CN102579444A

CN102579444A - 青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用

Info

Publication number: CN102579444A
Application number: CN2012100202112A
Authority: CN
Inventors: 张有成; 何晶晶
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-01-21
Filing date: 2012-01-21
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明公开了青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用。本发明的有益效果为：青藤碱在体外可剂量依赖性的抑制人消化系肿瘤细胞株的粘附、迁移、侵袭和增殖。这些结果也部分提示青藤碱直接抑制人消化系肿瘤细胞株增殖和侵袭转移的机制可能与其对上皮细胞的作用一样。青藤碱为天然药物青风藤中的活性成分之一，来源丰富，药用价值十分广泛，其副作用小、毒性低、致畸性低等均已经过研究确认。现阶段，国内外均缺少有效地抗肿瘤侵袭转移的药物，临床上，一旦有患者被诊断为肿瘤，多已并发转移，而此时多数患者无疑“被判处死刑”。因此，本申请提供的应用将会填补此领域的一大空白，能造福于更多的肿瘤患者。

Description

青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药活性成分的应用，具体涉及青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用。

背景技术

青藤碱是中药青风藤中主要的活性生物碱，青风藤的化学成分研究主要集中在青藤碱。青藤碱的药理作用及临床应用的研究多年来有了长足的进步，先后发现青藤碱具有显著的镇痛、镇静、抗炎、免疫抑制、镇咳、促组胺释放、降血压及抗心律失常等作用，已应用于治疗风湿病、抗心律失常。近年来，青藤碱的抗肿瘤作用亦逐渐受到关注，越来越多的研究显示青藤碱有抑制宫颈癌Hela细胞、肺癌NCI-H460细胞、白血病HL-60细胞的增殖、诱导凋亡以及化疗增敏的作用。之前已有实验证实青藤碱具有抑制人肝癌细胞HepG2增殖、诱导凋亡的作用，而青藤碱抑制肿瘤细胞侵袭及转移的研究国内外尚无报道。因此，本专利旨在青藤碱对于肿瘤侵袭及转移的治疗作用做一申请。

药材青风藤（《本草纲目》）为防己科植物青藤，华防己或清风藤科植物清风藤等的藤茎。目前为止，对青风藤（Sinomenium acutum Rehder & E.H. Wilson）的化学成分研究主要集中在青藤上，主要含有生物碱类成分以及脂类、甾醇类等。最早是由Ishiwari等从日本青风藤中分离得到的一种生物碱单体。20世纪60年代我国学者朱任宏从国产青风藤中也发现其成分。早在《本草汇言》中就有“青风藤，散风寒湿痹之药也，能舒筋活血，正骨利髓。”《本草便读》亦有“凡藤蔓之属，皆可通经入络，此物善治风疾，故一切历节麻痹皆治之，浸酒尤妙；以风气通于肝，故入肝，风胜湿，湿气又通于脾也。”因此青风藤主治风湿及类风湿性关节炎，关节肿大，肢体疼痛、麻木等症，后经历代学者研究发现青风藤中主要的生物活性碱青藤碱（青藤碱）还具有镇痛、抗炎、镇静、消肿、利尿、降压、抗心律失常、抗组胺释放以及免疫调节等多方面的药理作用。国内已有正清风痛宁片、盐酸青藤碱片、盐酸青藤碱注射液、毛青藤总碱片、青藤碱缓释剂等用于临床，凝胶剂、喷雾剂也已投入临床使用，这些制剂在治疗类风湿性关节炎等各种风湿病及心律失常取得明显疗效。近年来，亦有文献报道青藤碱对其他自身免疫性疾病、抗移植排斥反应以及抗肿瘤等多方面的作用，但更多的研究报道集中于青藤碱的抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤的凋亡而发挥作用，而对于青藤碱抑制肿瘤的侵袭转移方面并无相关报道。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用。

