CN105388294A - 线粒体三功能酶α亚基在制备AA005抑制脂质累积的药物靶标的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开线粒体三功能酶α亚基在制备AA005抑制脂质累积的药物靶标的应用，本发明利用化学蛋白质组学驱动的秀丽线虫feeding？RNAi技术表型筛选和靶点鉴定的一种可行可靠的新思路，并且应用该思路成功阐明了番荔枝内酯聚醚类似物AA005能够在无毒性的情况下特异性抑制线虫及前脂肪细胞3T3-L1中脂质累积的效应是通过作用于其靶蛋白线粒体三功能酶α亚基而实现的。通过本发明我们首次确定AA005通过作用于其靶蛋白线粒体三功能酶α亚基(HADHA)影响脂质合成通路从而抑制脂质的累积，很可能提供了一种选择性靶向脂肪合成通路的治疗方法，为制备预防或治疗脂质代谢异常药物的开发提供重要线索。

Description

线粒体三功能酶α亚基在制备AA005抑制脂质累积的药物靶标的应用

本申请是中国发明专利申请“准确快速实现表型筛选所获得活性化合物药物靶点鉴定的方法”(申请号：201410377168.4，申请日2014-08-01)的分案申请。

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体地讲，涉及线粒体三功能酶α亚基在制备AA005抑制脂质累积的药物靶标的应用。

背景技术

药物发现策略主要包括“基于表型的筛选(phenotypicscreening)”和“基于靶点的筛选(target-basedscreening)”。这两大类型的药物筛选已经相继主导过去一百年的药物开发。前者关注化合物诱导的细胞、组织或整个生物体的效应或表型，而后者在体外分析化合物对纯化的靶蛋白的效应。其中，基于靶点的药物筛选在近30年占主导地位。然而，1999年到2008年FDA批准的新药统计分析表明：基于靶点的筛选尽管在follower跟踪类药物的审批中占有优势，但是在first-in-class原创新药的发现上只有17个，而非主流技术“基于表型的筛选”first-in-class却有28个。基于表型的筛选在first-in-class原创新药开发中具有明显优势。学术界和产业界开始质疑基于靶标的筛选虽然有其优势，但也可能限制了药物发现的范围。而基于表型的筛选在药物发现中正卷土重来，并激起了激烈的争议。诺华和葛兰素史克公司是积极拥抱这种回潮的拥趸者，而罗氏和基因技术公司似乎对此疑虑重重。值得注意的是，无论是学术界还是产业界，无论是赞成基于表型筛选的诺华和葛兰素，还是反对者罗氏和基因技术公司(Genentech)，都源自基于表型筛选获得活性化合物后如何实现靶标鉴定这一问题。活性化合物的发现与靶标的鉴定两者间实现无缝对接是学术界和产业界关注的焦点和难点。靶标的鉴定的新技术已经成为能否让基于表型的筛选重新受到学术界和产业界的青睐,夺回被基于靶标的筛选侵占的主导地位的关键，推动药物研发革命的关键。

目前，基于表型的药物筛选包括基于细胞、组织表型的筛选以及基于动物表型的筛选。基于细胞表型分析通常使用原代人类细胞株，永生化细胞系(原代或工程化)，或来自患者或正常人类原代细胞，以及被诱导的多能干细胞(iPSCs)分化的特定细胞类型等。与基于靶标的药物筛选相比，基于细胞表型分析的药物筛选是处于复杂的蛋白相互作用和信号网络的生物环境，更接近于人体，是目前药物表型筛选的主流。但是，其缺点是细胞不能模拟人体的药物吸收、分布、代谢和排泄过程，以及体内的毒性。导致很多体外有生物学效应的化合物在体内效应不一致。

