CN109200051A - 石杉碱甲及其类似物作为治疗炎症性疾病药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及石杉碱甲及其类似物以及它们药学上可接受的盐或复合物在制备治疗炎症性疾病的药物及药物组合物的应用。

Description

石杉碱甲及其类似物作为治疗炎症性疾病药物的用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及石杉碱甲及其类似物作为治疗炎症性疾病的药物的用途。

技术背景

炎症(Inflammation)是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应，包括感染性炎症和非感染性炎症，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。

临床中，炎症性疾病是人类和动物面临的主要疾病种类之一，体表的外伤感染和各器官的大部分常见病和多发病大多属于炎症性疾病，涉及到包括神经系统、运动系统、呼吸系统、生殖系统、消化系统、泌尿系统、皮肤组织等几乎所有系统，常见的疾病包括脑膜炎、脊髓炎、神经炎、急慢性风湿性、急慢性关节炎、急慢性强直性脊椎炎、骨关节炎、肩周炎、滑囊炎、肌腱炎及腱鞘炎、腰背痛、扭伤、劳损及其他软组织损伤、急性痛风、痛经或生殖系统附件炎、牙痛和术后疼痛、耳鼻喉严重的感染性疼痛和炎症(如扁桃体炎、耳炎、鼻窦炎等)、过敏性鼻炎、咽炎、支气管炎、肺炎、过敏性哮喘、慢性阻塞性肺气肿、肾炎(肾小球肾炎、肾盂肾炎)、慢性宫颈炎、盆腔炎、阴道炎、尿道炎、膀胱炎、风湿性关节炎、风湿性心脏病、风湿性脉管炎、心肌炎、胃炎、肠炎、阑尾炎、肝炎、胰腺炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、红斑狼疮、化脓性炎症等，近年来科学家们认为部分肿瘤也可归属为炎症性疾病。

类风湿性关节炎和骨关节炎是炎症性疾病的典型代表。类风湿性关节炎是一种以滑膜炎为特征，以慢性多发性关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病，晚期能致关节畸形，最终导致不同程度的残疾，甚至累及心、肺、肾等功能，严重地影响人类健康。骨关节炎是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特性的慢性关节疾病。多见于中老年人，女性多于男性。好发于负重较大的膝关节、髋关节、腰骶部脊柱关节及第一跖趾关节等部位，以及手部的远端指间关节和近端指间关节。该病亦称为骨关节病、退行性关节炎、增生行关节炎、退化性关节炎、骨性关节炎等。

临床中对于炎症性疾病的治疗有不同的治疗方案，对于病原微生物引起的炎症主要是给予抗菌、抗病毒药物，同时根据情况给予消炎镇痛药辅助治疗；对于非病原微生物引起的炎症一般给予抗炎药物，如甾体类抗炎药、非甾体类抗炎药(NonsteroidalAntiinflammatory Drugs，NSAIDs)、免疫抑制剂、抗组胺药等。其中非甾体类抗炎药是使用最多的药物之一，其主要通过抑制前列腺素的合成，抑制白细胞的聚集，减少缓激肽的形成，抑制血小板的凝集等作用发挥消炎作用，具有抗炎、抗风湿、止痛、退热和抗凝血等作用，代表性药物有阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、美洛昔康、罗非昔布、塞来昔布等，在临床上广泛用于骨关节炎、类风湿性关节炎、多种发热和各种肿痛症状的缓解。比如临床上传统用于治疗类风湿性关节炎、骨关节炎的药物有三大类，即非甾体抗炎药(NSAID)、疾病调理性抗风湿药(DMARD)以及糖皮质激素类药物。

然而，由于作用机制原因，胃肠道副作用和心血管副作用是非甾体类抗炎药挥之不去的阴影。随着NSAIDs使用的增多，这类药物的安全使用问题也越来越受到临床医师、药师、患者、和政府监管部门的关注。Merck公司2004年10月宣布主动从全球市场撤回万络(罗非昔布)；美国食品药品监督管理局(FDA)认为NSAIDs存在潜在的心血管和消化道出血风险，多年来一直密切关注该类药物的安全性问题，多次要求NSAIDs药品生产厂家在多个NSAIDs药品说明书中提出安全警示。

显然，目前临床使用的抗炎药在安全性和有效性方面还远远不够，研究发明新的、安全有效的抗炎药仍然是药物研究工作者的目标之一。

石杉碱甲(Huperzine A)是目前临床使用的乙酰胆碱酯酶抑制剂类的抗AD药物的典型代表。石杉碱甲是从石松类中药千层塔(蛇足石杉，Huperzia serrata)中提取的一种新型石松生物碱。药理学研究表明石杉碱甲是一种高效、高选择性、可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，此外还表现出广泛的神经保护以及对抗氧化应激、改善脑缺血损伤、修复记忆损害等作用。毒理试验表明，石杉碱甲的小鼠LD50剂量分别为口服4.6mg/kg，皮下注射3.0mg/kg，腹腔注射1.8mg/kg和静脉注射0.63mg/kg。180天连续给药的亚急性毒性研究表明，推荐剂量下石杉碱甲对大鼠或狗的肝、肾、心、肺及脑等脏器均未观察到明显的组织病理学改变。致突变及致畸作用试验表明，石杉碱甲无致突变及致畸作用。

