CN105497013A - 倍半萜类化合物在制备抗哮喘疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及倍半萜内酯类化合物在制备抗哮喘疾病药物中的应用，所述倍半萜类化合物提取自旋覆花，本发明表明倍半萜类化合物OOABL在肥大细胞中具有阻断白三烯的合成和脱颗粒的抗炎作用和在哮喘动物模型中有效缓解气道阻塞等抗哮喘方面的作用和功效。

Description

倍半萜类化合物在制备抗哮喘疾病药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及中药旋覆花的提取物中分离得到的倍半萜内酯类化合物OOABL在制备抗哮喘疾病药物中的新应用。
背景技术
支气管哮喘(简称哮喘)是由嗜酸粒细胞、肥大细胞、T细胞及白细胞等多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症，在慢性炎症基础上伴随气道的高反应性(airwayhyperresponsiveness，AHR)和气道重建(airwayremodelling)，其本质是气道慢性炎症。哮喘是世界公认的医学难题，被世界卫生组织列为疾病中四大顽症之一。近十多年来，世界上许多国家和地区哮喘的发病率和病死率均呈增高趋势，这一现象已引起世界卫生组织(WHO)和各国政府的重视。
哮喘以可恢复的支气管阻塞、炎性细胞浸润和气道高反应性为其特征。哮喘涉及嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞、炎症介质、细胞因子的相互作用，呈现一种慢性气道炎症过程和气道高反应，从而引起可逆性气道阻塞，即迟发性哮喘反应。有报道指出，哮喘病人气道中肥大细胞数量增加，哮喘发作病人气道肥大细胞的活动性增强，气道活检标本中显示肥大细胞脱颗粒，支气管肺泡灌洗液中肥大细胞的产物增加。
旋覆花为菊科植物旋覆花属旋覆花InulajaponicaThunb.或Inulabritannica的干燥头状花序,属多年生草本植物。旋覆花作为我国传统中草药广泛分布在中国，日本和韩国等亚洲国家。旋覆花的干燥根和树叶作为我国民间中医药来治疗创伤，疖病和咳嗽。其花多半用在抗炎、化痰、助消化、消肿和驱虫等。2010版药典记载：旋覆花味辛苦咸温，归肺脾胃大肠经，具降气、消痰、行水、止呕之功能，主治风寒咳嗽、痰饮蓄结、胸膈痞闷、喘咳痰多、呕吐噫气、心下痞硬。现代药理学及临床研究表明旋覆花有抗炎、抗哮喘、抗糖尿病、低脂血症、抗肿瘤、抗菌、防霉、保肝和抗肝炎等作用。
文献报道倍半萜类化合物作为旋覆花植物中最主要的一类化学成分起到关键性的作用。很多研究组针对从旋覆花中分离提取的倍半萜内酯(sesquiterpenelactones)及其生物活性开展了大量研究，如杀菌、保肝和抗肿瘤作用等。最近几个研究组分离提取出了二萜(diterpenoid)和二聚倍半萜烯内酯(dimericsesquiterpenelactones)且对它们的抗炎，抗肿瘤等生物学活性做了初步研究。倍半萜内酯化合物Eupatolide，Bigelovin，1,6-O,O-diacetylbritannilactones(OOABL),Ergolide,1-O-acetylbritannilatone等均具有抗炎和抗癌作用。
本发明涉及倍半萜类化合物OOABL在肥大细胞中阻断白三烯的合成和脱颗粒的抗炎作用的机制和在哮喘动物模型中有效缓解气道阻塞等抗哮喘方面的作用和功效，尚未见相关报道。
发明内容
本发明创造公开一种倍半萜类化合物在制备抗哮喘疾病药物中的应用，所述倍半萜类化合物的化学式为：
进一步，所述倍半萜类化合物提取自旋覆花。
进一步，倍半萜类化合物的提取方法如下：
取中药旋覆花干燥头状花序分别按下述步骤进行处理：用药材重量6-10倍体积的乙醇回流提取，减压浓缩得乙醇浸膏；将乙醇浸膏以水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物；上述乙酸乙酯提取物，以硅胶柱色谱分离，分别用石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，TLC合并类似组分，得到的组分经制备凝胶渗透色谱GPC、凝胶(ToyopearlHW-40)柱、半制备HPLC纯化得到倍半萜内酯类化合物。
