细胞、例如淋巴细胞和嗜曙红细胞产生。

我们呈现的结果显示：DDAG显著降低来自于OVA刺激的小鼠的BAL液中的IL-4、IL-5、IL-13和eotaxin的水平。在具有破坏的NF-κB功能的OVA刺激的小鼠中观察到了相似的发现，所述NF-κB功能的破坏是通过条件化敲除IKKβ或在气道上皮中选择性转基因表达IκBα突变体而实现的^38，45。与此一致，IL-33的表达(IL-33增强体外的IL-5和IL-13从Th2细胞而非Th1细胞的产生)被DDAG显著降低。另外，已经证明NF-κB信号途径的抑制会阻断培养的人气道平滑肌细胞中IL-13诱导的eotaxin的产生⁴³。因此，所观察到的来自DDAG处理的小鼠的BAL液中IL-4、IL-5、IL-13和eotaxin水平的降低可能是由于炎性和气道驻留细胞中NF-κB的激活被抑制。这些数据说明DDAG的抗炎性效应至少部分是通过对于T淋巴细胞的抑制性作用而介导的。

嗜曙红细胞在过敏性炎症的病理发生中具有关键作用^5，7。我们呈现的结果显示：DDAG阻止了炎性细胞向气道的浸润，如BAL液中总细胞计数和嗜曙红细胞及淋巴细胞计数的显著下降以及肺切片中组织嗜曙红细胞过多的显著下降所示。白细胞向气道的转移受到细胞因子、例如IL-4，IL-5和IL-13的协调，以及特异性趋化因子例如eotaxin和RANTES并联合粘附性分子、例如VCAM-1和E-选择素的协调^7，25。IL-13是目前为止发现的气道上皮细胞中最强的eotaxin表达诱导剂⁴⁷。IL-17也被证明诱导从气道平滑肌产生Eotaxin⁴⁸。我们显示了DDAG强烈抑制OVA刺激的肺中E-选择素和IL-17 mRNA的表达和eotaxin的产生，以及TNF-α刺激的正常人支气管上皮细胞中RANTESmRNA的表达。这些发现可能是由于DDAG介导的NF-κB的抑制，因为E选择素、eotaxin和RANTES的基因在它们的启动子内含有NF-κB的κB位点⁴⁹。

综合起来，所观察到的由穿心莲内酯和DDAG引起的气道嗜曙红细胞过多的减少可能是对于IL-13、eotaxin和RANTES产生、以及对于E-选择素的表达的组合抑制效应的结果，这是由NF-κB之激活的抑制继发而来的。我们还证明，相对于DMSO对照，气道粘液的产生在DDAG处理的小鼠中显著下降。累积的证据表明：IL-4，IL-5和IL-13在小鼠的杯状细胞增生和粘液素Muc5ac基因和蛋白表达中具有关键作用^29，50。有趣的是，Muc5ac基因的表达依赖于NF-κB的转录活性^29，49，51。我们还观察到：在OVA刺激的肺中，穿心莲内酯和DDAG引起Muc5ac mRNA表达的显著下降。已经表明气道上皮中NF-κB功能的选择性抑制会降低小鼠中OVA诱导的粘液的产生^38，45。因此，经Eotaxin处理的小鼠的肺中粘液的产生的显著下降可能是由于气道上皮中IL-4、IL-5和IL-13水平的显著下降，以及对于NF-κB的直接的抑制作用。

升高的IgE-血清水平是Th2免疫应答的标志。我们的数据证明：在OVA刺激的小鼠中，穿心莲内酯和DDAG引起总IgE和OVA特异性IgE的血清水平的显著下降。另外，NF-κB在B细胞增殖和发育中具有关键作用^39，52，并且IL-4和IL-13对于指导B细胞生长、分化和IgE分泌具有重要意义^3，6。IgE的生物学活性是通过其与肥大细胞和嗜碱性细胞上的FcεRI的相互作用而介导的。FcεRI的交联启动多个信号级联，引起NF-κB的激活和脂介导子、细胞因子和趋化因子的产生^4，40。因此，所观察到的穿心莲内酯和DDAG在我们的哮喘模型中引起的血清总IgE和OVA特异性IgE的降低可能是由于其通过抑制NF-κB激活而对于B细胞激活的抑制效应、以及对于IL-4-和IL-13-介导的向IgE的类转换的抑制效应。

