CN109824655B - 穿心莲内酯化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
穿心莲内酯化合物及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及穿心莲内酯衍生物及其制备方法和用途，具体涉及一种新的具有靶向HK2抗炎症活性的化合物、其消旋体或旋光异构体，或其药学上可接受的盐和溶剂化物以及含有该化合物的药物组合物和制备方法。以及这些化合物在制备治疗和/或预防炎症药物中的应用。所述的化合物、及其异构体或其药学上可接受的盐如通式(I)所示，其中R如权利要求书和说明书所述。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及穿心莲内酯化合物及其制备方法和用途,具体涉及一种新的具有抗炎症活性的化合物、其消旋体或旋光异构体，或其药学上可接受的盐和溶剂化物，以及含有该化合物的药物组合物。还涉及该化合物的制备方法以及在制备治疗和/或预防炎症药物中的应用。
背景技术
炎症是免疫系统对感染和损伤的反应。许多疾病或健康问题的发病机制都涉及炎症。这些包括类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣关节炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、发烧、炎症和组织损伤引起的轻度至中度的疼痛、腰痛、肘部发炎、头痛、偏头痛、急性痛风、月经痛、转移性骨痛、术后疼痛、肌肉僵硬、帕金森病引起的疼痛和黄斑水肿。由于传统的抗炎药选择性较差,副作用明显,临床应用受到很大限制。
葡萄糖的无氧氧化分为糖酵解和乳酸生成两个阶段,己糖激酶(HK)是细胞糖酵解中的第一个限速酶,在ATP的参与下可将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖,为细胞在缺氧条件下提供了特别有意义的碳源和能量来源。在大多数肿瘤细胞中,HK2蛋白显著升高,活性增加,保证了肿瘤细胞糖酵解的快速进行。据报道HK2在类风湿性关节炎(RA)滑膜衬里中特异性表达并调节成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)侵袭性功能。因此，HK2被认为是一种新的潜在抗炎靶点。
穿心莲内酯(andrographolide)是穿心莲的主要活性成分，穿心莲为爵床科植物穿心莲(Andrographis paniculata)的全草或叶。有清热解毒、消炎、消肿止痛作用。主治细菌性痢疾、尿路感染、急性扁桃体炎、肠炎、咽喉炎、肺炎和流行性感冒，外用可治疗疮疖肿毒和外伤感染。在亚洲许多国家广泛用于治疗病毒感染、糖尿病、风湿关节炎、咽喉炎和腹泻。利用穿心莲内酯开发新型靶向HK2抗炎药物，具有良好的前景。
发明内容
本发明的目的是寻找并开发具有良好抗炎活性的化合物，该化合物可用于制备治疗/或预防炎症疾病的药物。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种通式(I)所示的化合物、其消旋体或旋光异构体，或其药学上可接受的盐和溶剂化物：
其中，
R为氢，取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的直链或支链的C1-C10烷酰基、取代或未取代的5-10元芳基或杂芳基，所述取代基为羟基、C1-C4烷基、卤素、硝基、C1-C4烷氧基苯基、羧基、磺酸基、C1-C4酰基、氨基、5-10元芳基或杂芳基；所述的杂芳基含有1-3个N、O或S的杂原子；
本发明优选通式(I)所示的化合物、其消旋体或旋光异构体，或其药学上可接受的盐和溶剂化物：
其中，
R为氢，取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的直链或支链的C1-C6烷酰基、取代或未取代的5-6元芳基或杂芳基，所述取代基为羟基、C1-C4烷基、卤素、硝基、C1-C4烷氧基苯基、羧基、磺酸基、C1-C4酰基、氨基、5-6元芳基或杂芳基；所述的杂芳基含有1-3个N、O或S的杂原子；
本发明优选通式(I)所示的化合物、其消旋体或旋光异构体，或其药学上可接受的盐和溶剂化物：
其中，
R为氢，取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的直链或支链的C1-C6烷酰基、取代或未取代的5-6元芳基或杂芳基，所述取代基为羟基、C1-C4烷基、卤素、硝基、C1-C4烷氧基苯基、羧基、磺酸基、C1-C4酰基、氨基、5-6元芳基或杂芳基；所述的杂芳基含有1-3个N、O或S的杂原子；
本发明优选通式(I)所示的化合物、其消旋体或旋光异构体，或其药学上可接受的盐和溶剂化物：
其中，
R为氢，取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的直链或支链的C1-C6烷酰基、取代或未取代的
所述取代基为羟基、C1-C4烷基、卤素、硝基、C1-C4烷氧基苯基、羧基、磺酸基、C1-C4酰基、氨基、苯基、
本发明优选通式(I)所示的化合物、其消旋体或旋光异构体，或其药学上可接受的盐和溶剂化物：
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基烟酸酯