与细胞相比，基于动物模型的筛选除了对疾病的疗效数据，给予小动物的表型筛选可提供对化合物吸收，分布，代谢和毒性丰富的信息。啮齿类动物，如小鼠、猴子等，与人类种属之间的保守型高，但是其成本高、操作复杂、周期长，不适合初期的药物筛选。在过去10–20年，很多疾病都找到了合适的与人类疾病相关性好小动物疾病模型，包括秀丽隐杆线虫，斑马鱼，非洲爪蟾和果蝇等，这些小动物体积小、好饲养、生命周期短，适合高通量的药物筛选，已经被成功应用于很多疾病相关的活性化合物筛选。无论是基于细胞的筛选以及基于动物模型的筛选，两者均受困于靶点鉴定。只有找到药物的靶点分子才能理解药物与靶点结构互作的本质；才可以针对性的开发、设计、优化和改造化合物；同时，也有利于药物的临床实验设计，选择合适的人群，增加药物研发的可预测性，降低药物研发的费用。

目前已知的药物靶点98％以上属于蛋白质，包括G蛋白耦联受体、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶、锌金属肽酶、丝氨酸蛋白酶、核激素受体以及磷酸二酯酶等。尽管以RNAi为代表的遗传学手段在药物靶点的鉴定方面有一些成功的案例，蛋白质芯片、同位素标记的策略以及化学蛋白质组学等从蛋白质角度鉴定药物靶点才是最直接有效的策略。其中，化学蛋白质组学是目前鉴定和发现药物靶点的最有效的手段。化学蛋白质组学以活性化合物为饵钓取相互作用的蛋白质，并结合质谱定性定量分析，发现药物靶点。值得注意的是，当药物与靶点蛋白是共价键结合时，通过苛刻的冲洗，可以显著减少非特异性结合蛋白质。但小分子化合物与蛋白质常常呈非共价键形式相互作用，为了保证靶点蛋白的结合，不能采用剧烈的冲洗，会残留很多非特性结合的蛋白质，需要艰巨的去伪存真的工作，这是困扰化学蛋白质组学与表型筛选对接的关键。

RNAi能够非常快速地使靶基因失活，从而很快成为基因功能研究和靶标验证的重要工具。然而在哺乳动物细胞中进行大规模的RNAi是有困难的。Timmons和Fire首次描述了通过喂食表达dsRNA的细菌给线虫可达到RNAi的目的，该技术(feedingRNAi)操作方便，很快成为一种有效的筛选目的基因功能缺失型的重要工具，为快速筛选化合物的潜在靶蛋白提供了可能。

秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)虫体小、透明，生命周期较短、繁殖快，便于表型观察；实验无需特殊条件、无菌要求低、不易交叉污染、便于操作及长期保藏；秀丽线虫具有2000个基因，是最早完成测序的生物体，约60％的基因与人类同源；在线虫中基因沉默、过表达、敲除及突变的技术非常成熟；CGC等线虫保藏中心拥有大量突变体线虫，另外还拥有丰富的WormBook、WormBase等免费网络资源提供线虫的基本知识、实验技术和基因信息。线虫虽小，只有1000个细胞，却已经具备分化的细胞和器官，可以表现出衰老、行为、认知和疾病等多细胞生物的复杂表型。同时，与细胞相比较，秀丽线虫在化合物筛选方面还得益于对化合物具有吸收、代谢、分部、排泄等药物代谢动力学的完整过程势，其获得的活性小分子化合物与人体实验更接近。秀丽线虫的复杂性正好适合于化合物的表性分析。近年来在抗衰老、脂肪储存和代谢、抗细菌和真菌感染、糖尿病、及神经退行性病变等领域均有深入的研究，建立了高效的筛选模型，并获得了一些重要的活性化合物。我们利用秀丽线虫和化学蛋白质组学可以实现两者的无缝对接，解决目前制约first-in-class原创药物发现的瓶颈和基础性问题。