进一步，所述抗哮喘疾病药物的有效成分为倍半萜内酯类化合物，还含有药学上可接受的载体。
本发明通过体外及体内实验验证旋覆花倍半萜内酯类化合物(OOABL)对哮喘类疾病具有抑制作用。
体外验证过程如下：
本发明以骨髓来源的肥大细胞为体外模型之一，研究探针OOABL对肥大细胞(bonemarrow-derivedmastcells,BMMCs)脱颗粒和白三烯C4(leukotrieneC4,LTC4)的影响。结果证实了OOABL对肥大细胞脱颗粒具有明显抑制作用，该抑制作用是通过抑制细胞质内Ca2+浓度和脱颗粒信息磷脂酶Cγ(phospholipaseCγ,PLCγ)的磷酸化而实现；并且OOABL能显著降低白三烯的产生，该过程是通过抑制胞质磷脂酶A2(cytosolicphospholipaseA2,cPLA2)的磷酸化而实现，但该过程并不抑制分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases,MAPKs)[包括extracellularregulatedkinases(ERK1/2)、c-junN-terminalkinases(JNK)和p38MAPkinases]的磷酸化。
另外，本发明以人肺癌上皮细胞A549为另一体外模型之一，研究探针OOABL对Janus激酶/信号转导和转录活化因子(Janusproteintyrosinkinases/signaltransducersandactivatorsoftranscription,JAK/STAT)通路的影响。结果证实探针OOABL浓度依存性地抑制了STAT6的磷酸化，而且OOABL能显著抑制Eotaxin-1和ALOX-15的mRNA表达。
体内验证过程如下：
本发明以OVA诱导小鼠哮喘模型，研究OOABL对小鼠呼吸道反应性和血清中IgE的含量。结果表明OOABL能有效缓解乙酰甲胆碱(Mch)激发的气道阻塞，并且明显减少了血清中IgE的含量。
需要说明的是，肥大细胞是重要的效应和调节性免疫细胞，它在哮喘疾病的发病机制中起到至关重要的作用。当抗原与IgE的交联反应激活肥大细胞后，肥大细胞通过脱颗粒作用释放出自身含有的多种炎症因子，包括组胺、蛋白酶、蛋白多糖等，同时释放合成的炎症因子，如白三烯C4(LTC4)、前列腺素D2(PGD2)等。白三烯和组胺是哮喘发作中的重要炎症介质，可引起支气管狭窄、粘液分泌增多、增加血管通透性，而且参与气道重塑。Th1/Th2细胞平衡失调是哮喘发病的重要基础。STAT6对Th2细胞分化起着关键性的作用。有报道指出STAT6基因敲除小鼠的Th细胞不能分化为Th2细胞，而且B细胞不能产生IgE。Eotaxin属于嗜酸性粒细胞趋化因子，其主要可吸引嗜酸粒细胞在肺内的募集，促进其粘附在血管内皮细胞上，进而导致组织损伤。有研究报道ALOX15有助于哮喘的发病机制，并且上皮细胞过表达ALOX15与疾病的严重度相关联。STAT6作为转录因子对Eotaxin和ALOX15的mRNA表达具有增强作用。
附图说明
图1是OOABL对肥大细胞毒性的影响图；
图2是OOABL对肥大细胞脱颗粒的影响图；其中，β-HEX：β-Hexosaminidase(β-己糖胺酶)，β-HEX的释放间接地表示BMMCs脱颗粒，它是BMMCs脱颗粒的一个指标；
图3是OOABL对肥大细胞脱内钙离子浓度的影像图；
图4是OOABL对PLCγ磷酸化的影响图；其中，PLC：磷脂酶C；
图5是OOABL对白三烯产生的影响图；其中，LTC4：leukotrieneC4(白三烯C4)；
图6是OOABL对cPLA2磷酸化的的影响图；其中cPLA2：胞质磷脂酶A2；
图7是OOABL对MAPKs磷酸化的影响图；其中，PD98059：ERK抑制剂；SP600125：JNK抑制剂；SB203580：p38抑制剂；
图8是OOABL对A549细胞毒性的影响图；
图9是在A549细胞中OOABL对Eotaxin-1mRNA的表达的影响图；其中Eotaxin-1：趋化因子；IL-4：白细胞介素-4；
图10是OOABL对ALOX15mRNA的表达的影响图；其中ALOX15：arachidonate15-lipoxygenase；
