CN102631390A

CN102631390A - 黑骨藤提取物的制备方法及其产品和用途

Info

Publication number: CN102631390A
Application number: CN2012101057258A
Authority: CN
Inventors: 周欣; 陈华国; 赵超; 龚小见; 赵杨
Original assignee: Guizhou Education University
Current assignee: Guizhou Education University
Priority date: 2012-04-12
Filing date: 2012-04-12
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2032-04-12
Also published as: CN102631390B

Abstract

本发明公开了一种黑骨藤提取物的制备方法及其产品和用途；该制备方法为：取黑骨藤药材，加入8-12倍重量60％-80％乙醇，在70-80℃水浴中回流提取1-3次，每次1-3h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.2-1.5，再加入1倍体积量的水，冷藏并静置12-48h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。本发明采用醇提水沉工艺对黑骨藤药材进行提取，并对醇提、水沉工艺参数分别进行了优化；所得提取物主要含有黄酮类和三萜类化合物，实验证明其对AA大鼠原发性及继发性炎症反应具有明显的治疗作用，在抗炎、消肿以及延缓AA大鼠关节炎损伤方面有较好作用；因而可将该提取物应用于类风湿关节炎药物的制备中。

Description

黑骨藤提取物的制备方法及其产品和用途

技术领域

本发明涉及一种黑骨藤提取物的制备方法及其产品和用途，属于中药技术领域。

背景技术

黑骨藤(Periploca forrestii Schltr.)是萝摩科杠柳属，西南杠柳的根茎，具有通经活络、祛淤止痛、祛风除湿的功效，是民间广泛应用于治疗闭合性软组织损伤、风湿与类风湿等疾病的民族药。黑骨藤是千百年来苗族人用以治疗风湿、类风湿疾病及颈肩臂腰腿疼痛的药中极品，“苗药三珍宝，黑骨藤、银杏、结石草”在民间广为流传，因黑骨藤使用方便，效果十分明显，所以又有“苗药三珍宝，首为黑骨藤”的美誉。黑骨藤生长于山野疏林中，分布于贵州、广西、云南、西藏等地，植物资源比较丰富。近年来对黑骨藤已有一定的研究，其主要化学成分有萜类、黄酮类、甾体类、强心苷以及挥发油等多类化合物。黑骨藤作为贵州苗族道地药材，有广泛的生物活性，近年来，已经得到省内各大药厂的充分利用和开发，以黑骨藤为主的中药复方制剂相继出现，主要表现在对风湿病、类风湿病的治疗，显示出良好的发展前景，有“黑骨藤追风活络胶囊”、“黑骨藤伸筋透骨液”、“黑骨藤伤湿帖”等。

专利申请03146799.7公开了一种黑骨藤提取物，其药物组合物及其药物用途，该申请涉及黑骨藤提取物，其提取方法，含有该提取物的药物组合物，以及该提取物用于制备治疗自身免疫性疾病或炎性疾病药物的用途。但是该申请仅采用溶剂对黑骨藤药材进行提取，提取液直接浓缩，所得提取物的成分以及药理活性不够确切。

专利申请200710188099.2公开了一种黑骨藤的多糖提取物、含有它的药物组合物及其制备方法和用途。该申请中黑骨藤多糖的主要成分为由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸以不同摩尔比组成的多种均一分子量多糖，其分子量分布为4×10³～2.7×10⁵，包括0.41×10⁴、1.06×10⁴、0.64×10⁴、0.56×10⁴、1.36×10⁴和1.54×10⁴的多糖。该发明的主要目的是提取黑骨藤中的多糖类化合物，多糖类化合物通常具有提高机体免疫能力方面的作用。虽然该申请公开了黑骨藤多糖提取物可用于制备治疗类风湿性关节炎的药物用途，但在其说明书的生物活性实验部分并没有明确验证该黑骨藤多糖提取物对类风湿性关节炎的药理活性。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种黑骨藤提取物的制备方法及其产品和用途。本发明采用醇提水沉法对黑骨藤药材进行提取，并对提取工艺进行了优化，所得提取物主要含有黄酮类和三萜类化合物，实验证明其对类风湿关节炎有良好的治疗作用。

本发明的技术方案：黑骨藤提取物的制备方法为：取黑骨藤药材，加入8-12倍重量60％-80％的乙醇，在70-80℃水浴中回流提取1-3次，每次1-3h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.2-1.5的流浸膏，再加入1倍体积量的水，冷藏并静置12-48h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

优选的制备方法为：取黑骨藤药材，粉碎，过60目筛，加入8倍重量80％乙醇，在70℃水浴中回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.5的流浸膏，再加入1倍体积量的水，冷藏并静置24h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