石杉碱甲制剂1994年被中国药政部门批准上市用于治疗AD。中华人民共和国药典自2010年版开始收录石杉碱甲及制剂，建议的剂量为一次100-200μg口服，一日2次。临床数据表明，石杉碱甲的总体临床安全性良好，不存在剂量限制的肝脏毒性，心血管临床数据也不存在异常，高剂量下少数患者会出现轻中度的呕吐、腹泻、厌食、幻觉及失眠等的不良反应。

早期国内外关于石杉碱甲生理活性研究及临床应用研究主要集中于跟乙酰胆碱酯酶直接相关的中枢神经系统，如重症肌无力、阿尔兹海默病、血管损伤性痴呆、多梗死性痴呆、精神分裂、青少年智力发育迟缓、慢性失眠等。近年来，石杉碱甲受到越来越多的医药研究者关注，被发现具有其他的生理活性。

中国专利CN1907974声称石杉碱甲具有镇痛作用，可用来缓解或治疗哺乳动物的疼痛、功能性疼痛综合症、器官性疼痛综合症；

CN101797223要求保护石杉碱甲在制备预防、治疗青光眼、眼压升高或伴有视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病药物中的应用

CN101797252要求保护石杉碱甲在制备预防、治疗青光眼、眼压升高或伴有视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病药物中的应用

CN102258518要求保护在制备治疗青光眼和/或缺血诱发的视神经损伤的药物中的用途；

CN 101804038要求保护石杉碱甲在治疗精神分裂症及神经功能损伤药物中的应用；

CN102846612声称石杉碱甲能抑制模型小鼠的脊髓炎症细胞浸润及炎性介质释放，要求保护石杉碱甲在制备防治多发性硬化疾病药物中的用途；

CN106046017要求保护石杉碱甲在治疗牙周炎的药物中的应用。

上述既有技术大多着眼于神经系统相关疾病，未涉及石杉碱甲作为抗炎药物在治疗非神经系统炎症、非牙周炎的其他炎症性疾病中的应用。

因此，研究石杉碱甲的抗炎活性及用作临床抗炎药物的可能性具有较高的学术价值、临床价值和商业价值。

发明内容

本发明涉及石杉碱甲类似物及其药学上可接受的盐或复合物在制备治疗炎症性疾病的药物及药物组合物中的应用。

本发明人在石杉碱甲的提取、纯化工艺研究中意外的发现石杉碱甲具有一定的抗炎作用。进一步的研究发现，石杉碱甲及类似物对二甲苯致炎的小鼠耳肿胀模型显示出剂量依赖的抑制作用；对完全弗氏佐剂诱导的大鼠类风湿性关节炎耳模型，石杉碱甲具有与阳性药双氯芬酸钠活性相当的抑制作用；在木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎模型试验中，呼吸道变应性疾病；典型病例的临床用药结果表明，石杉碱甲对慢性支气管炎伴随肺气肿具有明显的缓解作用。这些动物模型的实验数据和典型病例显示，石杉碱甲及其药学上可接受的盐或复合物可以应用于制备治疗包括关节炎、骨关节炎、支气管炎、肺气肿在内的炎症性疾病的药物。

本发明所指石杉碱甲类似物是指如下所示结构的化合物及其光学异构体以及它们药学上可接受的盐或者复合物，包括但不限于石杉碱甲与无机酸(如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，碱金属、碱土金属的酸式盐等)、有机酸(如C1-C20的羧酸、磺酸)、无机碱(如氨，碱金属、碱土金属的氢氧化物、碱式盐)、有机碱(如C1-C20的有机胺)所成的盐；或者它们与其他有机物或者无机物形成的复合物。

石杉碱甲类似物结构

其中，R1＝H，OH，NH2，SH，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、卤代烃、醚、胺、硫醚、醇、硫醇、羧酸及羧酸衍生物，C3-C20的杂环、芳环、芳杂环；

R2＝H，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、卤代烃、醚、胺、硫醚、醇、硫醇、羧酸及羧酸衍生物，C3-C20的杂环、芳环、芳杂环；

R3＝H，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、卤代烃、醚、胺、硫醚、醇、硫醇、羧酸及羧酸衍生物，C1-C20的杂环、芳环、芳杂环；

R4＝H，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、卤代烃、醚、胺、硫醚、醇、硫醇、羧酸及羧酸衍生物，C3-C20的杂环、芳环、芳杂环

R5＝H，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、卤代烃、醚、胺、硫醚、醇、硫醇、羧酸及羧酸衍生物，C3-C20的杂环、芳环、芳杂环。

