CN103463156B - 一种黑骨藤提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了黑骨藤提取物的制备方法，它包括如下操作步骤：（1）取黑骨藤药材，粉碎，90%v/v以上乙醇提取，提取物干燥后得乙醇浸膏；（2）取乙醇浸膏加水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，除去溶剂后，得乙酸乙酯浸膏；（3）取乙酸乙酯浸膏，上硅胶柱，依次用氯仿：甲醇=（10～5）:（0～1）梯度洗脱，收集氯仿：甲醇=5:1洗脱段，除去溶剂，干燥即得黑骨藤提取物。本发明还提供了该方法制备得到的提取物及其用途。本发明制备的黑骨藤提取物，具有良好的抗炎、抗类风湿性关节炎的活性，且药效活性显著优于其他提取部位，停药后反弹不明显，为临床用药提供了新的选择。

Description

一种黑骨藤提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种黑骨藤提取物及其制备方法和用途

背景技术

类风湿性关节炎(RheumatioidArthritis,RA)是一种自身免疫缺陷疾病，以关节滑膜慢性炎症为主要特征，中医学中属“痹证”范畴，具体发病原因尚不清楚，一般认为与环境、感染、免疫失调等多种因素有关。RA在我国发病率约为0.4%，多集中南方省份。治疗方法有化药、中药、生物制剂等药物治疗方法和物理治疗方法。

黑骨藤是萝摩科(Asclepiasaceae)杠柳属(PeriplocaLinn.)植物黑龙骨(PeriplocaforrestiiSchltr)的干燥根或全株，具有祛瘀止痛、祛风除湿、通经活络的功效,是民间广泛应用于治疗风湿与类风湿、闭合性软组织损伤等疾病的常用药。

对黑骨藤的现代研究也发现，其药效活性较好，但其提取物中有效成分含量较低，若将其制备成方制剂，辅料用量较大，不利于工业生产成本的节约，且其服药量较大，不便于患者使用。若能提供一种有效成分含量较高、且药效活性显著的有效部位，将会有利于黑骨藤的推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑骨藤提取物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种黑骨藤提取物，所述提取物中含有如下重量百分比的有效成分：

