CN103768117B - 墨旱莲提取物在制备抗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药材墨旱莲提取物作为治疗肺纤维化的药物用途。墨旱莲提取物由中药材墨旱莲经醇水提取、有机溶剂萃取等方法制备而成，墨旱莲提取物得率10.01-15.05％，其中总皂苷含量在53.24-56.1％，旱莲苷A含量为6.54-11.3％，蟛蜞菊内酯的含量1.46-3.56％。本发明所得到的中药材墨旱莲提取物可用于治疗肺纤维化等医药用途，墨旱莲提取物可抑制反映肺组织损伤的NO、MDA含量，降低反映胶原沉积的HYP含量和抑制肺组织中致纤维化的细胞因子TGF-β1表达从而干预博莱霉素诱导小鼠纤维化程度。

Description

墨旱莲提取物在制备抗肺纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种中药材墨旱莲提取物作为治疗肺纤维化的药物用途。

背景技术

肺纤维化(Pulmonaryfibrosis，PF)是多种肺部疾病或肺损伤发展到晚期的一种常见的病理变化，目前认为其发病机制主要包括上皮细胞和基底膜的破坏、成纤维细胞或肌成纤维细胞的聚集和细胞外基质过量沉积。其特征是肺间质细胞(成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞)过度增殖、细胞外基质的过度沉积而正常肺组织结构被破坏。传统观点认为，慢性炎症是成纤维细胞增殖和肺部结构病理改变的主要因素，但抗炎治疗效果不明显，大量研究显示成纤维细胞增殖与纤维化形成可以独立于炎症而发生，提示纤维化的病变不仅仅是炎症的继发结果。目前为止，抗炎及免疫调节药物治疗肺纤维化效果不好，传统的治疗药物仍以糖皮质激素和免疫抑制剂/细胞毒药物为主，如皮质激素、硫唑嘌呤或环磷酰胺无显著效果，副作用大，肺移植是肺纤维化终末阶段的唯一有效治疗方法，但在临床广泛应用受到经济、供体缺乏等限制，因此寻找新的治疗方法迫在眉睫。

有关肺纤维化发病机制的研究早期主要集中在肺泡巨噬细胞及其释放的细胞因子，但目前已确定肺成纤维细胞的活化、增殖及通过释放大量介质而产生细胞外基质在肺纤维化发病机制中起决定性作用，共同特征是体内胶原代谢的失衡，在肺纤维化早期主要以III型胶原增加为主，晚期是以I型胶原增加为主。在肺纤维化过程中，肺成纤维细胞的活化、增殖和分化作用受多种因子调控，除成纤维细胞产生ECM外，受损的肺上皮细胞转分化为肌成纤维细胞也产生ECM，肌成纤维细胞被认为是肺纤维化发病过程中肺组织损伤修复和再生的关键参与者，因此，研究药物抑制成纤维细胞的增殖对于防止肺纤维化有重要的意义，

多数肺纤维化病人的组织中可以观察到炎症与纤维化并存，提示炎症反应参与了肺纤维化的形成，肺泡炎症和纤维化是两个相对独立的过程，炎症反应是有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应，在某些情况下，炎症损伤持续并引起纤维化，在肺纤维化发生过程中，TGF-β、PDGF、FGF、VEGF等几个细胞因子起到关键性作用，可以作为研究和治疗的关键性靶点^[1]。细胞因子之间及其与炎症细胞、肺脏组织细胞之间可以相互作用发生一系列复杂的反应加重肺组织炎症或免疫损伤，刺激纤维母细胞分裂增殖，促进细胞外基质的产生和沉积，肺纤维化的发生是以细胞因子网络调控失衡导致大量趋化因子释放从而引起炎性细胞聚集、活化为基础。细胞因子在肺纤维化中的作用是目前研究的热点，采用抑制促纤维化的细胞因子为纤维化的治疗提供了一条新的有效途径。