最近发现：几丁质酶蛋白家族，包括AMCase、Ym1、Ym2和YKL-40，在人和小鼠哮喘模型中在过敏性气道炎症中显著升高^26-28。它们主要表达于气道上皮和肺泡巨噬细胞。AMCase水平在小鼠哮喘模型和哮喘受试者中以IL-13依赖性方式升高²⁶。当通过气管内给予时，IL-13在体内使来自小鼠BAL液的Ym1和Ym2水平升高⁵³。此外，YKL-40血清水平与哮喘受试者中的哮喘严重性、气道重塑和肺功能退化呈正相关²⁸。总之，几丁质酶可能在气道炎症和重塑中具有作用。我们的数据表明：穿心莲内酯显著下调OVA刺激的小鼠肺中的AMCase、Ym2和YKL-40 mRNA表达。这些可能是经穿心莲内酯或DDAG处理的气道中IL-4和IL-13水平的大幅下降的结果，并且可能引起减少的肺嗜曙红细胞过多。

相信在过敏性炎症中释放的炎性介导子在AHR的发展中具有关键作用⁵⁴。我们在本文中报道：DDAG显著抑制OVA诱导的对于浓度渐增的醋甲胆碱的AHR。已经证明了IL-5通过激动并激活嗜曙红细胞而在AHR中发挥重要作用，引起促炎性产物的释放，例如主要碱性蛋白和半胱氨酰-白三烯，它们与AHR密切相关^5，7。此外，IL-4和IL-13已被证明在小鼠哮喘模型中诱导AHR，其中半胱氨酰-白三烯牵涉于AHR中^6，55-56。此外，IgE介导的肥大细胞激活可以引起AHR：其是通过产生多种炎性介导子和细胞因子^4，40。OVA刺激的小鼠中的气道高反应性的增加可能是由于肺组织中的脱粒的肥大细胞计数的增加，因为肥大细胞介导子直接使平滑肌细胞收缩并增强它们的收缩应答⁵⁷。因此，所观察到的DDAG引起的AHR的降低可能与Th2细胞因子产量的降低、组织嗜曙红细胞过多的减低、血清IgE水平的降低和肥大细胞脱粒的减少相关。

皮质类固醇可以通过数种方式调节基因表达。在临床剂量，糖皮质激素受体(GR)在被皮质类固醇激活之后，转位至细胞核并与NF-κB的共同激活子结合，并募集组蛋白脱乙酰酶(HDAC)2以减少组蛋白的乙酰化，这导致这些激活的炎性基因的抑制⁵⁹。糖皮质激素的主要效应是抑制炎性转录因子活性。

具有式I的化合物例如穿心莲内酯或DDAG或本文描述的其它化合物对于细胞核κB激活的抑制在治疗具有糖皮质激素抗性的患者中具有光明的前景。

由于长期口服高剂量类固醇与严重的副作用相关，所以已经在寻求类固醇-保守性治疗。虽然穿心莲内酯或DDAG的抗炎活性小于皮质类固醇和非甾体药物，但是穿心莲内酯或DDAG的降低气道炎症、气道高反应性和降低IgE水平的能力引起下列推测：穿心莲内酯或DDAG可能可以用于控制严重的、控制不佳的支气管哮喘。

组合治疗

我们还检测了DDAG与低剂量的糖皮质激素在哮喘小鼠模型中的治疗性效应。我们报告了DDAG与类固醇能够显著减少炎症：即使是在最低剂量的DDAG和低剂量的类固醇的组合时。通过与单独的DDAG或单独的地塞米松比较，除了IL-4、IL-5和IL-13之外，DDAG和地塞米松的组合还显著降低了Eotaxin的水平。Eotaxin通过诱导嗜曙红细胞的趋向性而募集它们。因此，DDAG与低剂量的类固醇的组合的治疗性使用能够降低给药时所需的皮质类固醇的剂量，从而降低由于施用高剂量的糖皮质激素而引起的可能的副作用。

方法

动物

雌性BALB/c小鼠(Interfauna，East Yorkshire，UK)圈养于新加坡国立大学的动物饲养机构(AHU)的适当的笼子中(最多4只/笼)。圈养环境的温度和湿度分别维持在大约22℃和55％。随意提供商售的小鼠饲料和水。每周3次更换垫子，以确保居住条件的清洁。小鼠的操作和实验均严格按照新加坡国立大学的机构动物管理与使用委员会(IACUC)批准的规则进行。

系统性OVA致敏

使所有小鼠在致敏前适应至少一周。通过将20μg OVA和4mgAl(OH)3溶解于0.1ml盐水中来制备致敏混合物。通过在第0天和第14天使用腹膜内(i.p.)方式注射0.1ml致敏混合物而使小鼠致敏，从而产生小鼠哮喘模型。

