CN115515614A

CN115515614A - 用于改进关节健康和治疗关节炎的包含山姜属和其它植物提取物的组合物

Info

Publication number: CN115515614A
Application number: CN202180025755.5A
Authority: CN
Inventors: M·义马; P·焦; T·霍姆; M·洪; A·奥尼尔; Q·家
Original assignee: Unigen Inc
Current assignee: Unigen Inc
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2021-02-07
Publication date: 2022-12-23
Anticipated expiration: 2041-02-07
Also published as: CN115515614B; EP4100034A1

Abstract

本文公开了来自山姜属、木兰属、地肤属和胡椒属/胡椒的药用植物提取物及其生物活性剂，它们组合或单独地用于调节软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和关节炎表型，其导致软骨细胞的增强的合成代谢功能、细胞外基质和关节软骨的增加的更新/重建/再生以及骨关节炎和类风湿性关节炎的改进的表型。

Description

用于改进关节健康和治疗关节炎的包含山姜属和其它植物提取物的组合物

本申请是PCT申请，其基于并要求均题为“Compositions and Methods forRegulating Homeostasis of Chondrocytes, Extracellular Matrix, ArticularCartilage, and Phenotype of Arthritis”的2021年2月7日提交的美国发明申请序列号17/169490和2020年2月6日提交的美国临时专利申请序列号62970792的优先权，并且所有这些专利都是共同拥有的，并通过引用以其整体并入本文。

背景技术

骨关节炎(OA)是多因素疾病，其影响整个关节结构，并且特征在于软骨破坏和损失、软组织退化、包括软骨下增厚和骨赘形成的局部骨肥大、不同程度的滑膜炎和关节囊增厚(Loeser，2013)。

多年来，对于解决症状(尤其是疼痛途径)，已经取得进展，但对于解决驱动OA的发展和进展的关键有害因素并没有取得进展(Wenham和Conaghan，2013)。来自增强来源的证据的汇集表明骨关节炎不再被认为是预期由于老化而发生的“磨损和撕裂”退行性疾病，或不再被认为是关节炎的“非炎性”形式。例如，使用现代成像技术(例如MRI)，滑膜炎症已经显示与OA的严重性和进展的高流行程度相关，并且被认为是疼痛的主要原因(Pickering等人，2005；Roemer等人，2011)。也有报道称，免疫学变化(例如滑膜中B细胞的浸润和T细胞的活化)不仅参与类风湿性关节炎(RA)的发病机理，而且参与OA的发病机理(Qin等人，2007；Sakkas和Platsoucas，2007)。

大量报道已显示，明确地挑选出OA的病因学是难懂的，这指示在疾病的开始和进展中涉及机械和分子事件的多种因素的缠绕的存在。精确地查明疾病起源时间和位置是麻烦的，因为患者经常在已经发生显著结构损伤之后寻求帮助；然而，认为滑膜炎、软骨和半月板退化之间的强相关性已被描述为恶性循环永存OA的一部分(Roemer等人，2013)。

尽管软骨破坏是定义骨关节炎的主要事件，但是II型胶原的退化是基本事件，其被认为是与炎症相关的骨关节炎疾病的不可逆进展。关节软骨的进行性退化是OA的标志。关节软骨是无血管的、非神经支配的组织，由致密的细胞外基质(ECM)组成，且具有稀疏分布的高度特异化的细胞，称为软骨细胞。软骨细胞来源于间充质干细胞，并占关节软骨总体积的约2% (Alford和Cole，2005)。软骨细胞是代谢活性细胞，其在主要由II型胶原和聚集蛋白聚糖(aggrecan)组成的ECM的发展、维持和修复中起关键作用。胶原是ECM中最丰富的结构大分子，其中II型胶原占组织中胶原的90%-95%，并形成与蛋白聚糖聚集体缠绕的纤维。蛋白聚糖是高度糖基化的蛋白质单体，代表ECM中第二大组的大分子，并且占高达10%-15%。蛋白聚糖由共价附着有一个或多个线性糖胺聚糖(GAG)链的蛋白质核心组成。这些结构为关节软骨提供粘弹性性质和对压迫力的抵抗力。

细胞外基质(ECM)的稳态和完整性是关节软骨的正常功能的基础以维持健康关节。若干机械、生物化学和微环境因素可以调节关节软骨的ECM内的软骨细胞的代谢活性。因此，软骨细胞感知的不同合成代谢信号将导致软骨ECM的产生、组构和完整性维持。由于在关节的受影响结构中软骨细胞产生的基质金属蛋白酶(MMP)和蛋白聚糖酶增加所致的异常和分解代谢信号可以将ECM的稳态转移至分解代谢侧并导致ECM降解。这是骨关节炎和类风湿性关节炎的主要特征。已知促炎细胞因子(例如TNF-α、IL-1β和IL-6)通过级联分解代谢事件在关节软骨中的软骨基质降解中起重要作用，所述分解代谢事件导致刺激聚集蛋白聚糖酶和基质金属蛋白酶(MMP)分泌(Kapoor等人，2011)。除了破坏软骨基质稳态和完整性之外，这些共同的分解代谢介质降低软骨细胞对周围合成代谢信号的响应和敏感性，进一步使平衡向分解代谢软骨退化移动，而不是向ECM和软骨的合成代谢重建和更新移动。结果是，具有逆转从分解代谢到合成代谢过程的方向的能力的天然组合物可以用作疾病修饰剂，并具有有益的作用，例如修饰、减缓或逆转关节炎的进展。

目前OA的管理是不充分的，因为缺乏证明在阻碍疾病病因和进展中有效的主要疗法。目前主要集中于减少疾病症状(主要是相关疼痛)的药物方法将仅掩盖实际病因，而不是平衡分解代谢-合成代谢稳态，导致对软骨完整性和关节结构的不可逆损伤。虽然皮质类固醇(透明质酸)的关节内注射和口服或局部非类固醇抗炎药(NTHE)最常用于缓解OA患者的疼痛和僵硬，但是葡糖胺和软骨素也已经显示对于疼痛延迟但可测量结果和在更严重的OA阶段改进的功能。事实上，以前，国际骨关节炎研究学会(OARSI)推荐硫酸葡糖胺和硫酸软骨素作为髋和膝OA中可能的结构修饰剂(Jordan等人，2003；Zhang等人，2007)。然而，最近公布的OARSI指南将这些药剂(当用于所有OA患者时)降级为“不确定”为症状缓解剂或“不适当”为疾病修饰剂。类似地，口服和经皮阿片样物质止痛药对于管理OA被分级为“不确定的” (Zhang等人，2008，2010)。另一方面，推荐局部NTHE适合所有仅有膝盖OA的患者，并且发现与口服NTHE相比局部NTHE更安全和耐受性更好(McAlindon等人，2014)。专家小组对于使用推荐的这些周期性变化清楚地限定目前OA管理的非药理学和药理学疗法方式的不确定性。在加剧了复杂的情况下，许多病痛患者由于更多地倾向于低于标准的和未受监管的产品来源而损害了他们的安全性，希望减轻疾病的灾难性后果并改进他们的生活质量。因此，仍然存在对来自天然来源的基于证据的安全和有效替代物的未满足的需要。

类风湿性关节炎(RA)是主要影响关节的慢性炎性自身免疫性疾病(Smolen等人，2018)。尽管RA是全身性疾病，并且在关节外粘膜表面和初级淋巴组织发生多种免疫学事件，滑膜是中心角色。该疾病的特征在于细胞和体液免疫细胞(例如T细胞、B细胞和单核细胞)浸润关节滑膜。这个过程之前是新血管形成(内皮细胞的活化导致新血管的生长)，其被认为是RA滑膜炎的标志。滑膜中滑液成纤维细胞样和巨噬细胞样细胞的扩张导致增生的滑液衬里层。这种扩张的滑膜(通常称为“关节翳”)侵入软骨-骨连接处的关节周围骨，并导致骨侵蚀和软骨退化。

在RA的发病机理中，细胞因子网络整合滑膜炎中的促炎和组织损伤性细胞活性。已知促炎细胞因子(主要是TNF-α和IL-6)在RA中诱导分子，例如核因子κB配体的受体激活剂(RANKL)、前列腺素(PGE2)、基质金属蛋白酶(MMP-13、MMP-3、MMP-9、MMP-1)和聚集蛋白聚糖酶。这些因素介导RA的体征和症状。TNF-α和IL-6也刺激滑膜中破骨细胞的产生并促进骨损伤。这些分子和细胞事件导致临床疾病表现为软骨和骨的疼痛、肿胀(通常伴有晨僵和触痛)、畸形以及退化。由于滑液侵入相邻关节结构而造成的软骨和骨损伤是RA的主要体征之一(Smolen等人，2018)。

与OA类似，RA的治疗目标是减轻关节炎症和疼痛，使关节功能最大化，并防止关节破坏和畸形。多年来，对RA发病机理的更好理解(通过识别关键细胞和细胞因子)已导致靶向疾病修饰抗风湿药物的显著改进和开发。特别是，风湿病学家们已经学会如何最佳地使用免疫抑制剂氨甲蝶呤，并且该药物已经成为管理RA的治疗锚(Visser和van der Heijde，2009)。与这种理解非常一致，除了在改进关节结构维持和保护软骨下骨方面的组织学发现之外，本公开中公开的组合物当在胶原诱导的关节炎(CIA)中测试时，在症状缓解、以及关键炎性细胞因子(TNF-α和IL6)和基质降解酶(MMP-13和MMP-3)的减少方面产生与氨甲蝶呤相当的结果。该模型最常用作疾病模型，用于测试药物和营养物在RA和/或RA发病机理方面的功效(Cho等人，2007)。这些发现表明在本申请中公开的天然组合物除OA外还适用于RA的管理。

本文记载了多种天然提取物及其组合的组合物，其通过下调用这些组合物治疗的动物中的分解代谢细胞因子(例如TNF-α、IL-1β和IL-6)和细胞外基质降解酶(MMP3、9和13)，统计学上并且显著减少软骨转换(turnover)的分解代谢生物标志物，例如uCTX-II(软骨退化的主要标志物)。这些发现也通过调节软骨细胞的稳态得到证实，其中分解代谢途径的基质降解酶(金属蛋白酶和聚集蛋白聚糖酶)例如MMP13、MMP3和ADAMTS4的基因表达在口服治疗后被显著下调。这些现象是本发明的组合物在使关节炎表型的分解代谢过程最小化中的活性的关键指标。

迄今为止，还没有监管部门批准的用于OA的疾病修饰剂可以应用于软骨再生。正确地，具有多种已知作用机制的膳食补充剂可以有助于软骨修复过程。在本公开中，专利组合物由但不限于单独的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))组成，导致出乎意料的更快和改进的具有协同作用的软骨修复活性，如在动物承重数据和患病动物模型中软骨修复参数的组织病理学观察所反映的。当与媒介物治疗的疾病模型相比时，在用山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独提取物以及AMK和AP的那些组合物治疗的大鼠中，发现软骨合成标志物(例如IIA型前胶原氨基末端前肽(PIIANP)和生长因子TGF-β1)的水平显著更高。这些组合物在胶原诱导的大鼠关节炎模型中也显示显著的软骨保护活性，并且在角叉菜胶诱导的大鼠爪水肿模型中显示抗疼痛和抗炎活性。还使用Colby方程(Colby，1967)评价了将这些提取物组合以产生但不限于AP或AMK组合物的优点，并且发现组合的组合物具有出乎意料的协同作用。由单独的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于AP和AMK)所证明的这些广泛的活性可以归因于组合物中存在的活性剂的不同性质。汇编的数据表明，单独的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于AP和AMK组合物)提供症状缓解、抗分解代谢的关节软骨保护和合成代谢的关节软骨修复-三重功能，这可能是作为骨关节炎的疾病修饰剂的整体方法。

在本公开中，本专利中描述的数据详细描述了单独的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物)的新颖性，以解决对调节软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和关节炎表型的未满足的需要。以所例举的组合比率给药的单独的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于AP和AMK)通过诱导软骨合成和通过抑制ECM降解而逆转OA朝向正常或合成代谢稳态平衡的过程。我们相信天然组合物(如单独的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于AP和AMK组合物))具有刺激合成代谢基因表达和抑制分解代谢活性的独特能力，这将这些组合物确定为来自天然来源的OA/RA疾病修饰剂的优选选择。

药物给药的肠内和肠胃外途径是用于患有肌肉骨骼疼痛的患者的药物递送的常用方法之一。然而，已知通常处方的或非处方的抗疼痛药(例如选择性和非选择性非甾体抗炎药物)引起胃肠道、心血管和肾副作用(Harirforoosh等人，2013)。实际上经常遭受慢性疼痛的年长患者处于这些干预途径导致的副作用的更大风险中(Stanos和Galluzzi)。通过局部施用途径通过采用NTHE可以避免这些不良事件。将抗疼痛产品直接施用于受影响区域，例如在肌肉劳损、扭伤、骨关节炎、类风湿性关节炎和其它系列的肌肉骨骼病况的情况下，可以在预期的目标区域产生高浓度的活性化合物，产生快速和稳健的疼痛缓解，同时使全身暴露最小化(Rodriguez-Merchan，2018；Argoff，2013)。然而，对于对肌肉骨骼病症具有改进功效的局部适用药物或替代物仍存在未满足的需要。我们相信具有不同化学实体和作用机制的天然产物可以有助于填补局部替代物的空白。在对预期实施方案的工作中，我们筛选和评价了我们的植物库中的局部止痛剂，并假设它们潜在地增强了疼痛缓解活性，这是标准化制剂和改进的皮肤渗透的结果。在本文公开的预期实施方案的概念化中，已经记录了新型、局部有效的抗疼痛制剂的部分发现过程。