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)苯甲酸甲酯
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基2-硝基苯甲酸酯
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基4-硝基苯甲酸酯
(2R)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]吖庚因-1-基)甲基2-氨基-3-苯基丙酸酯
(2R)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基2-氨基-4-甲基戊酸
(2S)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]吖庚因-1-基)甲基吡咯烷-2-羧酸酯
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基5-(1,2-二硫杂环戊烷-3-基)戊酸甲酯
本发明进一步提供了上述部分化合物的制备方法，但不仅限于下述制备方法：
以穿心莲内酯为原料，在吡啶中回流，利用氧化铝(Al2O3)脱水，得到中间体IM-1；然后在三乙胺(TEA)作用下，4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化，用叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)选择性的保护C-19位羟基，得到中间体IM-2；C-3位羟基用温和性氧化剂氯铬酸吡啶鎓盐(PCC)氧化成羰基，得到中间体IM-3；IM-3用吡啶做溶剂与盐酸羟胺(NH2OH·HCl)反应生成酮肟中间体IM-4；然后加入对甲苯磺酰氯(p-TsCl)，在TEA作用，DMAP催化下，发生Beckmann重排反应，得到中间体IM-5；IM-5在HCl的作用下脱去保护基团生产中间体IM-6；IM-6与相应的酸在缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)和催化剂DMAP的作用下得到系列化合物。
本发明所述的药学上可接受的盐为有机酸盐、无机酸盐、有机碱盐或无机碱盐，其中有机酸包括乙酸、甲磺酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、甲磺酸、丙二酸、硫辛酸；无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸；有机碱包括葡甲胺、氨基葡萄糖；无机碱包括碱金属，如钠、钾、钡、钙、镁、锌的碱性化合物。
本发明还提供了一种药物组合物，是以上式(I)的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐作为活性成分。本发明的化合物或其药学上可接受的盐可与药学上可接受的稀释剂、辅助剂和/或载体混合制成临床上可接受的药用组合物。
当本发明的药物组合物应用于临床时，可将其配制成若干种剂型，如：口服制剂(如片剂，胶囊剂，锭剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(如软膏或溶液)。用于本发明的药物组合物的载体是药学领域可得到的常见载体，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。
本发明还提供了所述化合物、其异构体或其药学上可接受的盐或含有该化合物的药物组合物在制备治疗/或预防炎症疾病的药物中的应用。
附图说明
图1为MST试验测定化合物2和13与HK2之间的结合。
图2为不同浓度的化合物8的细胞存活率(％)。
图3为不同浓度的化合物8处理后细胞因子IL-1β和IL-6的含量。
图中###表示与control空白对照组相比，p<0.001；***表示与LPS模型组相比，p<0.001。
图4为化合物8对蛋白iNOS、COX-2、NF-κB表达的抑制作用及其灰度分析结果。
图中###表示与control空白对照组相比，p<0.001；***表示与LPS模型组相比，p<0.001。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：本发明化合物的制备
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基烟酸酯(简称化合物1)的制备：
将穿心莲内酯(3.0g,8.6mmol)溶解在无水吡啶(8mL)中，加入无水氧化铝(0.6g)，混合液在115℃回流12小时，溶液显淡棕黄色。冷却至室温，过滤出去固体氧化铝，蒸干吡啶，二氯甲烷(DCM)重新溶解，开放硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1：1洗脱)，得到白色固体，收率93％。