番荔枝内酯(Annonaceousacetogenins)是从番荔枝科植物中分离得到的一类具有广谱生理活性的天然化合物。申请人的发明专利申请番荔枝内酯聚醚类似物AA005及其结构类似物在制药中的应用(申请号：201310143100.5)已经揭示了番荔枝内酯聚醚类似物AA005及其结构类似物在制备预防或治疗脂质代谢异常疾病药物中的应用。我们在研究中意外发现该化合物类似物可以阻断秀丽线虫及小鼠前脂肪细胞3T3-L1脂质累积，但其作用靶标未知。本发明主要以该化合物为探针，探讨化学蛋白质组学结合秀丽线虫feedingRNAi鉴定药物靶标的新方法。这种策略的成功实施可能为解决目前药物候选蛋白从发现到确证的瓶颈提供可能。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供线粒体三功能酶α亚基在制备番荔枝内酯聚醚类似物AA005抑制脂质累积的药物靶标的应用。

本发明第二个目的在于，提供线粒体三功能酶α亚基作为药物靶标在筛选调控脂质代谢的小分子化合物中的应用。

为实现本发明第一个发明目的，本发明公开以下技术方案：线粒体三功能酶α亚基在制备番荔枝内酯聚醚类似物AA005抑制脂质累积的药物靶标的应用。线粒体三功能酶α亚基，在线虫中是T08B2.7，哺乳动物中是HADHA。

为实现本发明第二个发明目的，本发明公开以下技术方案：线粒体三功能酶α亚基作为药物靶标在筛选调控脂质代谢的小分子化合物中的应用。

首先，本发明建立基于秀丽线虫的高通量的表型筛选技术，以番荔枝内酯聚醚类似物AA005及生物素标记的AA005(Biotin-AA005)作为分子探针，依托秀丽线虫建立液体培养给药的方法和脂肪定量的方法，形成基于秀丽线虫的高通量药物筛选技术，有利于通量筛选活性化合物。

所述AA005的结构式如下：

所述生物素标记的AA005即Biotin-AA005结构式如下：

所述药物包括药品、保健品和膳食添加剂。

其次，建立基于定量的化学蛋白质组学的靶点识别技术。本发明以生物素标记的AA005(Biotin-AA005)作为分子探针，通过在活性化合物的设计和改造、秀丽线虫蛋白质的温和裂解和提取、以及相互作用蛋白质定量几个角度控制和减少蛋白质的非特异性结合，建立基于定量的化学蛋白质组学的靶点识别技术。

第三，建立覆盖秀丽线虫全基因组的完善RNAi文库。本发明依托秀丽线虫，建立覆盖秀丽线虫全基因组的完善的RNAi文库，借助线虫的feedingRNAi操作，实现对活性化合物结合蛋白的高通量的验证工作，快速识别真正介导其活性的靶点蛋白质。

第四，建立靶点蛋白在哺乳动物确认技术。本发明完善小鼠前脂肪细胞3T3-L1，人源肝癌细胞HepG2，以及高质饮食诱导的肥胖小鼠等脂质累积的研究模型，建立靶点蛋白在哺乳动物确认技术。

本发明以秀丽线虫的脂质累积为模型，利用秀丽线虫和化学蛋白质组学建立表型筛选和靶点鉴定的无缝对接技术，加速表型筛选中靶点鉴定的速度和精度，有利于突破困扰表型筛选在first-in-class原创新药发现的瓶颈，进一步推动我国重大新药的创制。