本发明所指炎症性疾病，指由炎症介质参与和介导的上皮组织、结缔组织、肌肉组织的炎症性疾病，包括但不限于急慢性风湿性关节炎、急慢性关节炎、急慢性强直性脊椎炎、骨关节炎、肩周炎、滑囊炎、肌腱炎及腱鞘炎、腰背痛、扭伤、劳损及其他软组织损伤、急性痛风、痛经或生殖系统附件炎、耳鼻喉严重的感染性疼痛和炎症(如扁桃体炎、耳炎、鼻窦炎等)、过敏性鼻炎、口腔炎、咽炎、急慢性支气管炎、急慢性肺炎、过敏性哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺病、急慢性肾炎(肾小球肾炎、肾盂肾炎、间质性肾炎)、慢性宫颈炎、盆腔炎、阴道炎、尿道炎、膀胱炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性心脏病、风湿性脉管炎、心肌炎、胃炎、阑尾炎、肝炎、胰腺炎、荨麻疹、湿疹、皮炎、过敏性鼻炎、皮肤瘙痒、红斑狼疮、血管炎、化脓性炎症，但不包括神经炎、多发性硬化疾病、牙周炎、肠炎。

本发明涉及的药物及药物组合物可通过外用、口服、注射、吸入式喷雾或通过植入式贮存器的方式施用，临床可在0.1μg至100mg之间选择适合剂量。

本发明所涉及的药物及其组合物可通过一定的药物制剂形式施用，所述制剂的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、贴剂、凝胶、混悬液、干混悬剂、口服液、颗粒剂或注射剂。

本发明还涉及一种治疗炎症性疾病的药物组合物，其包含治疗有效剂量的石杉碱甲或其光学异构体或其药学上可接受的盐或复合物，和药学上可接受的辅料，如填充剂、崩解剂、溶剂、稀释剂、抛射剂、着色剂、黏合剂等。

本发明还涉及治疗炎症性疾病的药物制剂，该制剂除含治疗有效剂量的石杉碱甲或其光学异构体或其药学上可接受的盐或复合物外，还含有载体物质、填充剂、崩解剂、溶剂、稀释剂、抛射剂、着色剂、黏合剂。这些辅剂物质及其用量的选择取决于药物是通过胃肠道、口含、静脉、腹腔、真皮内、肌注、鼻腔、吸入、肛内、阴道内、经皮吸收或其他给药方式给药；该制剂的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、贴剂、凝胶、混悬液、干混悬剂、口服液、颗粒剂、注射剂、喷雾剂或气雾剂；该制剂可根据临床需要制成缓释或者控释制剂。

本发明涉及的药物也可与其他合适的药物活性成分做成复方使用，所指的其他药物活性成分包括抗感染药、镇痛剂、非甾体消炎药、免疫抑制剂，包括但不限于抗生素(如青霉素、头孢霉素等)、合成抗菌药(如磺胺嘧啶、喹诺酮类抗菌药等)、曲马多、布洛芬、双氯芬酸、塞来昔布、艾拉莫德、来氟米特、氨甲喋呤；或者对炎症有治疗效果的中药或中药复方。

本发明涉及的药物制剂及药物组合物中石杉碱甲的剂量可在0.1μg至100mg，优选10μg至4mg。

本发明的效果是：发现了石杉碱甲及其药学上可接受的盐或者复合物在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用，可能为这些疾病的临床治疗提供新的候选药物。

具体实施方式

具体地说，本发明可以通过以下实施例予以说明，但本发明的范围不仅限于这些实施例。

实施例1化合物1(R1＝CH3CH＝，R2＝R3＝R4＝H，R5＝CH3，石杉碱甲)的制备

原料：千层塔(蛇足石杉)，采购自湖南，经鉴定符合中国药典要求。

试验方法：取千层塔草10kg，剪段，小型粉碎机粉碎，加入5倍重量的稀盐酸浸泡24h，过滤，再同法加入5倍稀盐酸浸泡二次，合并酸液，减压浓缩至总体积的五分之一左右，用稀氢氧化钠调节pH9.0，用二氯甲烷1Lx5提取，合并有机层，蒸干，加200ml稀盐酸溶解，活性炭脱色，调节pH9.0，二氯甲烷200mlx5提取，蒸干，得到石杉碱甲粗品。多批粗品合并丙酮多次重结晶，得到类白色粉末1.6g，按药典方法HPLC检测，纯度大于99％，核磁共振氢谱与文献报道数据一致。

实施例2化合物2(R1＝CH3CH＝，R2＝CH3，R3＝R4＝H，R5＝CH3)的制备

取石杉碱甲100mg，溶于5ml甲醇，10ml丙酮的混合溶剂中，加入碘甲烷1ml，室温搅拌过夜，蒸干，残物丙酮重结晶，得到类白色粉末92mg。¹H-NMR与文献报道一致。