各种因素作用于肺脏，直接或间接产生氧自由基，损伤肺组织，使MDA产生增多，一方面加重肺组织损伤，另一方面又通过各种生长因子，促进损伤后的修复，使胶原产生增多，最终导致肺纤维化的发生。MDA为机体内氧自由基，攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成的脂质过氧化物，其含量的变化反映了机体组织细胞受自由基攻击的严重程度。羟脯氨酸(HYP)是由结缔组织蛋白质水解所得的一种氨基酸，对胶原蛋白的稳定性起关键作用，胶原是唯一含羟脯氨酸较多的蛋白质。在肺纤维化病人肺组织中TGF-β1表达上调，而氧化应激可以直接导致肺纤维化时巨噬细胞分泌TGF-β1增多，TGF-β1是一个具有多重功能的细胞因子，通过细胞增殖、分化、凋亡及肺纤维上皮细胞分化等作用来调控组织形成和分化，是一种强力的致纤维化因子^[2]，可以刺激细胞合成并分泌细胞外基质组分，还可改变基质降解酶成分的活性，直接加剧ECM的沉积^[3]，肺纤维化机制中TGF-β1/Smad为经典信号通路，TGF-β1先与受体结合发生磷酸化，结合激活Smad2/3、与胞浆内Smad4结合，入核与核内相应转录因子结合启动调控基因的表达，从而调控细胞增殖、及致纤维化作用^[4]。因此，通过测定肺组织羟脯氨酸能确定组织中胶原的含量，TGF-β1表达降低可显示药物干预肺纤维化的可能作用机制，即药物不是通过抗炎而改善肺纤维程度，是通过降低组织中TGF-β1的表达，激活TGF-β1/Smad通路而发挥其干预作用。在众多细胞因子中TGF-β1被认为是肺纤维化形成与发展的“诱导剂”和“启动子”，TGF-β1可促进成纤维细胞(FB)的增殖、分化及分泌的过程，继而促进胶原蛋白等ECM成分在肺间质和肺泡中过度积聚，从而最终引起肺间质纤维化。博莱霉素诱导小鼠肺纤维化是经典的筛选抗肺纤维化药物的体内药效模型，博莱霉素可引起体内氧化与抗氧化失衡，氧自由基产生增多，从而启动脂质过氧化反应，降低其TGF-β1含量可减缓小鼠肺纤维化进程。

中药材墨旱莲为菊科植物鳢肠EcliptaprostrataL.的地上部分，自上个世纪80年代国内外学者该植物化学成分进行研究，分离鉴定噻吩、皂苷、香豆素草醚、黄酮等类型成分。《中国药典》(2010版)中收载蟛蜞菊内酯、旱莲苷A作为该药材的定性、定量指标性成分。墨旱莲提取物有镇静、镇痛、止血、升白、保肝、增加冠流等作用；注射旱莲草提取液能使常压缺氧情况下小鼠的生命明显延长，亦能提高在减压和缺氧环境下的小鼠存活率；旱莲草扩张冠状血管、增加冠脉流量和增加耐缺氧能力的作用出现快，维持时间长，毒性小；能提高减压缺氧情况下小鼠的存活率。近几年墨旱莲的药效研究主要集中于保肝、肝细胞的再生^[5，6]、抗癌^[7，8]、非特异性免疫增强^[9]、改善骨质疏松^[10]、脑神经保护^[11]等作用。分子水平实验证实化合物蟛蜞菊内酯(wedelolactone)是ATP酶抑制剂^{[12，13，13]}及异构酶II抑制剂^[15]，对NF-κB、IKK、capasse-11等转录因子均具有抑制作用^[16～19]，具有保肝、抗癌、抑制乳腺癌的肺转移^[20]、体外抑制人肝星状细胞LX-2的纤维化^[21]、减毒^[22]等作用。

目前，有关墨旱莲提取物等相关专利有近20余篇：主要集中在提取的制备方法(201010214799.6，201110184589.1，200610201098.2，201010603861.0，201110187513.4)、总皂苷的制备方法(200810031092.4，201310002410.5)、在保肝、降血脂(201110310181.4)以及在洗发膏、烟草香料等方面的应用。尚未见报道墨旱莲药材的改善肺纤维化作用及其在治疗此疾病药物中用途。