IM-1(3.3g,10mmol)溶于二氯甲烷(60mL)中，加入三乙胺(1.6mL)搅拌。置于冰水浴中降温，然后加入叔丁基二甲基氯硅烷(1.8g,11.94mmol)，再加入催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，25℃反应三小时。反应完成后，转移至分液漏斗中，20％柠檬酸洗一次，饱和碳酸氢钠溶液洗一次，水洗一次，饱和食盐水洗一次无水硫酸钠干燥。开放硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1洗脱)，得到白色固体，收率91％。
称取PCC(1g,3.98mmol)放于三颈瓶中，加入10mL无水二氯甲烷搅拌均匀，降温至0℃。IM-2(1g,2.24mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，加入到反应瓶中，控制温度。加入完毕后提到室温反应2小时，体系逐渐变成黑色。反应结束后，往体系中加入20mL无水乙醚，促进铬黑析出，抽滤除去固体物质，蒸出乙醚，加二氯甲烷溶解，转到分液漏斗里，饱和碳酸氢钠洗一次，水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。开放硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1洗脱)，得到白色固体，收率46％。
IM-3(0.1g，0.22mmol)溶于无水吡啶(5mL)，加入盐酸羟胺(0.085g,1.22mmol)，40℃反应2小时。蒸干吡啶，二氯甲烷重新溶解，20％柠檬酸溶液洗一次，饱和碳酸氢钠溶液洗一次，水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。得白色固体，收率98％。
IM-4(0.8g,1.74mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，置于冰水浴下加入三乙胺(0.6mL)，搅拌降温。然后加入对甲苯磺酰氯(0.83g,4.35mmol)，最后加入催化量的4-二甲氨基吡啶，然后升温至25℃反应3小时。反应完成后，用20％柠檬酸溶液洗一次，饱和碳酸氢钠溶液洗一次，水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。开放硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1→石油醚：乙酸乙酯＝1：1梯度洗脱)。得到淡黄色色固体IM-5，收率42％；
IM-5(0.5g,1.09mmol)溶于氯化氢的乙酸乙酯溶液(1.5mol/L,5mL)，室温搅拌一小时。待反应完全后，彻底蒸干溶液，乙酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠溶液洗一次，水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。开放硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1：2洗脱)，得到淡黄色固体，收率96％。
称取二环己基碳二亚胺(DCC)(36mg,0.17mmol)和烟酸(0.20mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，室温搅拌20分钟活化酸分子，然后称取IM-6(60mg,0.17mmol)加入到反应瓶中，加入催化量的DMAP，25℃反应两个小时。反应完成后，过滤掉固体物质，将滤液转移至分液漏斗，用20％柠檬酸溶液洗一次，饱和碳酸氢钠溶液洗一次，水洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥。开放硅胶柱色谱纯化，得到白色固体。1H-NMR(600MHz,CDCl3):9.19(1H,s,2’-H),8.84(1H,dd,J＝4.8,1.5Hz,6’-H),8.36(1H,m,4’-H),7.70(1H,s,15-H),7.59(1H,dd,J＝7.8,4.8Hz,5’-H),7.29(s,1H,4-NH),6.73(1H,dd,J＝15.9,10.2Hz,12-H),6.17(1H,d,J＝15.9Hz,13-H),4.90(2H,s,16-H),4.80(1H,s,18a-H),4.72(1H,d,J＝11.0Hz,20a-H),4.49(1H,s,18b-H),4.24(1H,d,J＝11.1Hz,20b-H),2.78(1H,d,J＝10.0Hz),2.47–2.35(m,3H),2.14(dd,J＝17.7,9.1Hz,1H),1.93(dd,J＝15.1,6.9Hz,2H),1.79(dd,J＝27.8,12.5Hz,1H),1.68(ddd,J＝24.1,13.6,6.6Hz,2H),1.62–1.53(m,2H),1.53–1.42(m,1H),1.38(3H,s,19-CH3),1.15–1.00(m,2H),0.93(3H,s,21-CH3).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ175.4,172.4,164.5,153.7,150.2,148.7,147.1,137.1,134.1,127.0,125.4,123.9,121.9,108.9,70.2,68.2,58.6,57.7,53.8,41.2,35.7,34.6,30.3,28.21,24.95,16.5.