实施例3化合物3(R1＝CH3CH＝，R2＝R3＝CH3，R4＝H，R5＝CH3)的制备

取石杉碱甲100mg，溶于5ml甲酸-甲醛1∶1混合溶液，100℃搅拌反应5h，蒸干，5ml水溶解，氨水调节pH9-10，二氯甲烷10mlX3提取，提取液蒸干，残物丙酮重结晶，得到类白色粉末90mg。¹H-NMR与文献报道一致。

实施例4石杉碱甲片剂的制备

4.1处方

4.2、制备工艺

称取处方量的石杉碱甲和阿司帕坦、柠檬酸、交联聚维酮按等量递加法过100目筛充分混合均匀，加入适量水作粘合剂制软材，过24目筛制粒，于50℃烘箱中烘至干燥，过100目筛成细粉后和微晶纤维素混合均匀，再和淀粉按等量递加法过100目筛充分混合均匀，加入适量水作粘合剂制软材，过24目筛制粒，于50℃烘箱中烘至干燥，过24目筛整粒。加入处方量的硬脂酸镁混合均匀，压片。

实施例5石杉碱甲-来氟米特胶囊的制备

5.1处方

5.2、制备工艺

将来氟米特、淀粉分别过100目筛，按等量递增法与石杉碱甲混合均匀，加入10％聚维酮无水乙醇溶液制成软材，过28目筛制粒，干燥后，24目筛整粒，混入处方量的硬脂酸镁，装入胶囊即成。

实施例6石杉碱甲风湿膏的制备

6.1处方 石杉碱甲0.1g伤湿止痛流浸膏(系取生草乌、生川乌、乳香、没药、生马钱子、丁香各1份，肉桂、荆芥、防风、老鹳草、香加皮、积雪草、骨碎补各2份，白芷、山柰、干姜各3份，粉碎成粗粉，用90％乙醇制成相对密度约为1.05的流浸膏)50g薄荷脑10g冰片10g樟脑20g芸香浸膏12.5g颠茄流浸膏30g

6.2制备工艺 按处方量称取各药，另加3.7～4.0倍重的由橡胶、松香等制成的基质，制成涂料。进行涂膏，切段，盖衬，切成小块，即得。

实施例7石杉碱甲凝胶剂

7.1处方 石杉碱甲0.1g，卡波姆3g，甘油20mL，卡波姆3g，三乙醇胺适量，蒸馏水100g。

7.2制备工艺 取卡波姆3g，加适量水溶胀后，加入甘油，研磨使润湿，加三乙醇胺研磨成透明凝胶基质。另取石杉碱甲用适量水搅匀。将上述药液加入凝胶基质中，边加边研磨，加蒸馏水至100g，继续搅拌均匀，得透明凝胶剂。

实施例8石杉碱甲鼻喷雾剂

石杉碱甲0.1g，山梨糖醇4g，苯甲酸钠4g，薄荷脑1g，与600ml纯净水搅拌加热溶解，过滤，以纯净水加至1000ml，高温灭菌30分钟，灌装，即得。

实施例9石杉碱甲-沙丁胺醇片剂

同实施例2，处方中加入20mg硫酸沙丁胺醇，同法制备。

实施例10石杉碱甲注射液的制备

10.1处方

10.2制备工艺

称取处方量的盐酸石杉碱甲，加入处方量50％的注射用水搅拌溶解，加入0.10％针用活性炭，60℃保温搅拌30min，趁热脱炭，用适量的注射用水洗涤滤器后，将其与滤液合并，再加注射用水定容，搅匀；经含量测定合格后用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液以每支5ml灌封于安瓿中，流通蒸气灭菌30分钟，灯检，印字，包装。

实施例11小鼠耳肿胀模型试验

11.1实验动物：KM小鼠，南京师范大学动物试验中心

11.2实验药物：石杉碱甲，自制，批号：160601，含量大于99％；

二甲苯：南京化学试剂公司，分析纯；双氯芬酸钠：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析纯。

11.3实验方法：

1)取雄性小鼠按体重随机分组，每组10只，给药前禁食12小时，自由饮水。

2)小鼠灌胃给药(药物以0.5％CMC-Na混悬)，给药容量为0.4ml/20g，分对照组(给溶媒0.5％CMC-Na)，药物A，B，C高、中、低剂量组，阳性药组(双氯芬酸钠)。灌胃给药后1h，用微量进样器将20微升致炎剂二甲苯均匀涂布于小鼠右耳廓内外表面，左耳廓作对照。

3)致炎30min后，将小鼠脱颈椎处死，剪下左右耳，在左右耳相同部位，用打孔器(直径8mm)各取下一耳片用电子天平称重。

4)计算左右耳重量之差即肿胀度(mg)和肿胀抑制率(％)。公式为：

肿胀度(mg)＝右耳片重-左耳片重

肿胀抑制率(％)＝(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100％

5)将肿胀度数据进行统计学处理。

11.4实验结果

结果见表1。

表1二甲苯致炎的小鼠耳肿胀试验

药物	给药剂量(mg/kg)	肿胀度(mg)	抑制率
				CMC-Na	-	10.9±2.2	0
双氯芬酸钠	48	4.4±1.3**	59.6％
				化合物1	0.2	7.8±1.6	20.2％
化合物1	0.5	5.3±1.8**	51.4％
				化合物1	1.0	小鼠不耐受
化合物2	20	10.4±2.1
				化合物2	40	4.6±2.4	57.8％
化合物3	20	8.3±1.3
				化合物3	40	5.5±2.2	49.5％

备注：给药剂量单位均为mg/kg。**P＜0.01compared with control(CMC-Na).