上述应用中，所述肿瘤为肝癌、胰腺癌、结肠癌或胃癌。

上述应用中，所述肿瘤具体为人肝癌细胞株MHCC97H、人胰腺癌细胞株PANC-1、人结肠癌细胞株HT-29或人胃腺癌细胞株HGC-27。

上述应用中，所述青藤碱的浓度为0.125-2.5mmol/L，处理时间为24-72小时。

上述应用中，优选的青藤碱的浓度为1.25-2.5mmol/L，处理时间为48-72小时。

本发明的有益效果为：

青藤碱在体外可剂量依赖性的抑制人消化系肿瘤细胞株的粘附、迁移、侵袭和增殖。这些结果也部分提示青藤碱直接抑制人消化系肿瘤细胞株增殖和侵袭转移的机制可能与其对上皮细胞的作用一样。

青藤碱为天然药物青风藤中的活性成分之一，来源丰富，药用价值十分广泛，目前已经在临床上用于类风湿性关节炎等其他疾病的治疗，其副作用小、毒性低、致畸性低等均已经过研究确认。现阶段，国内外均缺少有效地抗肿瘤侵袭转移的药物，临床上，一旦有患者被诊断为肿瘤，多已并发转移，而此时多数患者无疑“被判处死刑” 。因此，本申请提供的应用将会填补此领域的一大空白，能造福于更多的肿瘤患者。

附图说明

图1为青藤碱抗肿瘤侵袭转移的分子机制示意图。

图2为青藤碱对细胞增殖能力的影响。

图3为青藤碱对细胞粘附的影响。

图4为穿过聚碳酸酯膜和Matrigel 胶后人结肠癌细胞株HT-29细胞的Giemsa 染色(×400倍)。

其中，A：0.5mmol/L；B：1.25mmol/L；C：1.0mmol/L；D：0.625mmol/L；E：0.5mmol/L；F：0.25mmol/L；G：0.125mmol/L；H：空白组。

图5为青藤碱对细胞侵袭力的影响。

图6为青藤碱对细胞迁移能力的影响。

具体实施方式

设计原理：

第一阶段：青藤碱抗肿瘤侵袭转移的实验研究。

以中国药品鉴定所生产的青藤碱标准品（购于中国药品鉴定所，批号：110774-200206）为实验药物，利用transwell小室（购于Corning Costar公司，货号：3422）及基质胶（Matrigel）（购于美国BD公司，货号：356234）模拟基膜及细胞外基质，观察青藤碱对高侵袭转移能力的人消化系肿瘤细胞株（人肝癌细胞株MHCC97H、人胰腺癌细胞株PANC-1、人结肠癌细胞株HT-29以及人胃腺癌细胞株HGC-27，以上细胞株均来自于北京大学医学部肝病研究所）粘附、侵袭和迁移的影响，为其机制的进一步研究做准备。

通过第一阶段实验，发现青藤碱具有下列作用：

1、青藤碱能明显抑制人肝癌细胞株MHCC97H、人胰腺癌细胞株PANC-1、人结肠癌细胞株HT-29以及人胃腺癌细胞株HGC-27对Matrigel胶的粘附，并随药物剂量的增加，粘附抑制率逐渐提高。运用transwell小室的方法发现青藤碱使这四种细胞侵袭基底膜的能力显著下降，并且侵袭抑制率与药物剂量成正相关。在不涂Matrigel胶的transwell小室下室加入15%FBS（胎牛血清）的趋化下，细胞株经青藤碱处理12h后，穿过聚碳酸酯膜的细胞数明显减少，证明青藤碱对人消化系肿瘤细胞株侵袭转移有着直接作用；

2、通过MTT法检测青藤碱对上述四种细胞增殖的影响情况，发现细胞株分别经0.125-2.5mmol/L青藤碱处理24h后，细胞增殖抑制不明显，处理48h、72h后，1.25、2.5mmol/L青藤碱增殖抑制率才达30%以上。说明青藤碱对细胞的增殖存在时间和剂量依赖关系，同时也说明青藤碱对人消化系肿瘤细胞与Matrigel胶的粘附力、体外侵袭力及迁移力的抑制作用并非通过其细胞毒性作用所致；

3、青藤碱在体外可剂量依赖性的抑制人消化系肿瘤细胞株的粘附、迁移、侵袭和增殖。这些结果也部分提示青藤碱直接抑制人消化系肿瘤细胞株增殖和侵袭转移的机制可能与其对上皮细胞的作用一样。