取决于最初的刺激，疼痛可以是伤害感受性的、炎性的或神经性的。已经假设这些药用植物可以通过在受体水平直接干扰外周初级传入感觉神经元或通过疼痛转导、传递、调节和感知的许多途径起作用而间接地引起疼痛敏感性的抑制。缓激肽和前列腺素是已知在炎症中引起疼痛敏感性的典型炎症介质之一。

发明内容

本文公开了来自山姜属、木兰属、地肤属和胡椒属/胡椒的药用植物提取物及其生物活性剂，它们组合或单独地用于调节软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和关节炎表型，其导致软骨细胞的增强的合成代谢功能、细胞外基质和关节软骨的增加的更新/重建/再生以及骨关节炎和类风湿性关节炎的改进的表型。细胞和组织水平的平衡转移不仅保持/保护/改进/更新细胞外基质和关节软骨的结构完整性，而且保护/改进/增强关节/骨结构和关节功能，观察为关节炎症、关节疼痛、关节僵硬减少；软骨退化减少；活动性、活动范围、灵活性、关节身体功能改进或其任意组合。

在分子和细胞水平证明山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的抗分解代谢和促合成代谢活性，包括基因表达、蛋白质表达和蛋白质功能降低；在组织水平具有生物标志物引导的组织保护；在患病动物模型中，不仅症状缓解，而且生物标志物的合成代谢和分解代谢改变以及组织病理学图像和评分改进。

公开的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的使用方法包括但不限于维持软骨稳态、细胞外基质完整性和关节软骨；使软骨退化最小化，保护关节间隙不变窄，和通过保护软骨完整性促进健康关节；平衡合成代谢和分解代谢过程，减少影响关节健康的酶和促炎细胞因子的作用，改进关节运动和/或功能，减轻关节疼痛，减轻关节僵硬，改进关节活动范围和/或灵活性，促进活动性，管理和/或治疗骨关节炎和/或类风湿性关节炎，预防骨关节炎和/或类风湿性关节炎，或逆转骨关节炎和/或类风湿性关节炎的进展等。

具体地，公开了用于关节健康的组合物，其包含富含一种或多种苯丙素的山姜属提取物；富含一种或多种双酚木酚素的木兰属提取物；和富含一种或多种三萜皂苷的地肤属提取物的组合。

在另外的实施方案中，公开了用于关节健康的组合物，其包含富含一种或多种苯丙素的山姜属提取物；和富含一种或多种生物碱的胡椒属提取物的组合。

在又另外的实施方案中，公开了用于关节健康的组合物，其包含富含一种或多种苯丙素的山姜属提取物。

附图说明

图1显示山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))通过诱导软骨稳态逆转OA进展。

图2是山姜属乙醇提取物在254 nm的HPLC色谱图。

图3显示OCD大鼠在治疗6周后的钻孔部位的图像，显示不同口服治疗组的愈合进展的显著差异。

图4显示OCD大鼠的软骨下骨在钻孔部位的番红O染色。黑色圆圈指示代表性动物组织病理学载玻片的钻孔部位。

图5显示用AMK和MTX治疗的CIA诱导大鼠的踝关节的组织病理学图像(HE a-d和番红O e-f)。a和e-正常对照，b和f-CIA+媒介物，c和g-CIA+MTX，d和h-CIA+AMK。

图6显示用AP治疗的CIA大鼠的HE和番红O染色组织学(HE染色(40x)：a=正常对照+媒介物，b=CIA+媒介物，c=CIA+氨甲蝶呤，d=CIA+AP，番红O染色(40x)：e=正常对照+媒介物，f=CIA+媒介物，g=CIA+氨甲蝶呤，h=CIA+AP，C=软骨，SB=软骨下骨，I=炎症)。

具体实施方式

骨关节炎(OA)是多因素疾病，主要表现为软骨退化，其引起显著的病态、关节疼痛、僵硬和有限的活动性。目前OA的管理是不充分的，因为缺乏证明在阻碍疾病进展中有效的主要疗法，其中集中于对症疗法的方法，例如使用非甾体抗炎药物，掩盖导致不可逆的软骨消耗和关节结构损伤的实际病因。这里我们呈现新的天然提取物和组合物的发现，其实例被命名为但不限于山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属提取物和导致具有协同作用的意想不到的更快和改进的软骨更新和修复活性的各种组合。衍生自单独的山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的这些活性在本主题的实施例2、9、13、17和18中证明，并通过以下反映：抑制由分解代谢细胞因子白介素-1刺激的兔软骨外植体释放糖胺聚糖(GAG)；来自骨软骨模型(OCD)的动物承重数据(实施例25-31)；以及在胶原诱导的关节炎(CIA) (实施例40-58)、单碘乙酸酯诱导的关节炎(MIA) (实施例59-63)和OCD(实施例25-31)患病动物模型中在软骨保护、修复和更新参数的组织病理学观察，用于调节软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和关节炎表型。

具体地，公开了用于关节健康的组合物，其包含富含一种或多种苯丙素的山姜属提取物；富含一种或多种双酚木酚素的木兰属提取物；和富含一种或多种三萜皂苷的地肤属提取物的组合。开发了预期的组合物，使得组合物中的山姜属提取物或木兰属提取物或地肤属提取物在1重量%-98重量%的每种提取物的范围内，其中山姜属:木兰属:地肤属(AMK)的最佳重量比在2:4:3 (22.2%:44.4%:33.3%)或4:3:3 (40%:30%:30%)或5:4:4(38.4%:30.8%:30.8%)。

虽然软骨细胞对包括生长因子的多种刺激有响应，它们的复制潜力有限，这是促成软骨在响应损伤时内在愈合能力有限的因素。软骨细胞通过维持合成代谢(再生)和分解代谢(降解)活性之间的微妙平衡来调节软骨稳态。这些细胞仅占总基质体积的1-2%。它们是无血管的，并且在成年期不能分裂，引起非常有限的软骨自我修复能力和低转换率。它们通常主要通过滑液和软骨下骨的扩散来获得其营养和氧。软骨细胞通过调节各种关节组件的合成和降解之间的平衡来维持关节软骨基质的稳态。该过程由周围组织(例如软骨和/或滑液和/或滑膜)中细胞因子和生长因子的相对水平控制。软骨细胞可以通过合成大分子(例如II型胶原和聚集蛋白聚糖)来维持细胞外基质(ECM)的完整性，并且它们还可以产生ECM降解中涉及的蛋白质(例如MMP和聚集蛋白聚糖酶)。由于软骨细胞对其微环境的变化非常响应和敏感，直接或间接刺激软骨细胞以产生基质形成组分并抑制促炎细胞因子和基质降解酶分泌的天然提取物和组合物可以改变ECM的稳态和关节炎表型。在本主题中，我们在实施例中记载了数据，证实单独的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于组合物山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))在OCD模型中除了其在CIA、MIA和角叉菜胶模型中的软骨保护和症状缓解活性之外的软骨重建和更新能力，超过降解过程，以维持稳态。

在软骨形成期间，间充质干细胞(MSC)凝缩和随后的软骨细胞分化是软骨形成的初始步骤。这些过程由软骨发育的不同阶段的若干生长和转录因子驱动。在这些因子中，SOX9 (用于软骨形成的关键转录因子)参与MSC的凝缩期，刺激软骨特异性标志物的表达并抑制软骨细胞的终末分化。类似地，TGF-β家族的基因在软骨细胞中广泛表达，并且是参与软骨形成过程的生长因子的组成类别。在软骨形成早期阶段期间表达的所有因子中，TGF-β1是诱导MSC分化为软骨细胞的最重要的因子之一。该因子还刺激软骨细胞增殖，增加ECM的产生，并抑制软骨内骨化。在软骨发育的该合成代谢阶段(由SOX9和TGF-β1刺激)，成熟软骨细胞将产生富含分别由ACAN和COL2A1基因编码的蛋白聚糖和II型胶原纤维的软骨基质。结果是，上调转录因子或生长因子表达的外部因子帮助诱导软骨发育的合成代谢过程以维持过量的ECM。事实上，在衍生自单独的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的天然组合物的我们的发现过程中，发现在离体以及在体外模型中在IL-1β-刺激的人软骨细胞中SOX 9、TGF-β1、ACAN和COL2A1基因上调，如在本主题实施例21、22、23和24中证明的。调节软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和关节炎表型的这些发现后来由在本主题中证明的CIA、MIA和OCD模型的体内结果加强。当与媒介物治疗的疾病动物相比时，在用山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))治疗的大鼠中，发现软骨胶原合成标志物(例如IIA型前胶原氨基末端前肽(PIIANP) (实施例40、48、56和58)和生长因子TGF-β1 (实施例31))的水平显著更高。这些现象(例如直接参与软骨合成和更新的合成代谢基因标志物的上调)部分地解决了所公开的组合物的活性。

据我们所知，这是首次以给定比率评价所公开的药用植物在骨软骨缺损(OCD)模型中保留和重建软骨的能力，得到有利的结果。该模型在评估用于其软骨更新和重建功能的干预中具有直接的含义。山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的软骨合成(并因此疾病修饰活性)在大鼠中使用骨软骨缺陷(OCD)模型证明，如在实施例25、26、27、28、29、30和31中说明的。该模型通过利用身体自身的愈合潜能，利用在修复过程中刺激骨髓。该技术通过为新组织形成提供合适的环境来增强软骨表面重修。在模型诱导时，用精密钻头对股骨软骨下骨板暴露的承重表面进行钻孔，直到脂肪滴和血液从膝盖中的微骨折孔中出来。这为来自骨髓的身体自身的间充质干细胞提供最佳环境，以分化成适当的关节软骨样细胞，其继而产生细胞外基质，最终成熟为稳定的修复组织。使用该模型以不同的剂量和时间周期口服给药(例如200 mg/kg/天，8周)评价山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的软骨修复活性。作为评估修复进展的手段，使用平衡测痛仪(incapacitance tester)测量大鼠右腿和左腿之间的承重分布。在尸检时，收集用于生物标志物的血清和用于组织病理学的左膝。在用福尔马林固定动物之前，对所有动物拍摄聚焦在钻孔部位的左膝的图像。由独立的且经认证的病理学家处理和分析固定的组织。

OCD动物在受影响的腿上表现出跛行，其在所有组的整个研究过程中显示进行性改进。使用他们受影响的腿的开放视野观察中的这些变化也反映在疼痛测量(incapacitance measurement)中。对于用山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物治疗的大鼠，在承重测量中存在逐渐改进，这是显著改进。在每天口服治疗6周后，用AMK和AP组合物治疗的大鼠在使用它们受影响的腿来承载它们的体重时分别显示59.9%和51.5%的改进。这是手术钻孔膝盖疼痛减轻的指征。这些值似乎与在尸检时从AMK和AP组拍摄的照片中观察到的结果(相对于媒介物治疗的OCD动物)匹配。这些发现也被组织病理学数据证实，所述组织病理学数据使用在本专利正文对于软骨修复描述的Sellers分析方法分析，与媒介物治疗的疾病模型相比，其显示在用AMK和AP治疗的动物中40.4%和40.5%加速愈合。与媒介物治疗组相比，AMK和AP治疗的OCD大鼠的这些改进是统计学上显著的。这些发现反映AMK和AP在体内的软骨合成(合成代谢)和刺激活性，其与体外合成代谢基因标志物的上调互补，证明了它们的软骨重建和更新活性。

还在另外的动物模型中证明山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的软骨保护活性。在实施例40、48、56和58中展示的CIA和MIA诱导的关节炎模型中，山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于AP和AMK)在统计学上显著减少尿CTX-II (软骨退化的主要生物标志物)和在统计学上显著增加软骨合成生物标志物(PIIANP)。那些山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于AP和AMK)还显示统计学上显著减少血清分解代谢生物标志物(例如IL-1β、TNF-α和IL-6)水平以及不同的MMP酶，其被认为是与炎性细胞因子和基质降解酶相关的主要分解代谢途径。来自这些模型的数据表明这些单独的提取物和组合的组合物的抗分解代谢活性。

如下证实了体内观察结果：当用分解代谢细胞因子IL-1孵育人软骨细胞时，山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))上调关节软骨细胞外基质合成代谢生物标志物(例如COL2A1 (编码II型胶原的基因)和ACAN (编码软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白的基因))的表达并下调基质分解代谢稳态生物标志物(例如MMP13、MMP3和ADAMTS4)的表达。在用那些山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物以及那些例如但不限于AP和AMK组合物治疗的IL-1刺激的人软骨细胞中，还发现上调关节软骨基质合成转录因子SOX9和生长因子TGF-β1 (实施例23和24)。这些发现显示山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物以及这些植物提取物的组合物(不限于MK和AP)通过增加软骨合成的主要调节剂TGF-β1和SOX9的水平来促进软骨再生，导致软骨组分ACAN、COL2A1和PIIANP的增加。相反，提取物降低MMP13、MMP3、ADAMTS4和MMP9的表达和活性，这些是造成大部分直接软骨破坏的酶。这些活性的净结果是维持剩余软骨和开始软骨合成以恢复关节结构的完整性。