前述黑骨藤提取物的制备方法制备得到的黑骨藤提取物。该提取物中主要含有三萜类化合物(如α-香树脂醇乙酸酯、β-香树脂醇、熊果酸、β-香树脂醇乙酸酯、27-羟基-α-香树脂醇、3β-乙酰基-乌苏-12-烯-11-酮、3β-羟基-齐墩果-11，13(18)-二烯-28-羧酸、3-O-乙酰基齐墩果酸、α-香树脂醇、齐墩果酸、乌苏-14-烯-3-醇-1-酮、蒲公英甾醇、Jacoumaric acid、2α，3β-二羟基熊果酸)、黄酮类化合物(如山柰酚、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、proanthocyanidin A₂)、甾类化合物(如β-谷甾醇、β-胡萝卜甙、滇杠柳苷元A、杠柳甙元)、蒽醌类化合物(如大黄素、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷)、苯丙素类化合物(如东莨菪素、反式对羟基肉桂酸、咖啡酸)和神经酰胺类化合物(如1-O-β-D-葡萄糖-(2S，3S，4R，10E)-2-[(2R)-2-羟基二十四烷酰氨基]-10-十八烷-3，4-二醇、(2S，3S，4R，10E)-2-[(2R)-2-羟基二十四烷酰氨基]-10-十八烷-1，3，4-三醇)。

前述黑骨藤提取物中总黄酮类化合物的含量为20％-40％；三萜类化合物的含量为15％-40％。

前述黑骨藤提取物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途。

为了确保本发明的效果，申请人在研发过程中进行了一系列的试验研究，主要相关试验内容如下：

一、药效学研究

1.实验材料

1.1药物

1.1.1受试药物

HGT1、HGT2、HGT3、HGT4、HGT5样品，实验时用蒸馏水制成所需浓度混悬液，置于冰箱妥善保存，供实验备用。

其中HGT1的制备：同专利申请031467997中实施例2所述黑骨藤乙醇提取物的制备。

HGT2(醇提物)的制备：取黑骨藤药材粉碎成粗粉，称取500g，加10倍量80％的乙醇，回流提取3次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味，减压干燥，即得。

HGT3(水提物)的制备：取黑骨藤药材500g，加12倍量水煎煮3次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩，干燥，即得。

HGT4(醇提水沉物)的制备：取黑骨藤药材粉碎成粗粉，称取500g，加10倍量80％的乙醇，回流提取3次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味；浓缩液中缓缓加入等量新鲜热蒸馏水(70℃)，不断搅拌，使之充分混合溶解，静置48h以上，待沉淀完全，过滤至滤液澄明，减压干燥，即得。

HGT5(醚提物)的制备：取黑骨藤药材500g，加12倍量石油醚回流提取3次，每次2h，滤过，合并滤液，回收石油醚，浓缩，干燥，即得。

1.1.2阳性药

风湿骨痛胶囊由安徽精方药业有限公司提供，批号100902，口服胶囊剂型，每粒装重0.3g，每日3次，每次两粒，成人临床日用剂量(成人体重60kg计算)0.03/kg；肠溶阿司匹林片，南京第二制药厂，批号20100402，成人剂量按每日3g计算。

1.1.3佐剂：弗氏完全佐剂(美国SIGMA)。

1.2动物

Wistar大鼠，SPF级，体重180±20g，

各半，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所医学实验动物中心提供，许可证(附后)SCXK(渝)2001-0005。

1.3仪器

电子天平HZT-B500：美国康州HZ电子科技有限公司提供；紫外分光光度计：澳大利亚照生有限公司提供。

X光摄影仪：日本富士FCR.XG5000摄影机。

病理切片分析仪：OLYMPUS-BX50显微镜、HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统。

软尺(药理教研室自制)。

1.4实验场地

贵阳中医学院基础医学功能实验室：室内温度25-27℃，相对湿度50-70％。

2.实验方法

2.1动物分组及阳性药取220只Wistar大鼠，随机分为22组，雌雄各半，分别为空白对照组、模型对照组、阳性药对照组(风湿骨痛胶囊0.21g/kg体重，即为成人日用剂量的7倍；阿司匹林组为0.35g/kg体重，为成人剂量的7倍)。

HGT1样品高、中、低剂量组分别为0.2190g/kg体重、0.1095g/kg体重、0.0547g/kg体重；HGT2样品高、中、低剂量组分别为0.1960g/kg体重、0.0980g/kg体重、0.0490g/kg体重；HGT3样品高、中、低剂量组分别为0.3284g/kg体重、0.1642g/kg体重、0.0821g/kg体重；HGT4样品高、中、低剂量组分别为0.0168g/kg体重、0.0084g/kg体重、0.0042g/kg体重；HGT5样品高、中、低剂量组分别为0.074g/kg体重、0.037g/kg体重、0.018g/kg体重。给药途径为ig灌胃，容量均为10ml/kg体重。按性别分笼喂养。

2.2AA大鼠造模方法

除空白对照组外，其余各组大鼠均以佐剂0.1ml注射于左足跖皮下制做AA大鼠模型。

2.3观察指标

2.3.1观察AA大鼠原发性(急性)炎症期反应：于造膜后6h、第1d、第2d、第3d、第4d、第5d、第6d每天上午8:00用软尺由专人测量各大鼠左足跖周长(mm)。