第二阶段：青藤碱抗肿瘤侵袭转移的分子机制。

如图1所示，肿瘤转移是指恶性肿瘤脱离原发肿瘤通过各种转移方式,到达继发组织或器官得以继续增殖生长,形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的全过程。它包括多个过程,其中肿瘤细胞侵袭是肿瘤转移的前提,而EMT（上皮细胞-间充质转化）在肿瘤细胞侵袭过程中起着重要作用。因此，EMT的过程是肿瘤侵袭转移中最重要的生物学作用。EMT过程中肿瘤细胞可以自分泌许多转录因子，已发现青藤碱ail, Slug, Sip1, AP21（与MMPs关系密切）,NF-κB, Twist等多种转录因子可以诱导EMT。转录因子中的锌指家族如：青藤碱ail、Slug、Twist以及MMPs是上调的，而E-cadherin下调时,可使非侵袭性肿瘤转变为高侵袭性肿瘤。MMP表达上调与EMT关系密切。Twist是一个高度保守的转录因子,它可以调节胚胎发育中的组织重建,并赋予细胞迁移的能力。研究发现,表达Twist的细胞呈细长形, E-cadherin和β-catenin等粘附连接蛋白表达降低,从而引起EMT。另外, Twist的过度表达也是弥漫性胃癌发生EMT的一种重要因素。Twist引起E-cadherin下调的机制目前尚不十分清楚,它可能是通过直接与E-box位点结合的方式下调E-cadherin,也可能通过抑制某些调节因子的活性下调E-cadherin。有研究证实：在高侵袭性的肿瘤细胞中，EMT发展过程中引发MMP-9作用比青藤碱ail的作用更大，以这样的结果为基础，我们推测在高侵袭性的肿瘤细胞中MMP-9的过表达可能直接诱导（或刺激）EMT。使用MMP-9的特异性抑制剂可以导致波形蛋白（Vimentin）和纤维结合素（finronection）表达降低又有研究结果提示,EMT调控因子Twist1与Twist2在HCC侵袭、转移中具有不同的生物学功能,Twist1可以通过激活MMPs促进肿瘤细胞迁移、运动,进而促进HCC转移并影响预后。该研究从肿瘤转移角度,提出了Twist蛋白不同亚型可能具有不同的生物学功能,作为一种新的药物靶点对抗肿瘤转移治疗具有重要意义。在肿瘤的侵袭和转移的过程中，MMP14可裂解CD44，使其细胞外区暴露，促进MMP9与CD44的结合并定位于细胞表面；而MMP9只有与CD44结合于细胞表面才能发挥其促进侵润的作用。E-cadherin可与β连环素(β-catenin)和γ连环素(γ-catenin)结合,再与α连环素相连,形成E-cadherin2β连环素2α连环素复合体,其与肌动蛋白细胞骨架的正确连接对于细胞间粘附的稳定相当重要。

通过以上理论分析，分别对人消化系肿瘤细胞株（人肝癌细胞株MHCC97H、人胰腺癌细胞株PANC-1、人结肠癌细胞株HT-29以及人胃腺癌细胞株HGC-27）中与EMT形成相关指标（MMP-9、CD44、Twist-1、E-cadherin、β-catenin、Vimenin）进行检测，使用方法为蛋白质检测方法：Western blotting，结果发现青藤碱能够抑制MMP-9、CD44、Twist-1、E-cadherin、Vimenin的表达，另一方面增强β-catenin的表达。

由此，结合以上实验结果，表明青藤碱对于肿瘤的侵袭转移是有治疗作用的。目前，青藤碱虽已应用于类风湿性关节炎等临床治疗，疗效肯定，而亦有学者对于其抗凋亡作用进行研究，但对于青藤碱在肿瘤的侵袭转移方面的治疗作用，国内外均未见报道，因此，特在此方面申请专利，为下一步扩大青藤碱的临床适应症，更早的应用于肿瘤患者做好基础工作。