结论：石杉碱甲及类似物对二甲苯致炎的小鼠耳肿胀模型呈剂量依赖的抑制作用，石杉碱甲0.5mg/kg剂量组活性与对照药物双氯芬酸钠(48mg/kg)组活性相当。该试验结果表明石杉碱甲类似物对该模型的炎症具有明显的抑制作用。

实施例12石杉碱甲治疗完全弗氏佐剂诱导的关节炎大鼠的实验

12.1动物：SPF级SD大鼠60只，体重200±10g。

12.2药品和试剂：石杉碱甲(自制，批号：160601，含量大于99％)；完全弗氏佐剂(Sigma公司)；双氯芬酸钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析纯)。

12.3实验方法：将SD大鼠分为六组(n＝10)，即正常组、模型组、阳性药组(双氯芬酸钠10mg/kg)、石杉碱甲低剂量组(0.1mg/kg)、中剂量组(0.2mg/kg)和高剂量组(0.4mg/kg)。在大鼠(正常组除外)右后足部皮内注射完全弗氏佐剂致炎。从致炎第二天起灌胃给药，每天给药一次，持续28天。分别在给药第7天、第14天、第21天和第28天评价大鼠致炎侧足肿胀程度和关节炎指数。给药28天后，麻醉情况下取血，测外周血淋巴细胞和中性细胞。分离血清，用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测血清中白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。

12.4.实验结果

12.4.1石杉碱甲对大鼠足肿胀程度的影响

以致炎前大鼠足体积与给药后大鼠足体积的差值(ΔmL)来衡量大鼠足肿胀的程度。如表2所示。与模型组相比较，阳性药组和石杉碱甲各剂量组均显著抑制大鼠关节肿胀(P＜0.05)。石杉碱甲高剂量组表现出和阳性药组相当的对致炎大鼠足肿胀的抑制作用。

表2石杉碱甲对大鼠致炎侧足体积变化的影响

*为与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)

12.4.2石杉碱甲对大鼠关节炎指数的影响

大鼠关节炎指数采用通用的5分标准，即0分为无改变，1分为踝骨部有肿胀，2分为踝骨部和跗骨部均有肿胀，3分为肿胀延伸至跖骨部，4分为整个后足肿胀明显。每只受试大鼠的关节炎评分最高分为8分，即两只后足评分的加和。如表3所示，与模型组比较，石杉碱甲的各剂量组均显著降低大鼠关节炎指数(P＜0.05)。

表3石杉碱甲对大鼠关节炎指数的影响

*为与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)

12.4.3石杉碱甲对大鼠血清IL-6和TNF-α含量的影响

如表4所示，阳性药组和石杉碱甲各剂量组大鼠血清中IL-6和TNF-α的水平与模型组对比，均显著性降低(P＜0.05)。

表4石杉碱甲对大鼠血清IL-6和TNF-α含量的影响

*为与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)

实施例13石杉碱甲治疗木瓜蛋白酶诱导的关节炎大鼠的实验

13.1动物：SPF级SD大鼠60只，体重200±10g。

13.2药品和试剂：石杉碱甲(自制，批号：160601，含量大于99％)；木瓜蛋白酶(Sigma公司)；硫酸氨基葡萄糖(浙江海正药业股份有限公司)。

13.3实验方法：将SD大鼠随机分为六组(n＝10)，即正常组、模型组、阳性药组(硫酸氨基葡萄糖，0.1mg/kg)、石杉碱甲低剂量组(0.1mg/kg)、中剂量组(0.2mg/kg)和高剂量组(0.4mg/kg)。通过大鼠右后膝关节腔内注入木瓜蛋白酶，造成骨关节病变模型：除正常组外，各组均在第1、3、7天，水合氯醛腹腔麻醉，于右膝关节腔内注射4％木瓜蛋白酶和及半胱氨酸混合溶液致炎。造模成功后，用药各组灌胃给予相应药液，正常组和模型组给予蒸馏水，每日一次。连续给药四周后动物麻醉情况下取血，分离血清，用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测血清中白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。取大鼠完整患膝关节，去除关节周围的皮肤和肌肉，10％多聚甲醛中固定，脱钙、常规脱水、浸蜡、包埋，切片用HE染色，光镜观察关节的病理组织学变化。