实施例2
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)苯甲酸甲酯(简称化合物2)的制备：
具体操作及配比参考化合物1的制备。
得((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)苯甲酸甲酯。1H-NMR(600MHz,CDCl3):8.02(d,J＝7.4Hz,2H,Ph-H),7.74–7.61(m,2H,Ph-H,15-H),7.55(t,J＝7.7Hz,2H,Ph-H),7.19(s,1H,4-NH),6.72(dd,J＝15.9,10.2Hz,1H,12-H),6.16(d,J＝15.9Hz,1H,13-H),4.90(s,2H,16-H),4.79(s,1H,18a-H),4.66(d,J＝11.1Hz,1H,20a-H),4.48(s,1H,18b-H),4.21(d,J＝11.2Hz,1H,20b-H),2.77(d,J＝10.0Hz,1H),2.44–2.36(m,3H),2.15(s,1H),1.93(dd,J＝19.7,12.9Hz,2H),1.74–1.69(m,2H),1.66(dd,J＝14.3,9.7Hz,1H),1.59(td,J＝12.9,4.1Hz,2H),1.48(dd,J＝14.1,10.7Hz,2H),1.36(s,3H,19-CH3),1.03(d,J＝11.9Hz,2H),0.92(s,3H,21-CH3).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ175.4,172.4,165.5,156.5,148.8,147.1,133.4,129.4,129.3,128.7,127.0,121.9,108.9,70.2,67.8,58.5,57.7,53.8,41.2,35.7,34.7,31.0,28.3,25.3,16.4.
实施例3
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基2-硝基苯甲酸酯(简称化合物3)的制备：
具体操作及配比参考化合物1的制备。
得((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基2-硝基苯甲酸酯。1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ8.05(d,J＝7.6Hz,1H,4’-H),7.96(dd,J＝7.4,1.2Hz,1H,6’-H),7.90–7.80(m,2H,3’,5’-H),7.69(s,1H,15-H),7.08(s,1H,4-NH),6.72(dd,J＝15.8,10.2Hz,1H,12-H),6.15(d,J＝15.9Hz,1H,13-H),4.89(s,2H,16-H),4.77(s,1H,18a-H),4.65(d,J＝11.1Hz,1H,20a-H),4.47(s,1H,18b-H),4.24(d,J＝11.1Hz,1H,20b-H),2.75(d,J＝10.0Hz,1H),2.44–2.33(m,3H),2.15–2.05(m,2H),1.87(t,J＝10.0Hz,2H),1.71(d,J＝9.2Hz,1H),1.66–1.57(m,2H),1.53–1.44(m,2H),1.29(s,3H,19-CH3),1.07–0.99(m,1H),0.90(s,3H,21-CH3).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ175.3,172.4,164.,148.7,148.1,147.1,134.1,133.4,133.2,130.1,127.0,125.5,124.0,121.9,108.9,70.2,69.0,58.3,57.7,53.7,41.2,35.6,34.6,30.9,28.1,25.3,16.4.
实施例4
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基4-硝基苯甲酸酯(简称化合物4)的制备：
具体操作及配比参考化合物1的制备。
得((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基4-硝基苯甲酸酯。1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ8.36(2H,d,J＝8.7Hz,3’,5’-H),8.27(2H,d,J＝8.6Hz,2’,6’-H),7.69(s,1H,15-H),7.26(s,1H,4-H),6.73(dd,J＝15.8,10.2Hz,1H,12-H),6.17(d,J＝15.9Hz,1H,13-H),4.90(s,2H,16-H),4.79(s,1H,18a-H),4.73(d,J＝11.1Hz,1H,20a-H),4.48(s,1H,18b-H),4.26(d,J＝11.1Hz,1H,20b-H),2.77(d,J＝10.1Hz,1H),2.47–2.35(m,3H),2.15(t,J＝10.9Hz,1H),1.93(d,J＝10.8Hz,2H),1.79(dd,J＝30.6,12.2Hz,1H),1.73–1.64(m,2H),1.58(ddd,J＝17.8,11.5,4.2Hz,3H),1.53–1.45(m,2H),1.38(s,3H,19-CH3),1.28–1.18(m,2H),0.92(s,3H,21-CH3).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):175.4,172.4,164.1,150.3,148.7,147.1,134.8,134.1,130.8,127.0,123.8,121.9,108.9,70.2,68.7,58.5,57.6,53.7,41.2,35.6,34.5,31.0,28.2,25.3,16.5.