尽管OA/RA的最初病因学尚在争论之中，由软骨合成和退化失衡导致的稳态紊乱在骨关节炎以及类风湿性关节炎的起始和进展中起关键作用。本公开中呈现的数据显示这些山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))通过诱导软骨合成(并因此，合成代谢作用)和抑制退化和分解的分解代谢过程在逆转关节炎朝向正常和/或合成代谢稳态进展的方向的作用。图1显示山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属的单独的提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))通过诱导软骨稳态逆转OA进展。

我们相信疼痛的多因素复杂性可能提示需要干预策略，其涉及将两种或更多种活性提取物组合在一起以引发多种解决方法：增强的疼痛缓解、减轻软骨破坏和开始软骨合成。我们使用山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属以及组合物(不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))进行的体内研究证明增强的疼痛缓解以及软骨分解的组织学减轻。单独和组合地使用植物提取物，在本主题中我们证明的体外和离体研究显示，若干单独的提取物以及组合减少软骨退化以及增加软骨合成。值得注意的是，单独的提取物不是都显示这些活性中的每一种，但是提取物的组合物增强它们的单独的活性，在这些干预活性中协同作用实现了出乎意料的功效。

在局部治疗范例中，使用渗透增强剂以增加吸收程度和促进克服角质层屏障的经皮渗透具有更大的优势。关于这一点，我们考虑在我们的制剂中使用芦荟，并在制备一些提取物期间加入2%的芦荟，如实施例中指示的(Fox等人，2015)。

已知的局部活性NTHE药物以5%布洛芬或1%双氯芬酸配制，作为当前评价中的NTHE对照。还获得两种非处方(OTC)活性剂，以制备0.5%辣椒素或5%薄荷醇作为OTC阳性对照。商业OTC疼痛缓解产品(例如BENGAY®)也已经用作对照。

利用体内热板测试作为测试模型以评价所选天然先导物相对于已知阳性NTHE和OTC对照的局部疼痛缓解功能。利用少量DMSO以5%的浓度溶解植物提取物或化合物。将DMSO样品溶液与等体积的芦荟凝胶(2-4%芦荟叶凝胶粉末在DI水中)混合，在热板实验之前将其局部施用于大鼠爪子(实施例64)。

疼痛是由多种机制触发的多因素现象。这些测试材料的施用可以涉及但不限于外周神经纤维的初始活化和随后的脱敏、竞争性抑制或活化瞬时受体电位(例如TRPV1和/或TRPA1)、大麻素受体(CB1和CB2受体)的调节、TRPV1和TRPA1的拮抗和/或阻断、物质-P释放的初始增加随后耗尽、抑制缓激肽活性以及抑制炎性介质(例如前列腺素、缓激肽和细胞因子)的外周合成。因此，考虑到所测试的药用植物材料中存在的生物活性剂的多样性质，本主题中描述的当前局部抗疼痛数据，与角叉菜胶、MIA、CIA和OCD模型数据结合，可以扩展山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属的单独的提取物以及这些植物提取物的组合物(不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的用途，通过将这些植物材料以特定比率组合用于增强的疼痛缓解活性。

在以上和以下描述中，阐述某些具体细节以提供对本公开的各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践本公开。

在本说明书中，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，并且在适当的时候包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。此外，除非另外指明，否则本文所述的涉及任何物理特征(例如聚合物亚单元、尺寸或厚度)的任何数值范围应理解为包括所述范围内的任何整数。除非另有说明，否则本文所用的术语“约”和“基本上由……组成”是指所示范围、值或结构的±20%。应当理解，本文所用的术语“一”和“一个”是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代方案(例如，“和/或”)的使用应理解为是指替代方案中的一者、两者或其任何组合。除非上下文另有要求，否则在整个本说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”及其变体(例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)以及同义术语(如“包括”和“具有”)及其变体应被解释为开放的、包含性的含义；即“包括但不限于”。

在整个说明书中，对“一个实施方案”或“实施方案”的提及意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中的各个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定全部指代同一实施方案。

术语“前药”还指包括任何共价键合的载体，当将这样的前药给予哺乳动物受试者时，其在体内释放本公开的活性化合物。本公开的化合物的前药可以通过修饰本公开的化合物中存在的官能团来制备，其方式使得所述修饰在常规操作中或在体内裂解为本公开的母体化合物。前药包括本公开的化合物，其中羟基、氨基或巯基与任何基团键合，当将本公开的化合物的前药给予哺乳动物受试者时，所述基团裂解以分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括本公开的化合物中的醇的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能团的酰胺衍生物等。

术语“关节”健康是指指示改进手、肘关节、腕关节、腋关节、胸锁关节、椎关节、颞下颌关节、骶髂关节、髋关节、膝关节和足关节中的一个或多个“关节”的健康。

“稳定的化合物”和“稳定的结构”是指足够稳健以经受得住从反应混合物中分离至有用纯度并配制成有效治疗剂的化合物。

“生物标志物”或“标志物”组分或化合物是指指示所公开的植物、植物提取物或具有2-3种植物提取物的组合的组合物中的一种或多种固有化学组分或化合物，其用于控制本发明的组合物的质量、稠度、完整性、稳定性和/或生物功能。

“哺乳动物”包括人和家养动物两者，例如伴侣动物、实验动物或家庭宠物(例如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔)和非家养动物(例如野生动物)等。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的要素、组分、事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括其中要素、组分、事件或情况发生的情况以及其中它们不发生的情况。例如，“任选取代的芳基”是指芳基可以被取代或不被取代，并且该描述包括取代的芳基和不具有取代的芳基两者。

“药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括美国食品和药物管理局批准的用于人类或家养动物的可接受的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。

“药学上或营养学上可接受的盐”包括酸和碱加成盐。“药学上或营养学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物有效性和性质的那些盐，其不是生物学上或其它方面不期望的，并且其用无机酸和有机酸形成，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸例如乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。

“药学上或营养学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物有效性和性质的那些盐，其不是生物学上或其它方面不期望的。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱来制备。衍生自无机碱的盐包括钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。在某些实施方案中，无机盐是铵、钠、钾、钙或镁盐。衍生自有机碱的盐包括伯、仲和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂(例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、苯乙胺、苄星、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等)的盐。特别有用的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

通常，结晶产生本公开的化合物的溶剂化物。如本文所用，术语“溶剂化物”是指包含一个或多个本公开的化合物的分子与一个或多个溶剂分子的聚集体。溶剂可以是水，在这种情况下溶剂化物可以是水合物。或者，溶剂可以是有机溶剂。因此，本公开的化合物可以作为水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相应的溶剂化的形式。本公开的化合物可以是真溶剂化物，而在其它情况下，本公开的化合物可以仅保留外来的水或者是水加上一些外来溶剂的混合物。

“药物组合物”或“营养组合物”是指本公开的化合物和本领域公认的用于将生物学上活性化合物递送至哺乳动物(例如人)的介质的制剂。例如，本公开的药物组合物可以配制或用作独立的组合物，或作为处方药、非处方(OTC)药、植物药、草药、天然药物、顺势疗法药剂或政府机构审查和批准的任何其它形式的保健产品中的组分。本公开的示例性营养组合物可以配制或用作独立的组合物，或作为食物、功能性食物、饮料、棒、食物香料、医疗食物、膳食补充剂或草药产品中的营养或生物活性组分。本领域公认的介质包括所有药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

如本文所用，“富含”是指与提取或其它制备之前植物材料或其它来源的重量中发现的一种或多种活性化合物的量相比，植物提取物或其它制剂的一种或多种活性化合物增加至少两倍且至多约1000倍。在某些实施方案中，提取或其它制备之前植物材料或其它来源的重量可以是干重、湿重或其组合。

如本文所用，“主要活性成分”或“主要活性组分”是指在植物提取物或其它制剂中发现的或在植物提取物或其它制剂中富集的一种或多种活性化合物，其能够具有至少一种生物活性。在某些实施方案中，富集的提取物的主要活性成分将是该提取物中富集的一种或多种活性化合物。通常，与其它提取物组分相比，一种或多种主要活性组分将直接或间接地赋予一种或多种可测量的生物活性或作用中的大部分(即，大于50%、或20%或10%)。在某些实施方案中，主要活性成分可以是提取物重量百分比的次要组分(例如，小于提取物中所含组分的50%、25%、或10%或5%或1%)，但仍提供大部分期望的生物活性。含有主要活性成分的本公开的任何组合物还可以含有次要活性成分，其可以有助于或可以不有助于富集的组合物的药物或营养活性，但并不达到主要活性组分的水平，并且在不存在主要活性成分的情况下，单独的次要活性组分可能无效。

“有效量”或“治疗有效量”是指当给予哺乳动物(例如人)时足以实现治疗的本公开的化合物或组合物的量，包括以下任何一种或多种：(1)维持关节软骨稳态；(2)平衡软骨细胞分解代谢和合成代谢过程；(3)治疗或预防哺乳动物的软骨损失；(4)促进关节健康；(5)抑制哺乳动物的软骨损失；(6)增加哺乳动物的关节灵活性；(7)治疗或预防哺乳动物的关节疼痛；(8)缓和哺乳动物的关节炎症；和(9)增加关节活动范围，(10)在哺乳动物中管理和/或治疗骨关节炎和/或类风湿性关节炎、预防骨关节炎和/或类风湿性关节炎、或逆转骨关节炎和/或类风湿性关节炎的进展。构成“治疗有效量”的本公开的化合物、提取物或组合物的量将根据生物活性化合物或所治疗病况的生物标志物及其严重性、给药方式、治疗持续时间或所治疗受试者的年龄而变化，但可以由本领域普通技术人员根据其自身知识和本公开常规确定。在某些实施方案中，“有效量”或“治疗有效量”可以表示为相对于哺乳动物体重的量(即，0.005 mg/kg、0.01 mg/kg、或0.1 mg/kg、或1 mg/kg、或10 mg/kg、或50 mg/kg、或100 mg/kg、或200 mg/kg、或500 mg/kg)。人等效日剂量可以通过利用FDA指南考虑动物和人的总身体面积和体重的差异，从动物研究中的“有效量”或“治疗有效量”推断。

如本文所用，“膳食补充剂”是改进、促进、增加、管理、控制、维持、优化、修饰、减少、抑制或预防与天然状态或生物过程相关的特定状况、或结构和功能完整性、生物功能的稳态或表型状况(即，不用于诊断、治疗、减轻、治愈或预防疾病)的产品。例如，关于关节健康相关的状况，膳食补充剂可以用于维持关节软骨、使软骨退化最小化、通过保护软骨完整性来促进关节健康、减少影响关节健康的酶的作用、改进关节运动和/或功能、减轻关节疼痛、减轻关节僵硬、改进关节活动范围和/或灵活性、促进活动性、平衡合成代谢和分解代谢稳态和/或类似作用。在某些实施方案中，膳食补充剂是特殊类别的食品、功能性食品、医疗食品，并且不是药物。

如本文所用的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在具有关注的疾病或病况的哺乳动物(例如人)中治疗关注的疾病或病况，并且包括：(i)预防哺乳动物中的疾病或病况发生，特别是当这样的哺乳动物易患所述病况但尚未诊断为患有所述病况时；(ii)抑制疾病或病况，即阻止其发展；(iii)缓解或改变疾病或病况，即，引起疾病或病况的消退；或(iv)缓解由疾病或病况引起的症状(例如，缓解疼痛、减轻炎症、减少软骨损失)而不解决潜在的疾病或病况；(v)平衡合成代谢和分解代谢稳态或改变疾病或病况的表型。如本文所用，术语“疾病”和“病况”可以互换使用，或者可以不同，因为特定的疾病或病况可能不具有已知的病因(使得尚未解决病因)，并因此尚未被识别为疾病，而仅被识别为不期望的病况或综合征，其中临床医生已鉴定了或多或少的特定症状组。

如本文所用，“统计显著性”是指当使用Students t-检验计算时p值为0.050或更小，并且指示被测量的特定事件或结果不太可能偶然出现。

为了给药的目的，本公开的化合物可以作为未加工的化学品给药，或者可以配制为药物或营养组合物。本公开的药物或营养组合物包含在本公开中所述的结构的化合物和药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本文所述的结构的化合物以有效治疗关注的特定的疾病或病况的量存在于组合物中，即，以足以促进软骨细胞或细胞外基质或软骨稳态或本文所述的任何其它相关指征的量存在，并且通常对患者具有可接受的毒性。

纯形式或在适当的药物或营养组合物中的本公开的化合物或组合物或它们的药学上或营养学上可接受的盐的给药可以经由用于提供类似用途的药剂的任何可接受的给药模式进行。本公开的药物或营养组合物可以通过将本公开的化合物与适当的药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、乳膏、洗剂、酊剂、sashay、即饮型、面膜、微球和气溶胶。这样的药物或营养组合物的典型给药途径包括口服、局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道或鼻内。本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。配制本公开的药物或营养组合物以在将组合物给予患者后允许其中包含的活性成分是生物可利用的。将给予受试者或患者或哺乳动物的组合物采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如片剂可以是单一剂量单位，并且气溶胶形式的本公开的化合物或提取物或2-3种植物提取物的组合物的容器可以容纳多个剂量单位。制备这样的剂型的实际方法是本领域技术人员已知的，或将是显而易见的；例如，参见Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)。待给药的组合物在任何情况下将含有治疗有效量的本公开的化合物或其药学上或营养学上可接受的盐，用于根据本公开的教导治疗关注的疾病或病况。