13.4实验结果

13.4.1石杉碱甲对骨关节炎大鼠血清IL-6和TNF-α含量的影响

如表5所示，石杉碱甲各剂量组大鼠血清中IL-6和TNF-α的水平与模型组对比，均显著性降低(P＜0.05)。

表5石杉碱甲对大鼠关节液IL-6和TNF-α含量的影响

*为与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)

13.4.2石杉碱甲对骨关节炎大鼠病理组织学的影响

组织学切片显示，正常组大鼠膝关节软骨结构完整，表面光滑，切线层软骨细胞呈梭形、平行排列于表面；移行层和深层软骨细胞呈圆形或卵圆形，柱状排列；模型组大鼠关节出现病理改变，软骨表面局部粗糙不平或出现裂隙，或缺失形成溃疡，或软骨组织坏死，失去原有结构，可见中度至重度增生和炎细胞浸润。与模型组相比，阳性药组、石杉碱甲各剂量组均能显著抑制骨关节炎大鼠关节软骨变性。

实施例14石杉碱甲治疗C-BSA诱导的慢性肾小球肾炎的实验研究

14.1实验动物：Wistar大鼠。

14.2实验药物：石杉碱甲，自制，批号：160601，含量大于99％；醋酸泼尼松：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。弗氏不完全佐剂：Sigma公司；小牛血清白蛋白(BSA)：Sigma公司；乙二胺(EDA)：国药化学试剂有限公司)；碳化二亚胺(EDC)：由Sigma)提供；均为分析纯试剂。

14.3方法：石杉碱甲对C-BSA肾炎大鼠模型的治疗作用：

C-BSA的制备：用67ml EDA加500ml双蒸水，加入6mol/L盐酸350ml，调pH至4.75，冷却至温度25℃；搅拌下将5gBSA溶解于25ml双蒸水，搅拌后，加入1.8gEDC，恒定温度25℃搅拌2h；用pH为4.75的醋酸缓冲液30ml终止反应，4℃用双蒸水透析48h除盐，冷冻干燥，得C-BSA粉剂，零下40℃保存备用；临用前取上述粉剂，用pH7.4磷酸盐缓冲液溶解使用。

计量设置：石杉碱甲成人日用量，按动物系数折算，指定大鼠3个给药剂量，分别为低剂量0.1mg/kg、中剂量0.2mg/kg、高剂量0.4mg/kg；醋酸泼尼松根据成人剂量换算，给药8mg/kg。

C-BSA肾炎大鼠模型的复制及实验分组：选取雄性大鼠60只，体重150-200g，随机分为6组，除正常对照组10只，不做任何处理正常饲养外，其余大鼠均分别取C-BSA 1.0mg与弗氏不完全佐剂0.1ml混均，大鼠皮下多点注射预免疫；每只大鼠预免疫1周后，每只注射C-BSA，先腹腔注射1周，第1天至第7天的剂量依次为1.0mg、1.0mg、1.0mg、1.5mg、1.5mg、2mg、2mg；第2周起，每次在灭菌条件下尾静脉注射2.5mgC-BSA，同时灌胃给药，阳性药组给予醋酸泼尼松，石杉碱甲组给予高、中、低计量的石杉碱甲CMC-Na溶液，正常组与模型组给予等容量20ml/kg的CMC-Na溶液；

观察项目：生化指标：分别在给药第14天和第35天收集大鼠24h尿液，进行尿蛋白测定；给药后42天，从眼眶静脉取血，检测血清总蛋白、胆固醇及血清肌酐和尿素氮含量。

统计方法：所有结果用均数±SD来表示，组间差异用SPSS 11.55统计软件进行分析。

14.4、石杉碱甲对大鼠C-BSA肾炎模型尿蛋白的影响，见表6。

表6石杉碱甲对大鼠C-BSA肾炎模型尿蛋白的影响(mg/24h，x±sd)

#与正常组比较P＞0.05；*与模型组P＜0.05(下同)

结论：给药35天后，石杉碱甲大、中、小剂量组均降低大鼠尿蛋白，活性弱于阳性药，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)，并且呈剂量依赖性，表明石杉碱甲口服35天对24h尿蛋白排出有减少作用。

14.5、石杉碱甲对C-BSA至模型血清总胆固醇、总蛋白及球蛋白的影响，见表7。

表7石杉碱甲对C-BSA肾炎模型血清总胆固醇、血清总蛋白及球蛋白的影响(x±sd)

结论：石杉碱甲不同剂量组都有升高肾炎大鼠血浆总蛋白、总胆固醇、球蛋白作用。

14.6、石杉碱甲对C-BSA致模型肾炎模型血清尿素及血清肌酐的影响，见表8。

表8石杉碱甲对C-BSA肾炎模型血清肌酐、血清尿素氮的影响(x±sd)

	数量	剂量(mg/kg)	CR(μmol/L)	BUN(mmol/L)
					CMC-Na	9	-	64.86±6.11	5.96±0.55
模型组	8	-	122.01±11.30	9.62±0.76
					醋酸泼尼松	9	8	70.15±7.16	7.26±0.62
石杉碱甲	10	0.1	110.35±9.63	8.72±0.94
					石杉碱甲	9	0.2	93.06±6.92	8.27±0.83
石杉碱甲	8	0.4	78.91±7.67	7.03±0.78