实施例5
(2R)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]吖庚因-1-基)甲基2-氨基-3-苯基丙酸酯(简称化合物5)的制备：
具体操作及配比参考化合物1的制备。
得(2R)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]吖庚因-1-基)甲基2-氨基-3-苯基丙酸酯。1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ7.68(s,1H,15-H),7.31–7.23(m,2H,Ph-H),7.19(dd,J＝5.0,2.8Hz,3H,Ph-H),7.01(s,1H,4-NH),6.70(dd,J＝15.9,10.2Hz,1H,12-H),6.15(d,J＝15.8Hz,1H,13-H),4.89(s,2H,16-H),4.78(s,1H,18a-H),4.46(s,1H,18b-H),4.32(d,J＝11.0Hz,1H,20a-H),3.92(d,J＝11.0Hz,1H,20b-H),3.59(t,J＝6.9Hz,1H,2’-H),2.91(dd,J＝13.4,6.3Hz,1H),2.78–2.71(m,2H),2.36(ddd,J＝28.2,13.0,6.2Hz,3H),2.17–2.07(m,1H),1.84(dd,J＝22.6,7.6Hz,2H),1.60(dd,J＝13.3,9.6Hz,1H),1.49(qd,J＝12.9,7.1Hz,2H),1.18(s,3H,19-CH3),0.83(s,3H,21-CH3).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):175.2,174.5,172.4,148.8,147.1,137.9,134.1,129.1,128.1,126.9,126.2,121.8,108.9,70.2,67.3,58.4,57.4,55.9,53.3,41.0,40.3,35.7,34.4,30.8,28.2,24.8,16.6.
实施例6
(2R)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基2-氨基-4-甲基戊酸(简称化合物6)的制备：
具体操作及配比参考化合物1的制备。
得(2R)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基2-氨基-4-甲基戊酸。1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ7.68(s,1H,15-H),7.03(s,1H,4-NH),6.71(dd,J＝15.9,10.2Hz,1H,12-H),6.15(d,J＝15.9Hz,1H,13-H),4.89(s,2H,16-H),4.78(s,1H,18a-H),4.47(s,1H,18b-H),4.32(d,J＝11.1Hz,1H,20a-H),3.99(d,J＝11.1Hz,1H,20b-H),2.76(d,J＝10.1Hz,1H),2.43–2.30(m,3H),2.12(dd,J＝13.0,8.6Hz,1H),1.87(d,J＝10.6Hz,2H),1.71(dt,J＝13.4,6.6Hz,1H),1.62(dd,J＝13.0,9.5Hz,1H),1.54(dd,J＝13.3,4.2Hz,1H),1.50–1.38(m,3H),1.33–1.27(m,1H),1.24(s,3H,19-CH3),0.86(9H,m,21,5’,5”-CH3).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):175.7,175.2,172.4,148.9,147.1,134.1,126.9,121.8,108.8,70.2,67.3,58.4,57.4,53.2,52.5,43.4,41.1,35.7,34.4,30.8,28.3,24.9,24.1,22.8,21.8,16.6.
实施例7
(2S)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]吖庚因-1-基)甲基吡咯烷-2-羧酸酯(简称化合物7)的制备：
具体操作及配比参考化合物1的制备。
得(2S)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]吖庚因-1-基)甲基吡咯烷-2-羧酸酯。1H-NMR(600MHz,CDCl3):7.67(s,1H,15-H),6.98(s,1H,4-NH),6.71(dd,J＝15.9,10.2Hz,1H,12-H),6.16(d,J＝15.8Hz,1H,13-H),4.89(s,2H,16-H),4.78(s,1H,18a-H),4.46(s,1H,18b-H),4.35(d,J＝11.2Hz,1H,20a-H),4.02(d,J＝11.2Hz,1H,20b-H),3.69(dd,J＝8.4,5.6Hz,1H,2’-H),2.87(dt,J＝9.9,6.8Hz,1H),2.76(dt,J＝10.0,7.0Hz,2H),2.42–2.33(m,3H),2.16–2.07(m,1H),1.97(ddd,J＝14.9,12.6,8.1Hz,1H),1.85(d,J＝10.9Hz,2H),1.73(dt,J＝12.7,7.4Hz,1H),1.67–1.58(m,3H),1.54(dt,J＝13.2,9.2Hz,1H),1.50–1.42(m,1H),1.23(s,3H,19-CH3),0.86(s,3H,21-CH3).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):175.2,174.3,172.4,148.8,147.1,134.1,126.9,121.8,108.9,70.2,67.4,59.2,58.4,57.5,53.3,46.2,41.1,35.7,34.5,30.8,29.4,28.2,24.9,24.9,16.4.