本发明的优点在于：本发明提供利用化学蛋白质组学驱动的秀丽线虫feedingRNAi技术表型筛选和靶点鉴定的一种可行可靠的新思路，并且应用该思路我们成功阐明了番荔枝内酯聚醚类似物AA005能够在无毒性的情况下特异性抑制线虫及前脂肪细胞3T3-L1中脂质累积的效应是通过作用于其靶蛋白线粒体三功能酶α亚基而实现的。本发明对于从事药物研究的学术界和产业界均有一定的指导和借鉴意义。并且本发明建立的基于秀丽线虫的高通量的表型筛选技术，也可为基于秀丽线虫的调控衰老及神经退行性病变等活性化合物的表型筛选提供借鉴。本发明将亲和层析结合质谱分析的化学蛋白质组学手段与秀丽线虫的成熟feedingRNAi技术有机结合在一起，不仅解决了目前困扰单纯运用蛋白质组学手段分析药物互作蛋白容易产生的假阳性和假阴性问题，能够实现去伪存真，并且操作简便，筛选快速、精确，为实现大通量的药物互作蛋白的分析提供了可行方案，形成了更完善的化学蛋白质组学技术体系，为突破表型筛选蛋白质靶点鉴定的瓶颈提供了可能。同时表型筛选不以假说为起点，因此通过建立的从表型筛选出发确定药物靶标的新的技术体系可能发现新的药物靶点和first-in-class的原创新药，为推动药物研发提供线索。通过本发明我们首次确定AA005通过作用于其靶蛋白线粒体三功能酶α亚基(HADHA)影响脂质合成通路从而抑制脂质的累积，很可能提供了一种选择性靶向脂肪合成通路的治疗方法，为制备预防或治疗脂质代谢异常药物的开发提供重要线索。

附图说明

图1中，图1A为本发明实施的基本路线路；图1B为番荔枝内酯聚醚类似物AA005及其类似物A1、A2、A3的化学结构；图1C显示AA005能够特异性地抑制线虫体内脂质的累积。将同步化至L1期线虫，22℃，培养28小时，分别用4μM四种化合物AA005、A1、A2、A3处理14h，对照组不加药物。药物处理后，将每组线虫在含有OP50菌的NGM板上恢复16h，收取各组线虫进行油红O染色以及萃取油红定量，结果显示与对照组相比，化合物AA005和A3处理后的线虫体脂明显减少，A1和A2几乎不变。

图2中，图2A显示AA005处理后，不影响线虫的整体表型；图2B显示AA005处理后，不影响线虫的发育情况；图2C显示AA005处理后，不影响线虫的存活力；图2D显示AA005处理后，不影响线虫的身体弯曲次数，反映线虫运动力良好；图2E显示AA005处理后，不影响线虫的摆头次数，反映线虫运动力良好；图2F显示AA005处理后，不影响线虫吞咽球的收缩次数，反映线虫的进食情况良好；图2G显示AA005处理后，不影响线虫的生殖能力。

图3中，图3A显示AA005能够特异性抑制前脂肪细胞3T3-L1中甘油三酯的累积。分别用化合物AA005、A1、A2、A3处理MDI三联药诱导分化的3T3-L1细胞，诱导分化第8天，用油红O染色显示细胞中甘油三酯的累积情况，进行大体观及镜下(200×)拍照，并萃取油红O，进行定量统计；图3B显示AA005在无细胞毒性的情况下，呈剂量依赖性地抑制3T3-L1细胞中甘油三酯的累积。用不同浓度的AA005处理MDI三联药诱导分化的3T3-L1细胞，诱导分化第8天，用油红O染色显示细胞中甘油三酯的累积情况，进行大体观及镜下(200×)拍照，结果显示与对照组细胞相比，AA005的处理呈剂量依赖性的抑制3T3-L1细胞中甘油三酯的累积。用CCK-8试剂盒对诱导8天后的对照组及330nM-AA005处理组细胞进行细胞活力检测，结果显示两组细胞活力均良好。