本公开的药物或营养组合物可以是固体或液体形式。在一个方面，一种或多种载体是颗粒，使得组合物是例如片剂或粉末形式。一种或多种载体可以是液体，其中组合物是例如口服糖浆、可注射液体或气溶胶，其可用于例如吸入给药。

当旨在口服给药时，药物或营养组合物为固体乳膏、悬浮液和凝胶形式，其包括在本文考虑作为固体或液体的形式中。

作为用于口服给药的固体组合物，药物或营养组合物可以配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、sashay、薄片、棒剂或类似形式。这样的固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。此外，可以存在以下一种或多种：粘结剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、环糊精、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，例如藻酸、藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；调味剂，例如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂；和着色剂。

当药物或营养组合物为胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除了上述类型的材料之外，其还可以含有液体载体，例如聚乙二醇或油。

药物或营养组合物可以是液体形式，例如酏剂、酊剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于口服给药或用于通过注射递送。当旨在口服给药时，除了本发明化合物外，有用的组合物还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在旨在通过注射给药的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

本公开的液体药物或营养组合物，无论它们是溶液、悬浮液或其它类似形式，都可以包括一种或多种以下佐剂：无菌稀释剂，例如注射用水，盐水溶液，例如生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠，不挥发油，例如可以用作溶剂或悬浮介质的合成的甘油单酯或甘油二酯，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是通常有用的佐剂。可注射药物或营养组合物是无菌的。

旨在肠胃外或口服给药的本公开的液体药物或营养组合物应当含有一定量的本公开的化合物，使得将获得合适的剂量。

本公开的药物或营养组合物可以旨在局部给药，在这种情况下，载体可以适当地包含溶液、乳液、乳膏、洗剂、软膏或凝胶基料。例如，基料可以包含以下的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(例如水和醇)以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部给药的药物或营养组合物中。如果旨在经皮给药，则组合物可以包括经皮贴剂或离子电渗装置。

本公开的药物或营养组合物可以旨在直肠给药，例如，以栓剂的形式，其将在直肠中融化并释放药物。用于直肠给药的组合物可以含有油性基料作为合适的无刺激赋形剂。这样的基料包括羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。

本公开的药物或营养组合物可以包括改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。例如，组合物可以包括在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。或者，活性成分可以包裹在明胶胶囊中。

固体或液体形式的本公开的药物或营养组合物可以包括与本公开的化合物结合并从而帮助化合物递送的试剂。可以发挥这种能力的合适的试剂包括单克隆或多克隆抗体、蛋白质或脂质体。

固体或液体形式的本公开的药物或营养组合物可以包括减小颗粒的尺寸以例如改进生物利用度。有或没有赋形剂的组合物中的粉末、颗粒、微粒、微球体等的尺寸可以是宏观的(例如，肉眼可见或尺寸为至少100 μm)、微观的(例如，尺寸可以在约100 μm至约100nm的范围内)、纳米的(例如，尺寸可以不超过100 nm)和其间的任何尺寸或其任何组合，以改进尺寸和堆积密度。

本公开的药物或营养组合物可以由可以作为气溶胶给药的剂量单位组成。术语气溶胶用于表示从胶体性质的那些到由加压包装组成的系统范围内的各种系统。可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适的泵系统进行递送。本公开的化合物的气溶胶可以在单相、双相或三相系统中递送以递送一种或多种活性成分。气溶胶的递送包括必要的容器、激活器、阀、子容器等，它们一起可以形成试剂盒。本领域技术人员无需过度实验就可以确定最适当的一种或多种气溶胶。

本公开的药物或营养组合物可以通过药物或营养领域中公知的方法制备。例如，旨在通过注射给药的药物或营养组合物可以通过将本公开的化合物与无菌蒸馏去离子水组合以形成溶液来制备。可以加入表面活性剂以促进形成均匀的溶液或悬浮液。表面活性剂是与本公开的化合物非共价相互作用以促进化合物在水性递送系统中溶解或均匀悬浮的化合物。

本公开的化合物或其药学上或营养学上可接受的盐以治疗有效量给药，其将根据多种因素而变化，所述因素包括采用的具体化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间长度；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药方式和时间；排泄速率；药物组合；特定病症或病况的严重性；和经历疗法的受试者。

本公开的化合物或其药学上或营养学上可接受的衍生物也可以与食物、水和一种或多种其它治疗剂同时、在其之前或之后给药。这样的组合疗法包括给予单一药物或营养剂量制剂，其含有本公开的化合物或提取物或具有2-3种植物提取物的组合物和一种或多种另外的活性剂，以及给予本公开的化合物或提取物或具有2-3种植物提取物的组合物和在其自身单独的药物或营养剂量制剂中的每种活性剂。例如，本公开的化合物或提取物或具有2-3种植物提取物的组合物和另一种活性剂可以在单一口服剂量组合物(例如片剂或胶囊)中一起给予患者，或者每种药剂可以在单独的口服剂量制剂中给药。当使用单独的剂量制剂时，本公开的化合物和一种或多种另外的活性剂可以在基本上相同的时间(即，同时)或在分开交错的时间(即，顺序)给药；组合疗法应理解为包括所有这些方案。

应理解，在本说明书中，仅当所述化学式的取代基或变量的组合产生稳定化合物时，所述组合才是允许的。

本领域技术人员还将理解，在本文所述的方法中，中间体化合物的官能团可能需要通过合适的保护基团保护。这样的官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。用于羟基的合适的保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。用于氨基、脒基和胍基的合适的保护基团包括叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。用于巯基的合适的保护基团包括-C(O)-R” (其中R”是烷基、芳基或芳烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。用于羧酸的合适的保护基团包括烷基酯、芳基酯或芳烷基酯。保护基团可以根据本领域技术人员已知的并且如本文所述的标准技术加入或去除。保护基团的使用详细描述于Green, T.W. 和P.G.M. Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 第3版, Wiley。如本领域技术人员将理解的，保护基团还可以是聚合物树脂，例如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。

本领域技术人员还将理解，尽管本公开的化合物的这样的受保护的衍生物本身可能不具有药理学活性，但可以将它们给予哺乳动物，并且之后在体内代谢以形成为药理学活性的本公开的化合物。因此，这样的衍生物可以描述为“前药”。本公开的化合物的所有前药都包括在本公开的范围内。

此外，以游离碱或酸形式存在的本公开的所有化合物或提取物可以通过本领域技术人员已知的方法用适当的无机或有机碱或酸处理，将其转化为它们的药学上或营养学上可接受的盐。本公开的化合物的盐可以通过标准技术转化为它们的游离碱或酸形式。

在一些实施方案中，可以将本公开的化合物或提取物从植物来源分离，例如，从包括在实施例和整个本申请中的别处的那些植物分离。用于分离化合物的合适的植物部分包括叶、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、小枝、块茎、根、根茎、根皮、树皮表面、嫩枝、籽、果实、雄蕊群、雌蕊群、花萼、雄蕊、花瓣、萼片、心皮(雌芯)、花或其任意组合。在一些相关的实施方案中，将化合物或提取物从植物来源分离并合成修饰以含有任何所述取代基。在这方面，从植物分离的化合物的合成修饰可以使用本领域已知的并且在本领域普通技术人员的知识范围内的任何数目的技术来完成。

地肤(Kochia scoparia)(也被鉴定为Bassia scoparia；Bassia sieversiana；Kochia alata；Kochia trichophila；Kochia trichophylla)是从籽生长的一年生的大型草本植物，其常用名为：火草(burning bush)、豚草、扫帚草、地肤(kochia)和墨西哥火草。该植物原产于亚洲，但在北美的许多地方也被驯化。地肤植物含有高水平的蛋白质，并且通常用作家畜的饲料。籽可以用作鸟类的食物，并且也有价值作为家禽饲料。地肤属籽在日本也用作食品装饰，称为Tonburi或陆地鱼子酱(land caviar)。

地肤子(Kochiae Fructus)或籽在亚洲国家已被用作民间药物，以治疗多种疾病，例如皮肤病、糖尿病、类风湿性关节炎、肝病和黄疸等。最近的研究还报道了地肤属籽具有抗氧化、抗炎、抗寄生虫、抗癌、抗糖尿病、降血糖、减轻体重、抗过敏、止痛性质。齐墩果酸型三萜皂苷被鉴定为导致大多数地肤子功效的活性成分。最初从木鳖子(Momordicacochinchinensis)分离的苦瓜籽毒蛋白Ic是地肤子的主要成分，并且在小鼠舔后爪和福尔马林测试中也报道了具有抗伤害性和抗炎活性的各种天然草药。70%地肤子乙醇提取物和苦瓜籽毒蛋白Ic在小鼠中在角叉菜胶诱导的爪水肿模型中均显示抑制作用。

如在实施例1-4中证明的，地肤属提取物是预期可以用作目标化合物或组合物的一部分的组分或成分。地肤属提取物可以从任何合适的来源获得，包括地肤、Bassia scoparia、狭叶雾冰藜、木鳖子、Bassia dinteri、Bassia eriophora、钩刺雾冰藜、Bassia indica、Bassia laniflora、棉藜、Bassia littorea、Bassia muricata、尖翅地肤、兜藜、Bassia prostrata、Bassia salsoloides、Bassia stellaris、天山雾冰藜、Bassia tomentosa、Bassia villosissima或其任意组合。

如在实施例1、2、3和4中说明的，如本文预期的，地肤属提取物可以富含一种或多种物质。从地肤中分离的预期的皂苷可以用任何合适的溶剂提取，包括CO₂超临界流体、水、甲醇、乙醇、醇、水混合溶剂或其组合，或用超临界流体提取。在预期的实施方案中，地肤属提取物包含约0.01%至约99.9%的皂苷。从地肤属提取物中分离的预期的皂苷是Bassiasaponin A；Bassiasaponin B；Kochioside A；Kochioside B；Kochioside C；Kochianoside I；Scoparianos A；Scoparianoside B；Scoparianoside C；苦瓜籽毒蛋白Ic；Kochianoside I；Kochianoside II；Kochianoside III；Kochianoside IV；2'-O-吡喃葡萄糖基苦瓜籽毒蛋白Ic；2'-O-吡喃葡萄糖基苦瓜籽毒蛋白IIc等。

大高良姜(Alpinia galanga)属于姜科，并且在东南亚烹饪中用作香料草药，其常用名为：南姜(lengkuas)、大良姜和蓝姜。该植物是东南亚原产的多年生草本植物，并且常见于大巽他群岛、菲律宾和泰国。该植物的根茎已经用于具有类似于黑胡椒的独特辛辣感觉的食品，而没有残留作用。大高良姜传统上用于治疗各种类型的疾病，包括湿疹、支气管炎、内耳炎、胃炎、溃疡和霍乱、促进食欲、滋补作用等。已经报道大高良姜的许多药理学活性，尤其是作为抗细菌、抗真菌、抗病毒、免疫调节、抗氧化、抗糖尿病、止痛和许多其它药理学功能。

大高良姜的主要化学成分据报道是类黄酮，例如山奈酚、山奈素和挥发性组分，包括反式-二乙酸对香豆基酯、二-(对-羟基-顺式-苯乙烯基)甲烷、乙酸丁香酚酯、1'-羟基胡椒酚乙酸酯、对-羟基肉桂醛等。在本研究中，分离出苯丙素(1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(高良姜乙酸酯))和反式二乙酸对香豆基酯，并将其鉴定为该植物的两种主要活性化合物。据报道1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯是大高良姜的辛辣原理，并据报道其也具有抗微生物和抗癌性质。

局部施用大高良姜甲醇提取物的抗炎和止痛活性在实施例8、9、10和11中说明。在大鼠中在角叉菜胶诱导的爪水肿模型和在福尔马林测试两者中也发现山姜属甲醇提取物的抗炎和止痛活性。已报道主要的苯丙素之一(1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯)和大高良姜丙酮提取物在大鼠中在不完全弗氏佐剂(IFA)诱导的关节炎模型中有效。

山姜属提取物是预期可以用作目标化合物或组合物的一部分的组分或成分。山姜属提取物可以从任何合适的高良姜来源获得，包括大高良姜、高良姜、凹唇姜、山柰、益智、Alpinia abundiflora、Alpinia acrostachya、Alpinia caerulea、距花山姜、节鞭山姜、Alpinia globosa、Alpinia javanica、Alpinia melanocarpa、马来良姜、黑果山姜、Alpinia nutans、Alpinia petiolate、红姜、Alpinia pyramidata、Alpinia rafflesiana、彩叶姜、花叶良姜、艳山姜、Alpinia zingiberina或其任意组合。