气道刺激

使致敏小鼠经历气道刺激以产生对照模型以及哮喘模型。通过将0.15g OVA溶解进入15ml盐水溶液中来制备刺激混合物。然后在第22、23、24天以气雾剂化的1％OVA刺激小鼠30分钟以激发哮喘应答。通过在数只小鼠中进行盐水刺激来产生哮喘模型的阴性对照。在该情况下，使用15ml盐水作为刺激混合物。

使用超声雾化器(来自DeVilbiss Healthcare Inc，USA的Ultra-NebTM 2000)来进行刺激。雾化器使刺激混合物气雾剂化并将气雾剂薄雾(颗粒大小＜5μm)泵入邻近的气雾剂腔，小鼠被置于所述腔中。吸入气雾剂化的1％OVA的小鼠将再次暴露于气道中的抗原，在气道中产生免疫应答，其模拟哮喘病理发生，因此产生理想的哮喘模型。

穿心莲提取物的制备

在65°在静态渗滤器中以3.2升70％的乙醇覆盖1000克穿心莲地上部分(生物质)3小时。然后回收渗出物，在相同的条件下再提取生物质5次，但是每次提取使用2.6升的溶剂，所以大约获得15.2升的渗出物。将汇合后的渗出物过滤并在60°在减压下通过旋转蒸发器浓缩。在60°减压下将提取物干燥一夜。该提取物具有总共90.9g的干物质残留，相对于起始物质的产率是10.1w/w。穿心莲内酯HPLC含量是22.38％。或者，可以从Sigma，St.Louis，MO商购穿心莲内酯或DDAG。

对小鼠进行药物处理

在每次OVA气雾剂刺激之前2小时和之后10小时，通过腹膜内注射方式给予处于0.1ml盐水中的单独的穿心莲内酯或DDAG(0.1，0.5和1mg/kg；Sigma，St.Louis，MO)或介质(1％二甲基亚砜[DMSO])。从贮液制备穿心莲内酯或14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯(DDA)。DMSO用作溶剂以溶解穿心莲内酯或DDA。制备10mg/ml的贮液并储存于-20℃。当使用时，将贮液解冻并以盐水溶液稀释以形成3个不同的药物浓度：0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml。表1中显示了制剂情况。

表1.来自贮液的不同剂量的穿心莲内酯或14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯的制剂

如表2所示，本研究中有6个处理组。组A(盐水)由经OVA致敏和经盐水刺激的小鼠组成，其作为阴性对照组。组B(OVA)由经OVA致敏和OVA刺激的阳性小鼠哮喘模型组成。组C(DMSO)由经OVA致敏、OVA刺激并在刺激前2小时通过腹膜内(i.p.)注射给予1％DMSO的小鼠组成。该组作为介质对照组和药物的阴性对照组。

组D(0.1mg/kg DDA)由经OVA致敏、OVA刺激并在刺激之前2小时和之后10小时通过腹膜内(i.p.)注射给予0.1mg/kg穿心莲内酯或0.1mg/kg DDAG的小鼠组成。组E(0.5mg/kg DDAG)由经OVA致敏、OVA刺激并在刺激之前2小时和之后10小时通过腹膜内(i.p.)注射给予0.5mg/kg穿心莲内酯或0.5mg/kg DDAG的小鼠组成。组F(1.0mg/kg穿心莲内酯或1.0mg/kg DDAG)由经OVA致敏、OVA刺激并在刺激之前2小时和之后10小时通过腹膜内(i.p.)注射给予1.0mg/kgDDA的小鼠组成。

表2.本研究中使用的不同的对照和处理组(A-F)

支气管肺泡灌洗(BAL)液

在第25天，在最后一次OVA/盐水刺激之后24小时进行支气管肺泡灌洗(BAL)。使用27G1/2无菌针头

通过i.p.注射0.3ml麻醉混合物(克他命∶美托咪定∶水＝3∶4∶33，Parnell，Alexandria NSW，Australia&Pfizer，Auckland，New Zealand)来麻醉小鼠。在麻醉后5分钟，通过颈椎脱臼法(cervical dislocation)处死小鼠。使用25G1/2的无菌针头

进行血液采集。当采血时，将针对角地刺入左侧心室壁中，缓慢吸取，从而血流不致于停歇。然后进行气管切开术，在暴露的气管上进行小的横向切口。将连接于1ml无菌注射器的钝针头(20G)经由该切口插入气管，并将0.5ml冰冷的PBS(4℃)三次滴注入肺中(0.5mlx3)。从每只小鼠回收大约1.2-1.4mlBAL液，并保持于-80℃，用于随后的实验。