总黄酮25～35%、总皂苷27～37%、杠柳苷1～3%；且总黄酮和总皂苷之和大于60%。

进一步地，所述提取物中含有如下重量百分比的有效成分：

总黄酮30.3±1.16%、总皂苷32.48±1.32%、杠柳苷1.46±0.0014%。

优选地，所述提取物的HPLC色谱图如图1所示，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；

检测波长：221nm；

流动相：甲醇-水系统梯度洗脱，洗脱程序如下：

时间/min	甲醇/%	水/%
			0	50	50
20	65	35
			30	90	10
40	90	10
			41	50	50
46	50	50

进一步地，色谱柱柱温：25℃；流动相流速为1.0ml/min。

本发明还提供了上述黑骨藤提取物的制备方法，它包括如下操作步骤：

（1）取黑骨藤药材，粉碎，90%v/v以上乙醇提取，提取物干燥后得乙醇浸膏；

（2）取乙醇浸膏加水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，除去溶剂后，得乙酸乙酯浸膏；

（3）取乙酸乙酯浸膏，上硅胶柱，依次用氯仿：甲醇=（10～5）:（0～1）梯度洗脱，收集氯仿：甲醇=5:1洗脱段，除去溶剂，干燥即得黑骨藤提取物。

进一步地，步骤（1）中，所述乙醇浓度为95%v/v。

进一步地，步骤（3）中，依次用纯氯仿、氯仿：甲醇=10:1、氯仿：甲醇=5:1梯度洗脱。

优选地，步骤（3）中，每一个洗脱梯度的溶剂用量为4倍柱体积。

本发明还提供了上述黑骨藤提取物在制备抗炎药物中的用途。

本发明还提供了上述黑骨藤提取物在制备抗类风湿性关节炎的药物中的用途。

本发明还提供了一种药物组合物，它是由上述黑骨藤提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

本发明制备的黑骨藤提取物，具有良好的抗炎、抗类风湿性关节炎的活性，且药效活性显著优于其他提取部位，停药后反弹不明显，为临床用药提供了新的选择。

附图说明

图1本发明黑骨藤提取物HPLC色谱图

具体实施方式

实施例1本发明黑骨藤提取物的制备

将黑骨藤粉碎后，用95%v/v乙醇浸提，过滤，重复3次，将滤液减压干燥成浸膏，合并浸膏。将95%乙醇浸提物均匀分散到约2L蒸馏水中，震荡摇匀，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取液减压干燥，即得乙酸乙酯提取物。

取乙酸乙酯提取物，用150g160-200目的硅胶拌样。将样品上硅胶柱，用氯仿-甲醇体系进行洗脱，洗脱比例分别是纯氯仿、氯仿：甲醇=10:1、氯仿：甲醇=5:1。每个梯度洗4个柱体积，取氯仿：甲醇=5:1洗脱部位，除去溶剂，干燥，即得黑骨藤提取物。

经检测，所得黑骨藤提取物中有效成分百分含量如下：

总黄酮30.3±1.16%、总皂苷32.48±1.32%、杠柳苷1.46±0.0014%。

其中，总黄酮、总皂苷的含量检测方法参照现有技术报道的分光光度法进行。杠柳苷的含量以HPLC方法测定，条件如下：

色谱柱：AlltechApolloC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：

时间/min	甲醇/%	水/%
			0	50	50
20	65	35
			30	90	10
40	90	10
			41	50	50
46	50	50

柱温：25℃；

检测波长：221nm；

进样量：10μl

流速：1.0ml/min。

提取物HPLC色谱图参见图1。

实施例2黑骨藤有效部位的筛选

2.3黑骨藤抗类风湿有效成分的提取和分离纯化

2.3.1黑骨藤抗类风湿有效成分的粗提取

方法一：将黑骨藤用粉碎机粉碎，用50%的乙醇进行回流提取，照固液比10：1的比例进行回流提取，80℃回流一个小时，回流提取完成后过滤，再重复回流提取一次，过滤，合并滤液在60℃下减压干燥，备用。

方法二：将黑骨藤粉碎后，用95%乙醇浸提，重复3次，将滤液50℃减压干燥成浸膏，合并浸膏。取浸膏3g左右，平铺去培养皿中，105℃干燥至恒重，平行3次，计算含水量。

将95%乙醇浸提物均匀分散到约2L蒸馏水中，震荡摇匀，底下有少许不溶物，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4-5次，至萃取颜色很淡为止。将石油醚萃取液30℃减压干燥备用，乙酸乙酯萃取液40℃减压干燥备用，正丁醇萃取液和剩余的水相60℃减压干燥备用。

2.3.2黑骨藤抗类风湿有效成分的分离纯化

2.3.2.1大孔树脂D101分离纯化

将“2.3.1”项下方法一制备的50%乙醇回流提取物50g用蒸馏水溶解，超声搅拌，上样。分别用0%，20%，40%，60%，80%，95%乙醇-水流动相进行洗脱，每个片段均洗涤5个柱体积，各个片段60℃减压干燥，备用。

2.3.2.2用硅胶分离纯化萃取物

将“2.3.1”项下方法二制备的乙酸乙酯萃取物，用150g160-200目的硅胶拌样，干燥。将160-200目的硅胶900g倒入适量的氯仿中，上8cm*80cm的层析柱中。将风干的样品上入柱，上样量干燥重量90.1g；用氯仿-甲醇体系进行洗脱，洗脱比例分别是纯氯仿，氯仿：甲醇=10:1，氯仿：甲醇=5:1，氯仿：甲醇=1:1，纯甲醇。每个梯度4个柱体积，将每个梯度洗脱液进行减压干燥。备用。

