CN109432080A - 汉黄芩素在制备治疗肝纤维化的药物中的应用 - Google Patents

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孟晓明
李海迪
杜潇洒
姜玲
徐节节
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Abstract

本发明公开了汉黄芩素在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。本发明的优点在于：本发明首次公开汉黄芩素作为治疗肝纤维化的药物的应用，汉黄芩素可有效体外抑制肝纤维化指标蛋白的表达，促进星状细胞中凋亡指标蛋白的表达，降低肝纤维化模型中谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平以及Collagen‑α1和α‑SMA的表达，汉黄芩素减轻肝纤维化，其作用机制与汉黄芩素促进肝星状细胞(HSC)凋亡有关，应用前景广泛，也为肝纤维化的治疗提供了更多的药物选择。

Description

汉黄芩素在制备治疗肝纤维化的药物中的应用
技术领域
本发明属于制药领域，更具体涉及汉黄芩素在制备治疗肝纤维化的药物中 的新应用。
背景技术
肝纤维化(Hepatic fibrosis，HF)是临床常见肝脏疾病，是多种致病因子引 起的肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应，是细胞外基质(ECM)合 成大于降解导致ECM过度沉积的结果，其持续发展可导致肝硬化，甚至肝癌。 肝星状细胞(hepaticstellates cell，HSC)的激活是导致HF的中心环节，迄今为 止尚无任何有效治疗HF的措施，因此，寻找可以减轻组织损伤、抑制HSC激 活，促进HSC凋亡、防止肝硬化，肝癌发生的肝脏保护药物具有重要意义。
汉黄芩素(Wogonin，Wog)的分子式为C16H12O5，其化学结构式如下：
为从唇形科植物黄芩、半枝莲及夹竹桃科植物鳝藤等植物中分离得到的一种重要的黄酮类化合物，它主要存在于以上植物的根和茎中。先前研究结果显示， 汉黄芩素具有广泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒及神经保护 作用等，其中抗肿瘤活性是目前国内外研究的热点之一，但尚未报道其具有防 治肝纤维化的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供汉黄芩素在制备治疗肝纤维化的药物 中的新用途。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一方面，提供汉黄芩素在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。
另一方面，汉黄芩素在制备预防或治疗由肝纤维化导致的疾病的药物中的 应用。
优选地，所述汉黄芩素的给药浓度为10-40mg/kg。
优选地，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明首次公开汉黄芩素作为治疗肝 纤维化的药物的应用。试验结果证实：汉黄芩素可有效体外抑制肝纤维化指标 蛋白Collagen-α1、α-SMA的表达，促进星状细胞中凋亡指标蛋白Caspase3和 Caspase9的表达，降低肝纤维化模型中谷丙转氨酶ALT和谷草转氨酶AST水平 和Collagen-α1和α-SMA的表达。汉黄芩素减轻肝纤维化，其作用机制与汉黄芩 素促进肝星状细胞(HSC)凋亡有关，应用前景广泛，也为肝纤维化的治疗提 供了更多的药物选择。
附图说明
图1为正常组、模型组和汉黄芩素组中Collagen-α1和α-SMA的表达图，其 中图1A为Collagen-α1和α-SMA电泳图，图1B为α-SMA mRNA相对表达图， 图1C为Collagen-α1mRNA相对表达图；
图2为正常组、模型组和汉黄芩素组中Caspase3和Caspase9的表达图，其 中图2A三组细胞凋亡流式细胞术结果图，图2B为凋亡流式统计图，图2C为 三组细胞为Caspase3电泳条带图；
图3为正常组、模型组、汉黄芩素低剂量组、中剂量组和高剂量组中ALT 和AST水平变化图，其中图3A为HE染色的肝组织切片的荧光倒置显微镜图， 图3B为各组小鼠血清中AST水平统计图，图3C为各组小鼠血清中ALT水平 统计图；