图11是OOABL对STAT6磷酸化的影响图；其中，AS1517499：STAT6抑制剂；
图12是OOABL对JAK3磷酸化的影响图；
图13是OOABL对STAT6活性的影响图；
图14是在OVA诱导的小鼠哮喘动物模型中OOABL对乙酰甲胆碱激发的气道高反应性的的影响图；其中，NC：正常组；PC：哮喘模型组；Mont：孟鲁司特；Dex：地塞米松；Mch：乙酰甲胆碱；
图15是OOABL对血清中IgE的水平的影响图。
以上图中#均代表致敏组(体外细胞实验中DNP-HSA，IL-4刺激组和体内实验中OVA致敏组)与无刺激无致敏组比较；*均代表用药组(包括OOABL和PD98059、SP600125、SB203580、AS1517499、Mont、Dex等各种阳性对照药)与致敏组比较；#P﹤0.05，##P﹤0.01，###P﹤0.001；*P﹤0.05，**P﹤0.01，***P﹤0.001。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明创造进行进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或本领域技术人员在知识范围内能够推知的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中涉及的试剂和仪器用具，通常为商用可市购产品，或能够通过其他公开途径获得的产品。
实施例1分子细胞水平研究OOABL在BMMCs、人肺癌A549中抗哮喘多重作用机制
1.实验方法
1.1.制备BMMCs
从无特异病原体影响的6周雄性Balb/C小鼠的大腿部采取骨髓干细胞，将细胞悬浮于RPMI1640培养基(包括100U/ml青霉素，100g/ml链霉素和10％胎牛血清)和IL-3(20％商路促分裂原刺激的脾脏细胞条件培养基，pokeweedmitogen-stimulatedspleenconditionmedium,PWM-SCM)存在的条件下培养3周以上，得到成熟的BMMCs。此方法已确定＞98％的细胞是BMMCs。
1.2制备PWM-SCM
从无特异病原体影响的6周雄性Balb/C小鼠取出脾脏，将脾脏研磨成细胞悬液，过200目不锈钢筛，调整细胞浓度为2×106cells/ml的脾细胞悬液，使用RPMI1640培养基(包括100U/ml青霉素，100g/ml链霉素，10％胎牛血清和2.5μg/ml的PWM和48μM的2-巯基乙醇)培养5天。5天后取上清液，用于IL-3(白细胞介素3)的来源。
1.2检测指标
1.2.1检测OOABL对BMMCs和A549细胞毒性的影响
将BMMCs或A549细胞铺于96孔板，处理OOABL孵育7h或24h，孵育后加入Aqueous单溶液试剂包含一种四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium；MTS]和一个电子耦合试剂(乙硫吩嗪，PES)，继续孵育1h，之后在490nm测其吸光度。
1.2.2检测OOABL对BMMCs脱颗粒和白三烯的影响
BMMCs悬液与抗二硝基苯基抗体(Anti-Dinitrophenylantibody；Anti-DNPAb)共孵育过夜，预处理的BMMCs与OOABL(设4-5个非毒剂量浓度梯度)共培养1h，之后使用二硝基苯基化人血清白蛋白(DNP-HSA，作为变应原)激活，15min后收集上清测定β-Hexosaminidase(β-HEX，是BMMCs脱颗粒的一个指标，其释放浓度可间接地表示BMMCs脱颗粒浓度)的释放及采取酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测对LTC4的影响。
1.2.3检测OOABL对BMMCs脱颗粒和白三烯的抑制作用机制
前期处理与1.2.2相同，只是15min后收集细胞，加入RIPA细胞裂解液，使细胞完全裂解。利用WesternBlot的方法测定蛋白的表达。具体测定BMMCs激活时所诱导的炎症因子LTC4的合成信息如胞质磷脂酶cPLA2和分裂原活化蛋白激酶MAPKs(ERK1/2、JNK、p38)等蛋白的磷酸化，继而测定诱导BMMCs脱颗粒的PLC蛋白的磷酸化程度。
1.2.4测定细胞质内Ca2+浓度变化
