KR101334403B1 - 형질전환 예쁜꼬마선충 및 이를 이용하여 당 대사 조절물질을 검색하는 방법 - Google Patents
형질전환 예쁜꼬마선충 및 이를 이용하여 당 대사 조절물질을 검색하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 당에 반응하여 형광을 나타내는 형질전환 예쁜꼬마선충 (C. elegans)을 제조하고, 이를 이용하여 당 대사 및 대사 질환을 조절할 수 있는 후보물질 및 새로운 유전자를 찾아내는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 예쁜꼬마선충은 형광현미경으로 당의 변화를 실시간으로 쉽게 관찰할 수 있도록 제조된 것으로, 신속 정확하게 당 대사 조절 물질 발굴을 가능하게 하며, 나아가 비만, 당뇨병 등의 대사와 관련된 다양한 난치병을 치료하기 위한 연구에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 당에 반응하여 형광을 나타내는 형질전환 예쁜꼬마선충 (C. elegans)을 제조하고, 이를 이용하여 당 대사 및 대사 질환을 조절할 수 있는 후보물질 및 새로운 유전자를 찾아내는 방법에 관한 것이다.
예쁜꼬마선충(C. elegans)은 유전자 조작이 아주 쉽고, 크기가 작아서 실험실에서 동시에 많은 수를 비교적 저비용으로 키울 수 있다. 알에서 부화되어 L1, L2, L3, L4의 4단계를 통해 성충이 되는데 약 3일 정도만이 소요되어 빠른 실험에 적합하다. 몸의 구조가 단순하여 생식세포를 제외하면 전체 세포수가 959개에 불과하고, 몸이 투명하여 현미경 등으로 내부를 직접 관찰하기가 용이하다.
또한 수정란에서 성충에 이르는 세포 계보가 완전히 밝혀져 있다. 게놈 프로젝트 결과 예쁜꼬마선충은 효모의 3배, 사람의 1/3-1/5 정도의 유전체를 가진다. 이중 40%가 인간의 것과 유사하며, 지금까지 알려진 인간 질병 유전자 5,000개 가운데 75%를 공유하고 있어 인간 질병 연구를 위한 좋은 모델 시스템으로 널리 인식되어 있다.
최근 들어서 대사 및 대사 관련 질환에 대한 관심이 집중적으로 높아짐으로써 예쁜꼬마선충의 유전학을 이용한 대사 연구가 급속도로 진행되고 있다. 이들 연구를 통해 발굴된 많은 유전자들이 또한 포유류에도 보존이 되어 있다. 예를 들어 포유류의 대사에 중요한 유전자들, 예를 들면 insulin 신호전달 체계의 유전자들, mTOR 신호전달체계 상의 유전자들, Tubby, SREBP, PPARγ, BAR (bile acid receptor) 등의 유전자들에 대한 상동유전자가 예쁜꼬마선충에 존재하며 이들의 전반적인 대사에서의 역할이 활발하게 연구되고 있다.
당분은 인간을 비롯한 지구상 거의 모든 생명체의 필수적인 에너지원이다. 하지만 당분이 많은 음식은 비만, 심장병, 그리고 특히 혈중 포도당의 이상을 초래하는 이형 당뇨병 (type II diabetes)과 밀접한 연관이 있기 때문에 심각한 의료적 문제를 초래할 수 있다.
2003년 당뇨병의 사망률은 우리 나라의 경우 인구 십만 명 당 25명으로 1994년 인구 십만 명 당 17명에서 10년 사이에 무려 47%나 증가했다. 당뇨병의 사회적 비용은 미국의 경우 1997년 약 980억 달러에 달하는 것으로 추정될 정도로 막대하다. 따라서 사회경제적인 비용 절감을 위해서라도 당뇨병에 대한 연구는 매우 중요하다. 하지만 당뇨병은 유전적, 환경적 요인의 복잡한 상호작용에 의해 결정되기 때문에 그 원인을 정확하게 찾기가 쉽지 않다. 따라서 당뇨병에 작용하는 유전자들의 네트워크 규명 및 당 대사 조절이 가능한 물질을 찾기 위해서는 예쁜꼬마선충과 같이 간단한 모델 동물을 이용하는 것이 효율 면에서 뛰어날 수 있다. 하지만 현재까지 예쁜꼬마선충을 이용하여 당 대사 및 당뇨병에 대한 후보유전자 및 후보약물을 스크리닝하기 위해 이용한 연구결과는 전무하다.