实施例8
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基5-(1,2-二硫杂环戊烷-3-基)戊酸甲酯(简称化合物8)的制备：
具体操作及配比参考化合物1的制备。
得((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基5-(1,2-二硫杂环戊烷-3-基)戊酸甲酯。1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ7.67(s,1H,15-H),6.94(s,1H,4-NH),6.71(dd,J＝15.8,10.2Hz,1H,12-H),6.15(d,J＝15.8Hz,1H,13-H),4.89(s,2H,16-H),4.78(s,1H,18a-H),4.47(s,1H,18b-H),4.35(d,J＝11.2Hz,1H,20a-H),3.98(d,J＝11.2Hz,1H,20b-H),3.59(td,J＝12.5,6.2Hz,1H),3.18(dt,J＝12.1,6.2Hz,1H),3.10(dt,J＝11.0,6.8Hz,1H),2.74(d,J＝10.1Hz,1H),2.43–2.35(m,4H),2.34–2.30(m,2H),2.18–2.05(m,2H),1.90–1.80(m,3H),1.73–1.68(m,1H),1.57–1.51(m,3H),1.50–1.43(m,2H),1.36(dt,J＝21.2,10.5Hz,3H),1.23(3H,s,19-CH3),1.16–1.09(m,1H),1.03(td,J＝12.9,3.3Hz,1H),0.86(3H,s,21-CH3).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):175.2,172.5,172.4,148.8,147.0,134.1,127.0,121.8,108.8,70.2,66.8,58.3,57.7,56.0,56.0,53.5,41.1,39.8,38.0,35.8,34.6,34.0,33.3,30.9,28.3,28.0,25.0,16.3.
实施例9
本发明产物对RAW264.7细胞生成NO的影响研究
将RAW264.7细胞接种在96孔板中，并用不同浓度(0-100μM)的化合物处理3小时，然后与LPS(1μg/mL)一起温育24小时。将具有或不具有LPS的DMSO作为媒介物对照或模型对照处理。使用Griess试剂在540nm下用酶标仪测量培养基中的亚硝酸盐积累。计算化合物处理组的抑制率(％)并测定IC50值以评价NO抑制活性。以氢化可的松为阳性对照药。
本发明产物与HK2的结合
1.HK2的大量表达与纯化
(1)将编码HK2(Genebank:BC021116.1)的基因克隆至pET26b的载体上；
(2)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中，使用SB培养基于37℃，250rpm摇床中培养至对数生长期(OD600＝0.8-1.0)，加入0.4mM异丙基异丙基硫黄苷(IPTG)置于摇床15℃，220rpm诱导表达20h；
(3)诱导表达结束后，将菌液于4℃，4000rpm离心10min，收集菌体；
(4)向收集菌体中加入裂解缓冲液，进行超声波细胞破碎，破碎参数：超声功率40W，超声1s，总超声时间设置为3min，超声3轮。破碎菌液于4℃，14000rpm高速离心，取上清；
(5)依次使用镍亲和层析法、阴离子交换色谱和分子筛色谱法提纯该蛋白质对该蛋白进行纯化得重组人HK2蛋白。
2.化合物体外HK2酶抑制活性筛选
(1)将10μL重组人HK2蛋白(0.1mg/mL)与5μL待测试化合物于37℃恒温震荡培养箱中共孵育10min，加入剩余85μL反应体系(100mM Tris HCl，pH 8.0,5mM MgCl2,200mMglucose,0.8mM ATP,1mM NAD+,0.25Units of G6P-DH)后，将96孔板放入SpectraMax酶标仪中。酶标仪参数设置：检测波长为340nm，读数时间为20min，读数间隔为2min。
(2)化合物设置浓度梯度，每个浓度设置三个复孔，使用GraphPad Prism 5计算出相应化合物的酶活性半数抑制浓度(IC50)，结果如表1。
3.化合物8与HK2的Kd值测定
(1)10μL HK2蛋白与20μL Monolith NTTM Protein Labeling Kit RED等体积混匀，置于暗处室温孵育30min；
(2)将该标记体系通过分子排阻色谱除去游离的荧光标记染料，收集荧光染料标记的蛋白样品；
(3)将待测试药物按照一定梯度比稀释成12个浓度梯度，取各浓度梯度的药物溶液于等体积的已标记蛋白样品，离心；
(4)使用仪器专用的标准毛细管按照浓度高低顺序依次虹吸样品，置于微量热泳动仪Monolith NT.115instrument(Germany)中进行测定。参数设置：LED power 30％，Laspower 20-40％；
(5)通过MO.Affinity Analysis v2.2.4*软件进行实验数据分析，软件可自动拟合出待测化合物与HK2的解离常数，结果如图1。
表1.化合物抑制HK2酶活性和RAW264.7细胞NO生成IC50值表
从表中可以发现，化合物4和8抑制NO生成的活性高于氢化可的松，5和8显示出很好的HK2酶抑制活性。