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发明目的

本项发明的目的在于发现墨旱莲提取物可用于治疗肺纤维化病症的医药新用途。

技术方案

墨旱莲提取物在制备抗肺纤维化药物中的应用。

所述的墨旱莲提取物在制备抗肺纤维化药物中的应用，其特征在于按质量百分比计，所述的墨旱莲提取物中总皂苷含量为53.24-56.1％，提取物中旱莲苷A含量为6.54-11.30％，蟛蜞菊内酯含量为1.46-3.56％。

所述的墨旱莲提取物经醇水提取、有机溶剂萃取方法制备而成，所述的墨旱莲提取物得率10.01-15.05％。

其中所述的墨旱莲提取物由如下方法制得：墨旱莲干燥地上部分，以10倍于生药体积的80％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并提取液，减压去除乙醇，得总浸膏；将总浸膏悬于水中，以石油醚等倍量萃取，用乙酸乙酯进行萃取、分别获得乙酸乙酯萃取物及水部位，同时将乙酸乙酯部位通过HP-20吸附树脂柱色谱进行分离，分别获得水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、60％乙醇洗脱部位、90％乙醇洗脱部位；其中60％乙醇洗脱部位、70％乙醇洗脱部位经减压干燥，以蒸馏水稀释墨旱莲极性提取物。

具体来说：

本项发明是经过研究证明墨旱莲提取物可改善博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型，并采用分光光度法对墨旱莲提取物中总皂苷含量，采用HPLC法对提取物中2种单体物质蟛蜞菊内酯和旱莲苷A的含量进行了测定。通过观察HE、Masson染色后肺组织病理切片、测定各组肺脏系数、在不同时期检测各组小鼠肺组织中NO、MDA、HYP、TGF-β1含量。实验结果表明：本发明中的墨旱莲提取物可改善模型小鼠肺组织纤维化程度，降低模型肺组织胶原沉积，显示对小鼠肺纤维化模型的干预作用，可用于治疗肺纤维化疾病的新医药用途。

有益效果

1、肺纤维化是多种肺部疾病或肺损伤发展到晚期的一种常见的病理变化，多数研究认为糖皮质激素治疗肺纤维化有效率小于30％，患者生存率无明显改变，目前尚无明确治疗药物。本发明墨旱莲是常用中药材。中医认为墨旱莲为保肝补肾中药，目前，没有任何研究报道墨旱莲提取物或其中某类单体成分可用于肺纤维化的治疗，本发明人通过体内实验证明该墨旱莲提取物显著改善博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。本发明的墨旱莲提取物具有较好的稳定性，可以用于制备治疗相应疾病的药物。

2、依据《中国药典》(2010版)记载，本发明提取物测定总皂苷含量(53.24-56.1％)之外，同时测定墨旱莲的指标成分蟛蜞菊内酯(1.46-3.56％)和旱莲苷A(6.54-11.30％)。本发明中的墨旱莲提取物是个复杂体系，体内、外实验结果证明提取物整体入药有效，尚不能确定活性成分及辅助成分类型。具体来说本发明的实验结果表明，在实施例1和2(即权利要求两个端点值)中所制备的提取物给药组中，HE、Masson染色病理切片显示给药组肺纤维化程度明显改善，墨旱莲提取物给药组NO含量明显低于模型组，给药第14、28天，肺组织中反映肺损伤的MDA含量明显低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，给药第14、28天肺组织中反映胶原沉积的HYP的含量均明显低于模型组，说明墨旱莲提取物对肺纤维化进程不同时期都有一定的保护作用，提示墨旱莲提取物具有减轻氧自由基损伤，抑制胶原形成、保护肺组织的作用。实施例3(不在发明保护范围内)提取物给药组，虽然模型小鼠肺系数有较显著变化(P＜0.05)，但其小鼠肺组织改善程度不明显，NO、MDA、HYP、TGF-β1等指标无明显改变。抑制肺纤维化细胞过度增生和促进其凋亡也成为防治肺纤维化的一种有效手段，体外细胞增殖抑制实验结果表明：在1.6-100μg/mL范围内，实施例1-3制备的墨旱莲提取物呈剂量依赖性抑制HFL-1增殖，体外实验结果也证实了墨旱莲提取物的抗肺纤维药物用途。因此说明本发明保护范围内其可以墨旱莲提取物对肺纤维化进程不同时期都有一定的保护作用，不在本发明保护范围效果不佳。