细胞质内Ca2+浓度升高是BMMCs合成LTC4和释放颗粒的必要步骤。用抗体预处理的BMMCs与Ca2+荧光试剂FluoForteTM共反应1h后，与OOABL继续反应1h，之后再用抗原DNP-albumin刺激5min。利用多功能酶标仪(Ex＝485nm/Em535nm)检测荧光值，观察胞内Ca2+浓度变化，研究OOABL抑制炎症因子合成释放的分子机制。
1.2.5检测OOABL对Eotaxin-1和arachidonate15-lipoxygenase(ALOX15)的mRNA的表达的影响
-OOABL与A549细胞共孵育1h，再以IL-4刺激A549细胞24h，收集细胞。采用RT-PCR的方法检测A549细胞中Eotaxin-1和ALOX15的mRNA的表达。
1.2.6研究OOABL抑制STAT6磷酸化的机制研究
在没有细胞毒性的浓度下OOABL与A549细胞共孵育1h，再以IL-4刺激A549细胞30min，收集细胞。采用WesternBlot的方法检测A549细胞中JAK3和STAT6的磷酸化程度。1.2.7检测OOABL对STAT6活性的影响
用脂质体瞬时转染试剂Lipofectamine2000，将含有STAT6报告基因的质粒STAT6-luc转染入A549细胞，A549细胞经OOABL预处理1h后再与IL-4共孵育6h，收集细胞蛋白，通过荧光测定仪测定生物荧光来评价OOABL对STAT6活性的影响。
1.3统计方法
所有的实验数据均以来表示，组间比较采用One-wayANOVAtest，P﹤0.05，P﹤0.01，P﹤0.001具有统计学意义。
2.结果
2.1OOABL在对DNP-HSA诱导的BMMCs脱颗粒的抑制作用
如图1所示，OOABL浓度为5,10和25μM时对BMMCs无明显的细胞毒性作用。如图2所示DNP-HSA显著诱导BMMCs脱颗粒，说明肥大细胞脱颗粒模型成功；与诱导组相比OOABL显示明确的抑制脱颗粒作用。
2.2OOABL在DNP-HSA诱导的BMMCs中对细胞内Ca2+浓度的抑制作用
如图3所示，DNP-HSA显著诱导细胞内Ca2+浓度的升高，与诱导组相比OOABL显著地抑制Ca2+的释放。
2.3OOABL在DNP-HSA诱导的BMMCs中对PLCγ磷酸化的抑制作用
如图4所示，DNP-HSA显著诱导PLCγ的磷酸化，与诱导组相比OOABL显示明确的抑制PLCγ的磷酸化。
2.4OOABL在对DNP-HSA诱导的BMMCs生成LTC4的抑制作用
如图5所示，DNP-HSA诱导大量的LTC4的合成，与诱导组相比OOABL浓度依存性地抑制LTC4的合成。
2.5OOABL在DNP-HSA诱导的BMMCs中对cPLA2磷酸化的抑制作用
如图6所示，DNP-HSA诱导cPLA2磷酸化，与诱导组相比OOABL地抑制cPLA2的磷酸化。
2.6OOABL在DNP-HSA诱导的BMMCs中对MAPKs磷酸化的抑制作用
如图7所示，DNP-HSA诱导三种MAPKs磷酸化，但与诱导组相比OOABL对ERK、JNK、p38的磷酸化没有抑制作用。
2.7OOABL在IL-4诱导的A549细胞中对Eotaxin-1和ALOX15的mRNA的表达的抑制作用
如图8所示，OOABL浓度为25,50和100μM时对A549无明显的细胞毒作用。如图9和10所示，IL-4显著增高Eotaxin-1和ALOX15的mRNA的表达，与诱导组相比OOABL抑制Eotaxin-1和ALOX15的mRNA的表达。
2.8OOABL在IL-4诱导的A549细胞中对STAT6磷酸化的抑制作用
如图11所示，IL-4诱导STAT6磷酸化，与诱导组相比OOABL明显地抑制STAT6的磷酸化，AS1517499作为STAT6的特异性抑制剂明显抑制了STAT6的磷酸化。
2.9OOABL在IL-4诱导的A549细胞中对JAK3磷酸化的抑制作用
如图12所示，IL-4诱导JAK3磷酸化，与诱导组相比OOABL地抑制JAK3的磷酸化。
2.10OOABL在IL-4诱导的A549细胞中对STAT6活性的的抑制作用
如图13所示，A549细胞用STAT6-Luciferase质粒转染后再用IL-4刺激6h，IL-4明显增加生物荧光值，与诱导组相比OOABL明显抑制荧光素酶活性，提示OOABL是通过抑制STAT6的活性而降低荧光素酶活性。