본 발명은 예쁜꼬마선충의 저비용 고효율의 특성을 이용하여 실시간으로 생체내 당의 변화를 형광으로 볼 수 있는 형질전환 예쁜꼬마선충을 제조하고, 이를 이용하여 당 대사를 조절할 수 있는 후보 유전자 및 후보약물을 스크리닝하는 방법 등을 제공하고자 한다.
구체적으로, 본 발명은 당 및 지질 대사에 관련된 유전자를 조작하였을 때 상기 형질전환 예쁜꼬마선충에서 형광 변화가 일어나는 것을 보여줌으로써 생체 내 당의 리포터로서의 본 형질전환 예쁜꼬마선충의 유용성을 확립하고자 한다.
본 발명은 당에 반응하여 생체 내 형광을 나타내는 형질전환 예쁜꼬마선충 (C. elegans)을 제공한다. 상기 당은 포도당을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 형질전환 예쁜꼬마선충은 당 섭취에 의해 발현이 증가하는 유전자인 far-3(fatty acid and retinol binding protein 3)에 녹색형광단백질(GFP)를 붙인 far-3::GFP DNA가 염색체상에 융합된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 자외선을 가하여 far -3:: GFP DNA를 염색체 상에 융합하는 단계를 포함하는, 형질전환 예쁜꼬마선충을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 당에 반응하여 생체 내 형광을 나타내는 형질전환 예쁜꼬마선충을 이용하는 것을 특징으로 하는, 당 대사 조절 후보 유전자 및 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 스크리닝 방법은 형질전환 예쁜꼬마선충에 당을 섭취시키는 동시에 RNAi (RNA interference) 방법을 이용하여 당 대사 조절 유전자의 발현을 저하시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 형질전환 예쁜꼬마선충은 실체 형광현미경으로 당의 변화를 실시간으로 쉽게 관찰할 수 있도록 제조된 것으로, 신속 정확하게 당 대사 조절 물질 발굴을 가능하게 한다. 또한 예쁜꼬마선충의 특성상 낮은 비용으로 고효율의 연구가 가능하다. 따라서 본 발명은 비만, 당뇨병 등의 대사와 관련된 다양한 난치병을 치료하기 위한 연구에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 형질전환 예쁜꼬마선충을 제조시 DNA융합 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2A는 far -3:: GFP 형질전환 예쁜꼬마선충을 2% 포도당이 포함된 배지에서 키웠을 때 대조군에 비해 밝은 형광을 나타내는 것을 보여주는 결과이며, 도 2B는 이를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 3A는 포도당이 있는 조건에서 gpi -1 RNAi로 해당과정(glycolysis)을 차단했을 때, 대조군에 비해 포도당에 의해 증가된 형광이 더욱 증가하는 것을 보여주는 결과이며, 도 3B는 이를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 4A는 포도당이 있는 조건에서 pod -2 RNAi 나 fasn -1 RNAi로 지방산 합성 과정을 차단했을 때 대조군에 비해 포도당에 의해 증가된 형광이 더욱 증가하는 것을 보여주는 결과이며, 도 4B는 이를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 5A는 포도당이 있는 조건에서, 예측된 포도당 수송체 H17B01.1의 발현을 RNAi로 억제했을 때, 포도당에 의해 증가된 형광이 대조군에 비해 줄어든 것을 보여주는 결과이며, 도 5B는 이를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 2A는 far -3:: GFP 형질전환 예쁜꼬마선충을 2% 포도당이 포함된 배지에서 키웠을 때 대조군에 비해 밝은 형광을 나타내는 것을 보여주는 결과이며, 도 2B는 이를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 3A는 포도당이 있는 조건에서 gpi -1 RNAi로 해당과정(glycolysis)을 차단했을 때, 대조군에 비해 포도당에 의해 증가된 형광이 더욱 증가하는 것을 보여주는 결과이며, 도 3B는 이를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 4A는 포도당이 있는 조건에서 pod -2 RNAi 나 fasn -1 RNAi로 지방산 합성 과정을 차단했을 때 대조군에 비해 포도당에 의해 증가된 형광이 더욱 증가하는 것을 보여주는 결과이며, 도 4B는 이를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 5A는 포도당이 있는 조건에서, 예측된 포도당 수송체 H17B01.1의 발현을 RNAi로 억제했을 때, 포도당에 의해 증가된 형광이 대조군에 비해 줄어든 것을 보여주는 결과이며, 도 5B는 이를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 당에 반응하여 형광을 나타내는 형질전환 예쁜꼬마선충 (C. elegans)을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 '예쁜꼬마선충'은 학명으로는 Caenorhabditis elegans 이며 흙에서 박테리아를 먹고사는 선충류로서 유전학, 분자생물학, 세포생물학 실험에서 널리 사용된다.