按照上述分离纯化方法，得到的纯化部位如下：

表1标记表格

2.4含量测定

将“2.3.2”中的提取物进行有效成分的含量测定，分别测定总黄酮，总皂苷和杠柳苷，其中包括大孔树脂D101分离纯化得到的0%乙醇片段，20%乙醇洗脱片段，40%乙醇洗脱片段，60%乙醇洗脱片段，80%洗脱乙醇片段，95%乙醇洗脱片段，硅胶分离纯化得到的纯氯仿洗脱片段，氯仿：甲醇=10:1洗脱片段，氯仿：甲醇=5:1洗脱片段，氯仿：甲醇=1:1洗脱片段，纯甲醇洗脱片段。结果见下表。

表A

3动物药效实验筛选

3.1黑骨藤提取物小鼠耳肿胀实验

3.1.1实验动物

普通级昆明系健康小鼠，体重20±2g，全雄性，分笼饲养，购自成都达硕动物饲养中心。

3.1.2实验材料、试剂和仪器

实验“2.3”项下的提取片段。

对照药醋酸泼尼松（浙江仙琚药业有限公司），吐温80（成都科龙化工试剂厂），羧甲阳性基纤维素钠、二甲苯购（AR，于成都科龙化工试剂厂），水为蒸馏水。

ESJ120-4万分之一电子天平（沈阳龙腾），手术解剖剪，不锈钢打孔器，镊子等

3.1.3药品配置方法

参考中国药典2010版，《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996），　卫生部公告2006年第12号规定《就进一步规范健康相关产品审批工作的公告》，吐温80的安全口服剂量为0.5%-5%，羧甲基纤维素钠的国际标准的安全摄入量(ADI)是25mg/(kg·d)，本实验的溶剂均符合要求。

称取5g羧甲基纤维素钠至1000mL烧杯中，加入蒸馏水加热搅拌溶解，冷却至室温后补齐蒸馏水至刻度线得到0.5%羧甲基纤维素钠溶液1000mL，称取含25mg醋酸泼尼松的片剂干粉至100mL容量瓶，加4ml吐温，加0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到0.25mg/ml醋酸泼尼松羧甲基纤维素钠溶液100mL。

称取50%乙醇回流提取物1.00g至50mL容量瓶中加0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到浓度为20mg/ml的0.5%羧甲基纤维素钠溶液50mL。

称取石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物，水相萃取物，95%乙醇浸提物各1.00g至50mL容量瓶中，加2ml吐温促溶，加0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到浓度为20mg/ml的0.5%羧甲基纤维素钠溶液50mL。

取100ml容量瓶，加入4ml吐温，用0.5%羧甲基纤维素钠定容，超声混匀，做为空白组。

上述提取物制备方法参见“2.3.1”项。

3.1.4小鼠耳肿胀实验

普通级昆明系健康小鼠，体重20±2g，买来后称重，适应性喂养七天，将体重控制在同一水平。随机分成8组，每组10只。编号，标记。下文中提到的动物实验片段组均表示下文的标记组。

A组为空白组，灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为空白组。

B组为阳性组，灌胃0.25mg/ml醋酸泼尼松0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为阳性组。

C组为50%回流提取片段组，灌胃20mg/mL50%回流提取物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为50%回流片段组。

D组为95%乙醇浸提组，灌胃20mg/mL95%乙醇浸提物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为95%浸提组。

E组为石油醚萃取取物组，灌胃20mg/mL石油醚萃取物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为石油醚组。

F组为乙酸乙酯萃取物组，灌胃20mg/mL乙酸乙酯萃取物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为乙酸乙酯组。

G组为正丁醇萃取物组，灌胃20mg/mL正丁醇萃取物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为正丁醇组。

H组为水相组，灌胃20mg/mL水相萃取物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL标记为水相组。

每24小时灌胃一次，连续灌胃六天。第七天最后一次给药，给药1小时后给小鼠右耳均匀涂上二甲苯，半个小时后断椎处死，用手术剪剪下左右双耳，用不锈钢打孔器在左右双耳同一位置打下等大耳片，称重。