图4中，图4A显示利用化学方法对AA005的结构进行修饰，连接上生物素，得到生物素标记的小分子(Biotin-AA005)；图4B显示Biotin-AA005能够特异性抑制3T3-L1中甘油三酯的累积；图4C显示Biotin-AA005主要定位在细胞线粒体中。3T3-L1细胞爬片24h后，Biotin-AA005处理细胞12h，收取细胞玻片，对细胞进行固定，透化，孵育Mito-tracter和StreptavidinFITC抗体过夜，DAPI标记细胞核。免疫荧光结果显示Biotin-AA005主要定位在细胞线粒体；图4D显示3T3-L1细胞的线粒体、细胞核、细胞浆的纯化情况；图4E显示考染胶。Biotin和Biotin-AA005在体外分别与3T3-L1细胞各细胞器组分裂解液孵育，通过streptavidin-agarosebeads钓取与Biotin-AA005相互作用的蛋白，单独Biotin标记作为对照，收取各组蛋白进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色。

图5显示与Biotin-AA005相互作用的蛋白。将Biotin-AA005在线粒体组分中出现的明显多于单独Biotin组的蛋白条带进行割胶，脱色，酶解，通过LC-MS分析得到与Biotin-AA005相互作用的蛋白30个。

图6中，图6A显示与Biotin-AA005相互作用的蛋白对应线虫的所有同源基因功能被抑制后线虫体脂累积情况。找到与Biotin-AA005相互作用的蛋白相对应的线虫同源基因，利用秀丽线虫feedingRNAi技术，逐一沉默43种蛋白质的功能，收取线虫固定，油红O染色，萃取，定量统计。daf-2和sbp-1的功能被抑制后分别作为体脂增加和体脂减少的阳性对照；图6B显示8种基因沉默表达后能够明显延迟线虫的发育。将同步化至L1期线虫，分别喂食含对应8种基因RNAi质粒的菌，记录其自然发育到L4期的时间。

图7显示与Biotin-AA005相互作用的蛋白对应线虫的所有同源基因功能被抑制后镜下观察线虫整体形态。其中有8种基因包括rpl-5、rla-0、hsp-6、H28016.1、atp-2、act-4、act-3和act-1(红色框标出)经过RNAi干扰48h后线虫体长明显减小。

图8中，图8A显示基因T08B2.7沉默表达后线虫体脂明显减少。构建了分别针对基因T08B2.7的N端(T08B2.7-N)和C端(T08B2.7-C)的RNAi质粒，给L1期线虫喂食，48h后油红O染色，镜下观察线虫体脂累积情况；图8B显示针对基因T08B2.7的N端或C端的两种质粒均沉默T08B2.7的mRNA水平；图8C显示基因T08B2.7沉默表达后，不影响线虫的发育情况；图8D显示基因T08B2.7沉默表达后，不影响线虫的存活力；图8E显示基因T08B2.7沉默表达后，不影响线虫的身体弯曲次数，反映线虫运动力良好；图8F显示基因T08B2.7沉默表达后，不影响线虫的摆头次数，反映线虫运动力良好；图8G显示基因T08B2.7沉默表达后，不影响线虫吞咽球的收缩次数，反映线虫的进食情况良好；图8H显示基因T08B2.7沉默表达后，不影响线虫的生殖能力。

图9中，图9A显示针对HADHA的敲除片段均能沉默其在3T3-L1细胞中的表达；图9B显示沉默HADHA蛋白表达后3T3-L1细胞中的脂质累积明显减少。构建了针对基因hadha的RNAi质粒，转染3T3-L1细胞，油红O染色，镜下观察细胞脂质累积情况；图9C显示5倍和10倍AA005能够阻断Biotin-AA005与蛋白HADHA的特异性结合。Biotin-AA005及加入5倍和10倍AA005竞争组，在体外分别与3T3-L1细胞裂解液孵育，通过streptavidin-agarosebeads钓取与Biotin-AA005相互作用的蛋白，单独Biotin组作为对照，Input作为细胞裂解液全蛋白对照，WesternBlot检测各组蛋白中HADHA的情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1.AA005及其结构类似物能够在无毒性情况下特异性抑制线虫体脂累积