본 발명에서 사용된 용어 '형질전환'은 외부로부터 주입한 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변한 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 자외선을 가하여 far -3:: GFP DNA 를 염색체 상에 융합하는 단계를 포함하는, 형질전환 예쁜꼬마선충 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 'GFP (green fluorescence protein)' 는 세포 내에서 발현되어 강한 녹색 형광을 발하는 단백질로, 특히 관찰이 용이하다는 장점으로 인해 유전자의 발현의 유무를 측정하는 다양한 분야에서 사용되고 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '형질전환 예쁜꼬마선충'은 포도당 섭취에 의해 발현이 증가하는 유전자인 far -3에 녹색형광단백질(GFP)을 부착한 far -3::GFP DNA를 융합하여 제조된 당 리포터 형광 예쁜꼬마선충을 의미한다.
또한, 본 발명은 당에 반응하여 생체 내 형광을 나타내는 형질전환 예쁜꼬마선충을 이용하여 당 대사 조절 후보 유전자 및 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 스크리닝 방법은 RNAi (RNA interference) 방법을 이용하는 것을 특징으로 한다.
상기 방법은 형질전환 예쁜꼬마선충에 당을 섭취시키는 동시에 RNA interference(RNAi) 방법을 이용하여 예쁜꼬마선충의 유전자들의 발현을 저하시키는 단계를 포함한다. 상기 본 발명의 일 실시예에서, 지질 및 당 대사 유전자를 저하시켰을 때 녹색 형광의 세기가 현저하게 바뀌는 것을 관찰하였으며, 이는 형질전환 예쁜꼬마선충을 이용하여 대사 조절 관련의 새로운 유전자를 발굴할 수 있음을 시사한다 (도 3 내지 도 5 참조).
구체적으로, 본 발명자들은 도 1에 나타난 바와 같이 포도당 섭취에 의해 발현이 증가하는 유전자인 far -3 에 녹색형광단백질(GFP)을 부착하여 제조된 형광을 나타내는 far -3:: GFP 형질전환 예쁜꼬마선충을 제조하여, far -3:: GFP 형질전환 예쁜꼬마선충을 2% 포도당이 포함된 배지에서 키웠을 때 대조군에 비해 밝은 형광을 나타내는 것을 확인하였다 (도 2 참조).
이어 본 발명자들은 포도당이 있는 조건에서 당의 분해 과정인 해당과정(glycolysis)을 gpi -1 RNAi로 차단했을 때 대조군에 비해 포도당에 의해 증가된 형광이 더욱 증가하는 것을 확인하였다 (도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 포도당이 있는 조건에서 지방산 합성 과정을 pod -2 RNAi나 fasn -1 RNAi로 차단했을 때 대조군에 비해 포도당에 의해 증가된 형광이 더욱 증가하는 것을 확인하였다 (도 4 참조).
이에 더하여, 본 발명자들은 포도당이 있는 조건에서, 예측된 포도당 수송체 H17B01.1의 발현을 RNAi로 억제했을 때, 포도당에 의해 증가된 형광이 대조군에 비해 감소하는 것을 보여주는 것을 확인하였다 (도 5 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예
1. 형질전환
예쁜꼬마선충을
제조하는 방법 -
DNA
융합(
integration
)
예쁜꼬마선충에 삽입된 far -3:: GFP DNA는 염색체에 포함되어 있지 않은 형태이기 때문에 예쁜꼬마선충의 자손에게 모두 전달되지 않는다. 이러한 형태의 형질전환 예쁜꼬마선충으로 실험을 하기 위해서는 형질전환된 예쁜꼬마선충을 골라내야 하는 어려움이 있고 far -3:: GFP 의 발현이 일정하지 않은 문제가 있다.
따라서 안정적인 형질전환 예쁜꼬마선충을 얻기 위해 자외선을 가해서 DNA에 변화를 줌으로써 외부에서 유입된 far -3:: GFP DNA가 염색체 상에 융합될 수 있게 하였다. 자외선을 통한 DNA 융합은 매우 낮은 확률로 이루어지기 때문에 다수의 예쁜꼬마선충에 자외선을 가함으로써 성공률을 높일 수 있었다.
far -3:: GFP DNA는 짧은 체형의 돌연변이(dpy -5)를 긴 체형으로 회복시키는 유전자와 함께 삽입되어 있기 때문에 광학 현미경으로 형질전환 여부를 확인할 수 있었다. 본 DNA 융합과정에서도 이를 이용해 형질전환된 예쁜꼬마선충을 구분하였다. DNA 융합과정에 앞서 far -3:: GFP DNA의 자손 전달 빈도를 측정한 결과 약 50%의 자손에게 DNA가 전달되는 것을 확인할 수 있었고 자외선 처리 후 약 50%의 생존율을 보이는 자외선의 세기를 찾은 결과 300 J/m2 임을 알 수 있었다.