实施例10
本发明产物化合物8在RAW264.7细胞中抗炎作用与机制研究
(1)CCK8法检测化合物8对细胞存活率的影响
对数生长期的RAW264.7细胞以5000个/孔接种于96孔板中培养12h。换不同浓度的化合物8(100、50、25、12.5、6.25和3.125μmol/L)处理细胞。以加入相应体积的DMSO的细胞孔作为空白对照。24h后弃掉培养基，每孔均加入100μL的含10％CCK8的培养基，培养20min后，酶标仪检测450nm处各孔的OD值计算实验组细胞存活率(以空白对照组细胞存活率为100％)。结果图2所示：
由图2可知，化合物8对RAW264.7细胞的存活率没有显著影响。
(2)ELISA法检测化合物8对白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)的生成的抑制作用
对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板培养12h。实验组用不同浓度化合物8(5、10和20μmol/L)处理。3h后，模型对照组和实验组加入LPS，使其终浓度为1μg/mL，而空白对照组加入等体积的DMEM培养基，继续培养24h。每孔均取细胞上清，按照ELISA试剂盒操作手册，于酶标仪检测450nm处各孔的OD值，计算每组的细胞因子含量。结果如图3所示：
由图3可知，化合物8可以抑制LPS引起的巨噬细胞RAW264.7分泌的细胞因子含量，并且，其抑制作用呈现剂量依赖性。
(3)Western blot检测化合物8对炎症相关蛋白的表达的抑制作用
RAW264.7细胞接种于6孔板培养12h。实验组用不同浓度化合物8(5、10和20μmol·L-1)处理。3h后，模型对照组和实验组加入LPS，使其终浓度为1μg/mL，而空白对照组加入等体积的DMEM培养基，继续培养24h。弃掉培养基，清洗并收集细胞进行Western Blot实验，测定蛋白iNOS、COX-2、NF-κB及其通路蛋白IκBα和磷酸化水平P-IκBα的表达情况，曝光条带用Gel-Pro analyzer进行灰度分析。结果如图4：
由图4可知，化合物8可以抑制iNOS和COX-2的表达，同时也降低了NF-κB及其通路蛋白IκBα的表达，以及IκBα的磷酸化水平。
以上具体实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.如下所述的化合物或其药学上可接受的盐：
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基烟酸酯；
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)苯甲酸甲酯；
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基2-硝基苯甲酸酯；
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基4-硝基苯甲酸酯；
(2R)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]吖庚因-1-基)甲基2-氨基-3-苯基丙酸酯；
(2R)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基2-氨基-4-甲基戊酸酯；
(2S)-((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]吖庚因-1-基)甲基吡咯烷-2-羧酸酯；
((1R,5aS,6R)-1,5a二甲基-7-亚甲基-3-氧代-6-((E)-2-(2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)乙烯基)十氢-1H-苯并[c]氮杂
-1-基)甲基5-(1,2-二硫杂环戊烷-3-基)戊酸酯。
2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述的药学上可接受的盐包括有机酸盐、无机酸盐、有机碱盐或无机碱盐。
3.一种药物组合物，包含权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药用载体。
4.一种药物制剂，包含权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求3所述的药物组合物。
5.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：
其中，R如权利要求1所述。
6.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求3所述的药物组合物或权利要求4所述的药物制剂在制备治疗和/或预防炎症疾病的药物中的应用。
7.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求3所述的药物组合物或权利要求4所述的药物制剂的制备抑制己糖激酶、白介素1β或白介素6生成或抑制iNOS和COX-2的药物中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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