同步化后的L1期N2线虫，在NGM板上OP50菌饲养28h后，将线虫均分入六孔板中，分别用4μM的AA005、A1、A2、A3化合物处理线虫14h，对照组不加药物，并适当的OP50菌饲养。药物处理后的各组线虫，分别放在含有OP50菌的NGM板上恢复16h，收取等量线虫油红O染色以及萃取油红O定量，观察AA005及其衍生物对线虫脂质累积情况的影响。镜下观察(图1C)，与对照组相比，化合物AA005和A3处理后的线虫体内脂质明显减少，而化合物A1和A2的脂质几乎不变。染色后分别取对照组和实验组线虫100条，加入100％的异丙醇萃取线虫体内油红O，37℃静置2h，分光光度计检测各组吸收峰，统计定量结果也显示只有化合物AA005和A3处理后的线虫体内脂质明显减少。为了排除AA005对线虫产生毒性效应以致线虫存活力下降而导致体脂减少，同时检测了该浓度的AA005处理后线虫的各项基本生命指标，表明线虫存活力良好(图2)。将同步化后L1期N2线虫在NGM板上OP50菌饲养28h后，不加药组和4μM-AA005组分别处理线虫14h，镜下观察每组线虫整体表型，计算平均体长(图2A)；计算每组内L4期线虫数目所占线虫总数的比例和未发育到L4期线虫数目所占线虫总数的比例，测定两组线虫的发育情况(图2B)；计算每组线虫的存活率，作为药物处理后线虫的存活率(图2C)；将线虫置于空板上，1min后待线虫适应环境后，记录20s内两组线虫运动时的身体弯曲次数(n＝10)(图2D)；记录线虫1min内两组线虫的摆头次数(n＝10)(图2E)，作为药物处理后线虫运动情况的测定；记录10s内两组线虫的吞咽球收缩次数(n＝10)(图2F)，测定线虫的进食能力；继续培养，记录两组L4期线虫从产卵开始24h内板子上的虫卵以及孵化幼虫的总数(n＝12)，测定线虫的产卵情况(图2G)。综合以上结果表明，化合物AA005在无细胞毒性的情况下具有特异性抑制线虫体脂的表型。

实施例2.AA005及其结构类似物能够特异性抑制前脂肪细胞3T3-L1中甘油三酯的累积

3T3-L1细胞连续生长至完全接触抑制两天后，加入MDI三联药至含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中诱导分化，处理组细胞加入300nM的AA005及结构类似物A1、A2、A3，将诱导分化8天的对照组与四种化合物处理组细胞油红O染色后，进行大体观及镜下拍照(图3A),萃取细胞中油红O染料，分光光度计定量。结果提示与对照组相比，AA005处理组与A3处理组细胞中油红O染色减少，并且AA005的抑制效应最为显著，而A1和A2处理组细胞中油红O染色不变。加入不同浓度的AA005处理，将诱导分化8天的对照组与AA005处理组细胞油红O染色后，进行大体观及镜下拍照(图3B)，结果提示与对照组相比，AA005处理组细胞中油红O染色减少，并且随着AA005处理浓度的升高，油红O染色减少越明显。当然为排除AA005对细胞产生毒性效应以致细胞死亡而油红O染色减少，同时用CCK-8试剂盒检测表明该浓度的AA005处理组细胞活力良好，与对照组细胞无明显差异。这些结果提示AA005能够在无细胞毒性条件下特异性抑制前脂肪细胞3T3-L1中甘油三酯的累积。