2.3.2观察AA大鼠继发性(免疫性)炎症期反应：于造模后第8d开始采用隔日分别测量各AA大鼠右踝关节周长。

2.3.3记录各鼠体重(以此调整ig给药剂量及观察动物增长发育情况)及空白对照组大鼠踝关节周长，以此作为正常对照，观察药物对AA大鼠体重变化的影响。

2.3.4实验第24d，各组大鼠禁食不禁饮12h，分别称各组大鼠体重后，股静脉放血处死动物；剪取胸腺、脾脏、肾上腺分别称重，计算脏器系数。

2.3.5剪取左下肢进行X光影像摄影，观察各鼠踝关节影像变化；剥去左踝关节皮肤后，放入盛有生理盐水5ml试管内，静置12h，离心，取上清液，置入波长278nm处测量踝关节炎症物质PGE2(前列腺素E2)含量，观察药物对PGE2释放影响。

2.3.6将各鼠右踝关节分别放入10％甲醛溶液10ml内固定，经过脱钙、蜡埋等步骤进行踝关节病理切片、观察踝关节病理组织形态变化(专业人员进行此项检验，图片参见附图5-图9)。

3.实验结果

3.1HGT样品对AA大鼠原发性关节炎肿胀的影响

以佐剂注射于大鼠足跖皮下制做AA大鼠，经佐剂注射大鼠足跖皮下后，其大鼠踝关节周长与致炎前比较明显增加，P＜0.05，出现红、肿、热、痛关节炎症状，表明AA大鼠造模成功。造模后6h至6d的观察结果表明样品HGT1高剂量在第5、6天有一定抑制关节炎肿胀的作用(与模型组比较P＜0.05)，样品HGT2低剂量在第3、5、6天有一定作用(与模型组比较P＜0.05)，样品HGT3高、低剂量在第5、6天有一定作用(与模型组比较P＜0.05)，样品HGT4的各剂量组在整个过程中均显示出抑制AA大鼠关节炎肿胀的作用(与模型组比较P＜0.05)，样品HGT5高剂量在第5、6天显现出抑制关节肿胀的作用(与模型组比较P＜0.05)。结合整个原发阶段中AA大鼠关节肿胀的改变以及药物作用的连续性，样品HGT4、HGT5具有稳定的减轻AA大鼠关节肿胀的作用。其结果见表1：

表1HGT对AA大鼠原发性关节炎肿胀的影响(

n＝10)

3.2HGT样品对AA大鼠继发性反应影响

3.2.1造模后第8d-24d为AA大鼠继发性反应的阶段，会出现大鼠注射佐剂对侧关节的肿胀。自第8天开始，每2天测量大鼠右侧关节，观察样品对继发性关节炎关节肿胀的影响。结果表明样品HGT2低剂量在一段时间内(8-20天)有一定作用(与模型组比较P＜0.05)，但在实验末期作用不明显(与模型组比较P＞0.05)，样品HGT4的各剂量组在整个过程中均显示出抑制AA大鼠关节炎肿胀的作用(与模型组比较P＜0.05)。结合整个继发性关节炎肿胀阶段中AA大鼠关节肿胀的改变以及药物作用的连续性，样品HGT4具有稳定的减轻AA大鼠继发性关节肿胀的作用，结果见表2：

表2HGT对AA大鼠继发性右踝关节肿胀的影响(n＝10)

3.2.2HGT对AA大鼠造模后体重的影响实验期间，间断检测AA大鼠体重的变化情况，结果表明，HGT样品对大鼠体重的增长没有明显影响，模型组以及HGT样品治疗组与空白组比较没有明显差异(P＞0.05)，结果见表3。

表3HGT对AA大鼠造模后体重的影响(g)(n＝10)

3.2.3HGT样品对AA大鼠脏器系数及关节浸出液中PGE2的影响

实验结束，处死大鼠，取大鼠胸腺、脾脏、双侧肾上腺，测定各组大鼠胸腺、脾脏、肾上腺脏器系数。结果表明，各组间比较无明显差异。表明受试药物对机体免疫功能无明显影响，提示作用机制可能与免疫抑制无关。紫外分光光度计测得踝关节浸泡液内PGE2，结果表明HGT3高、低剂量组，HGT4样品组大鼠关节浸出液中PGE2明显减少，表明HGT3、HGT4可以抑制炎症性物质PEG2释放。结果见表4：

表4HGT对AA大鼠免疫器官系数(g/100g体重)及关节浸出液中PGE2的影响(

n＝10)

注：*与模型组比较P＜0.05。

3.2.4X光影像检查结果见X光影像诊断报告单，可见HGT4样品组AA大鼠踝关节关节面较光滑，关节间隙清晰，未见明显狭窄；骨干骨质结构未见异常改变，较模型组改变为轻。

3.2.5病理组织形态学检查结果见病理组织形态学检查报告单(参见附图5-图9)，可见HGT4样品组在滑膜细胞增生、炎细胞浸润以及血管增生方面有明显抑制作用，与模型组比较有明显改善。

4.结论

4.1AA大鼠造模成功

4.2结合大鼠足肿胀以及X片与病理切片结果，显示HGT4样品对AA大鼠原发性及继发性炎症反应具有明显的治疗作用，在抗炎、消肿以及延缓AA大鼠关节炎损伤方面有较好作用。