实施例1：

人肝癌细胞株MHCC97H、人胰腺癌细胞株PANC-1、人结肠癌细胞株HT-29以及人胃腺癌细胞株HGC-27均通过以下方法证实青藤碱对肿瘤侵袭转移的抑制作用：

1、MTT法检测细胞增殖：

将对数生长期细胞的四种消化系统肿瘤细胞以0.25% 胰酶消化, 细胞计数, 用高糖型DMEM培养基稀释单细胞悬液至所需细胞浓度5×104/ml, 每孔100μl, 接种于96孔细胞板中,37℃,5%CO₂培养过夜；根据报道进行样品稀释, 每孔加入无血清高糖型DMEM培养基稀释的样品100μl, 同时设空白对照组、溶剂对照组和调零孔, 每组设6个复孔, 37 ℃, 5%CO2继续培养, 分别于24h、48h、72h 后, 小心去除培养基,加入现配制的MTT 溶液（配制方法为：准确称取MTT0.5g，溶于100ml的0.01mol/L、PH7.4的PBS溶液中，以0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后，4℃以下保存）(100 μl/ 孔), 37℃, 5%CO₂培养4h, 使用微量枪吸出去除MTT溶液, 加入DMSO (150μl/孔),振荡10min, 酶标仪490nm 检测各孔吸光值，OD值，实验重复3次。分别计算青藤碱对细胞的24h、48h和72h增殖抑制率。增殖抑制率计算方法为（1- 实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%；

2、细胞对细胞外基质的粘附检测：

于96孔板每孔中加入含有matrigel胶（购于美国BD公司，货号：356234）2μg的高糖型DMEM培养液50μl,4℃处理过夜,吸出Matrigel胶，放入细胞培养箱中1 h，收集细胞并调整细胞浓度至5×10⁵/ml, 与样品终浓度分别为0mmol/L、0.125mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.625mmol/L、1.0mmol/L、1.25mmol/L及2.5mmol/L混和，37 ℃孵育30 min 后, 以每孔100μl 细胞悬液加入上述培养板中,每组细胞设6个复孔，培养箱中（37℃含5%CO₂细胞培养箱）继续培养2 h。倒去培养液并用PBS轻洗2次，加入100μl无血清高糖型DMEM培养液及10μl MTT（5mg/ml），37 ℃, 5%CO₂培养4 h, 去除MTT 溶液, 加入DMSO (150 μl/ 孔),振荡10min, 全波长酶标仪490nm检测各孔吸光值和OD值。黏附抑制率计算方法为（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%；

3、细胞体外侵袭能力检测：

在24 孔transwell 上室聚碳酸酯膜（购于Corning Costar公司，货号：3422）( 膜孔径8 μm) 上涂1 mg/ml 的Matrigel胶 50 μl, 室温通风条件下放置3小时，使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。以细胞计数的方法确定指数生长期细胞，并取指数生长期细胞, 以0.1% BSA（小牛血清白蛋白）的高糖型DMEM培养液调整细胞数1×10⁶/ml, 取细胞100μl 接种于transwell 上室内, 分别按终浓度为0.125、0.25、0.5、0.625、1.0、1.25 及2.5mmol/L 加入样品处理细胞, 对照组加入等体积无血清RPMI-1640, 每组设3 个复室；下室加入含15% FBS 的高糖型DMEM培养液500μl , 37 ℃、5% CO₂ 培养24 h 后,滤膜以4%多聚甲醛固定15min, 然后用Giemsa染料（购于Solarbio公司，货号：G1010-100）染色10min，双蒸水冲洗，将滤膜上层的细胞用棉签抹去。400倍光镜下选择膜上下左右中5个不同视野的穿过膜的细胞数, 求平均值, 按下式计算药物对肿瘤细胞的侵袭抑制率。侵袭抑制率=( 1-实验组平均侵袭细胞数/ 对照组平均侵袭细胞数) ×100%。抑制率达30%以上, 且经统计学处理P<0.05 者认为有抗侵袭活性；