实施例3.化学蛋白质组学钓取AA005的相互作用蛋白质

为了利用亲和层析获得AA005相互作用的蛋白，我们在其活性中心以外连接了Biotin构建了生物素标记的AA005(Biotin-AA005)(图4A)。修饰后的小分子依然保持了AA005抑制3T3-L1细胞脂质累积的生物学活性，能够显著抑制细胞内脂滴的形成(图4B)。我们又通过Mito-tracker标记线粒体和FITC标记的链霉亲和素共染的免疫荧光染色实验来分析Biotin-AA005在3T3-L1细胞内的定位，结果表明Biotin-AA005几乎全部定位于线粒体内(图4C)。据此，我们推测AA005的相互作用蛋白很可能定位于线粒体中。接下来，利用差速离心联合不连续密度梯度离心方法分离纯化3T3-L1细胞线粒体、细胞核以及细胞浆组分。同时用各细胞器的标志蛋白通过免疫印迹法评价各细胞器的纯化程度，结果表明各细胞器的纯化情况良好(图4D)。在此基础上，各细胞器裂解液上清与Biotin-AA005进行体外孵育，用亲和素的磁珠pull-down与之相互作用的组分，用SDS-PAGE胶分离并用考马斯亮蓝染色。结果与我们的推测一致，与Biotin-AA005相互作用的蛋白条带主要产生在线粒体组分，并且这些条带在单独的Biotin孵育组中并没有出现(图4E)。我们接下来将这些差异蛋白条带切胶然后进行LC-MS质谱分析。质谱鉴定结果显示Biotin-AA005共分离得到候选蛋白30种(图5)。

实施例4.利用秀丽线虫feedingRNAi高通量的对相互作用蛋白质进行验证

这其中可能包含了很多与AA005非特异性结合的蛋白，靶标蛋白质可能隐匿其中。理论上，可以利用RNAi技术在3T3-L1细胞中把43种蛋白质依次沉默各蛋白的表达，发现可能的靶标蛋白质。然而这样规模的RNAi在哺乳动物细胞中实施起来也是非常耗时耗力的。秀丽隐杆线虫中建立起来的成熟的feedingRNAi技术，操作方便，已经成为一种有效的筛选目的基因功能缺失型的重要工具。同时线虫作为一种有利的研究脂质代谢调控的生物模型也是人们所熟知的。因此，我们将已获得的AA005—蛋白质相互作用图谱与线虫体内RNAi筛选两者结合起来，发展了一种新方法，快速的发现AA005的靶蛋白(图1A)

查找上述30种AA005的候选蛋白对应的线虫同源基因，共找到39个线虫同源基因(图5)，利用含有相应基因干扰片段的细菌给线虫喂食48h后，对线虫进行油红染色并萃取油红定量，观察线虫RNAi干扰后的体脂累积水平。喂食空载L4440菌作为正常对照组，sbp-1和daf-2分别作为脂质减少和脂质增多的对照。定量结果显示，与正常对照组相比，大部分基因功能被抑制后线虫油红染色减少，尤其是T08B2.7、rpl-5、rla-0、hsp-6、H28016.1、atp-2、act-4、act-3和act-1组的线虫体内油红明显减少，降低率均大于40％，提示这些基因功能的缺失可能抑制了线虫体内脂质累积(图6A)。然而镜下观察线虫形态(图7)，其中有8种基因包括rpl-5、rla-0、hsp-6、H28016.1、atp-2、act-4、act-3和act-1经过RNAi干扰48h后线虫体长明显减小，提示这些基因可能同时影响了线虫的生长发育。进一步，我们测量了这些线虫生长到与对照组染色和定量时相同大小的时间，发现其所需时间明显延长(图6B)，提示这9种基因功能抑制后既可以抑制线虫体脂累积也会影响线虫的发育，与AA005只影响脂质累积的表型不相符合。

经过上述分析，发现只有T08B2.7基因在沉默表达后，与对照组相比较，显著抑制线虫的脂质累积(图8A)，经过Realtime-PCR检测确保了T08B2.7两个敲除片段的沉默效应(图8B)，进一步的，对沉默T08B2.7功能后线虫的发育(图8C)、生存(图8D)、运动能力包括身体弯曲(图8E)和摆头次数(图8F)、进食(图8G)、生殖(图8H)各项基本生理功能进行检测，结果表明T08B2.7功能被抑制后线虫存活力良好，与AA005处理线虫后的表型一致，提示其在线虫内可能是AA005抑制脂质累积的靶标蛋白。