성공적인 DNA 융합 실험을 위해서는 자외선 처리 후 600마리 이상의 형질전환된 예쁜꼬마선충이 필요했기 때문에 200마리의 L4 단계 형질전환 예쁜꼬마선충에 300 J/m2의 자외선을 가했다. 6일 후 자외선을 처리한 예쁜꼬마선충에서 태어난 자손 예쁜꼬마선충(F1) 600마리를 각각 600개의 플레이트에 옮기고 자손을 낳게 하였다. 4일 후 600마리의 예쁜꼬마선충에서 태어난 자손 예쁜꼬마선충(F2)을 각 플레이트에서 두 마리씩 1,200개 플레이트에 각각 옮겨 자손을 낳게 하였다. 약 4일 후 1,200개 플레이트를 확인하였다. DNA 융합이 성공적으로 이루어지면 형질전환된 예쁜꼬마선충이 100%로 나타나기 때문에 각 플레이트를 관찰해 100% 정상 체형의 예쁜꼬마선충이 있는 플레이트를 찾았다. 100%의 정상체형을 가진 형질전환 예쁜꼬마선충을 포도당이 포함된 배지에서 형광을 관찰하여 DNA 융합 여부를 확인하였다 (도 1 참조).
실시예
2. 포도당이 있는 조건에서
far
-3::
GFP
의
형질전환
예쁜꼬마선충의
형광 측정
실시예 1에서 제조된 far -3:: GFP 형질전환 예쁜꼬마선충을 2% 포도당이 포함된 배지에서 키운 후, 하기의 방법으로 형광을 측정하였다.
구체적으로, 슬라이드글라스 위에 2% 아가로즈(agarose)를 한 방울 떨어뜨리고 다른 슬라이드글라스로 덮어 아가로즈를 얇게 펴고, 아가로즈가 굳은 뒤 덮었던 슬라이드글라스를 떼어내어 패드를 만든 후, 아가로즈 패드 위에 50 mM 농도의 NaN3 한 방울을 떨어뜨리고 예쁜꼬마선충 약 15 마리를 옮겨 마취시켰다. 공기방울이 생기지 않게 커버글라스를 조심스럽게 덮은 뒤 형광현미경을 이용해 사진을 찍어 far-3::GFP 의 형광을 관찰하였다. 형광현미경은 Zeiss Axio Scope A1을 이용하였다. ImageJ 프로그램을 이용해 예쁜꼬마선충의 몸 전체에서 나타나는 형광을 정량하였고 세 번의 독립적인 실험을 통해 20마리 이상의 예쁜꼬마선충의 형광을 분석하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 포도당이 포함되지 않은 배지에서 키운 far -3::GFP 형질전환 예쁜꼬마선충 대조군에 비해 밝은 형광을 나타내는 것을 확인하였다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001, two-tailed Student's t-test).
실시예
3.
RNA
interference
(
RNAi
)를 이용하여 당 대사 유전자를 검색하는 방법
본 발명자들은 특정 유전자의 발현을 억제하고 far -3:: GFP 의 형광을 관찰하기 위해 Julie Ahringer RNAi 박테리아 library를 사용하였다. Library에서 얻은 박테리아를 LB/ampicillin 플레이트에 긁어서 옮긴 다음 37℃ 배양기에서 12-16시간 동안 배양하고, 플레이트에 자란 박테리아 콜로니 하나를 선택하여 액체 LB/ampicillin 배지에 옮겨 37℃ 회전 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 배양 12시간이 지난 후 박테리아가 자란 액체 LB/ampicillin 배지를 2% 포도당과 ampicillin이 포함된 NG배지에 100㎕씩 분주 한 후 37℃ 배양기에서 12-16시간 동안 배양하였다. 인덕션 (Induction) 반응을 위해 100 mM 농도의 IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) 50㎕를 박테리아 위에 분주하고 상온에서 하루 동안 반응시킨 후, far -3:: GFP 형질전환 예쁜꼬마선충 성체 두 마리를 RNAi 박테리아가 자란 플레이트로 옮겨 알을 낳게 하였다. 약 12시간 뒤 성체 far -3:: GFP 형질전환 예쁜꼬마선충을 제거하고 3일 뒤 알에서 자라난 예쁜꼬마선충이 성체가 되었을 때 상기에 기재된 far -3:: GFP 의 형광을 측정하는 방법을 이용하여 형광 현미경으로 형광의 발현을 관찰하였다.