3、本发明涉及实验材料来自原植物，原植物分别范围广，成本低，提取物活性明确，具有广泛的实用价值。

附图说明

1.图1实施例1-3的墨旱莲提取物对造模第14、28天的小鼠肺系数及肺组织中HYP含量的影响。A：对肺系数的影响；B：对肺组织中HYP含量的影响；^#p＜0.05，versuscontrol；^*p＜0.05，^**p＜0.01versusmodel；阳性对照药物：prednisone。

2.图2实施例1-3的墨旱莲提取物对各组肺组织炎症程度的影响(HE染色×200)。A空白；B～D实施例1-3的墨旱莲提取物；E模型；F阳性药

3.图3实施例1-3的墨旱莲提取物对各组肺组织纤维化程度的影响(Masson染色×200)。A空白；B～D实施例1-3的墨旱莲提取物；E模型；F阳性药

4.图4实施例1-3制备的墨旱莲提取物对造模第14、28天时各组肺组织中NO(A)与MDA(B)含量的影响。(^##p＜0.01，^#p＜0.05，versuscontrol；^*p＜0.05，^**p＜0.01versusmodel)，阳性对照药物：prednisone

5.图5实施例1-3制备的墨旱莲提取物对各组肺组织中TGF-β1含量的影响。(^##p＜0.01，^#p＜0.05，versuscontrol；^*p＜0.05，^**p＜0.01versusmodel)，阳性对照药物：prednisone

具体实施方式

实施例1

一、墨旱莲提取物的制备和质量标准考察

墨旱莲(HerbaEcliptae)为菊科植物鳢肠EcliptaprostrateL.的干燥地上部分，购于安徽亳州。乙醇、石油醚等试剂均为分析纯。

墨旱莲干燥地上部分，以10倍于生药体积的80％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并提取液，减压去除乙醇，得总浸膏903g。将总浸膏悬于水中，以石油醚等倍量萃取，用乙酸乙酯进行萃取、分别获得乙酸乙酯萃取物(EtOAc)及水部位(H2O)，同时将乙酸乙酯部位通过HP-20吸附树脂柱色谱进行分离，分别获得水(6.56％)、30％(4.66％)、60％(5.51％)、90％(4.49％)乙醇洗脱部位，60％乙醇洗脱部位减压干燥，以蒸馏水稀释墨旱莲极性提取物，配制成药液用于活性研究。

1、墨旱莲提取中总皂苷的含量测定方法如下：

①标准溶液、样品溶液的制备：称取干燥至恒重所得旱莲苷A对照品1.46mg，甲醇溶解，定容于10ml量瓶，作为标准溶液。精密称取墨旱莲提取物7.01mg，甲醇溶解，定容至25ml，混匀，作为样品液。

②标准曲线的绘制：分别取旱莲苷A对照品溶液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，置于10ml具塞试管中水浴挥干，加0.2ml的5％香草醛/冰醋酸和0.8ml高氯酸溶液，于60℃水浴加热15min，冷却后加5ml冰醋酸，以溶液浓度C为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为C＝0.4757A+0.0002，R²＝0.9998，在0.029～0.146mg/ml呈良好的线性关系。依同法制备空白对照。于波长550nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

③样品中总皂苷含量测定：吸取样品液1mL，按标准曲线制备步骤操作，测定吸收度。计算墨旱莲总皂苷含量为56.1％。

2、墨旱莲提取物中旱莲苷A和蟛蜞菊内酯的含量测定：

①色谱条件：C₁₈柱(ZORBAXSB-C₁₈，14.6×250mm5-Micron，Agilent)；进样量：20μL。流速1ml/min。检测波长：210nm。流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸缓冲液(B)梯度洗脱，0～10min，15-23％(A)；10-40min，23％(A)；40-42min，23-40％(A)；42-60min，40％(A)；60-65min；40-90％(A)。

②对照品、供试品溶液制备：精密称取蟛蜞菊内酯对照品6.72mg，旱莲苷A7.03mg于25ml容量瓶，甲醇溶解并定容。即蟛蜞菊内酯和旱莲苷A的浓度分别为0.2688mg/ml，0.2812mg/ml。精密称取墨旱莲提取物16.77mg于10ml容量瓶，甲醇溶解定容，摇匀，即得。