计算公式如下：

3.2黑骨藤抗类风湿分离片段小鼠耳肿胀实验

3.2.1实验动物

普通级昆明系健康小鼠，体重20±2g，全雄性，分笼饲养，购自成都达硕动物饲养中心。

3.2.2实验材料、试剂和仪器

实验2.3.2中的提取片段，片段名称见表2-8。

阳性对照药醋酸泼尼松（浙江仙琚药业有限公司），吐温80（成都科龙化工试剂厂），羧甲基纤维素钠、二甲苯购（AR，于成都科龙化工试剂厂），水为蒸馏水。

ESJ120-4万分之一电子天平（沈阳龙腾），手术解剖剪，不锈钢打孔器，镊子等

3.2.3药品配置方法

参考中国药典2010版，《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996），卫生部公告2006年第12号规定《就进一步规范健康相关产品审批工作的公告》，吐温80的安全口服剂量为0.5%-5%，羧甲基纤维素钠的国际标准的安全摄入量(ADI)是25mg/(kg·d)，本实验的溶剂均符合要求。

称取5g羧甲基纤维素钠至1000mL烧杯中，加入蒸馏水加热搅拌溶解，冷却至室温后补齐蒸馏水至刻度线得到0.5%羧甲基纤维素钠溶液1000mL，称取含25mg醋酸泼尼松的片剂干粉至100mL容量瓶，加4ml吐温，加0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到0.25mg/ml醋酸泼尼松羧甲基纤维素钠溶液100mL，做为阳性组。

分别称取水分离片段、20%片段、40%片段、60%片段、80%片段、95%片段各0.5g至25mL容量瓶中，每个容量瓶中加1ml吐温。加0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到浓度为20mg/ml的0.5%羧甲基纤维素钠溶液50mL。

称取纯氯仿片段，氯仿：甲醇=10:1片段，氯仿：甲醇=5:1片段，氯仿：甲醇=1:1片段，纯甲醇片段各0.375g至25mL容量瓶中，每个容量瓶中加1ml吐温，加0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到浓度为15mg/ml的0.5%羧甲基纤维素钠溶液50mL。

取100ml容量瓶，加入4ml吐温，用0.5%羧甲基纤维素钠定容，超声混匀，做为空白组。

上述提取物命名及来源参见表1。

3.2.4小鼠耳肿胀实验

普通级昆明系健康小鼠，体重20±2g，买来后称重，适应性喂养七天，将体重控制在同一水平。随机分成8组，每组10只。编号，标记。下文中提到的动物实验片段组均表示下文的标记组。

A组为空白组，灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为空白组。

B组为阳性组，灌胃0.25mg/ml醋酸泼尼松0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为阳性组。

C组为0%片段组，灌胃20mg/mL水分离片段0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为0%片段组。

D组为20%片段组，灌胃20mg/mL20%片段0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为20%片段组。

E组为40%片段组，灌胃20mg/mL40%片段0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为40%片段组。

F组为60%片段组，灌胃20mg/mL60%片段.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为60%片段组。

G组为80%片段组，灌胃20mg/mL80%片段0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为80%片段组。

H组为95%片段组，灌胃20mg/mL95%片段0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为95%片段组。

I组为纯氯仿片段组，灌胃20mg/mL纯氯仿片段0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为纯氯仿片段组。

J组为氯仿：甲醇=10:1片段组，灌胃20mg/mL氯仿：甲醇=10:1片段0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为10:1片段组。

K组为氯仿：甲醇=5:1片段组，灌胃20mg/mL氯仿：甲醇=5:1片段分离物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为5:1片段组。

L组为氯仿：甲醇=1:1片段组，灌胃20mg/mL氯仿：甲醇=1:1片段分离物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为1:1片段组。

M组为纯甲醇片段组，灌胃20mg/mL纯甲醇片段0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次0.2mL，标记为纯甲醇片段组。