4、细胞迁移能力检测：

实验方法与体外侵袭力的检测相同, 只是不在聚碳酸脂膜上铺 Matrigel人工基底膜胶, 下室加入含15%FBS, 置培养箱中12h后取出。

结果：

1、青藤碱对人结肠癌细胞株HT-29细胞增殖的影响：

分别以0.125、0.25、0.5、0.625、1.0、1.25 及2.5mmol/L,青藤碱处理人结肠癌细胞株HT-29细胞24 h,发现青藤碱对人结肠癌细胞株HT-29增殖抑制作用较弱, 为3.21%-8.27%,而处理48h、72 h后, 抑制率明显升高,48h的抑制率为4.99%-41.29%。72h时，其中1.25mmol/L、2.5 mmol/L组抑制率分别为(38±3.4)%、(66.38±1.9)%, 与0.125mmol/L抑制率(19.83±2.8)%比较差异显著( P<0.01，如图2所示) 。表明青藤碱随着处理浓度增加和作用时间延长, 对人结肠癌细胞株HT-29的增殖有一定的抑制作用；

2、青藤碱对人结肠癌细胞株HT-29细胞粘附能力的影响：

分别以0.125、0.25、0.5、0.625、1.0、1.25 及2.5mmol/L 青藤碱与HepG2细胞温箱孵育30 min 后, 可以观察到青藤碱能够明显抑制人结肠癌细胞株HT-29细胞对matrigel胶的粘附能力。抑制率为19.38%-58.56%, 并随浓度的增加而升高。各实验组OD 值与对照组比较, 差异均有统计学意义, 其中1.0、1.25 及2.5mmol/L组实验组与对照组比较差异显著( P<0.01，如图3所示) ；

3、青藤碱对人结肠癌细胞株HT-29细胞侵袭能力的影响：

如图4所示，不同浓度青藤碱处理的人结肠癌细胞株HT-29细胞24 h 后, 人结肠癌细胞株HT-29细胞穿过人工基底膜matrigel胶细胞数随青藤碱浓度的增加而减少。其中0.125、0.25、0.5、0.625mmol/L抑制率均≤30%, 认为对人结肠癌细胞株HT-29细胞没有抗侵袭作用。如图5所示，1.0、1.25 及2.5mmol/L 青藤碱组能明显抑制人结肠癌细胞株HT-29细胞的侵袭( P<0.01) , 其抑制率分别30.8%、31.03%和51.56%；

4、青藤碱对人结肠癌细胞株HT-29细胞迁移能力的影响：

青藤碱能够剂量依赖性的抑制人结肠癌细胞株HT-29细胞穿过聚碳酸酯膜的能力。如图6所示，其中0.5、0.625、1.0、1.25 及2.5mmol/L组与对照组比较差异显著(P<0.01)。0.5、0.625、1.0、1.25 及2.5mmol/L组迁移抑制率分别为33.71% 、51.05%、53.97%、58.67%与68.56%, 说明青藤碱在中、高浓度时能明显抑制肿瘤细胞的迁移。

其他三种细胞株结论均与人结肠癌细胞株HT-29相似。

其中：

1．青藤碱对人肝癌细胞株MHCC97H细胞的抑制作用最强，2.5mM青藤碱作用72小时时抑制率可高达84.89%；

2．青藤碱对人胰腺癌细胞株PANC-1细胞的抑制作用，2.5mM青藤碱作用72小时时抑制率可达77.08%；

3．青藤碱对人胃腺癌细胞株HGC-27细胞的抑制作用，2.5mM青藤碱作用72小时时抑制率可达66.83%。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤为肝癌、胰腺癌、结肠癌或胃癌。

3.根据权利要求2所述的青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤为人肝癌细胞株MHCC97H、人胰腺癌细胞株PANC-1、人结肠癌细胞株HT-29或人胃腺癌细胞株HGC-27。

4.根据权利要求3所述的青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用，其特征在于：所述青藤碱的浓度为0.125-2.5mmol/L，处理时间为24-72小时。

5.根据权利要求4所述的青藤碱在制备抑制肿瘤侵袭转移的药物中的应用，其特征在于：所述青藤碱的浓度为1.25-2.5mmol/L，处理时间为48-72小时。