③标准曲线的绘制：精密吸取混合对照品溶液各1.00，1.25，1.5，1.75，2.00ml于10ml量瓶，甲醇稀释至刻度，摇匀，得标准品溶液，按上述条件测定。以对照品溶液浓度X(×10^-5mg/ml)为横轴，峰面积Y为纵轴，绘制标准曲线，得蟛蜞菊内酯的回归方程为：Y＝1.0459X-784.56(R²＝0.9905)，旱莲苷A的回归方程为：Y＝0.0793X-29.940(R²＝0.9982)，分别在0.02688～0.05376mg/ml和0.02812～0.05624mg/ml范围内呈良好线性关系。

将供试品溶液按上述所述条件进样检测，计算得总皂苷旱莲苷A的含量为11.30％和蟛蜞菊内酯的含量为3.56％。

实施例2

墨旱莲干燥地上部分，以10倍于生药体积的80％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并提取液，减压去除乙醇，得总浸膏903g。将总浸膏悬于水中，以石油醚等倍量萃取去除叶绿素等脂溶性成分，水溶液减压浓缩成每毫升相当于2.0g生药的溶液，通过HP-20树脂，用乙醇-水梯度洗脱，依次采用30％，70％及90％乙醇洗脱，其中70％乙醇洗脱部位减压干燥后，备用，用于抗肺纤维化活性研究。

按实施例1所述条件进样检测，计算得总皂苷含量为53.24％，旱莲苷A的含量为6.54％和蟛蜞菊内酯的含量为1.46％。

实施例3

墨旱莲干燥地上部分，以10倍于生药体积的80％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并提取液，减压去除乙醇，得总浸膏903g。将总浸膏悬于水中，以石油醚等倍量萃取去除叶绿素等脂溶性成分，水溶液减压浓缩成每毫升相当于2.0g生药的溶液，得墨旱莲极性提取物，-20℃冷藏保存备用。实验用药：以蒸馏水稀释墨旱莲极性提取物，配制成药液。

按实施例1中所述条件检测，计算得总皂苷为45.2％，旱莲苷A的含量为0.71％，蟛蜞菊内酯的含量为0.26％。

实施例4

二、墨旱莲提取物改善博莱霉素所致小鼠肺纤维模型

选取实施例1-3中所制备的墨旱莲提取物进行下述体内药效学研究。气管内注入博来霉素复制小鼠肺纤维化模型，是国际上普遍采用的一种方法，而且与人类肺间质纤维化相近。

1材料与仪器ICR小鼠，雌性，体重18-22g，由南京市青龙山动物繁殖场提供。娃哈哈纯净水。羟脯氨酸试剂盒，南京建成生物工程研究所。醋酸泼尼松，批号120101，江苏平光制药有限责任公司。水合氯醛，批号20100813，国药集团化学试剂有限公司。

2实验方法ICR雌性小鼠，分空白组，模型组，阳性药组，墨旱莲提取物按照剂量10g/kg灌胃给药，每组各20只。小鼠腹腔注射10ml/kg，4％的水合氯醛进行麻醉，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠颈部。用剪刀纵向剪开小鼠颈部皮肤，用镊子纵向钝性撕开筋膜与肌肉，暴露气管。注射器刺入气管，空白组注入生理盐水，其余各组均注入博来霉素(5mg/kg)。然后迅速将鼠板直立，旋转鼠板，观察小鼠呼吸情况，旋转后用75％酒精棉消毒颈部伤口，缝合伤口，并在缝合处滴1-2滴青霉素注射液。将术后小鼠放回干燥洁净的鼠笼休息，等待苏醒，大约1-2h后苏醒，之后正常饲养。

造模后即日开始，空白组，模型组每天灌胃生理盐水，阳性药组灌胃6.67mg/kg/d醋酸泼尼松。取实施例1-3中所制备的墨旱莲提取物，分别灌胃10g/kg墨旱莲提取物，连续灌胃28天。于28日，小鼠称体重，摘眼球取血，血液流入1.5ml离心管中，静置后，4℃3000rpm离心20min，-80℃保存备用。取出肺组织，称重，计算肺系数，肺系数＝肺重(mg)/体重(g)，见图1A所示。另取各组实验小鼠左上肺叶按照试剂盒说明书测定羟脯氨酸含量，结果见图1B。取各组小鼠左下肺放入4％甲醛中固定，逐级酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋后，常规切片，HE染色，Masson染色，观察肺组织损伤及纤维化变化，造模28天后肺组织形态学观察，结果如图2和3。