综上，本发明选定HGT4的制备方法作为黑骨藤的提取工艺路线。

二、黑骨藤的提取工艺优化

结合药理实验数据，醇提水沉物有很好的抗类风湿关节炎活性，同时考虑到加热回流法提取效率高，并且操作简单易行，适合工业生产，是一种值得推广的药材提取方法，因此实验采用加热回流提取。并且由于水提后续样品处理较麻烦，且提取杂质较多，因此实验采用乙醇提取。

由于实验采用醇提水沉工艺，因此实验分别对醇提工艺和水沉工艺进行考察。以总黄酮和总皂苷相对含量(简称相对含量)为考察指标，对影响提取效率的各因素(药材粉碎粒度、乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间、提取温度)分别进行单因素考察，并且在单因素考察基础上，选取合适的因素水平运用响应面法设计试验，得到最佳的醇提工艺参数；进而在此基础上对水沉工艺进行优化。

相对含量＝浸膏中总黄酮百分含量+浸膏中总皂苷百分含量

1、醇提工艺研究

1.1含量测定方法

1)总皂苷含量测定方法

精密吸取适量对照品溶液和供试品溶液于具塞试管中，显色，以试剂为空白做参比。在550nm波长处测其吸光度，按标准曲线回归方程计算总皂苷含量。

2)总黄酮含量测定方法

精密吸取对照品溶液和供试品溶液适量于具塞试管中，显色，以试剂作空白，在505nm处测其吸光度，按标准曲线回归方程计算总黄酮含量。

1.2单因素考察

1)药材粒度的考察

取黑骨藤药材粉末10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入12倍量70％乙醇，回流提取2次，每次2h，滤过，精密吸取上清液25mL，蒸干溶剂，残渣加70％乙醇使溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，测其吸光度，以总黄酮含量、总皂苷含量以及得膏率为指标进行优选。结果如表5所示：

表5药材粒度的考察

药材粒度	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)
				过10目筛	1.91	0.84	10.69
过20目筛	3.35	1.15	13.41
				过40目筛	4.91	1.70	16.97
过60目筛	6.16	2.07	16.68

2)溶剂浓度考察

精密称定黑骨藤药材粉末10g(过60目筛)，置具塞锥形瓶中，加入12倍量不同浓度乙醇，回流提取2次，每次2h，滤过，精密吸取上清液25mL，蒸干溶剂，残渣加70％乙醇使溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，测其吸光度，以总黄酮含量、总皂苷含量以及得膏率为指标进行优选。由表6可知，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮和总皂苷的含量先增加后降低，乙醇体积分数在70％时，其含量达到最大值。这是因为乙醇体积分数过低时黄酮类和皂苷类物质不能很好地溶出，而体积分数过高又会将杂质等一起溶出。

表6溶剂浓度考察

溶剂浓度	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)
				50％	6.19	1.27	14.34
60％	8.81	2.82	17.11
				70％	10.38	4.03	19.73
80％	10.15	3.99	16.62

90％

10.00

3.75

19.75

3)溶剂用量的考察

取黑骨藤药材粉末10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入适量70％乙醇，回流提取2次，每次2h，滤过，精密吸取上清液25mL，蒸干溶剂，残渣加70％乙醇使溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，备用。以总黄酮含量、总皂苷含量以及得膏率为指标对溶剂用量进行优选。随着提取溶剂量的增加，总黄酮含量和总皂苷含量先增加，但是溶剂用量达12倍重量时，这两大类化合物的含量达到最大值后又减少。提取溶剂量越大，细胞内外的浓度差越大，传质推动力也越大，内扩散的速度越大，越有利于绿原酸的溶出。当提取溶剂量超过12倍重量时，平衡被打破，总皂苷含量又减少，因此实验过程中应严格控制溶剂用量。结果如表7所示：

表7溶剂用量考察

溶剂用量	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)
				8倍重量	6.76	4.18	20.67
10倍重量	6.96	4.22	23.14
				12倍重量	8.09	4.31	25.04
15倍重量	8.21	4.13	24.91
				20倍重量	8.38	4.02	25.29

4)提取时间考察

取黑骨藤药材粉末10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入12倍量70％乙醇，回流提取2次，滤过，精密吸取上清液25mL，蒸干溶剂，残渣加70％乙醇使溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，备用。以总黄酮、总皂苷含量即提取率进行优选。结果如表8所示：随着提取时间的增加，总黄酮和总皂苷含量在2h达到最大值，后期出现有所下降的趋势，主要是因为随着时间的增加，可溶性杂质成分溶出的就越多，使得提取液粘度增大，在后期操作中有所损耗。

表8提取时间的考察

提取时间(h)	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)
				1	7.39	4.00	23.43
1.5	7.65	4.04	23.63
				2	7.79	4.38	25.77
2.5	7.61	4.41	26.07
				3	7.50	3.89	24.75

5)提取温度的考察

取黑骨藤药材粉末10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入12倍量70％乙醇，在不同温度下回流提取2次，每次2h，滤过，精密吸取上清液25mL，蒸干溶剂，残渣加70％乙醇使溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，备用。结果如表9所示，温度为80℃时，提取效果最佳。