血清收集

使来自心脏的血液凝集至少4小时。然后在4℃将所有的血液样品以3000rpm离心5分钟。仔细地提取上清液即血清，并储存于-80℃。保持样品，以用于进行ELISA。

总细胞计数

将收集自小鼠的肺的BAL液在4℃以3000rpm离心5分钟。收集上清液并储存于-80℃。将沉淀重悬于200μl 0.875％NH₄Cl(8.75mgNH₄Cl在1ml MilliQ水中)中，并在室温温育5分钟，以除掉不需要的红细胞。然后将细胞悬浮液在4℃以3000rpm离心5分钟。弃掉上清液，将含有炎性细胞的沉淀重悬于200μl含有1％BSA的RPMI(10mg BSA在1ml RPMI中)。使用血细胞计数器(10μl 0.4％台盼蓝：10μl细胞悬浮液)在显微镜下以200倍放大计数活细胞的总数目。

差别化细胞计数

在总细胞计数之后，将使用RPMI/BSA溶液收集的BAL液稀释(1x10⁵个细胞/150μl RPMI/BSA)。然后使用Cytospin离心机(ThermoShandon，Pittsburgh，USA)在600g将所有的样品进行细胞离心10分钟，以将细胞固定于载玻片上。使浸润的炎性细胞的涂片气干，然后使用Liu染色(经修改的Wright染色)法染色。在Liu染色法中，以800μl Liu A将cytospin玻片染色30秒，然后使用1600μl Liu B染色90秒。将玻片静置，以干燥过夜，将盖玻片封片至染色斑点上。然后，对于每个cytospin玻片，在显微镜下(1000倍放大)在最少500个细胞上进行差别化细胞计数。鉴定4种类型的炎性细胞，即巨噬细胞、嗜曙红细胞、嗜中心粒细胞和淋巴细胞，基于染色结果和特色的形态学特征计算它们各自的比例。计算每种炎性细胞的绝对数目。

测试处理

在每次OVA气雾剂刺激之前2小时和之后10小时通过腹膜内注射方式给予处于0.1ml盐水中的单独的DDAG(0.1，0.5和1mg/kg；Sigma，St.Louis，MO)或介质(2％二甲基亚砜[DMSO])。在组合实验中，通过腹膜内方式给予DDAG(0.1mg/kg)与地塞米松(0.05mg/kg)的组合。在两种实验环境下，盐水气雾剂用作阴性对照。根据新加坡国立大学的动物管理与使用委员会的机构准则进行动物实验。

BAL液中的细胞因子和趋化因子水平

测定BAL液中的IL-4、IL-5、IL-13、eotaxin和IFN-γ的水平(IL-4、IL-5和IFN-γ来自BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA，USA；IL-13和eotaxin来自R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)。试剂盒获自两个不同的生产商，所以在某些步骤中程序有所不同。简而言之，将处于各自的包被缓冲液(对于IL-4、IL-5和IFN-γ而言是pH 9.5的0.1M碳酸钠溶液；对于IL-13和eotaxin而言是1xPBS)中的50μl包被捕获抗体包被至96孔ELISA平板(NUNC，Denmark)。以parafilm密封平板并在各自的温度(对于IL-4、IL-5和IFN-γ而言是4℃；对于IL-13和eotaxin而言是室温)温育过夜。次日，使用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween-20的PBS)洗涤每个孔并以200μl封闭缓冲液(对于IL-4、IL-5和IFN-γ而言是含有10％FBS的PBS；对于IL-13和eotaxin而言是含有1％BSA和5％蔗糖的1xPBS)在室温封闭2小时。封闭之后，将50μl标准物和BAL液样品装入各个孔，并在室温温育2小时。洗涤几次以除掉未结合的分子。将平板与生物素化的检测抗体及HRP一起温育1小时(BD OptEIA^TM Kit)或与生物素化的检测抗体温育1小时、然后与HRP温育45分钟(R&D Kit)。洗涤之后，向每个孔中加入50μl TMB过氧化物酶底物(溶液A∶溶液B＝9∶1)，并在黑暗中温育30分钟。最后，加入50μl终止溶液(1M H₂SO₄)以终止反应。在450nm读取平板中的每个孔的光密度并在570nm进行λ校正。各个试剂盒的检测限值如下：对于IL-4和IL-5是4pg/ml；对于IL-13和IFN-γ是15.6pg/ml；对于eotaxin是2pg/ml。