所有数据均用均数±SD(x±s)表示。应用SPSS11.5统计软件处理，统计采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，P＜0.05表示差异有统计学意义。

病理组织切片经HE、Masson染色，结果表明对照组的小鼠肺组织结构完整清晰，肺泡间隔未增厚，肺泡腔透亮，腔内未见明显渗出物，肺泡腔未见炎性细胞浸润，无成纤维细胞增生，对照组小鼠的肺组织内可见少量染成蓝色的胶原纤维，是细胞外基质的主要组成部分。模型组小鼠肺泡结构破坏，肺泡间隔增宽，大量炎性细胞浸润急成纤维细胞增生，大量胶原沉积，肺纤维化形成，Masson染色后可见多量致密被染成蓝色的胶原纤维，呈束状或片状沉积，基本符合肺纤维化的特点，则说明实验小鼠肺纤维化模型制备成功。经实施例1-3所制备的墨旱莲提取物治疗后，可见小鼠肺组织结构完整清晰，肺泡间隔略增厚，炎性细胞浸润及成纤维细胞增生程度均比模型组轻。经阳性药物醋酸泼尼松治疗后，阳性对照组小鼠肺泡间隔较宽，肺泡腔变窄，较多炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，病变程度较模型组减轻。给药各组及阳性药与模型组相比，纤维化程度均减轻。(图2和3)

3.总提取物对模型小鼠肺系数和肺组织HYP含量所产生的影响。

羟脯氨酸(HYP)是由结缔组织蛋白质水解所得的一种氨基酸，约占胶原重量的14％，对胶原蛋白的稳定性起关键作用，由于胶原是唯一含HYP较多的蛋白质，因此，测定HYP含量能反映组织胶原的总量变化。造模之后的第14、28天测定肺系数，消化法检测肺组织中HYP的含量。与正常对照组比较，模型组小鼠肺系数明显增高且差异均有统计学意义(P＜0.01或0.05)；与模型组小鼠肺系数相比较。给药14、28天后，墨旱莲提取物组和阳性药物(醋酸泼尼松)组的肺系数均有明显下降，具有显著性差异(P＜0.01)，但实施例1-3所制备的墨旱莲提取物组间不具有明显差异(图1A)。与对照组相比，28天时模型组肺组织HYP含量显著增加(P＜0.01)，与模型组相比，实施例1和实施例2所制备的提取物可明显降低肺组织中HYP含量(P＜0.05)，实施例3所制备的提取物的作用不明显(图1B)。提示实施例1-3所制备的墨旱莲提取物在10g/kg剂量下可不同程度的改善博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，墨旱莲提取物剂可降低模型肺组织胶原纤维含量，减缓模型小鼠肺纤维化发展程度。

4.墨旱莲提取物对模型小鼠肺组织中NO，MDA、TGF-β1含量所产生的影响。

肺组织损伤则MDA产生增多，引起肺泡炎症，炎症细胞释放炎症递质NO、TNF-α等及各种细胞因子，一方面加重肺组织损伤，另一方面又通过各种生长因子促进胶原产生过度增多。本实验按照试剂盒的要求规范操作，比色法检测14、28天时各组肺组织NO、MDA含量。

实验结果表明，与对照组比较，第14、28天模型组的NO、MDA含量均升高(P＜0.01)，阳性给药组中反映肺损伤的MDA、NO含量明显低于模型组，同样，实施例1和实施例2法所制备的墨旱莲提取物给药组的NO、MDA含量也显著下降(P＜0.01或0.05)(图4)，提示实施例1-2所制备的墨旱莲提取物在10g/kg剂量下可不同程度的改善模型小鼠的肺组织损伤程度。