每24小时灌胃一次，连续灌胃六天。第七天最后一次给药，给药1小时后给小鼠右耳均匀涂上二甲苯，半个小时后断椎处死，用手术剪剪下左右双耳，用不锈钢打孔器在左右双耳同一位置打下等大耳片，称重。

计算公式如下：

3.2.5重复性实验

将实验3.2.1-3.2.4重复操作一次，察看实验的重复性。

3.3弗氏佐剂型大鼠关节炎模型动物实验

大鼠足肿胀实验专一性验证抗类风湿药效，采用大鼠弗氏佐剂性关节炎模型进行抗类风湿药效研究，佐剂性关节炎(adjuvantarthritis，AA)模型，是研究类风湿性关节炎动物模型的最基本方法之一。

3.3.1实验动物

SPF级SD大鼠，体重200±20g，6月龄，全雄性，购自成都达硕动物饲养中心。买来后称重，适应性喂养七天，将体重控制在同一水平。随机分成8组，每组10只。编号，标记。

3.3.2实验材料、试剂和仪器

40%片段，5:1片段，纯甲醇片段，见表1。

阳性对照药醋酸泼尼松（浙江仙琚药业有限公司），阳性对照药雷公藤多苷片（湖南协力药业有限公司），羧甲基纤维素钠（成都科龙化工试剂厂），完全弗氏佐剂（美国Sigma公司），吐温（成都科龙化工试剂厂），水为蒸馏水。

PV-200足肿胀仪器（成都泰盟科技发展有限公司），一次性注射器，实验动物饲料，75%医用消毒乙醇，消毒脱脂棉花。

3.3.4药品配置方法

参考中国药典2010版，《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996），卫生部公告2006年第12号规定《就进一步规范健康相关产品审批工作的公告》，吐温80的安全口服剂量为0.5%-5%，羧甲基纤维素钠的国际标准的安全摄入量(ADI)是25mg/(kg·d)，本实验的溶剂均符合要求。

称取10g羧甲基纤维素钠至2000mL烧杯中，加蒸馏水加热溶解，冷却至室温后补齐蒸馏水至刻度线得到0.5%羧甲基纤维素钠溶液2000mL。

称取含50mg醋酸泼尼松的片剂干粉至250mL容量瓶加10ml的吐温试剂，混匀，再加入0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到0.20mg/ml醋酸泼尼松羧甲基纤维素钠溶液250mL。

称取含50mg雷公藤多苷的雷公藤多苷片干粉至250mL容量瓶中，加入10ml的吐温试剂，再加入0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到0.20mg/ml醋酸泼尼松羧甲基纤维素钠溶液250mL。

称取40%乙醇洗脱产物5g至250mL烧杯中，加入10ml的吐温试剂，再加入0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到浓度为20mg/ml的0.5%羧甲基纤维素钠溶液250mL。

称取氯仿：甲醇=5:1片段各2g至100mL容量瓶中，在容量瓶中加4ml吐温，加0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到浓度为20mg/ml的0.5%羧甲基纤维素钠溶液50mL。

称取纯甲醇片段2g至100mL容量瓶中，每个容量瓶中加4ml吐温，加0.5%羧甲基纤维素钠溶解得到浓度为20mg/ml的0.5%羧甲基纤维素钠溶液50mL。

3.3.5大鼠足肿胀实验

购得180-220g健康SD大鼠后，适应性喂养七天，随机分成7组，每组10只。其中6组大鼠右足足趾部注射0.2mL的完全弗氏佐剂，注射第二天测定右足足体积，若是足体积大于2.0mL且与正常组有显著性差异则造模成功，随机分组用于模型组，阳性组和实验组实验。

A组为空白组，灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次2.0mL，标记为空白组。

B组为模型组，灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次2.0mL，标记为模型组。

C组为泼尼松阳性组，灌胃含0.25mg/ml醋酸泼尼松的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次2.0mL，标记为泼尼松组。

D组为雷公藤多苷片阳性组，灌胃含0.25mg/ml雷公藤多苷的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次2.0mL，标记为雷公藤多苷片组。