实施例2OOABL对OVA诱导的小鼠哮喘模型的作用及机制
1.实验方法
1.1分组和建立模型
无特异病原体影响的6周雌性Balb/C小鼠,体质量18～22g，随机分为4组：正常对照组；哮喘模型组；OOABL给药组，孟鲁司特(Montelukast,Mont)给药组(孟鲁司特为哮喘的治疗药，作为阳性对照组)，地塞米松(Dexamethasone,Dex)给药组(地塞米松为抗炎药，作为阳性对照组)。正常对照组不给任何刺激。哮喘模型组小鼠第0、7、14天腹腔注射抗原致敏物，其具体方法为0.1mg/mlOVA生理盐水与佐药(adjuvant)Alum(明矾)以体积比为1：1的比例混匀后腹腔注射0.2ml，在第22、23、24天连续3天用1％OVA生理盐水溶液雾化吸入，激发慢性哮喘。正常对照组雾化吸入生理盐水代替1％OVA生理盐水溶液。OOABL给药组，阳性对照组在从21到24天每天隔12个小时连续7次灌胃给药(第22、23、24连续3天，1％的OVA生理盐水溶液雾化吸入1h前灌胃给药)。第25天，麻醉小鼠打开胸腔暴露肺和心。
1.2检测指标
1.2.1气道反应性(AHR)检测
动物模型第25天，麻醉小鼠打开胸腔切开气管，在无限制昏迷状态评估气道反应性。雾化吸入乙酰甲胆碱(Mch)(5,20,30和40mg/ml)造成的气道阻力(RI)由全身体积描记法测量。每个暴露点5分钟，记录每个乙酰甲胆碱处理过程中得到的增强呼气间歇(Penh)值。
1.2.2血清中IgE检测
小鼠AHR评估后，用注射器抽尽右心室内血液，血液离心后利用上清(即为血清)检测血清中IgE的含量。
1.3统计方法
所有的实验数据均以来表示，组间比较采用One-wayANOVAtest，P﹤0.05，P﹤0.01，P﹤0.001具有统计学意义。
2.实验结果
2.1OOABL对气道高反应性(AHR)的抑制作用
最后一次处理24h后，麻醉小鼠，切开器官检测其气道反应性。由图14可见，与正常对照组相比，Mch浓度分别为5，20，30和40mg/ml时，OVA诱导组的Penh值显著增高。OOABL给药剂量为10和20mg/kg时明显减小增高的Penh值。用为阳性对照药的孟鲁司特(Mont，给药剂量为20mg/kg)和地塞米松(Dex，给药剂量为2mg/kg)也明显降低Penh值。
2.2OOABL对血清中IgE的影响
由图15可见，与正常对照组相比，OVA诱导组的血清IgE的含量显著增加，而OOABL明显降低IgE的水平。孟鲁司特和地塞米松给药组也明显减少血清中IgE的含量。
以上对本发明创造的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明创造的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明创造的实施范围。凡依本发明创造申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明创造的专利涵盖范围之内。

Claims (4)

1.倍半萜类化合物在制备抗哮喘疾病药物中的应用，所述倍半萜类化合物的化学式为：
2.如权利要求1所述倍半萜类化合物在制备抗哮喘疾病药物中的应用，其特征在于，所述倍半萜类化合物提取自旋覆花。
3.如权利要求1所述倍半萜类化合物在制备抗哮喘疾病药物中的应用，其特征在于，倍半萜类化合物的提取方法如下：
取中药旋覆花干燥头状花序分别按下述步骤进行处理：用药材重量6-10倍体积的乙醇回流提取，减压浓缩得乙醇浸膏；将乙醇浸膏以水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物；上述乙酸乙酯提取物，以硅胶柱色谱分离，分别用石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，TLC合并类似组分，得到的组分经制备凝胶渗透色谱GPC、凝胶(ToyopearlHW-40)柱、半制备HPLC纯化得到倍半萜内酯类化合物。
4.由权利要求1所述倍半萜类化合物在制备抗哮喘疾病药物中的应用，其特征在于，所述抗哮喘疾病药物的有效成分为倍半萜内酯类化合物，还含有药学上可接受的载体。
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