支气管肺泡灌洗液和血清分析

在最后一次气雾剂刺激之后24小时将小鼠麻醉，按照上文的描述进行支气管肺泡灌洗(BAL)。按照上文的描述测定BAL液总细胞计数和差别化细胞计数，以及细胞因子和趋化因子水平。通过心脏穿刺收集血液，测定总IgE和OVA特异性IgE、IgG1和IgG2a的血清水平。

测定了血清中的总IgE和OVA特异性IgE、IgG1和IgG2a的水平。在4℃以50μl捕获抗体(用于总IgE：以1M Na₂CO₃进行1∶250稀释)或50μl的20μg/ml OVA(用于OVA特异性IgE、IgG1和IgG2a)包被96孔ELISA平板过夜。次日，以洗涤缓冲液(对于总IgE是含有0.05％Tween-20的PBS；对于OVA特异性IgE是含有0.1％Tween-20的PBS)洗涤平板并以300μl处于PBS中的10％FBS在室温封闭2小时。封闭之后，向各个孔中加入标准物(仅为了测总IgE)和血清样品，并温育2小时。洗涤之后，加入各个检测抗体并温育1小时，然后与HRP缀合的抗体在黑暗中温育45分钟。然后在黑暗中加入底物，轻微摇动30分钟。最后，加入50μl终止溶液(1M H₂SO₄)以终止反应。在450nm读取平板中的每个孔的光密度并在570nm进行λ校正。总IgE的检测限值是2ng/ml。

组织学分析

将肺固定于10％中性福尔马林中、涂石蜡、切成6-μm的切片并以苏木精与伊红(H&E)染色以检查细胞浸润，以高碘酸-Schiff(PAS)法染色以测定粘液的产生。按照下文的描述进行不知情式进行定量分析。使用甲苯胺-蓝染色在肺组织中检测肥大细胞。在石蜡切片中计数肥大细胞的数目。通过计数具有10％的挤出粒的细胞数目来计算肺中脱粒的肥大细胞的百分率。

定性分析和评分标准

对于H&E和PAS染色，所选的用于分析的支气管具有相似的结构和大小，具有清晰的形态呈现和最小的周围组织的破坏(可能在切片过程中形成)。在每只小鼠的2-4个制备物中进行炎性和杯状细胞的评分，从4-5只小鼠计算平均分数。评分标准总结于表3。

按照不知情方式进行支气管周细胞计数并按照本领域已知的方法进行评分。使用5分制系统(0-4)，0：无细胞；1：少量细胞；2：1个细胞层深的细胞环；3：2-4个细胞深的细胞环；4：多于4个细胞深的细胞环。以不知情方式测定气道上皮中杯状细胞增生并根据PAS阳性的产生粘液的细胞的百分率评分。使用如下的5分制系统(0-4)，0：无杯状细胞；1：＜25％；2：25-50％；3：50-75％；4：＞75％。简而言之，为了测定炎性细胞浸润的严重性，基于5分制系统以不知情方式进行支气管周细胞计数，0：无细胞；1：少量细胞；2：1个细胞层深的细胞环；3：2-4个细胞深的细胞环；4：＞4个细胞深的细胞环。为了测定粘液的产生程度，使用5分制系统以不知情方式定量气道上皮中的杯状细胞增生，0：无杯状细胞；1：＜25％；2：25-50％；3：50-75％；4：＞75％。对于每个肺切片，在至少3个不同视野中进行炎性细胞和杯状细胞的评分。从4只动物获得平均得分。^＊：相对于DMSO对照具有显著性差异，P＜0.05。

评分	H&E染色	PAS染色
			0	无细胞	0％
1	少量细胞	＜25％
			2	1层深的细胞环	25-50％
3	2-4层深的细胞环	50-75％
			4	＞4层深的细胞环	＞75％

表3.肺切片样品的H&E染色和PAS染色的评分系统

气道高反应性(AHR)的测定

按照上文的描述麻醉小鼠并进行气管切开术。向内部颈静脉中插管并连接于微型注射器以静脉内施用醋甲胆碱。使用全身体积描记器腔(Buxco，Sharon，CT)记录响应于浓度渐增的醋甲胆碱的气道阻力(Rl)和动态顺应性(Cdyn)，通过通风设备经由插入到气管中的管子进行机械通风，潮气容积为200μl/呼吸，呼吸速率为150/分钟。通过各自的传感器检测气流和压力变化，通过Biosystem XA软件(Buxco，Sharon，CT，USA)记录并分析。结果表示为各自的响应于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)的基础数值的百分率。