表9提取温度考察

提取温度(℃)	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)
				60	7.11	3.23	15.94
70	7.20	3.35	22.34
				80	7.96	4.37	26.14
90	7.54	3.46	22.27
				煮沸	7.86	4.03	23.30

6)提取次数

取黑骨藤药材粉末10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入12倍量70％乙醇，在70℃水浴下分别回流提取1次、2次、3次，每次2h，滤过，精密吸取上清液25mL，蒸干溶剂，残渣加70％乙醇使溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，备用。结果如表10所示：可以看出，提取两次与提取一次相比，总黄酮含量与总皂苷含量明显增多，而提取三次相比提取两次总黄酮含量与总皂苷含量增加不明显，因此实验采用提取次数为2次。

表10提取次数考察

提取次数(次)	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)
				1	8.28	4.22	27.21
2	10.85	4.54	32.14
				3	11.05	4.57	33.71

1.3响应面法优化醇提工艺

通过单因素试验确定响应面试验设计的因素和水平，即选取溶剂浓度(A)、溶剂用量(B)、提取时间(C)和提取温度(D)为因素，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，以各试验单因素最优取值点为中心，上下区域各取1个水平值作为响应面试验设计水平，以总黄酮含量、总皂苷含量和相对含量为评价指标，设计4因素3水平共29个试验点的响应面分析，零点试验重复5次，用以估计误差。中心组合试验方案如表12所示。并采用Design-Expert统计软件对实验结果进行响应面回归分析。响应面因素水平表见表11；响应面分析试验设计及结果如表12。

表11响应面因素水平表

表12响应面分析试验设计及结果

试验号	A	B	C	D	总黄酮含量％	总皂苷含量％	相对含量％
								1	0.00	0.00	-1.00	-1.00	9.18	3.06	49.92
2	0.00	0.00	-1.00	-1.00	9.16	3.62	45.9
								3	0.00	-1.00	0.00	1.00	9.28	4.05	42.09
4	0.00	0.00	0.00	0.00	8.41	2.87	55.39
								5	0.00	-1.00	1.00	0.00	8.92	3.26	50.75
6	0.00	0.00	1.00	-1.00	8.56	2.42	38.73
								7	-1.00	0.00	0.00	-1.00	10.6	3.05	48.75
8	-1.00	1.00	0.00	0.00	9.95	4.07	42.48
								9	0.00	0.00	0.00	0.00	8.75	3.93	36.83
10	-1.00	0.00	-1.00	0.00	8.46	3.11	48.25
								11	1.00	1.00	0.00	0.00	9.07	3.93	44.86
12	0.00	0.00	1.00	1.00	8.32	2.63	41.31
								13	1.00	0.00	-1.00	0.00	6.77	2.91	37.31
14	0.00	-1.00	-1.00	0.00	7.38	3.42	27.75
								15	0.00	1.00	1.00	0.00	7.00	1.8	50.29
16	-1.00	-1.00	0.00	0.00	10.33	3.78	45.59
								17	1.00	-1.00	0.00	0.00	9.52	3.86	48.4
18	0.00	1.00	0.00	-1.00	8.81	3.63	41.7
								19	1.00	0.00	0.00	-1.00	9.89	3.63	38.27
20	0.00	0.00	0.00	0.00	10.31	3.65	40.51
								21	0.00	0.00	0.00	0.00	7.6	3.57	40
22	1.00	0.00	1.00	0.00	9.29	3.38	41.84
								23	-1.00	0.00	0.00	1.00	8.2	3.18	51.32
24	1.00	0.00	0.00	1.00	8.94	3.05	32.27
								25	0.00	1.00	0.00	1.00	7.49	3.78	39.64
26	-1.00	0.00	1.00	0.00	8.44	3.78	50.94
								27	0.00	0.00	0.00	0.00	10.36	4.17	44.87
28	0.00	1.00	-1.00	0.00	8.81	3.21	34.74
								29	0.00	-1.00	0.00	-1.00	8.21	2.9	41.43

1.4响应面法试验结果分析

1.4.1影响相对含量提取工艺参数的优化

1)建立模型方程与显著性检验

将所得试验数据进行多元回归拟合，得到相对含量与各因素变量的二次回归方程模型为：相对含量＝44.44+4.43*A-2.78*B+0.36*C-0.63*D-3.21*A*B+2.36*A*C-2.81*A*D+1.54*B*C+3.77*B*D+0.51*C*D-3.50*A²-1.63*B²-3.43*C²+5.51*D²

式中：溶剂浓度(A)、溶剂用量(B)、提取时间(C)和提取温度(D)在设计中均经量纲线性编码处理，故方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。

为了检验方程的有效性，对相对含量的数学模型进行方差分析，并对各因子的偏回归系数进行检验，结果见表13。一次项中的回归系数极显著，说明溶剂浓度对总黄酮和总皂苷相对含量有极显著影响；二次项中提取温度的偏回归系数达到显著水平。回归方差分析显著性检验结果表明，该模型显著性P＜0.01；且失拟项不显著，说明该方程对试验拟合度较好，表明残差由随机误差产生。应用此方程可以预测黑骨藤总黄酮和总皂苷相对含量及优化乙醇回流提取黑骨藤总黄酮和总皂苷的工艺。