结论：与模型组比较，石杉碱甲高、中、低剂量组，醋酸泼尼松组均明显降低肾炎大鼠血浆肌酐含量；石杉碱甲给药组明显消除血清尿素氮，呈剂量相关性。

综合结论：C-BSA肾炎大鼠模型实验表明，石杉碱甲能明显降低模型大鼠的尿蛋白含量，降低血清肌酐、尿素氮水平，显示出对该模型肾炎的治疗作用。

实施例15石杉碱甲对大鼠过敏性鼻炎模型的影响

实验药物：石杉碱甲石杉碱甲，自制，批号：160601，含量大于99％；

卵清蛋白(OVA)：Sigma公司；氢氧化铝：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；地塞米松：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

实验动物：SD大鼠，体重180g-220g

实验方法：

大鼠过敏性鼻炎模型制备

配置OVA混悬液取OVA0.3mg，氢氧化铝30mg溶于生理盐水1mL，即得。

将每只隔日大鼠腹腔注射1ml OVA混悬液，共7次，用小鼠皮肤被动过敏实验(PCA)验证造模是否成功。

将造模成功的50只大鼠随机分为5组，每组10只，加正常健康大鼠10只，共60只。

造模成功后，将ova混悬液稀释10倍，用微量进样器滴入大鼠双侧鼻腔，每侧20uL，每天1次，共7次局部加强致敏，同时按照以下方法给药治疗：①正常对照组和②模型组每天用生理盐水灌胃，③地塞米松对照租5mg/kg 1次/d，④石杉碱甲小剂量组0.1mg/kg1次/d，⑤石杉碱甲中剂量组0.2mg/kg 1次/d，⑥石杉碱甲大剂量组0.4mg/kg 1次/d。

过敏性鼻炎鼻部症状评分

最后一次ova混悬液滴鼻后30min，观察动物的鼻痒、喷嚏、清涕的轻重程度并逐项评分，逐项评分后用叠加法计算总分。①鼻痒：1分(轻擦鼻数次)2分(擦鼻多次)3分(抓鼻、面不止，到处摩擦)②喷嚏：1分(1-5个)2分(5-10个)3分(11个以上)③流涕：1分(流到鼻前)2分(超过鼻前孔)3分(涕流满面)。

由表9可见，石杉碱甲(0.1mg/kg，0.2mg/kg，0.4mg/kg)明显抑制卵白蛋白所致过敏性鼻炎大鼠的抓鼻，喷嚏和流涕反应。且呈剂量依赖性。地塞米松组亦呈显著的抑制作用。

表9石杉碱甲对大鼠过敏性鼻炎模型的影响x±SD

组别	治疗前评分	治疗后评分
			正常对照组	1.30±0.30	1.28±0.33
模型组	6.82±0.61	7.02±0.72<sup>#</sup>
			地塞米松组	6.95±0.58	3.68±0.55<sup>*#</sup>
石杉碱甲小剂量组(0.1mg/kg)	7.15±0.60	4.21±0.62<sup>*#</sup>
			石杉碱甲中剂量组(0.2mg/kg)	7.01±0.74	3.74±0.66<sup>*#</sup>
石杉碱甲大剂量组(0.4mg/kg)	6.70±0.58	3.55±0.71<sup>*#</sup>

^*与模型组比较，P＜0.05；^#与正常对照组比较，P＜0.05；n＝10

结论：石杉碱甲对对抗原(卵清蛋白)所致大鼠过敏性鼻炎模型具有与地塞米松活性相当的抑制作用。

实施例16石杉碱甲对由卵清蛋白致敏的大鼠鼻腔血管通透性升高的影响

SD大鼠，体重180g-220g，按照以下方法分组，每组各10只。①正常对照组和②模型组用生理盐水灌胃，③地塞米松对照组5mg/kg灌胃，④石杉碱甲小剂量组0.1mg/kg灌胃，⑤石杉碱甲中剂量组0.2mg/kg灌胃，⑥石杉碱甲大剂量组0.4mg/kg灌胃。

实验方法大鼠致敏方法同实施例5的方法，在初次免疫后第14天，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/mg，麻醉后自气管向鼻腔插管，固定后将插管和恒流泵连接，以流速0.2ml/min，37℃生理盐水冲洗鼻腔15min，然后在大鼠尾部静脉注射1％Evans蓝生理盐水溶液5ml/kg，3min后收集灌流液10min。在致敏大鼠和正常大鼠，灌流液含卵清蛋白(OVA)1mg/ml，从鼻腔收集的灌流液经10000转离心10分钟后，620nm处比色测定上清液中Evans蓝的浓度。受试药物和卵清蛋白在灌流前分别灌胃给药。