E组为40%洗脱片段组，灌胃含20mg/mL40%片段的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次2.0mL标记为40%片段组。

F组为氯仿：甲醇=5:1片段组，灌胃含20mg/mL氯仿：甲醇=5:1片段洗脱物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次2.0mL，标记为5:1片段组。

G组为纯甲醇片段组，灌胃含20mg/mL纯甲醇片段洗脱物0.5%羧甲基纤维素钠溶液，每次2.0mL，标记为纯甲醇片段组。

每隔二十四小时灌胃一次，连续灌胃1个月。前5天连续测定各组大鼠的左右足体积，后每隔5天测一次，记录数据。1个月后停止给药，继续饲养，每隔5天测定各组大鼠的左右足体积，记录数据，

3.4动物实验结果

3.4.1黑骨藤提取物小鼠耳肿胀实验结果

经过SPSS15.0分析实验结果见表2。结果表明，给药组F肿胀率与模型组对比有显著差异，具有抗炎效果。实验结果表明给药组F乙酸乙酯片段组肿胀率与模型组对比有显著性差异，具有较好的抗炎效果。

表2小鼠耳肿胀实验(n=10）

注：标记见实验3.1.4；*：与模型组对比P<0.05

3.4.2黑骨藤抗类风湿分离片段小鼠耳肿胀实验结果

经过SPSS15.0分析实验结果如表3。实验结果表明，实验组E，M肿胀率与模型组对比有显著性差异，具有较好的抗炎效果。实验组K组肿胀率与模型组相比有极显著性差异。说明硅胶分离片段氯仿：甲醇=5：1片段组有更好的药效。

表3小鼠耳肿胀实验(n=10）

注：标记见实验3.2.4；*：与模型组对比P<0.05；**：与模型组对比P<0.01

3.4.3重复性实验结果

经过SPSS15.0分析实验结果如4。实验结果表明，实验组E，M肿胀率与模型组对比有显著性差异，具有较好的抗炎效果。实验组K组肿胀率与模型组相比有极显著性差异。说明硅胶分离片段氯仿：甲醇=5：1片段组有更好的药效。同时，和上一次实验相比，实验结果类似，说明上次实验结果可信，可重复。

表4小鼠耳肿胀实验(n=10）

注：标记见实验3.2.4；*：与模型组对比P<0.05；**：与模型组对比P<0.01

3.4.4弗氏佐剂型大鼠关节炎模型动物实验结果

3.4.4.1造模前足体积

实验结果见表5：

表5造模前各足体积(n=10）

注:组别标记见3.3.5；*：与空白组对比；P<0.05**：与空白组对比，P<0.01

用SPSS15.0对各组老鼠左右足体积进行组内方差分析，结果见表5，组内个体之间无显著性差异，可以用于造模。

3.4.4.2造模后足体积

造模后结果见表6

表6SD大鼠足肿胀实验结果(n=10）

表6续

注：

*：与空白组对比，P<0.05**：与空白组对比，P<0.01

▲：与模型组对比，P<0.05▲▲：与模型组对比，P<0.01

△：与泼尼松组对比，P<0.05△△：与泼尼松组对比，P<0.01

★：与雷公藤组对比，P<0.05★★：与雷公藤组对比，P<0.01

☆：与纯甲醇片段组对比，P<0.05☆☆：与雷公藤组对比，P<0.01

□：与40%片段组对比，P<0.05□□：与雷公藤组对比，P<0.01

◆：与5:1片段组对比，P<0.05◆◆：与雷公藤组对比，P<0.01

造模二十四小时后各组与空白组均有极显著差异，说明造模成功，可适用于下一步实验。造模后各组肿胀度都有不同程度的降低，但一直到造模后第十天泼尼松与模型组对比有显著性差异，说明药物泼尼松已经开始发挥药效，而其他药物组没有显著性差异，其他药物比泼尼松发挥药效时间要迟缓些。第二十天后其余各组与模型组有显著性差异，均表现出药效。直到第三十天趋于稳定，但是一直与空白组有极显著差异，说明各给药组不能彻底治愈足肿胀。该实验表明黑骨藤提取纯化片段有较好的抗炎抑风湿效果。