采用ELISA法，在造模28天结束时检测各组小鼠肺组织中TGF-β1的含量(图5)。与对照组相比，模型组的TGF-β1的含量显著升高，而与模型组相比，灌胃给予实施例1和实施例2所制备的墨旱莲提取物之后，模型小鼠肺组织中TGF-β1的含量均显著降低(P＜0.05)，而灌胃给药实施例3法制备的提取物之后，模型肺组织中TGF-β1含量变化不明显。TGF-β1是组织纤维化中公认的致纤维化因子，通过经典的TGF-β1/Smads途径参与纤维化进程，研究结果提示实施例1-2所制备的墨旱莲提取物在10g/kg剂量下可不同程度的降低TGF-β1含量，较好地干预博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化发展程度。

三、实施例1-3所制备的墨旱莲提取物对人胚肺成纤维细胞增殖的影响

肺成纤维细胞是肺纤维化进程中的效应细胞，不是被动参与病程，成纤维细胞的增殖并且分化成肌成纤维细胞，这两种细胞均可分泌细胞外基质(ECM)，肺内的ECM主要由胶原、糖胺聚糖、纤连蛋白FN等构成，在肺纤维化早期主要以III型胶原增加为主，晚期是以I型胶原增加为主。由于肺成纤维细胞异常增殖及胶原分泌增加在肺纤维化过程中起重要作用，抑制肺纤维化细胞过度增生和促进其凋亡也成为防治肺纤维化的一种有效手段。

人胚肺成纤维细胞(HFL1)购自中国科学院上海细胞库。HFL1细胞采用含有10％胎牛血清的F12-K培养基，置37℃，5％CO2培养箱中培养。每2天换1次培养基，细胞生长90％密度时用0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞并传代。将实施例1-3中所制备的墨旱莲提取物分别命名为1号、2号、3号提取物。

实验选用对数生长期细胞。采用MTT法考察不同浓度药物对HFL-1的生长抑制作用。取对数生长细胞，胰蛋白酶消化，并接种于96孔培养板内，细胞密度为5×10⁴cell/ml，每孔细胞悬液200μl，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。24h后，弃原培养液，实验组依次加入不同浓度的墨旱莲提取物培养液，设立空白及阴性对照组，每组5个复孔，重复3次。分别作用48h后加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，孵育4h，弃去孔内培养液，每孔加150μlDMSO，震荡混匀后，在酶标仪492nm波长处检测各孔的吸光度。(如表1)。

表1不同浓度墨旱莲提取物对人胚肺成纤维细胞增殖的影响(n＝5，48h，x±SD)

不同提取物均HFL-1细胞增殖有明显的抑制作用，在1.6-100μg/mL范围内呈剂量依赖性；与对照组比较，药物作用48h后对细胞生长具有较显著抑制作用(P＜0.05或0.01)。

四.讨论

本实验结果表明，在实施例1和2中所制备的提取物给药组中，HE、Masson染色病理切片显示给药组肺纤维化程度明显改善，墨旱莲提取物给药组NO含量明显低于模型组，给药第14、28天，肺组织中反映肺损伤的MDA含量明显低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，给药第14、28天肺组织中反映胶原沉积的HYP的含量均明显低于模型组，说明墨旱莲提取物对肺纤维化进程不同时期都有一定的保护作用，提示墨旱莲提取物具有减轻氧自由基损伤，抑制胶原形成、保护肺组织的作用。实施例3提取物给药组，虽然模型小鼠肺系数有较显著变化(P＜0.05)，但其小鼠肺组织改善程度不明显，NO、MDA、HYP、TGF-β1等指标无明显改变。抑制肺纤维化细胞过度增生和促进其凋亡也成为防治肺纤维化的一种有效手段，体外细胞增殖抑制实验结果表明：在1.6-100μg/mL范围内，实施例1-3制备的墨旱莲提取物呈剂量依赖性抑制HFL-1增殖，体外实验结果也证实了墨旱莲提取物的抗肺纤维药物用途。

Claims (1)

1.墨旱莲提取物在制备抗肺纤维化药物中的应用，其特征在于按质量百分比计，墨旱莲提取物中总皂苷含量在53.24-56.1％，提取物中旱莲苷A的含量为6.54-11.30％，蟛蜞菊内酯的含量为1.46-3.56％。