由表10可见，石杉碱甲明显抑制卵清蛋白(OVA)过敏性鼻炎模型大鼠的鼻腔血管通透性，石杉碱甲显示明显的抑制趋势，且呈剂量依赖性。地塞米松组亦呈显著的抑制作用。

表10石杉碱甲对大鼠过敏性鼻炎模型鼻腔血管通透性升高的影响x±SD

组别	Evans蓝浓度(ug/ml)
		正常对照组	0.25±0.12
模型组	0.79±0.15
		地塞米松组	0.35±0.13
石杉碱甲小剂量组(0.1mg/kg)	0.44±0.15<sup>**</sup>
		石杉碱甲中剂量组(0.2mg/kg)	0.38±0.14<sup>**</sup>
石杉碱甲大剂量组(0.4mg/kg)	0.35±0.15<sup>**</sup>

^**与模型组比较，P＜0.05

结论：石杉碱甲对对抗原(卵清蛋白)所致大鼠过敏性鼻炎模型的鼻腔血管通透性升高具有与地塞米松活性相当的抑制作用。

实施例17

患者陈某，男，71岁，40年烟龄，慢性支气管炎合并轻度肺气肿，秋冬季经常发作，久治不愈。2015年11月再次发作，出现咳嗽、哮喘、气短等症状，服用罗红霉素胶囊+川贝枇杷露2周无明显改善，改服用石杉碱甲片200μg，bid，一周后咳嗽、哮喘、气短症状逐渐改善，3周后症状基本消失。改为石杉碱甲片100μg，bid长期服用，至2016年12月咳嗽、哮喘未再发作。

Claims (10)

1.具有如下结构的石杉碱甲类似物及其光学异构体以及它们药学上可接受的盐或复合物在制备治疗炎症性疾病的药物及药物组合物中的应用，

其中，R1＝H，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、醚、胺、醇、酸及衍生物；R2＝H，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、醚、胺、醇、酸及衍生物；R3＝H，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、醚、胺、醇、酸及衍生物；R4＝H，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、醚、胺、醇、酸及衍生物；R5＝H，CH3，CH2＝CH，CH3CH＝，CH3CH2，或其他C1-C10的烷烃、烯烃、卤代烃、醚、胺、硫醚、醇、硫醇、羧酸及羧酸衍生物，C3-C20的杂环、芳环、芳杂环。

2.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述炎症性疾病是由炎症介质参与和介导的急慢性风湿性关节炎、急慢性关节炎、急慢性强直性脊椎炎、骨关节炎、肩周炎、滑囊炎、肌腱炎及腱鞘炎、腰背痛、扭伤、劳损及其他软组织损伤、急性痛风、痛经或生殖系统附件炎、扁桃体炎、耳炎、鼻窦炎、过敏性鼻炎、口腔炎、咽炎、急慢性支气管炎、急慢性肺炎、过敏性哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺病、急慢性肾小球肾炎、急慢性肾盂肾炎、急慢性间质性肾炎、慢性宫颈炎、盆腔炎、阴道炎、尿道炎、膀胱炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性心脏病、风湿性脉管炎、心肌炎、胃炎、阑尾炎、肝炎、胰腺炎、荨麻疹、湿疹、皮炎、过敏性鼻炎、皮肤瘙痒、红斑狼疮、血管炎、化脓性炎症中的一种或一种以上。

3.权利要求1-2所述的应用，其特征在于，该药物是石杉碱甲或其光学异构体；或石杉碱甲与无机酸、有机酸、无机碱、有机碱所成的盐；或者石杉碱甲与其他有机物或者无机物形成的复合物。

4.权利要求1-2所述的应用，其特征在于，该药物或药物组合物可通过外用、口服、注射、吸入式喷雾或通过植入式贮存器的方式施用。

5.一种治疗炎症性疾病的药物组合物，其特征是，其包含治疗有效剂量的石杉碱甲或其光学异构体或其药学上可接受的盐或复合物，和药学上可接受的辅料。

6.权利要求5述的药物组合物，其特征是所述药物是通过胃肠道、口含、静脉、腹腔、真皮内、肌注、鼻腔、眼内、吸入、肛内、阴道内、经皮吸收或其他给药方式给药。

7.一种治疗炎症性疾病的药物制剂，其包含治疗有效剂量的石杉碱甲或其光学异构体或其药学上可接受的盐或复合物，其特征是，该制剂的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、贴剂、凝胶、混悬液、干混悬剂、口服液、颗粒剂、注射剂、喷雾剂或气雾剂。

8.权利要求7所述的药物制剂，其特征是该制剂是缓释或者控释制剂。

9.权利要求7所述的药物制剂，其特征是该制剂是石杉碱甲及其药学上可接受的盐或者复合物与其他合适的药物活性成分组成的复方制剂。

10.权利要求7-9所述药物制剂，其特征是该药物制剂含有的石杉碱甲及其药学上可接受的盐或者复合物的有效剂量是0.1μg至100mg。