细胞培养

为了测定穿心莲内酯对于淋巴细胞中的OVA特异性免疫应答的效应，使胸部淋巴结细胞生长于支气管上皮bulletkit培养基(CambrexBioScience，Walkersvile，MD，USA)中，其中补充了牛垂体提取物(2ml)、氢化可的松(0.5ml)、重组人EGF(0.5ml)、肾上腺素(0.5ml)、转铁蛋白(0.5ml)、胰岛素(0.5ml)、视黄酸(0.5ml)、三碘甲状腺氨酸(0.5ml)、硫酸庆大霉素(50μg/ml)和两性霉素B(50ng/ml)。将细胞在5％CO2温育箱中在37℃温育，并在80％-85％汇合度亚培养。将细胞暴露于200μg/ml OVA 72小时。伴刀豆球蛋白A(Con A，10μg/ml)用作阳性对照。通过ELISA分析来自平行的一式三份培养物的上清液中的细胞因子水平。正常人支气管上皮细胞培养于含有补充物的优化的支气管上皮bulletkit培养基(Lonza，Basel，Switzerland)中。以30μM穿心莲内酯或介质(0.01％DMSO)预处理细胞，4小时后，以10ng/ml肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激。在指定的时间间隔从细胞中提取总蛋白和核蛋白，以及mRNA。

免疫印迹

分离肺和细胞培养物的细胞核蛋白(10mg/泳道)。将裂解物在冰上温育30分钟，然后离心(18,000g，5min)。收集上清液，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。将28μl测定的蛋白与7μl 5x样品缓冲液混合并在95℃煮沸5分钟。按照本领域已知的方式设定10％的SDS-PAGE。将凝胶置于Trans-Blot槽(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中。向每个孔中加入30μl样品混合物和预染色的SDSPage标记物(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，并在100V跑胶2小时。然后使用半干式转印器(ATTO Corp，Tokyo，Japan)将蛋白转移至PVDF膜。以Tween-20 Tris缓冲盐水(TTBS)中的5％的脱脂牛奶封闭该PVDF膜2小时，并以TTBS中的1％的脱脂牛奶中的各个一抗(对于抗兔子抗体，按照1∶2,000；对于抗小鼠抗体，按照1∶5,000；对于β-肌动蛋白，按照1∶10,000)探测、在4°温育过夜。然后以TTBS洗涤PVDF膜10次(2-3分钟/次)，并与HRP-或AP-缀合的抗-小鼠或抗-兔子抗体温育1小时。再次以TTBS洗涤膜。对于HRP-缀合的抗体，向膜上加入各1ml的HRP底物1和底物2。对于AP-缀合的抗体，加入7.5ml AP底物(300μl AP 25x缓冲液、75μl试剂A、75μl试剂B、7.5ml水)/凝胶。然后使用ECL试剂在黑暗中在hyperfilm上显影。以抗-p65、抗-磷酸化p65(Ser536)和抗-TATA结合蛋白(TBP，Abcam，Cambridge，UK)探测免疫印迹。

mRNA表达

在最后一次OVA或盐水刺激之后24小时，从胸腔分离肺，并储存于RNAlater中。将样品在-40℃过夜温育，以使RNAlater渗透进入肺组织以稳定RNA。然后将样品储存于-80℃。在分离RNA之前，在-4℃将肺组织解冻。然后将它们从RNAlater中取出并浸没于1mlTrizol溶液中。然后，使用匀浆器(SilentCrusher M，Heidolph ElektroGmbH&Co.，Kelheim，Genman)进行匀浆。将所有样品置于冰上以防止RNA降解。然后将匀浆物在4℃在12,000g离心10分钟。然后，轻轻倒出澄清的含有RNA的上清液，在室温温育5分钟，并加入0.2ml氯仿。将所有的管剧烈摇动15秒并在室温温育3分钟，然后在4℃在12,000g离心15分钟。轻轻倒出大约500μl无色的含有RNA的含水上层。加入0.5ml异丙醇并混合30秒，然后在室温温育10分钟。然后将管在4℃在12000rpm离心15分钟。弃上清并向RNA沉淀物中加入1ml 75％的乙醇。然后在4℃在8500rpm离心5分钟以洗涤沉淀。再次弃上清，将经洗涤的RNA沉淀物在室温气干10分钟。将干燥的RNA沉淀物溶解于100μl不含核糖核酸酶的DEPC水中，并在55℃温育10分钟。使用分光光度计(来自Thermo Risher ScientificInc.，Waltham，MA，USA的NanoDrop ND-1000)定量样品中存在的RNA的量和纯度。记录A₂₆₀/A₂₈₀(DNA/蛋白)和A₂₆₀/A₂₃₀(DNA/有机污染物)之比，作为所提取的RNA的纯度的指征。A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀读数的可接受水平的纯度应该是大约1.8至2.0。