将表中的试验数据(表12)对此方程所代表的面进行分析，可以推测出优化条件在试验中所覆盖的区域，或是指明在哪些方向上再进行试验可得到更好的结果。

由方差分析(见表13)，比较各因素的均方值(均方值越大表明对试验指标的影响越大)，影响总皂苷和总黄酮相对含量的因素的主次顺序为：A＞B＞D＞C，即溶剂浓度＞溶剂用量＞提取温度＞提取时间，其中乙醇浓度达到极显著程度，乙醇倍量有显著性。模型的复相关系数为0.9422，说明该模型能解释94.22％响应值的变化，即该模型与实际试验拟合良好，试验误差小。

表13方差分析

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	Pr＞F
						模型	943.93	14	67.42	5.34	0.0017**
A	235.68	1	235.68	18.66	0.0007***
						B	92.57	1	92.57	7.33	0.0170*
C	1.53	1	1.53	0.12	0.7333
						D	4.83	1	4.83	0.38	0.5464
AB	41.22	1	41.22	3.26	0.0924
						AC	22.28	1	22.28	1.76	0.2054
AD	31.7	1	31.7	2.51	0.1355
						BC	9.42	1	9.42	0.75	0.4022
BD	56.78	1	56.78	4.5	0.0523
						CD	1.04	1	1.04	0.082	0.7783
A^2	79.29	1	79.29	6.28	0.0252*
						B^2	17.34	1	17.34	1.37	0.2609
C^2	76.26	1	76.26	6.04	0.0277*
						D^2	196.75	1	196.75	15.58	0.0015**
残差	176.82	14	12.63
						失拟项	137.45	10	13.74	1.4	0.4002
净误差	39.37	4	9.84
						总离差	1120.74	28

注***为差异极显著(P＜0.001)；**为差异高度显著(P＜0.01)：*为差异显著(P＜0.05)。

2)总皂苷和总黄酮响应面分析与最优工艺条件的确定

响应面图是根据回归方程绘制的，是响应值在各试验因素交互作用下得到的结果构成的一个三维空间曲面，可以预测和检验变量的响应值以及确定变量相互作用的关系。

根据回归方程，做出响应面，考察拟合响应曲面的形状，分析当溶剂浓度、溶剂用量、提取时间和提取温度其中有两个因素固定时，另外两个因素及其交互作用对总黄酮和总皂苷相对含量影响的响应曲面图和等高线图，结果见图1-图4；可以看出，一定范围内，提取时间和溶剂浓度，提取时间和溶剂倍量的交互作用较为显著，其它交互作用均没有显著性。并且随着提取时间和溶剂浓度的增加，相对含量先增大后减小；随着提取时间和溶剂倍量的增加，相对含量也是先增大后减小。根据动力学理论，时间的延长有利于总黄酮和总皂苷的充分扩散析出，同时溶剂浓度的增加使得分子解附和扩散运动速率加快，从而增加了总黄酮和总皂苷的析出速率及其得率，但是当溶剂浓度和时间增加到一定程度时，也增加了杂质的溶出以及得率，因此总黄酮和总皂苷的相对含量也就有所减少。因此在实际生产中应严格控制提取时间、溶剂浓度以及溶剂倍量以获得较高的总黄酮和总皂苷的得率。

二次多项回归模型方程中二次项系数均为负值，说明响应曲面开口向下(从图1和图3中的响应面亦可看出)，有极大值。提取的最优条件为乙醇浓度77.24％，乙醇倍量8.58倍，提取时间1.90h，提取温度71.14℃。在此条件下，总黄酮和总皂苷相对含量预测值为57.43％。

1.5最优醇提工艺的确定

由于本专利技术主要是对有效部位的研究，有效部位，是指当一味中药或复方中药提取物中的一类或几类化学成分的含量达到总提取物的50％以上。因此选择醇提工艺主要以相对含量为指标进行优化，并且以此优化参数得到的总黄酮和总皂苷含量与其预测值相比相差不大，且由得膏率数据分析可知，所提取出的杂质较少。因此实验最终选取的优化参数为：药材过60目筛，乙醇浓度77.24％，乙醇倍量8.58倍，提取时间为1.90h，提取温度为71.14℃，提取次数为2次。

2、水沉工艺研究

醇提水沉法(醇水法)系指先以适宜浓度的乙醇提取药材成分，将提取液回收乙醇后，加适量水搅匀，静置冷藏一定时间，沉淀完全后滤除的方法。药材用乙醇为溶剂提取，可避免淀粉、蛋白质、黏液质等成分的浸出，加水处理后可除去醇提液中树脂、脂溶性色素等杂质，因此试验对水沉工艺也进行了考察。

2.1浓缩相对密度考察

分别取黑骨藤药材(过60目筛)10g，按照优选好的工艺参数进行提取，适当浓缩(g/ml)，冷藏静置48h，在5000转/min时离心5min，沉淀继续用水洗涤两次，每次10ml，合并上清液，溶剂浓缩至干，用70％乙醇定容至10ml容量瓶中，作为供试品溶液，测定吸光度，并计算总黄酮、总皂苷及其总黄酮和总皂苷的相对含量。并主要以相对含量为指标对相对密度进行优选。由表14可知相对密度在1.5时，相对含量最大，因此选取相对密度为1.5。