实施例5.靶点蛋白在哺乳动物的进一步确认

T08B2.7对应于哺乳动物的同源基因为线粒体三功能酶α亚基(HADHA)。那么AA005是否通过作用于HADHA蛋白来发挥抑制3T3-L1细胞中甘油三酯的累积效应的呢？我们构建沉默HADHA蛋白表达的质粒，与空载对照同时转染小鼠前脂肪细胞3T3-L1，并对沉默效应进行了验证(图9A)。之后对该细胞株进行诱导分化，分化第8天时油红O染色，大体观及镜下观察脂质累积情况(图9B)，与我们的推测一致，3T3-L1细胞中抑制HADHA蛋白的功能后，细胞甘油三酯的累积明显减少，这一表型与AA005作用于3T3-L1细胞内的效应相符。同时，我们用WesternBlot分析了Biotin-AA005与HDHDA蛋白的结合(图9C)，与质谱鉴定的结果相一致。进一步的，用AA005竞争与Biotin-AA005结合HADHA，可见5倍及10倍的AA005可以阻断Biotin-AA005的结合，提示AA005与之作用于HADHA蛋白质的同一位点。HADHA是AA005作用的靶标蛋白质。

脂肪累积是一个高度保守的生物学过程，参与了很多病理生理的过程。线虫是研究脂肪累积的经典模型，在脂肪累积的调控基因以及活性化合物方面，发挥了突出的作用。本研究利用了线虫在脂肪累积方面的保守性、作为生物体对化合物的响应性以及线虫高通量RNAi的特点，对化学蛋白质组学发现的靶标做了逐一的筛选。发现HAHDA是最有可能的靶标蛋白。在3T3L1细胞中沉默表达HADHA，获得了相似的生物学效应，提示该基因对脂肪累积发挥着保守的生物学效应。

除了脂肪累积，线虫在细胞凋亡、自吞噬等诸多生物学过程高度保守，化学蛋白质组学结合线虫的RNAi在这些领域可能是一个高效的靶标蛋白的鉴定方法。另一方面线虫毕竟是一种相对低等的生物，没有血液循环后天免疫等系统，在研究中应小心求证其保守性，避免错失一些高等生物特异的靶标蛋白。

结论：本发明利用化学蛋白质组学驱动的秀丽线虫feedingRNAi技术建立化合物表型筛选和靶点鉴定的无缝对接，并且利用该方法成功确定了番荔枝内酯聚醚类似物AA005的靶蛋白为HADHA。本发明利用化学蛋白质组学结合秀丽线虫feedingRNAi的技术对AA005的相互作用蛋白进行表型筛选，其中基因T08B2.7功能沉默后与AA005处理线虫的表型一致，T08B2.7对应哺乳动物中的同源基因是HADHA，在前脂肪细胞3T3-L1中进一步验证后确认HADHA为AA005的靶蛋白。本发明的新方法主要以Biotin-AA005为探针尝试利用亲和层析结合质谱分析的化学蛋白质组学驱动的秀丽线虫feedingRNAi的新思路鉴定AA005的靶标，不仅操作简便，同时能够在大规模的与活性化合物互作的候选蛋白中去伪存真，快速、准确识别真正介导其活性的靶点蛋白质。这种策略的成功实施可能为解决目前制约first-in-class原创药物从表型筛选到靶点鉴定的瓶颈提供可能，从而为制备预防或治疗类似脂质代谢异常等复杂性疾病的药物应用提供新线索。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.线粒体三功能酶α亚基在制备番荔枝内酯聚醚类似物AA005抑制脂质累积的药物靶标的应用。

2.线粒体三功能酶α亚基作为药物靶标在筛选调控脂质代谢的小分子化合物中的应用。