실시예
3-1.
gpi
-1
RNAi
이용
본 발명자들은 gpi -1 RNAi을 이용하여 해당과정(glycolysis)에 관련된 것으로 알려진 gpi -1 유전자 발현을 차단했을 때 형질전환 예쁜 꼬마선충의 형광 세기의 변화를 관찰하였다.
포도당이 세포 내로 유입되면 hexokinase에 의해 glucose-6-phosphate로 변환되며, 이어서 gpi -1(glucose-6-phosphate isomerase)에 의해 fructose-6-phosphate로 변환된다. gpi -1은 해당과정(glycolysis) 상위 단계에서 중요한 역할을 하고 있으므로 gpi -1의 발현억제를 통해 해당과정을 차단할 수 있다.
도 3에 나타난 바와 같이, 포도당이 있는 조건에서 gpi -1의 발현이 줄어들지 않은 형질전환 예쁜꼬마선충 대조군에 비해 gpi -1 유전자 발현을 차단했을 때 포도당에 의해 증가된 형광이 더욱 증가하는 것을 알 수 있다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001, two-tailed Student's t-test).
실시예
3-2.
pod
-2
RNAi
또는
fasn
-1
RNAi
이용
본 발명자들은 pod -2 RNAi나 fasn -1 RNAi를 이용하여 지방산 합성에 관련된 것으로 알려진 pod -2 또는 fasn -1 을 차단했을 때 형질전환 예쁜꼬마선충의 형광 세기 변화를 관찰하였다.
pod -2 (acetyl-CoA carboxylase)는 지방산 합성의 최상위 단계에 위치한 효소로 acetyl-CoA를 malonyl-CoA로 변환하는 역할을 한다. fasn -1 (fatty acid synthase)은 pod -2의 다음 단계에서 acetyl-CoA와 malonyl-CoA를 이용해 지방산을 합성하는 데 관여한다. pod -2와 fasn -1은 지방산 합성의 시작 단계를 조절하는 중요한 효소이므로 pod -2와 fasn -1을 차단함으로써 지방산 합성을 크게 저하시킬 수 있다.
도 4에 나타난 바와 같이, 포도당이 있는 조건에서 pod -2 또는 fasn -1의 발현이 줄어들지 않은 형질전환 예쁜꼬마선충 대조군에 비해 pod -2 또는 fasn -1 유전자의 발현을 차단했을 때 포도당에 의해 증가된 형광이 더욱 증가하는 것을 알 수 있다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001, two-tailed Student's t-test).
실시예
3-3.
H17B01
.1
RANi
이용
본 발명자들은 H17B01.1 RANi를 이용하여 예측된 포도당 수송체 H17B01.1의 발현을 차단했을 때 형질전환 예쁜꼬마선충의 형광 세기 변화를 관찰하였다.
H17B01.1은 인간의 포도당 수송체 GLUT1과 가장 유사한 염기서열을 가진 예쁜꼬마선충의 유전자로 예쁜꼬마선충에서 포도당을 세포 내로 수송하는 역할을 할 것으로 예측된다.
도 5에 나타난 바와 같이, 포도당이 있는 조건에서 H17B01.1을 차단하지 않은 형질전환 예쁜꼬마선충 대조군에 비해 H17B01.1을 차단했을 때 포도당에 의해 증가된 형광이 감소하는 것을 알 수 있다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001, two-tailed Student's t-test).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (5)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- far-3(fatty acid and retinol binding protein 3) 유전자에 녹색형광단백질(GFP) 유전자를 붙인 far-3::GFP DNA 가 염색체상에 융합된 형질전환 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)에 포도당을 섭취시키는 단계;
RNAi(RNA interference) 방법을 이용하여 당대사조절 유전자의 발현을 저하시키는 단계; 및
형질전환 예쁜꼬마선충의 생체내 형광세기 변화를 관찰하는 단계를 포함하는, 당대사조절 유전자의 스크리닝 방법으로서,
상기 당대사조절 유전자는 gpi-1(glucose-6-phosphate isomerase), pod-2(acetyl-CoA carboxylase), fasn-1(fatty acid synthase) 및 H17B01.1(glucose transporter)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법. - 삭제
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