表14相对密度考察

相对密度	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)	相对含量(％)
					2	5.04	1.25	12.26	51.27
1.5	5.01	1.57	11.86	55.56
					1.25	4.97	1.56	12.24	53.29
1	4.83	1.52	12.08	52.57
					0.5	5.12	1.25	12.89	49.48
0.25	4.98	1.44	13.47	47.62

注：

2.2加水量考察

分别取黑骨藤药材(过60目筛)10g，按照优选好的工艺参数进行提取，浓缩至每毫升相当于1.5g生药材，按照下列表格所示，加入一定量水，冷藏静置48h，在5000转/min时离心5min，沉淀继续用水洗涤两次，每次10ml，合并上清液，溶剂浓缩至干，用70％乙醇定容至10ml容量瓶中，作为供试品溶液，测定吸光度，并计算总黄酮、总皂苷及其总黄酮和总皂苷的相对含量，见表15。并主要以相对含量为指标对加水量进行优选。由表中数据可知加入1倍体积量水时，相对含量最大，因此选取加水量为1倍体积量。

表15加水倍量考察

加水倍量	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)	相对含量(％)
					0.5	5.20	1.24	12.08	53.25
1	5.27	1.51	12.34	54.99
					2	5.44	1.44	13.47	51.07
3	5.39	1.41	13.38	51.66

2.3水沉时间考察

分别取黑骨藤药材(过60目筛)10g，按照优选好的工艺参数进行提取，浓缩至每毫升相当于1.5g药材，后加入1倍体积量水，分别冷藏静置24h、36h和48h，在5000转/min时离心5min，沉淀继续用水洗涤两次，每次10ml，合并上清液，溶剂浓缩至干，用70％乙醇定容至10ml容量瓶中，作为供试品溶液，测定吸光度，并计算总黄酮、总皂苷及其总黄酮和总皂苷的相对含量，见表16。并主要以相对含量为指标对水沉时间进行优选。由表中数据可知静置24h时，相对含量最大，因此选取水沉时间为24h。

表16水沉时间考察

水沉时间(h)	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)	相对含量(％)
					24	5.45	1.45	12.89	53.54
36	5.11	1.25	12.03	52.90
					48	4.91	1.25	12.29	50.14

2.4水沉工艺的确定及验证试验

1)水沉工艺的确定

根据以上单因素考察，最终选取水沉工艺为：将提取液浓缩至相对密度为1.5，后加入1倍体积量的水，冷藏并静置24h。

2)验证性试验

分别取黑骨藤药材(过60目筛)10g，加入8.58倍重量77.24％的乙醇，在71.14℃水浴中，提取2次，每次1.90h，过滤，合并滤液，并浓缩至每毫升相当于1.5g药材，后加入1倍体积量水，冷藏静置24h后，在5000转/min时离心5min，沉淀继续用水洗涤两次，每次10ml，合并上清液，溶剂浓缩至干，用70％乙醇定容至10ml容量瓶中，作为供试品溶液，测定吸光度，并计算总黄酮、总皂苷及其总黄酮和总皂苷的相对含量，总皂苷平均含量为1.39％；总黄酮平均含量为5.28％；相对含量平均值为：53.75％。结果见表17。

表17水沉工艺验证试验

编号	总黄酮含量(％)	总皂苷含量(％)	得膏率(％)	相对含量(％)
					1	5.23	1.35	12.34	53.32
2	5.31	1.43	12.42	54.27
					3	5.29	1.39	12.45	53.65

3、最终醇提水沉工艺

醇提工艺：乙醇浓度为77.24％，乙醇倍量为8.58倍，提取温度71.14℃，提取次数2次，提取时间1.90h。

水沉工艺：将提取液浓缩至相对密度为1.5，后加入1倍体积量的水，冷藏并静置24h。

三、黑骨藤提取物中化学成分的分离与鉴定

按照本发明所优选出的醇提水沉工艺进行提取：黑骨藤药材粉碎，过60目筛，加入8倍重量75％-80％乙醇，在70℃水浴中回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.5，再加入1倍体积量的水，冷藏并静置24h，取上清液，回收乙醇，浓缩。

将所得提取物进行分离纯化，并进行结构鉴定，得到以下化合物：三萜类：α-香树脂醇乙酸酯、β-香树脂醇、27-羟基-α-香树脂醇、3β-乙酰基-乌苏-12-烯-11-酮、熊果酸、β-香树脂醇乙酸酯、3β-羟基-齐墩果-11，13(18)-二烯-28-羧酸、3-O-乙酰基齐墩果酸、α-香树脂醇、齐墩果酸、乌苏-14-烯-3-醇-1-酮、蒲公英甾醇、Jacoumaric acid、2α，3β-二羟基熊果酸；黄酮类：山柰酚、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、proanthocyanidin A₂、山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷；甾类：β-谷甾醇、β-胡萝卜甙、滇杠柳苷元A、杠柳甙元；蒽醌类：大黄素、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷；苯丙素类：东莨菪素、反式对羟基肉桂酸、咖啡酸；神经酰胺类：1-O-β-D-葡萄糖-(2S，3S，4R，10E)-2-[(2R)-2-羟基二十四烷酰氨基]-10-十八烷-3，4-二醇、(2S，3S,4R，10E)-2-[(2R)-2-羟基二十四烷酰氨基]-10-十八烷-1，3，4-三醇。