如本文预期的并且如在实施例8、9、10和11中证明的，山姜属提取物可以富含一种或多种物质。从山姜属提取物分离的预期的芳族化合物用任何合适的溶剂提取，包括CO₂超临界流体、水、甲醇、乙醇、醇、水-混合溶剂、有机溶剂(例如己烷、乙酸乙酯、丙酮、丁醇)或其任意组合或用超临界流体，或通过根茎中的油的水蒸馏。在预期的实施方案中，山姜属提取物包含约0.01%至约99.9%的苯丙素、小芳族化合物。从山姜属提取物分离的预期的芳族化合物是1'-乙酰氧基丁香酚乙酸酯；松柏醇二乙酸酯；3-(4-羟基苯基)-2-丙烯醛；3-(4-羟基苯基)-2-丙烯-1-醇；肉桂酸甲酯(Methyl cinnamate)，FEMA 2698；3-(4-甲氧基苯基)-2-丙烯-1-醇；1'-羟基胡椒酚乙酸酯；4-乙酰氧基肉桂醇；4-乙酰氧基肉桂基乙基醚；1'-乙氧基胡椒酚乙酸酯；1-(3,4-二羟基苯基)-2-丙烯-1-醇；(S)-形式，3'-Me醚，4'-Ac；1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯；1-(4-羟基苯基)-2-丙烯-1-醇；-形式，二-Ac；3-(4-羟基苯基)-2-丙烯-1-醇；(E)-形式，二-Ac；4-(2-丙烯基)-1,2-苯二酚；1-O-D-吡喃葡萄糖苷；4-(2-丙烯基)-1,2-苯二酚；2-O-D-吡喃葡萄糖苷；双(4-乙酰氧基肉桂基)醚；乙基4-阿魏酰基-D-吡喃葡萄糖苷；Lusitanicoside；4-(2-丙烯基)-1,2-苯二酚；1-O-[-L-吡喃鼠李糖基-D-吡喃葡萄糖苷]；4-(2-丙烯基)-1,2-苯二酚；二-O-D-吡喃葡萄糖苷；4'-O-反式-阿魏酰基它乔糖甙(Feruloyltachioside)或其组合。

胡椒(常用名黑胡椒)是胡椒科的开花藤本植物。在本公开中，术语“胡椒属(piper)”、“胡椒(pepper)”和“胡椒属(piper)/胡椒(pepper)”可互换使用，指包含该提取物或组分的实施方案。黑胡椒原产于印度西南的喀拉拉邦州，并在热带地区(例如越南、印度和印尼)广泛栽培。称为干胡椒的磨碎的干果实因其味道而使用并用作传统药物。黑胡椒是世界上最常用的香料之一。胡椒碱是黑胡椒中的主要成分，促成辛辣的味道。

黑干胡椒的特征是在南亚的阿育吠陀、西达尔特和尤那尼医学中作为药物。它们用作开胃剂和治疗消化系统相关的问题。黑胡椒可以用作咽喉疼痛的治疗法以减轻咽喉炎症。它可以外用以减少脱发和治疗一些皮肤问题。已经报道了黑胡椒的许多药理学作用，例如抗真菌、抗氧化、促消化、抗抑郁和认知作用、止痛和抗炎、抗癌、免疫调节、降脂等。

胡椒属提取物是预期可以用作目标化合物或组合物的一部分的组分或成分。胡椒属提取物可以从任何合适来源获得，如在实施例5、6和7中说明的，包括胡椒和许多其它胡椒属物种、黑团孢属、胡椒、荜茇、Piper amalgo、Piper aurantiacum、Piper chaba、Piper capense、Piper crassinervium、Piper guineense、卡瓦胡椒、Piper novae-hollandiae、Piper peepuloides、Piper ponapense、毛蒟、假荜拔、Piper sintenense、Piper tuberculatum、山蒟、大豆、Petrosimonia monandra、欧薄荷、silocaulon absimile和细基格孢属或其组合。

主要的活性生物碱化合物(胡椒碱)被广泛研究并报道用作中枢神经系统抗抑郁药和神经兴奋剂，并具有抗氧化、解热、保肝、缓解疼痛、抗炎、杀虫和许多其它作用。胡椒碱也被报道为生物利用度增强剂。

如本文预期的，如在实施例5、6和7中说明的，胡椒属提取物可以富含一种或多种物质。从胡椒属提取物分离的预期的生物碱用任何合适的溶剂提取，包括CO₂超临界流体、水、甲醇、乙醇、醇、水-混合溶剂、有机溶剂(例如乙酸乙酯、丙酮、丁醇或其组合)或用超临界流体。在预期的实施方案中，胡椒属提取物包含约0.01%至约99.9%哌啶生物碱。从胡椒属提取物中分离的预期的生物碱是胡椒碱；Piperchabamide A；Kaousine；5-乙酰氧基-5,6-二氢-1-(3-苯基丙酰基)-2(1H)-吡啶酮；5,6-二氢-N-(3,4-二甲氧基肉桂酰基)-2(1H)-吡啶酮；N-[3-(3,4-二甲氧基苯基)丙酰基]-5,6-二氢-2(1H)-吡啶酮；Cenocladamide；3,4-Epoxypipermethystine；4'-O-去甲基荜茇明碱；Piplaroxide；顺式-荜茇明碱；荜茇明碱；8,9-二氢荜茇明碱；3,4-环氧-8,9-二氢荜茇明碱；Cycloguineense B；Nigramide K；Nigramide H；Nigramide J；Nigramide M；Nigramide N；Nigramide I；Nigramide L；Chabamide H；Chabamide I；Nigramide Q；Nigramide A；Nigramide C；Nigramide P；Dipiperamide C；Nigramide G；Dipiperamide A；Dipiperamide E；胡椒环丁酰胺A；Nigramide R；Nigramide B；Dipiperamide B；Dipiperamide F；Dipiperamide G；Nigramide F，Piperchabamide G；Piperarborenine A；荜茇明碱二聚体A；7,8'-二差向异构体，3,3'-双(脱甲氧基)；1,1'-[[2,4-双(6-甲氧基-1,3-苯并二氧杂环戊二烯-5-基)-1,3-环丁烷二基]二羰基]双哌啶；Piperarborenine E；胡椒环丁酰胺B；Dipiperamide D；Nigramide S；Nigramide D；Nigramide E；Piperarborenine D；Piperarborenine B；2,4-双(2-甲氧基-4,5-亚甲基二氧基苯基)-1,3-环丁烷羧酸二哌啶化物(dipiperidide)；3'-甲氧基；Piperarborenine C；Piperarboresine；Piperchabamide H；1,1'-[[2,4-双(3,4,5-三甲氧基苯基)-1,3-环丁烷二基]二羰基]双[5,6-二氢-2(1H)-吡啶酮]；3-苯基丙酸2,3-二脱氢-4-羟基哌啶化物(piperidide)；1-(1,6-二氧代-2,4-癸二烯基)哌啶；1-[5-(4-羟基苯基)-1-氧代-2,4-戊二烯基]哌啶；伊来西胺；3,4-亚甲基二氧基肉桂酰基哌啶化物；(Z)-形式；3,4-二羟基-1-(3-苯基丙酰基)-2-哌啶酮；4,5-二羟基-2-癸烯酸哌啶化物；4,5-二羟基-2-癸烯酸；(2E,4S,5R)-形式，哌啶化物；胡椒碱；异胡椒碱；异胡椒碱；Piperpense；Feruperine；1-[5-(1,3-苯并二氧杂环戊二烯-5-基)-1-氧代-2-戊烯基]哌啶；N-(3-甲氧基-4,5-亚甲基二氧基肉桂酰基)哌啶化物；2-甲氧基-4,5-亚甲基二氧基肉桂酰基哌啶化物；2-羟基-4,5-亚甲基二氧基肉桂酸；(Z)-形式，Me醚，哌啶化物；Dihydroferuperine；四氢胡椒碱；荜茇酰胺C；Puberullumine；1-[7-(1,3-苯并二氧杂环戊二烯-5-基)-1-氧代-2,4,6-庚三烯基]哌啶；1-[7-(1,3-苯并二氧杂环戊二烯-5-基)-1-氧代-2,4-庚二烯基]哌啶；Pipersintenamide；Wisanine；(E,E)-形式；Piperx；PiperoleinA；(E)-形式；胡椒碱S；Piperodione；4,5-二氢-2'-甲氧基胡椒碱；2,4-十六碳二烯酸哌啶化物；Piperlongimine B；11-苯基-2,4-十一碳二烯酸哌啶化物；荜茇酰胺B；1-[8-(1,3-苯并二氧杂环戊二烯-5-基)-1-氧代-7-十八烯基]哌啶；脱氢荜茇环碱；Piptigrine；1-[9-(1,3-苯并二氧杂环戊二烯-5-基)-1-氧代-2,8-壬二烯基]哌啶；Piperolein B；Piperoctadecalidine；2,4,12-十八碳三烯酸哌啶化物；2,4-十八碳二烯酸哌啶化物；1-[11-(1,3-苯并二氧杂环戊二烯-5-基)-1-氧代-2,4,10-十一碳三烯基]哌啶；Piperchabamide B；Pipereicosalidine；1-[8,9-二羟基-9-(3,4-亚甲基二氧基苯基)-2-壬烯酰基]哌啶；荜茇环碱；8,9-二氢，8R*,9S*-二羟基；N-(2,14-二十碳二烯酰基)哌啶；2,4-二十碳二烯酸哌啶化物；1-[13-(1,3-苯并二氧杂环戊二烯-5-基)-1-氧代-2,4,12-十三碳三烯基]哌啶；胡椒十三碳二烯酰胺；Pipsaeedine；Pipbinineor；或其组合。

厚朴在中国通常被称为“厚朴(houpu)”，是最流行的传统中药材之一，具有非常广泛的应用范围。它是中国原产的木兰属物种，主要生长于四川和湖北省。厚朴指其厚树皮，其可以从茎、枝和根剥取。传统指征是治疗中风、寒伤、头疼、对抗气血两痹。木兰属树皮已用于治疗痛经、腹疼、腹部胀气、恶心和消化不良。树皮也是用于治疗咳嗽和哮喘的配方中的成分。具有木兰属树皮的许多制剂用于治疗肺病，例如包括咳嗽和哮喘或肠道感染和痉挛，缓解各种原因引起的腹部肿胀和水肿。

双酚木脂素被鉴定为导致功效的主要活性组分。厚朴酚与和厚朴酚作为在木兰属树皮中发现的两种主要多酚化合物据报道具有多种药理学活性和功能，例如抗氧化、抗炎和抗肿瘤(Park 2004)。和厚朴酚的抗癌研究已扩展到若干不同的实体瘤类型，例如乳腺癌、前列腺癌、胃癌和卵巢癌，具有增强目前抗癌方案的潜力(Fried 2009)。和厚朴酚还减少炎症和氧化应激，在神经保护和葡萄糖调节方面提供有益作用，作为炎性疾病的治疗剂具有巨大潜力。特别地，已知厚朴酚与和厚朴酚对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及真菌(例如丙酸杆菌属和金黄色葡萄球菌)表现出有效的抗微生物活性，显示其作为有效对抗更具感染性和抗生素抗性的微生物的抗微生物剂的潜力(Bopaiah 2001；Bang 2000；Syu2004)。在商业化的木兰属树皮提取物中，和厚朴酚与厚朴酚的含量可以在1-99%变化。

厚朴酚与和厚朴酚

如在实施例13中证明的，木兰属提取物是可以用作目标化合物或组合物的一部分的预期的组分或成分。木兰属提取物可以从任何合适的来源获得，包括厚朴、渐尖木兰(Magnolia acuminate)、望春玉兰(Magnolia biondii)、可可木兰(Magnolia coco)、白玉兰(Magnolia denudate)、Magnolia fargesii、Magnolia garrettii、洋玉兰(Magnolia grandiflora)、大叶木兰(Magnolia henryi)、紫花玉兰(Magnolia liliflora)、乌心石舅(Magnolia kachirachirai)、日本辛夷(Magnolia Kobus)、日本厚朴(Magnolia obovata)、皱叶木兰(Magnolia praecocissima)、Magnolia pterocarpa、Magnolia pyramidata、有喙木兰(Magnolia rostrate)、Magnolia salicifolia、天女木兰(Magnolia sieboldii)、二乔玉兰(Magnolia soulangeana)、星状木兰(Magnolia stellate)、弗吉尼亚木兰(Magnolia virginiana)、桦树木质素退化产物、小花老鼠簕(Acanthus ebracteatus)、Aptosimum spinescens、台湾楤木(Aralia bipinnata)、狭叶南洋杉(Araucaria angustifolia)、智利南洋杉(Araucaria araucana)、苦艾(Artemisia absinthium)、大叶芸香(Haplophyllum acutifolium)、大叶芸香(Haplophyllum perforatum)、北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)、Krameria cystisoides、紫苏(Perilla frutescens)、肉桂肉豆蔻(Lawsonia inermis Myristica fragrans) (肉豆蔻(nutmeg))、云南拟单性木兰(Parakmeria yunnanensis)(优选属名木兰属(Magnolia))、日本鳄梨(Persea japonica)、海风藤(Piper futokadsura)、Piper wightii、野生番荔枝(Rollinia mucosa)、Sassafras randaiense、Scrophularia albida-colchica、瑞香狼毒(Stellera chamaejasme)、关东丁香(Syringa velutina)、海南蒲桃(Syzygium cumini)、Talauma gloriensis、Virola elongate、Urbanodendron verrucosum、Wikstroemia sikokiana或其组合。