对有效组进行组间对比，甲醇组的药效最差，与模型组对比，一直没有出现极显著性差异，40%片段组的药效在第30天的时候，与5:1片段组相比，出现显著性差异(P<0.05)，说明药效不如5:1片段组。5:1片段组的药效最好，表现均优良于其他纯化片段组。

3.4.4.2停药后效果

停止给药后的记过见表7。

表7SD大鼠足肿胀实验停止给药后结果(n=10）

注：

*：与空白组对比，P<0.05；**：与空白组对比，P<0.01；

▲：与模型组对比，P<0.05；▲▲：与模型组对比，P<0.01；

△：与泼尼松组对比，P<0.05；△△：与泼尼松组对比，P<0.01；

★：与雷公藤组对比，P<0.05；★★：与雷公藤组对比，P<0；

☆：与纯甲醇片段组对比，P<0.05；☆☆：与雷公藤组对比，P<0.01；

□：与40%片段组对比，P<0.05；□□：与雷公藤组对比，P<0.01；

◆：与5:1片段组对比，P<0.05；◆◆：与雷公藤组对比，P<0.01。

由上表可知，停药后各组均有反弹，模型组中泼尼松组反弹组大也很明显。雷公藤组也有一定程度的反弹，纯甲醇反弹后，在45天的时候，已经和模型组没有显著性差异，说明该片段组反弹后已经相对于没有治疗效果，不适合后期的药物开发。40%片段组反弹后还有一定的药效，和模型组相比保持这显著性差异。在第45天的时候，和药物组泼尼松出现了显著性差异，说明该片段组反弹小于泼尼松。5:1片段组药效最后，和其他组相比均有显著性差异，在停止给药后，反弹最小。

结论：

综合上述实验，药效作用：5:1片段>40%片段组>纯甲醇片段组。停止给药后反弹表现5:1片段<40%片段组<纯甲醇片段组。药效5:1片段组表现均优于其他纯化片段组，停止给药后反弹最小，对佐剂性关节炎模型拥有更好的治疗能力。

Claims (6)

1.一种黑骨藤提取物，其特征在于：黑骨藤提取物中含有如下重量百分比的有效成分：总黄酮30.3±1.16％、总皂苷32.48±1.32％、杠柳苷1.46±0.0014％；

所述黑骨藤提取物的制备方法包括如下步骤：：

(1)取黑骨藤药材，粉碎，95％v/v以上乙醇提取，提取物干燥后得乙醇浸膏；

(2)取乙醇浸膏加水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，除去溶剂后，得乙酸乙酯浸膏；

(3)取乙酸乙酯浸膏，上硅胶柱，依次用纯氯仿、氯仿：甲醇＝10:1、氯仿：甲醇＝5:1梯度洗脱，收集氯仿：甲醇＝5:1洗脱段，除去溶剂，干燥即得黑骨藤提取物。

2.根据权利要求1所述的黑骨藤提取物，其特征在于：步骤(3)中，每一个洗脱梯度的溶剂用量为4倍柱体积。

3.根据权利要求1或2所述的黑骨藤提取物，其特征在于：所述提取物的HPLC色谱图如图1所示，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；

检测波长：221nm；

流动相：甲醇-水系统梯度洗脱，洗脱程序如下：

时间/min 甲醇/％ 水/％ 0 50 50 20 65 35 30 90 10 40 90 10 41 50 50 46 50 50

。

4.根据权利要求3所述的黑骨藤提取物，其特征在于：色谱柱柱温：25℃；流动相流速为1.0ml/min。

5.权利要求1-4任意一项所述黑骨藤提取物在制备抗炎或抗类风湿性关节炎药物中的用途。

6.一种用于抗炎或抗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于：它是由权利要求1-4任意一项所述黑骨藤提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。