与现有技术相比，本发明采用醇提水沉工艺对黑骨藤药材进行提取，并对醇提工艺和水沉工艺分别进行试验考察，得到了最佳的醇提以及水沉工艺参数；所得提取物主要含有黄酮类和三萜类化合物，药效学实验证明其对AA大鼠原发性及继发性炎症反应具有明显的治疗作用，在抗炎、消肿以及延缓AA大鼠关节炎损伤方面有较好作用；因而可将该黑骨藤提取物应用于类风湿关节炎药物的制备中。且本发明所采用的加热回流法提取效率高，操作简单易行，适合工业化生产，值得推广应用。

附图说明

图1是提取时间(C)和溶剂浓度(A)对相对含量交互影响的响应面图；

图2是提取时间(C)和溶剂浓度(A)对相对含量交互影响的等高线图；

图3是提取时间(C)和溶剂用量(B)对相对含量交互影响的响应面图；

图4是提取时间(C)和溶剂用量(B)对相对含量交互影响的等高线图；

图5是HGT4样品组的病理组织形态学检查结果图；

图6是阿司匹林组的病理组织形态学检查结果图；

图7是风湿骨痛组的病理组织形态学检查结果图；

图8是空白组的病理组织形态学检查结果图；

图9是模型组的病理组织形态学检查结果图。

具体实施方式

本发明的实施例1：黑骨藤提取物的制备

取黑骨藤药材，粉碎，过60目筛，加入8倍重量80％的乙醇，在70℃水浴中回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.5的流浸膏，再加入1倍体积量(即与流浸膏同等体积)的水，冷藏并静置24h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

本发明的实施例2：黑骨藤提取物的制备

取黑骨藤药材，粉碎，过60目筛，加入9倍重量75％的乙醇，在70℃水浴中回流提取2次，每次1.9h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.4的流浸膏，再加入1倍体积量(即与流浸膏同等体积)的水，冷藏并静置36h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

本发明的实施例3：黑骨藤提取物的制备

取黑骨藤药材，粉碎，过40目筛，加入10倍重量70％乙醇，在75℃水浴中回流提取3次，每次1h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.3的流浸膏，再加入1倍体积量的水，冷藏并静置48h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

本发明的实施例4：黑骨藤提取物的制备

取黑骨藤药材，加入12倍重量60％乙醇，在80℃水浴中回流提取3h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.2的流浸膏，再加入1倍体积量的水，冷藏并静置12h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

本发明的实施例5：黑骨藤提取物单方制剂

取实施例1-4中制得的黑骨藤提取物250g，加入250g PEG2000，用胶体磨混匀，压制成1000粒软胶囊。该制剂口服，每次4粒，一日3次，用于治疗类风湿关节炎。

本发明的实施例6：含黑骨藤提取物的药物组合物

按下述配比称取原料：党参15g、黄芩10g、干姜9g、黄连6g、炙甘草6g、大枣5枚；按传统汤剂制备方法制成汤液，再加入实施例1-4中制得的黑骨藤提取物5g，混匀，每日1剂，头煎加水500mL，煎取药液200mL，二煎加水300mL，煎取药液100mL，两煎相混，分多次少量温服，一般服用7～28剂。该制剂可用于类风湿关节炎的治疗。

Claims

1.一种黑骨藤提取物的制备方法，其特征在于：取黑骨藤药材，加入8-12倍重量60％-80％乙醇，在70-80℃水浴中回流提取1-3次，每次1-3h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.2-1.5的流浸膏，再加入1倍体积量的水，冷藏并静置12-48h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

2.根据权利要求1所述黑骨藤提取物的制备方法，其特征在于：取黑骨藤药材，粉碎，过60目筛，加入8倍重量80％乙醇，在70℃水浴中回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.5的流浸膏，再加入1倍体积量的水，冷藏并静置24h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

3.如权利要求1或2所述黑骨藤提取物的制备方法制备得到的黑骨藤提取物。

4.根据权利要求3所述的黑骨藤提取物，其特征在于：提取物中含有三萜类化合物、黄酮类化合物、甾类化合物、蒽醌类化合物、苯丙素类化合物和神经酰胺类化合物。

5.根据权利要求4所述的黑骨藤提取物，其特征在于：所述三萜类化合物包括α-香树脂醇乙酸酯、β-香树脂醇、熊果酸、β-香树脂醇乙酸酯；所述黄酮类化合物包括山柰酚、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

6.根据权利要求4或5所述的黑骨藤提取物，其特征在于：提取物中总黄酮类化合物的含量为20％-40％。

7.根据权利要求4或5所述的黑骨藤提取物，其特征在于：提取物中三萜类化合物的含量为15％-40％。

8.如权利要求3-7中任一项所述黑骨藤提取物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途。