如本文预期的，木兰属提取物可以富含一种或多种物质。从木兰属提取物中分离的预期的木酚素用任何合适的溶剂提取，包括CO₂超临界流体、水、甲醇、乙醇、醇、有机溶剂(例如乙酸乙酯、丙酮、丁醇)；水-混合溶剂或其组合或用超临界流体。在预期的实施方案中，木兰属提取物包含约0.01%至约99.9%的双酚木酚素。从木兰属提取物中分离的预期的木酚素是厚朴酚、和厚朴酚、厚朴醛D；厚朴醛D；4'-脱氧、6'-羟基；6,8-环氧-3,3'-木素-7,8'-二烯-4'-醇；3,3'-木素-8,8'-二烯-4,6'-二醇；3,3'-木素-8,8'-二烯-4,4'-二醇；3,3'-木素-8,8'-二烯-4,6'-二醇；7'-异构体(E-)；厚朴醛D；6'-甲氧基、4'-脱氧；厚朴醛A；厚朴醛A；6'-羟基、4'-脱氧；6,8-环氧-3,3'-木素-7,8'-二烯-4'-醇；9-羟基；3,3'-木素-8,8'-二烯-4,6'-二醇；6'-Me醚；3-甲酰基-2,2'-二羟基-5,5'-二-2-丙烯基联苯；厚朴醛A；6'-甲氧基、4'-脱氧；厚朴醛A；6-甲氧基、4-脱氧；3,3'-木素-8,8'-二烯-4,4'-二醇；4-乙醚；3,3'-木素-8,8'-二烯-4,4',5-三醇；5-Me醚；木兰属木脂素E；木兰属木脂素C；木兰属木脂素A；8',9'-二羟基和厚朴酚；3,3'-木素-8,8'-二烯-4,4'-二醇；4-O-(2-丙烯基)醚；4-羟基-6'-甲氧基-3,3'-木素-7,7'-二烯-9,9'-二醛；厚朴醛C；苏型Honokitriol；赤型Honokitriol；苏型木兰属木脂素B；赤型木兰属木脂素B；香豆木脂素；木兰属木脂素D；赤型木兰属木脂素D；5,5'-二烯丙基-2'-(3-甲基-2-丁烯氧基)联苯-2-醇；7-O-乙基Honokitriol；6'-氨基-3,3'-木素-8,8'-二烯-6-醇；N-[2-(4-羟基苯基)乙基]；HoupulinC；胡椒基厚朴酚；胡椒基和厚朴酚；冰片基厚朴酚；Houpulin I；Houpulin F；Houpulin G；Houpulin H；木兰属木脂素A 4'-葡糖苷；木兰属木脂素C 6'-葡糖苷；丁香三环烷厚朴酚；Eudeshonokiol A；Eudeshonokiol B；Eudesmagnolol或其组合。

预期的化合物、药用组合物和组合物可以包含或另外包含至少一种活性成分或由其组成。在一些实施方案中，至少一种生物活性成分可以包含植物粉末或植物提取物等或由其组成。

在任何上述实施方案中，包含提取物或化合物的混合物的组合物可以以特定的重量比混合。在实施例15中证明，山姜属提取物和胡椒属提取物可以分别以1:2的重量比共混。在某些实施方案中，本公开的两种提取物或化合物的比率(按重量计)在约0.5:5至约5:0.5的范围内。当使用多于两种提取物或化合物(例如，三种、四种、五种)时，适用类似的范围。示例性比率包括0.5:1、0.5:2、0.5:3、0.5:4、0.5:5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:2、2:3、2:4、2:5、3:1、3:2、3:3、3:4、3:5、4:1、4:2、4:3、4:4、4:5、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5、1:0.5、2:0.5、3:0.5、4:0.5或5:0.5。在实施例14中说明的某些实施方案中，将公开的山姜属和/或胡椒属和/或木兰属和/或地肤属的单独提取物分别以1:1:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1、5:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:1:5、1:2:3、1:2:4、1:2:5、1:2:6、1:2:6、1:2:8、1:2:9或1:2:10等重量比共混成具有3种单独提取物的组合物。在进一步的实施方案中，公开的山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独提取物已经组合成称为AMK的组合物，例如但不限于2:4:3和5:4:4的山姜属:木兰属:地肤属的共混比，如在实施例14中证明的。在进一步的实施方案中，以这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))，在体外和/或离体和/或体内模型中评价山姜属、胡椒属、木兰属和地肤属的单独提取物的所述组合的优点/缺点和感知的生物学功能的出乎意料的协同作用/拮抗，以及软骨细胞、细胞外基质、关节软骨和关节炎表型的合成代谢和分解代谢稳态的有效调节。基于在体外和/或离体和/或体内模型上测量的出乎意料的协同作用，选择具有特定共混比的山姜属或胡椒属或木兰属或地肤属的单独提取物的最佳组合物，所述协同作用是由于每种提取物中化学组分的多样性和每种提取物中不同类型生物活性化合物的不同作用机制，以及组合物中天然化合物对ADME的潜在增强以使生物输出最大化所致。

在任何上述实施方案中，包含提取物或化合物的混合物的组合物可以以一定的百分比水平或比率存在。在某些实施方案中，包含山姜属提取物和/或地肤属提取物的组合物可以包含0.1%-49.9%或约2%至约40%或约0.5%至约8%的乙酰氧基胡椒酚乙酸酯、0.1%-49.9%或约1%至约10%或约0.5%至约3%的苦瓜籽毒蛋白lc或其组合。在某些实施方案中，包含山姜属提取物的组合物可以包含约0.01%至约99.9%的乙酰氧基胡椒酚乙酸酯或包含至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(例如，1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯或二乙酸对香豆基酯或两者)。

在某些实例中，可以配制本公开的组合物以进一步包含药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中药物或营养制剂包含约0.05重量百分比(重量%)或0.5重量百分比(重量%)或5%或25%至约95重量%的提取物混合物的活性或主要活性成分。在进一步的实施方案中，药物或营养制剂包含约0.05重量百分比(重量%)至约90重量%、约0.5重量%至约80重量%、约0.5重量%至约75重量%、约0.5重量%至约70重量%、约0.5重量%至约50重量%、约1.0重量%至约40重量%、约1.0重量%至约20重量%、约1.0重量%至约10重量%、约3.0重量%至约9.0重量%、约5.0重量%至约10重量%、约3.0重量%至约6重量%的在提取物混合物中的主要活性成分等。在任何上述制剂中，将本公开的组合物配制成片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊、粉末或颗粒。

本文还预期所公开的化合物的药剂。这样的产物可以由例如所给予的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等产生，主要是由于酶促过程。因此，预期的化合物是通过包括将预期的化合物或组合物给予哺乳动物足以产生其代谢产物的时间段的过程产生的那些。通常通过向动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、猪、绵羊、马、猴或人)以可检测剂量给予放射性标记的或非放射性标记的本公开的化合物，允许足够的时间发生代谢，然后从尿、血液或其它生物样品中分离其转化产物，来鉴定这样的产物。

预期的化合物、药用组合物和组合物可以包含或另外包含至少一种药学上或营养学上或美容上可接受的载体、稀释剂或赋形剂或由其组成。本文所用的短语“药学上或营养学上或美容上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括美国食品和药物管理局批准的可接受用于人或家养动物的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。预期的化合物、药用组合物和组合物可以包含或另外包含至少一种药学上或营养学上或美容上可接受的盐或由其组成。本文所用的短语“药学上或营养学上或美容上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。

在一些实施方案中，来自公开的山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属的单独提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的生物活性剂可以任选地与其它RA和OA管理剂组合，例如非甾体抗炎剂/镇痛药、COX-2抑制剂，包括但不限于对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、阿司匹林、双氯芬酸、吲哚美辛、吡罗昔康、酮洛芬、水杨酸三乙醇胺；神经性疼痛缓解剂，例如利多卡因；生物药剂甲氨喋呤、IL-1和TNF-α抗体；促进关节健康的草药和/或植物提取物，包括但不限于大麻(大麻油)油或CBD/THC、全谱大麻提取物、姜黄提取物或姜黄素、榄仁树提取物、柳树树皮提取物、钩果草根提取物、辣椒提取物或辣椒素、花椒树皮提取物、Nexrutine或黄檗(philodendra)树皮提取物、Perluxan或啤酒花提取物、5-Loxin/Apresflex或乳香和/或齿叶乳香(Boswellia serrata)提取物、桑树根皮提取物、儿茶提取物、黄芩根提取物、蔷薇果提取物、迷迭香提取物、绿茶提取物、槐属提取物、薄荷或胡椒薄荷提取物、姜或黑姜提取物、绿茶或葡萄籽多酚、补骨脂酚或补骨脂籽提取物、鱼油、Piascledine或ASU、或促进关节健康的膳食补充剂，包括但不限于葡糖胺化合物例如硫酸葡糖胺、盐酸葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、氯化软骨素、硫酸软骨素和甲基磺酰基甲烷(MSM)、透明质酸、UC-II或未变性和/或变性的胶原、Ω-3和/或Ω-6脂肪酸、磷虾油、蛋壳膜(ESM)、γ-亚麻酸、绿唇贻贝(绿唇贻贝-GLM)、SAMe、不可皂化的鳄梨/大豆(ASU)提取物、柑橘生物类黄酮、金虎尾浓缩物、虾青素、碧萝芷、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B、维生素A、L-赖氨酸、钙、锰、锌以及一种或多种矿物氨基酸螯合物、硼和甘氨酸硼、二氧化硅、益生菌、樟脑和薄荷醇。

本公开的其它实施方案涉及公开的山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属的单独提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的使用方法，在本公开中，包括但不限于维持分解代谢/合成代谢生物标志物稳态。那些分解代谢生物标志物是但不限于TNF-α、IL-1β、IL-6、聚集蛋白聚糖酶和基质金属蛋白酶(MMP)例如MMP13、MMP9、MMP3、MMPl、uCTX-II和ADAMTS4；和那些合成代谢生物标志物是但不限于SOX 9、TGF-β1、ACAN、COL2A1和PIIANP。

本公开的其它实施方案涉及公开的山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属的单独提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的使用方法，在本公开中，包括但不限于维持软骨稳态，诱导软骨合成(并因此，合成代谢作用)并抑制退化和分解的分解代谢过程，保护细胞外基质完整性和关节软骨，使软骨退化最小化，减轻软骨分解，以及开始和/或促进和/或增强软骨合成，软骨更新和软骨重建，修复受损软骨，维持、重建和修复关节组织的细胞外基质，恢复关节结构，维持稳定的血流至关节，通过保护软骨完整性来促进健康关节，平衡合成代谢和分解代谢过程，维持滑液以用于哺乳动物的关节润滑，减少影响哺乳动物的关节健康的酶和促炎细胞因子的作用。

本公开的其它实施方案涉及公开的山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属的单独提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的使用方法，在本公开中，包括但不限于改进关节运动和/或身体功能，维持关节健康和老年活动性，支持、保护或促进关节舒适，减轻关节疼痛，减少关节摩擦，减轻关节僵硬，改进关节活动范围和/或灵活性，促进活动性，减少炎症，减少氧化应激，减少和防护关节磨损和撕裂，管理和/或治疗骨关节炎和/或类风湿性关节炎，预防骨关节炎和/或类风湿性关节炎，或逆转骨关节炎和/或类风湿性关节炎的进展；预防和治疗哺乳动物的幼年型类风湿性关节炎、斯蒂尔病、银屑病关节炎、反应性关节炎、脓毒性关节炎、赖特综合征、贝赫切特综合征或费尔蒂综合征等。

实施例

实施例1. 来自地肤果实的提取物的制备和HPLC定量

将干燥的地肤果实研磨成粉末。将20克地肤果实粉末与足够的硅藻土混合以填充100mL提取池，并通过使用ASE 350提取仪用100%乙醇(EE)、70%乙醇/水(70E)或50%乙醇/水(50E)提取(提取条件：加热=5分钟，静置=5分钟，冲洗=80体积，清洗=900秒，循环=3，压力=1500 psi，温度=60℃)。提取后，用旋转蒸发器在50℃和高真空下浓缩溶液，以生产固体提取物。

在于205 nm波长下检测的Hitachi HPLC系统中，用Luna C18反相柱(Phenomenex，10μm，250mm×4.6mm)定量地肤提取物中的目标组分，例如苦瓜籽毒蛋白lc。用0.1%三氟乙酸在水中(流动相A)和乙腈(流动相B)的二元梯度以1 ml/min流速和35℃柱温洗脱柱。

根据实施例xx产生的参考标准用作定量标准。所有样品在MeOH中制备，用于HPLC分析，标准浓度为约3 mg/ml，并且提取物样品浓度为约10 mg/ml。

表1. HPLC分析方法的梯度表

时间(分钟)	流动相A	流动相B
			0.0	70	30
20	0	100
			23	0	100
23.1	70	30
			30	70	30

表2：地肤提取物的提取和HPLC定量结果

样品ID	提取溶剂	提取率	提取物中的苦瓜籽毒蛋白lc
				R00577-EE	乙醇	17.8%	11.2%
R00577-70E	70%乙醇/水	22.2%	9.7%
				R00577-50E	50%乙醇/水	19.1%	9.9%

实施例2. 从地肤分离和纯化苦瓜籽毒蛋白lc

将来自地肤果实的乙醇提取物(EE，10 g)在有机溶剂(各100 ml)和水(150 ml)之间按己烷、EtOAC和BuOH的顺序分配，以产生己烷级分(HE)、EtOAC级分(EA)、BuOH级分(Bu)和水级分(WA)。化合物苦瓜籽毒蛋白lc富集BuOH级分(1.7 g)，标志物化合物从提取物中的9.7%增加到BuOH级分中的46.2%。

表3. 地肤提取物和级分对GAG释放的抑制

将BuOH级分(300 mg)注入制备型C18柱(21.1×250 mm)中，以10 mL/min运行，梯度开始于30%甲醇/0.1%甲酸水，然后在45分钟内将MeOH增加到100%，在100% MeOH下保持另外的15分钟。溶剂洗脱运行产生56个级分，然后基于在205 nm波长下检测的HPLC图谱将那些级分合并成20个最佳库。化合物苦瓜籽毒蛋白lc在最佳库RP17中分离(124 mg)，并在实施例17中说明的GAG释放抑制测定中显示活性。