图4正常组、模型组、汉黄芩素低剂量组、中剂量组和高剂量组中 Collagen-α1和α-SMA的表达图，其中图4A为Masson染色的肝组织切片的荧光 倒置显微镜图，图4B为α-SMA免疫组化染色的肝组织切片的电镜图，图4C为 各组小鼠肝脏组织中Collagen-α1mRNA相对表达图，图4D为α-SMA mRNA相 对表达图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提 下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围 不限于下述的实施例。
耗材：汉黄芩素购于美仑生物技术公司(中国，批号822A0546)；TGF-β1购于PeproTech Inc(Rocky Hill,USA，批号86560855)；ALT/AST assay kit购于 建成生物(中国，货号C009-2/C010-2)；凋亡试剂盒购于贝博生物公司(中国， 批号BB18091)；Collagen-α1、α-SMA、β-actin一抗购于博奥森抗体试剂公司(中 国，批号AG05161874/AG08161133/AH01032107)；Caspase3、Caspase9一抗， 购于abcom抗体公司(USA，批号ab13847/ab32539)；鼠源、兔源二抗购于 LI-COR公司(美国，925-68020/925-68021)，橄榄油购于美仑生物技术公司(中 国，批号MB13084)。
细胞：HSC-T6细胞，大鼠肝脏星状细胞，购于中国科学院。
小鼠：c57小鼠，购于安徽医科大学实验动物中心。
Western Blot具体步骤：配胶-上样-电泳(80V，30min；120V，55min)-200mA 转膜(根据蛋白分子量确定即分子量多大转膜多少分钟)-封闭3小时(5％脱脂 奶粉的TBST)-洗膜(15min每次，3次)-孵育一抗36小时(根据抗体说明书配 置)-洗膜(15min每次，3次)-孵育二抗1小时(根据抗体说明书配置)-洗膜(15min 每次，3次)-显影。
Real time-PCR程序：95℃-30s(Cycle 1)；95℃-5s，60℃-30s(Cycle 40)。
英汉对照一览表
Collagen-α<sub>1</sub> I胶原蛋白
α-SMA α平滑肌肌动蛋白
HSC 肝星状细胞
TGF-β 人重组转化生长因子
Caspase3 半胱天冬酶3
Caspase9 半胱天冬酶9
Wogonin(Wog) 汉黄芩素
ALT 谷丙转氨酶
AST 谷草转氨酶
实施例1：汉黄芩素(Wog)在体外对转化生长因子(TGF-β)诱导的重组 人胶原蛋白-1(Collagen-α1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和肝星状细胞(HSC) 的影响
将对数生长期的星状细胞(HSC)T6接种于6孔板和12孔板中，接种密度 约为1.0×105个细胞/ml，分别分为正常组(NC，control)、模型组(TGF-β，model) 和汉黄芩素组(TGF-β+Wog)，每组重复3-4次实验，孵育24小时，在模型组 和汉黄芩素组中添加10ng/ml TGF-β，在汉黄芩素组中还添加1.25μg/ml Wog， 继续培养24小时后，PBS洗三遍，收集细胞，提取总蛋白和RNA。
根据所提供的方法通过Western Blot和Real time-PCR法检测肝纤维化指标 蛋白(Collagen-α1和α-SMA)的表达。结果如图1所示，表明汉黄芩素能明显 抑制TGF-β诱导的具有治疗作用。
根据所提供的方法通过Western Blot法检测凋亡指标蛋白(Caspase3和Caspase9)的表达。结果如图2C和图2D所示，联合图2A，2B流式细胞术分 析结果表明，汉黄芩素能够明显促进肝星状细胞的凋亡，同时Western Blot结果 验证汉黄芩素增加TGF-β诱导的星状细胞Caspase3及Caspase9水平的表达，进 一步验证汉黄芩素对肝星状细胞凋亡的促进作用。(注：与正常组(NC)比较： *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；与模型组(TGF-β)比较：#P<0.05,##P<0.01,### P<0.001。)
实施例2：汉黄芩素对肝纤维化模型鼠中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶 (ALT)、Collagen-α1和α-SMA的影响