进行逆转录以从所提取的RNA合成单链互补DNA(cDNA)模板。基于从分光光度计所测的核酸浓度计算含有1μg总RNA的体积，并使用DEPC水补至20μl。然后将10.58μl主混合物加入到每个样品中。然后，使用多孔热循环仪(来自Applied Biosystems，Foster City，CA，USA的GeneAmp PCR系统2700)，通过在95℃反应10分钟并在42℃反应30分钟而从1μg RNA合成cDNA。

然后，使用多孔热循环仪在25μl反应体积中的1μl cDNA模板上进行PCR扩增。反应体积含有10.5μl不含核酸酶的水、0.5μl正向引物(10μM)、0.5μl反向引物(10μM)和12.5μl 2x PCR主混合物(50单位/ml TaqDNA聚合酶，400μM dATP，400μM dGTP，400μM dCTP，400μM dTTP和3mM MgCl₂)。用于炎性生物标志物的引物显示于表4。

表4.用于逆转录酶-聚合酶链式反应分析的引物组

NF-κB DNA结合

还使用TransAM NF-κB p65转录因子测定试剂盒(Active Motif，Carlsbad，CA)分析了细胞核蛋白的NF-κB DNA结合活性。

统计学分析

数据表示为平均值±SEM。使用单因素ANOVA、然后使用Dunnett’s检验来测定处理组之间的显著性差异。显著性水平设定为P＜0.05。

本领域技术人员将认识到，本文描述的发明易于进行除了那些具体描述的之外的改变和修改。本发明包括所有此类的改变和修改。本发明还包括在说明书中单独或联合指出或指明的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及步骤或特征的任意和所有组合或任意两个或更多个步骤或特征。

本文中引用的每篇文章、参考文献、专利申请或专利都明确通过引用方式全文并入本文，意思是：其应该被读者阅读并认为是本文的一部分。本文中引用的每篇文章、参考文献、专利申请或专利未在本文中加以重复，仅仅是为了简明的原因。

本文或任何通过引用方式并入本文的文献中提及的任何产品的任何生产商的指示、描述、产品说明书，以及产品图表都通过引用方式并入本文，并且可用于本发明的实施。

本发明在范围上不受本文描述的任何具体实施方式的限制。这些实施方式仅仅意在示例。功能等效的产品、制剂和方法显然落在本文描述的发明的范围内。

本文描述的发明可以包括数值的一个或多个范围(例如尺寸、浓度等)。数值的范围将被理解为包括该范围内的所有数值，包括确定该范围的数值，以及与确定该范围的界限的数值紧邻的数值引起相同或基本上相同的结果的邻近该范围的数值。

在本说明书通篇，除非上下文另有需要，否则词语″包括(comprise)″或变体例如″包括(comprises)″或″包括(comprising)″将被理解为暗示包括指明的整数或整数的组，但不排除任何其它整数或整数的组。还要注意，在本公开、尤其是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等可以具有美国专利法中赋予它的含义；例如，它们可以意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；术语例如“实质上由......组成(consisting essentially of)”和“实质上由......组成(consists essentially of)”具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未明确提及的元素，但是排除在现有技术中存在或影响发明的基础或新颖性特征的元素。

可以在本发明的详细描述中发现本文所选择的术语的其它定义，并且适用于通篇。除非另有定义，否则本文使用的所有其它科学和技术术语具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同意义。

虽然已经通过参考具体方法和实施方式描述了本发明，但是将认识到：可以不脱离本发明而作出多种修改和改变。

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Claims

1.控制肺细胞中的炎症的方法，包括施用一定剂量的式I

其中

R¹和R²可以选自羟基，甲氧基，亚甲基，或者醚或酯连接的糖基团；氢，取代或非取代的、线性或支链的(C₁-C₈)烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基等；芳基，例如苯基、萘基等，所述芳基可以是取代的；杂芳基，例如吡啶基、呋喃基、硫代苯基等，所述杂芳基可以是取代的；芳烷基，例如苄基、苯乙基等，所述芳烷基可以是取代的；杂芳烷基，例如吡啶甲基、吡啶乙基、呋喃甲基、呋喃乙基等，所述杂芳烷基可以是取代的；(C₂-C₈)烷酰基，例如乙酰基、丙酰基、丁酰基等，所述(C₂-C₈)烷酰基可以是取代的；(C₃-C₈)烯酰基，例如丙烯酰基、丁烯酰基、戊烯基等，所述(C₃-C₈)烯酰基可以是取代的；芳酰基，例如苯甲酰基等，所述芳酰基可以是取代的；杂芳酰基，例如吡啶羰基、呋喃羰基等，所述杂芳酰基可以是取代的；芳烯酰基，例如苯基丙烯酰基、苯基丁烯酰基、苯基戊烯酰基等，所述芳烯酰基可以是取代的；芳烷酰基，例如苯基丙酰基、苯基丁酰基、苯基戊酰基等，所述芳烷酰基可以是取代的；磺酰基，例如甲磺酰基、苯磺酰基、对甲基苯磺酰基等，所述磺酰基可以是取代的；