实施例3. 从地肤提取物富集苦瓜籽毒蛋白lc的过程开发

将地肤果实粉末(100 g)在500 ml 0.25 M NaOH水溶液中回流一小时，然后在4000 rpm下离心以收集第一碱性水提取物，并在相同条件下再重复提取一次。然后将碱性水提取溶液合并，并用0.29 M HCl中和至pH 4，在此条件下，观察到溶液中的沉淀。通过以4000 rpm离心将沉淀物与上清液分离，然后用500 mL水洗涤以去除任何含盐的物质，并再次离心以去除上清液。再重复两次水洗。然后将500 mL乙醇加入到固体中，并将EtOH可溶性部分浓缩并在高真空下干燥，以获得11.8 g含有14%的苦瓜籽毒蛋白lc的固体。

将根据实施例1产生的地肤提取物R00577-EE (171 mg)、R00577-70E (262 mg)和R00577-50E (234 mg)在BuOH和水之间分配，收集BuOH级分，真空去除溶剂，并用如在实施例1中所述的定量方法定量所有三种BuOH级分。从50% EtOH提取物产生的BuOH级分显示最高的苦瓜籽毒蛋白lc含量(30%)。

将来自另一份收集R00782 (520 g)的地肤果实粉末等量分入两个烧瓶中，向每个烧瓶中加入600 ml的50%乙醇/水(50E)，回流1小时，通过过滤收集提取物，再回流两次。合并所有提取物(约3升)，在旋转蒸发器上将有机溶剂减少至约600 mL的最终体积，然后通过加入更多的水使体积达到2升。提取物用BuOH分配三次，每次约750 mL。用旋转蒸发器在高真空下干燥BuOH级分，产生34 g富集的BuOH级分。化合物苦瓜籽毒蛋白lc从50%乙醇提取物(50E)中的4.2%富集到BuOH级分中的24.3%。

表4：来自地肤的BuOH级分的HPLC定量结果

样品ID	BuOH级分重量(mg)	BuOH级分分布	提取物中的苦瓜籽毒蛋白lc
				R00577-EE-Bu	103.4	62%	5%
R00577-70E-Bu	92.8	36%	23%
				R00577-50E-Bu	48.3	22%	30%

实施例4. 以生产中试规模从地肤制备提取物

将干燥的地肤果实(18 kg)粉碎，并用5-10倍体积的乙醇在80℃下提取1小时，重复提取过程3次。每次提取后，过滤、浓缩并真空干燥煎剂以产生1.8 kg提取物。提取率为约10% (w/w)，并且提取物含有11.8%的苦瓜籽毒蛋白lc。

将干燥的地肤果实粉末(35 kg)用5-10倍体积的95%乙醇在90℃下提取1小时，然后过滤煎剂以得到溶液中的第一提取物。向生物质中加入新鲜溶剂，并将提取过程再重复2次。将来自三次重复的溶液中的提取物合并，浓缩，并在70-85℃之间的温度下真空干燥。将从35 kg植物粉末到提取物粉末的生产过程重复三次(3×35 kg)，以产生三批提取物，提取率在13-15%之间。将干燥的提取物研磨并与25%麦芽糖糊精共混，然后过筛以通过80目以产生细粉末提取物，最终产率为18%。这三批提取物分别含有8.4%、9.1%和8.6%的苦瓜籽毒蛋白lc。

实施例5. 来自胡椒果实的提取物的制备和HPLC定量

将胡椒果实粉末(314 g)等量分入两个烧瓶中，向每个烧瓶中加入600 mL有机溶剂50%甲醇在二氯甲烷中，回流1小时，通过过滤收集提取物，在相同条件下再重复回流两次。合并所有的提取溶液，在旋转蒸发器上去除溶剂，并在高真空下干燥提取物，产生31 g有机提取物(OE)。通过HPLC，该OE提取物含有33.7%胡椒碱。

使用相同的程序获得类似的结果，但是用甲醇或乙醇代替有机溶剂，以分别提供甲醇提取物(ME)或乙醇提取物(EE)、乙醇:H₂O (7:3)提取物、乙醇:H₂O (1:1)提取物、乙醇:H₂O (3:7)提取物和水提取物。

在Hitachi HPLC系统中，在254 nm下，用Luna C18反相柱(Phenomenex，10μm，250mm×4.6mm)定量胡椒有机提取物中的目标组分胡椒碱。用水(流动相A)和甲醇(流动相B)的二元梯度以1 mL/min流速和35℃柱温洗脱柱。参考标准胡椒碱(得自Sigma)用作定量标准。

表5.胡椒碱的HPLC分析方法的梯度表

时间(分钟)	流动相A	流动相B
			0.0	40	60
20	0	100
			23	0	100
23.1	40	60
			30	40	60

实施例6. 以生产中试规模从胡椒制备提取物

将干燥的胡椒果实(10 kg)粉碎并用5-10倍体积的70%乙醇/水在80℃下提取3小时，过滤以收集提取物，在相同的条件下再次提取2小时。合并来自两次提取的提取物，用旋转蒸发器去除溶剂，并将样品真空干燥以产生100 g 70%乙醇提取物(70E)。通过HPLC分析，提取物含有41.9%胡椒碱。

将干燥的胡椒果实粉碎并用90%乙醇在水中在80℃下提取。将溶液真空浓缩直到体积减少至小于20%，并在室温下静置以沉淀。收集固体，并在乙醇和水溶液中重结晶。标准化的15:1胡椒提取物含有不小于30%的胡椒碱。

实施例7. 从胡椒分级分离和纯化胡椒碱提取物

使如在实施例5中所述获得的干燥的胡椒果实的有机提取物(10.9 g)经受硅胶柱分级分离以跟踪GAG释放抑制活性。将OE提取物分开并分别装载到两个预填充的Biotage闪式柱(120 g二氧化硅，粒度32-60 μm，4 cm×19 cm)上，然后用己烷、EtOAc和甲醇(作为流动相)以20 mL/分钟的流速洗脱。梯度开始于100%己烷洗脱5分钟，然后在25分钟的持续时间内EtOAc从0%增加到100%，并在100% EtOAc下保持另外的五分钟，然后在下一个15分钟周期内将MeOH从0%增加到50% MeOH/EtOAc，最后将洗脱溶液变为100% MeOH，并洗脱柱持续另外的16分钟。总运行时间为66分钟，并且每次柱分级分离产生88个级分。通过硅胶薄层层析(TLC)分析级分，并且合并在一起以产生八个最佳库NP1至NP8。GAG释放抑制测定(实施例17)证实在最佳库4中活性最高，并且通过HPLC分析它含有77%的胡椒碱。

表6. 胡椒提取物和级分对GAG释放的抑制

实施例8. 来自山姜属根茎的提取物的制备和HPLC定量

将干燥的山姜属根茎研磨成粉末。将20克山姜属根茎粉末与足够的硅藻土混合以填充100mL提取池，并通过使用ASE 350提取仪(提取条件：加热=5分钟，静置=5分钟，冲洗=80体积，清洗=900秒，循环=3，压力=1500 psi，温度=60°C)用100%乙醇(EE)提取。提取后，用蒸发器在50℃下浓缩溶液，以产生固体提取物。

使用相同的程序获得类似的结果，但用甲醇或乙醇代替有机溶剂，以分别提供甲醇提取物(ME)或乙醇:H₂O (7:3)提取物、乙醇:H₂O (1:1)提取物、乙醇:H₂O (3:7)提取物和水提取物。

在Hitachi HPLC系统中在254 nm下用Luna C18反相柱(Phenomenex，10µm，250mm×4.6mm)定量提取物中的目标组分1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯。

表7. 1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的HPLC分析方法的梯度表

时间(分钟)	流动相A	流动相B
			0.0	70	30
20	0	80
			20.1	0	100
23	0	100
			23.1	70	30
30	70	30

用水(流动相A)和乙腈(流动相B)的二元梯度以1 ml/min流速和35°C柱温洗脱柱。购自LKT lab的参考标准1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯含有1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯和二乙酸对香豆基酯峰两者，其中色谱图纯度分别是62%和24%，用作定量标准。图2显示山姜属乙醇提取物在254 nm下的HPLC色谱图。

从印度、中国和泰国从不同的地质位置和不同的物种收集山姜属植物。如上所述用EtOH提取原料粉末。EtOH提取的产率和1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(标志物1)和二乙酸对香豆基酯(标志物2)的HPLC定量列于下表中。

表8：山姜属提取物的提取和HPLC定量结果

样品ID	拉丁名称	提取率	提取物中的标志物1	提取物中的标志物2	植物来源
						R00602-EE	高良姜	5%	1.6%	1.95%	中国
R00778-EE	大高良姜	4%	20%	0.46%	印度
						R00784-EE	大高良姜	3%	38%	0.8%	印度
R00787-EE	大高良姜	7%	17%	1.1%	印度
						R00958-EE	大高良姜	11%	22%	0.39%	印度
R00959-EE	大高良姜	5%	37%	0.8%	印度
						R00960-EE	高良姜	12%	0	0	中国
L0572-EE	高良姜	6%	31%	1.6%	中国
						L0666-EE	大高良姜	15%	0	0	印度
L0717-EE	大高良姜	5%	24%	1.11%	印度
						L0718-EE	大高良姜	7%	22%	0.44%	印度
L0719-EE	大高良姜	4%	21%	0.39%	印度
						L0720-EE	大高良姜	6%	22%	1.01%	印度
P05797-EE	大高良姜	16%	17%	0.9%	泰国

实施例9. 从山姜属根茎的提取物分离和纯化活性化合物

将大高良姜根茎干燥粉末(170 g)放置在烧瓶中，加入600 ml乙醇以回流1小时，通过过滤收集提取物，再重复回流两次。合并所有的提取溶液，在旋转蒸发器上去除溶剂，并在高真空下干燥提取物，产生27 g乙醇提取物(P05797-EE)。通过HPLC分析，该乙醇提取物含有17%的1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯。

将山姜属提取物P05797-EE (12 g)在有机溶剂(100 ml)和水(150 ml)之间按照己烷、EtOAc和BuOH的顺序分配，以产生己烷级分(4.2 g)、EtOAc级分(1.2 g)、BuOH级分(0.6 g)和水级分(5.1 g)。在己烷和EtOAc级分中发现GAG释放抑制活性。合并两种活性级分(5.4 g)，并负载到预填充的Biotage闪式柱(120 g二氧化硅，粒度32-60 μm，4 cm×19cm)上，然后用己烷、EtOAc和甲醇(作为流动相)以20 mL/分钟的流速洗脱。梯度开始于95%己烷/ EtOAc洗脱5分钟，然后在35分钟的持续时间内将EtOAC从5%逐渐增加到100%，然后在100% EtOAC下保持另外的5分钟，然后在下一个15分钟时间段内将MeOH从0增加至100%，最后在100% MeOH下保持另一个16分钟。总运行时间为66分钟，并产生88个级分。通过硅胶薄层层析(TLC)分析级分，并合并在一起以产生11个最佳库。最佳库NP3和最佳库NP4含有具有有效GAG释放抑制活性的大部分重量。

硅胶柱最佳库NP3 (200 mg)在制备型C18柱(21.1 mm×250 mm)上用40%甲醇/水至100%甲醇的线性梯度在45分钟内以10 mL/分钟的流速分级分离，以产生45个级分，然后基于在254 nm下的HPLC图谱合并为12个最佳库。最佳库RP3含有第一目标化合物1’-乙酰氧基胡椒酚酯(131.4 mg)，并证实GAG释放抑制活性(实施例17)。

表9. 山姜属提取物和级分对GAG释放的抑制

硅胶柱最佳库NP4 (210 mg)在制备型C18柱(21.1 mm×250 mm)上用30%乙腈/水至80%乙腈的线性梯度在42分钟内以10 mL/分钟的流速分级分离，以产生19个级分，然后基于在254 nm下的HPLC图谱合并为6个最佳库。最佳库RP3含有第二目标化合物二乙酸对香豆基酯(4.3 mg)，并证实GAG活性。

实施例10. 以生产规模从山姜属根茎制备EtOH提取物

将干燥的大高良姜根茎(40 kg)粉碎并用5-10倍体积的乙醇在80℃下提取3小时，过滤以收集提取物，在相同的条件下再次提取2小时。合并来自两次提取的提取溶液，用旋转蒸发器去除溶剂，并将样品真空干燥以产生2 kg乙醇提取物(EE)。通过HPLC定量，提取物含有约20%的1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯。

将干燥的大高良姜根茎粉碎并用95%乙醇提取。真空浓缩和干燥后，加入麦芽糊精将固体提取物粉碎，以产生具有6:1比率的根茎:提取物的提取物。该标准化的山姜属提取物含有4%-8%的化合物1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯。

实施例11. 从山姜属根茎制备超临界CO₂流体提取物

将大高良姜粉末(45 g)放置在100 ml不锈钢容器中，并用液态CO₂加压，加热至50℃的提取温度，然后加压至640巴的提取压力，然后开始超临界CO₂的动态流动。将含有超临界CO₂的提取物减压至收集小瓶中。75分钟后，可溶性组分提取完成，并产生1.23 g提取物，产率为2.96% (W/W)和56.7%的高良姜乙酸酯。CO₂提取完成后，将5%/W/W乙醇加入到超临界CO₂中，并在相同的温度和压力条件下继续提取相同的样品，以产生0.15 g含有4.7%高良姜乙酸酯的提取物。