将6-8周龄C57BL/6鼠适应性培养1-2天，分为正常组(NC)、模型组(CCl4)、 汉黄芩素低剂量组(CCl4+Wog 10mg/kg)、中剂量组(CCl4+Wog 20mg/kg)、 高剂量组(CCl4+Wog40mg/kg)，每组12-16只。对模型组和汉黄芩素低、中、 高剂量组鼠体内腹腔注射20％CCl4 2.5ml/kg建立肝纤维化模型，并对汉黄芩素 低、中、高剂量组鼠分别体内腹腔注射10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg Wog，培 养6周。
在麻醉状态下取培养6周后的鼠的血清样本及肝组织，肝组织包埋切片后， 用HE(hematoxylin-sosin staining)染色检测肝脏损伤情况，用荧光倒置显微镜 对肝组织进行观察，结果如图3A所示。根据试剂盒说明书检测血清中AST和 ALT的含量。
AST/GOT试剂盒：
测定孔 对照孔
基质液(ul) 20 20
待测样本(ul) 5
测定空每孔吸取一个样本，将吸嘴伸入孔板底部基质液中，反复吹打均匀， 37℃水浴或气浴30min。
2,4-二硝基苯肼液(ul) 20 20
待测样本(ul) 5
对照孔每孔吸取一个样本，将吸嘴伸入孔板底部溶液中，反复吸打，混匀 后37℃水浴或20min。
0.4mol/LNaOH(ul) 200 200
将以上试剂按照表格顺序分别在室温条件下加入到对应分组的96孔板中， 轻轻水平摇动96孔板，室温放置15min，波长510nm，酶标仪测定各孔OD值， 以(绝对OD值＝测定孔OD值-对照孔OD值)，查标准曲线，求AST/GOT活 力单位，结果如图3B所示。
y＝a+bx+cx2.5+dx3
将实验所得数据结合以上公式运算，得最终结果：
a＝0.01907275b＝303.10147c＝-2060.8957d＝14023.06
ALT/GPT测试盒：与AST/GOT试剂盒方法一样，结果如图3C所示。
y＝a+bx+cx1.5+dx2.5+ex3
将实验所得数据结合以上公式运算，得最终结果：
a＝0.0092174253b＝170.61834c＝1206.0703d＝-4614.6537e＝6556.842
从图3A可以看出，HE染色结果显示四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化模型 中肝脏的肝细胞排列紊乱，细胞间隙增大，肝小叶结构破坏，门管区有大量炎 细胞浸润，而汉黄芩素组可明显改善肝脏病变，且呈现剂量依赖性。从图3B和 3C可以看出，汉黄芩素可以有效降低CCl4诱导的ALT和AST水平，并且浓度 越高，ALT和AST水平越低，证实汉黄芩素在一定程度上能够抑制肝纤维化的 进展。在麻醉状态下取培养6周后的鼠的原代星状细胞，收取肝组织。肝组织 包埋切片后，进行Masson染色和α-SMA免疫组化染色，用荧光倒置显微镜对肝组织进行观察，结果如图4A和4B所示。同时提取细胞RNA，Real-time PCR 检测Collagen-1和α-SMA的表达，结果如图4C和4D所示。
从图4A可以看出，Masson染色结果显示模型组有较多的成纤维细胞出现， 纤维结缔组织增生，增多的胶原纤维形成线条状纤维间隔，分割肝小叶，使小 叶结构破坏，从图4B可以看出，α-SMA免疫组化结果表明汉黄芩素能明显抑 制纤维化指标α-SMA的升高。从图4C和4D可以看出，Real-time PCR结果进 一步验证汉黄芩素对Collagen-α1和α-SMA表达的抑制作用，以上结果表明汉黄 芩素对肝纤维化的治疗作用。(与正常组(NC)比较：*P<0.05,**P<0.01,***P< 0.001；与肝纤维化模型组(CCl4)比较：#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

Claims (4)

1.汉黄芩素在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。
2.汉黄芩素在制备预防或治疗由肝纤维化导致的疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述汉黄芩素的给药浓度10-40mg/kg。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
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