R³选自甲基或亚甲基；

R⁴选自羟基或羰基；

2.权利要求1的方法，其中所述细胞是体外的。

3.权利要求1的方法，其中所述细胞是体内的并且向需要控制气道病症的患者施用式I。

4.权利要求1的方法，其中所述式I是穿心莲内酯。

5.权利要求1的方法，其中所述式I是14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯。

6.权利要求1的方法，其中控制炎症包括控制哮喘。

7.权利要求1的方法，其中控制炎症包括控制变应原性效应。

8.权利要求1的方法，其中控制炎症包括控制慢性阻塞性肺病(COPD)。

9.治疗气道病症的方法，包括施用一定剂量的式I

其中

R¹和R²可以选自羟基，甲氧基，亚甲基，或者醚或酯连接的糖基团；氢，取代或非取代的、线性或支链的(C₁-C₈)烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基等；芳基，例如苯基、萘基等，所述芳基可以是取代的；杂芳基，例如吡啶基、呋喃基、硫代苯基等，所述杂芳基可以是取代的；芳烷基，例如苄基、苯乙基等，所述芳烷基可以是取代的；杂芳烷基，例如吡啶甲基、吡啶乙基、呋喃甲基、呋喃乙基等，所述杂芳烷基可以是取代的；(C₂-C₈)烷酰基，例如乙酰基、丙酰基、丁酰基等，所述(C₂-C₈)烷酰基可以是取代的；(C₃-C₈)烯酰基，例如丙烯酰基、丁烯酰基、戊烯基等，所述(C₃-C₈)烯酰基可以是取代的；芳酰基，例如苯甲酰基等，所述芳酰基可以是取代的；杂芳酰基，例如吡啶羰基、呋喃羰基等，所述杂芳酰基可以是取代的；芳烯酰基，例如苯基丙烯酰基、苯基丁烯酰基、苯基戊烯酰基等，所述芳烯酰基可以是取代的；芳烷酰基，例如苯基丙酰基、苯基丁酰基、苯基戊酰基等，所述芳烷酰基可以是取代的；磺酰基，例如甲磺酰基、苯磺酰基、对甲基苯磺酰基等，所述磺酰基可以是取代的，

R³选自甲基或亚甲基；

R⁴选自羟基或羰基；

10.权利要求9的方法，其中所述式I是穿心莲内酯。

11.权利要求9的方法，其中所述式I是14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯。

12.权利要求9的方法，其中所述气道病症是哮喘加重。

13.权利要求9的方法，其中所述气道病症是COPD。

14.权利要求1或9的方法，还包括施用皮质类固醇。

15.权利要求14的方法，其中所述皮质类固醇包括地塞米松、布地奈德、氟替卡松、环索奈德或二丙酸倍氯米松。

16.用于治疗气道病症的式I的化合物

其中

R³选自甲基或亚甲基；

R⁴选自羟基或羰基；

17.权利要求16的化合物，其中所述气道病症是哮喘。

18.权利要求16的化合物，其中所述气道病症是COPD。

19.权利要求16的化合物，其中式I是穿心莲内酯。

20.权利要求16的化合物，其中式I是14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯。

21.包含皮质类固醇和式I的组合物，

其中

R³选自甲基或亚甲基；

R⁴选自羟基或羰基；

22.权利要求21的组合物，其中式I是穿心莲内酯。

23.权利要求21的组合物，其中式I是14-脱氧-11，12-二去氢穿心莲内酯。

24.权利要求21-23任一项的组合物，其中所述皮质类固醇包括地塞米松、布地奈德、氟替卡松、环索奈德或二丙酸倍氯米松。

25.权利要求21-24任一项的组合物，用于治疗气道病症。

26.权利要求25的组合物，其中所述气道病症是哮喘。

27.权利要求25的组合物，其中所述气道病症是COPD。