另一提取遵循先前的提取方案，但从提取开始直至实验完成(300分钟)用超临界CO₂/EtOH 5% W/W进行，以产生1.18 g提取物(产率为2.58%)和47.3%的高良姜乙酸酯。

实施例12. 来自不同来源的山姜属提取物的HPLC定量

在中国和印度从不同地质位置和供应商处获得山姜属提取物，然后用在实施例8中描述的HPLC方法定量1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯。HPLC定量结果如下表所示。

表10. 山姜属提取物的HPLC定量结果

样品ID	提取物中的1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯	提取物中的二乙酸对香豆基酯
			L0660	0	0.04%
L0662	0	0
			L0667	1%	0.12%
L0679	4%	0.51%
			L0680	0%	0
L0702	4%	0.75%
			L0703	4%	0.75%
L0704	4%	0.72%
			L0705	10%	0.43%
L0721	1%	0.03%
			L0722	1%	0.03%
L0729	8%	0.40%
			L0730	9%	0.41%
L0731	8%	0.41%

实施例13. 从厚朴制备50%提取物

将干燥的厚朴树皮粉碎并用超临界CO₂提取，随后浓缩并真空干燥。将干燥的提取物与30%麦芽糊精共混，以产生10:1提取物的粉末。标准化的提取物含有不小于50%的厚朴酚与和厚朴酚的合并的总量。

证实在50%的厚朴提取物、30%的提取物、纯厚朴酚与和厚朴酚中的GAG活性，结果列于下表：

表11. 厚朴提取物和化合物对GAG释放的抑制

实施例14. 制备山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物

将地肤属籽的乙醇提取物(R00835-EE，360 g)在食品共混机中研磨成细粉末，然后将木兰属树皮提取物粉末(L0555，480 g)加入到同一共混机中并共混以确保粉末均匀。然后，将共混的地肤属和木兰属提取物粉末转移到准备与山姜属提取物混合的深不锈钢锅中。在烧杯中称出油状的山姜属提取物(R00829-EE，240 g)，并在400 ml MeOH中超声处理1小时，然后将上层液体转移到不锈钢锅中，同时搅拌以与地肤属和山姜属共混物混合。将烧杯中的一些剩余固体在更多MeOH中超声处理另外3次，每次100 ml，并且每次将顶部液体转移至锅中以混合，因此将所有山姜属提取物在MeOH中转移至不锈钢锅中以产生重量比为2:4:3的山姜属:木兰属:地肤属(AMK)的共混物。在45℃的烘箱中真空干燥混合的浆料一周，然后在台式草本植物研磨机中研磨以获得1042 g粉末。基于对每种成分的定量结果和共混比，该AMK组合物含有约4%的1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯、22%的厚朴酚/和厚朴酚以及4%的苦瓜籽毒蛋白lc。

通过共混本文所述的粉末形式的所有组分来制备重量比为5:4:4的另一种AMK组合物。单独称取山姜属提取物(L0795，30 g)、木兰属树皮提取物(L0789，24 g)和地肤属籽提取物(L0798A，24 g)，并放入食品共混机中混合，以获得一致的粉末。基于每种成分的定量结果和共混比，该AMK 5:4:4组合物含有约3%的1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯、18%的厚朴酚/和厚朴酚和3%的苦瓜籽毒蛋白lc。

山姜属和/或胡椒和/或木兰属和/或地肤属的单独的提取物可以以不同的比率组合到具有3种单独的提取物的组合物中，重量比分别包括1:1:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1、5:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:1:5、1:2:3、1:2:4、1:2:5、1:2:6、1:2:6、1:2:8、1:2:9或1:2:10等。

实施例15. 制备山姜属:胡椒属/胡椒(AP)组合物

在实施例10、11、12和6、7、8中分别公开了来自山姜属根茎和胡椒果实的生物活性剂的提取方法和定量。通过在小瓶中以1:2重量比称量山姜属和胡椒提取物并在每次测定前加入适当的溶液以超声处理和涡旋以使其均匀来制备山姜属:胡椒(AP)组合物。组合物含有约7%的1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯和20%胡椒碱。

山姜属和胡椒的单独的提取物可以以不同的比率组合到组合物中，比率在约0.5:5至约5:0.5的范围内，分别包括0.5:1，0.5:2、0.5:3、0.5:4、0.5:5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:2、2:3、2:4、2:5、3:1、3:2、3:3、3:4、3:5、4:1、4:2、4:3、4:4、4:5、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5、1:0.5、2:0.5、3:0.5、4:0.5或5:0.5，以重量计。

实施例16. 从山姜属、胡椒属/胡椒和木兰属制备提取物用于局部施用

许多草药已经被用作抗炎和疼痛控制，口服或局部施用作为替代药物。它们的疼痛缓解和抗炎性质与通过不同机制和途径具有潜在靶向的广泛类型的生物活性化合物相关。我们在制备和局部施用后寻找可以渗透皮肤并在需要它们的地方发挥作用的镇痛药，包括来自胡椒的生物碱、厚朴的双酚木酚素和来自大高良姜的苯丙素高良姜乙酸酯。这些活性剂代表不同类型的化学成分，并且可以通过不同的机制递送药理学作用。

根据每种物质的性质和溶解度，在DMSO、丙二醇、芦荟凝胶(1:2:1)的组合中或DMSO、丙二醇和MCT油(1:1:2)的组合中制备浓度为50 mg/mL的山姜属、胡椒和木兰属提取物。芦荟凝胶用作渗透增强剂以改进在局部给药期间的皮肤渗透。

实施例17. 用于测试山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属植物的单独的提取物、级分和化合物抑制糖胺聚糖(GAG)释放的程序

软骨组织主要由软骨细胞分泌的细胞外基质组成。组织的单独的组分包括胶原II纤维、透明质酸和蛋白聚糖，其由结合到蛋白质核心的糖胺聚糖(GAG)组成，例如硫酸软骨素或硫酸角蛋白。软骨组织的酶促分解导致这些组分在细胞外基质中的游离分子和被身体再吸收。

软骨外植体培养

在处死每只动物后，立即从兔(体重2.5 kg)的踝关节处取出关节软骨。按照Sandy等人，1986所述的方法获得关节软骨外植体。简言之，在无菌条件下手术暴露关节面后，解剖每个关节约200-220 mg关节表面，并浸没在完全培养基(DMEM，补充有热灭活的5% FBS；青霉素100 U/ml；链霉素100 μg/ml)中。然后用完全培养基漂洗它们若干次，并在37℃下在加湿的5% CO₂/95%空气培养箱中孵育2天以稳定。用基础培养基(DMEM，补充有热灭活的1%FBS、10 mM HEPES和青霉素100 U/ml、链霉素100 µg/ml)替换完全培养基。将约30 mg软骨碎片(2×3×0.35 mm/碎片)放置在48孔板中，并用给定浓度的测试试剂处理。预处理1小时后，向培养基中加入5 ng/ml rhIL-1α，并在37℃下在加湿的5% CO₂/95%空气培养箱中进一步孵育。24小时后收集培养基，并在-80℃下储存直到测定。

糖胺聚糖测量

通过1,9-二甲基亚甲蓝方法使用可商购获得的试剂盒(Blyscan蛋白聚糖和糖胺聚糖测定)根据制造商的说明书来确定反应结束时培养基中硫酸化的GAG的量，其反映关节软骨退化的量。300 µg/ml的双氯芬酸用作阳性对照。

实施例18. 通过山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属植物的单独的提取物抑制糖胺聚糖(GAG)释放

如在前述实施例中说明的，在离体糖胺聚糖(GAG)释放测定中测试山姜属、胡椒、木兰属和地肤属植物提取物的剂量曲线，以评估它们的软骨保护作用。在暴露于IL-1α之前，用每种提取物预处理软骨外植体，暴露于IL-1α引起软骨基质退化和GAG从中释放。发现每种提取物减少GAG释放的能力是剂量响应性的，其中IC₅₀值如下表指示。木兰属提取物引起最大的保护作用，其中IC₅₀为17.9 μg/mL。胡椒和地肤属提取物显示大致相同量的保护免于软骨退化，其中IC₅₀值分别是40.8 μg/mL和42.1 μg/mL。在四种测试的提取物中，山姜属显示最小的保护作用，其中IC₅₀值为71.6 μg/mL。如该测定所证明的，所有四种测试的提取物保护软骨免于退化。

表12. 山姜属、胡椒、木兰属和地肤属植物的单独的提取物的GAG释放IC₅₀值

提取的植物	GAG释放IC<sub>50</sub> (µg/mL)
		山姜属	71.6
胡椒	40.8
		木兰属	17.9
地肤属	42.1

四种测试的提取物表现出的抑制GAG释放指示它们抑制软骨退化，意味着它们抑制软骨分解代谢。我们通过测试提取物对基质金属蛋白酶(MMP)的直接抑制，并通过测试它们对分解代谢效应物转录的作用进一步探索了这种功能。

实施例19. 用于测试通过山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属植物的单独的提取物抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的程序

将山姜属、胡椒、木兰属和地肤属的单独的提取物植物以100 μg/mL与基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)或基质金属蛋白酶-13 (MMP-13)在50 mM MOPS (pH 7.2)、10 mM CaCl₂、10 µM ZnCl₂、1% DMSO、0.05% Brij 35和4.0 µM Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2(下文称为“底物”)中一起孵育。底物表现出荧光，并被两种MMP酶裂解，降低荧光输出。将底物、每种MMP酶和每种提取物在37℃下孵育两小时，并用荧光光谱定量底物的量。与媒介物对照相比，对于每种单独的提取物计算每种MMP酶的抑制百分比。TIMP-2用作抑制MMP的阳性对照。

实施例20. 通过山姜属、胡椒属/胡椒、木兰属和地肤属植物的单独的提取物抑制基质金属蛋白酶(MMP)

MMP酶由软骨组织中的软骨细胞表达，并在软骨退化中起重要作用，因为它们是OA疾病进展的分解代谢生物标志物。在细胞因子释放和增加的炎性信号传导后软骨细胞分泌MMP-13，并通过该酶的胶原酶活性导致软骨退化。MMP-9是明胶酶，它进一步分解部分消化的胶原。(Gepstein等人，2002)。直接抑制任一种酶(但尤其是MMP-13)都可能降低其活性，并导致致使软骨分解的分解代谢途径的下降。

通过测量与测试提取物孵育后荧光底物的剩余量，测试100 μg/mL的每种山姜属、胡椒、木兰属和地肤属植物的单独的提取物对MMP-9和MMP-13的抑制。每种提取物对每种MMP的抑制百分比示于下表中。胡椒属/胡椒和木兰属提取物对于MMP-13的抑制分别为70%和68%，并且对于MMP-9的抑制分别为44%和36%。山姜属提取物对MMP-13的抑制为38%，但不显著抑制MMP-9，因为抑制百分比仅为3%。地肤属提取物适度抑制两种酶，其中对MMP-13的抑制为10%，并且对MMP-9的抑制为3%。胡椒、木兰属和山姜属提取物通过直接结合和抑制MMP酶来降低MMP的活性。这对于这些单独的提取物对与软骨退化相关的分解代谢途径的作用具有重要的暗示。

表13. 通过山姜属、胡椒、木兰属和地肤属的单独的提取物抑制MMPS

提取物(100 µg/mL)	MMP-13%抑制	MMP-9%抑制
			山姜属	38	3
胡椒	70	44
			木兰属	68	36
地肤属	10	3

实施例21. 用IL-1处理人软骨细胞的分子生物学程序以及合成代谢和分解代谢基因表达的定量

制备细胞

将人软骨细胞(ScienCell，目录号4650)解冻并使用软骨细胞生长培养基(Sigma，目录号411-500)在T75 Falcon®组织培养烧瓶(VWR，目录号BD353136)中接种。将细胞在37℃和5% CO₂下孵育24小时，此时用新鲜的37℃软骨细胞生长培养基替换培养基。在37℃/5%CO₂下继续孵育另外的48小时，或直到软骨细胞变为约90%汇合。吸出培养基，并用2-4mLPBS (VWR，目录号VWRL0119-0500)漂洗细胞一次。将2 mL胰蛋白酶-EDTA (Sigma，目录号T3924-100ML)加入到烧瓶中，并让其静置约3-5分钟或直到大多数细胞脱落。将8 mL胰蛋白酶抑制剂(Sigma，目录号T6414-100ML)加入到烧瓶中，使总体积达到10 mL。将细胞溶液转移到15 mL锥形管中，并以1000 rpm离心5分钟。吸出上清液，并将软骨细胞重悬于1 mL软骨细胞生长培养基中。为了计数细胞，将10 μL等份的重悬的细胞加入到90 μL台盼蓝(VWR，目录号12002-038)中。将10 μL该溶液加入到血细胞计数器中。然后使用得自Sigma的软骨细胞生长培养基以约13,200个细胞/cm² (对于24孔板是25,000个细胞/孔，而对于96孔板是4,200个细胞/孔)的密度将细胞接种到24孔板和96孔板(VWR，目录号62406-159，62406-08)中。将软骨细胞在37℃/5% CO₂下孵育24小时。吸出培养基，并使用软骨细胞培养基基底(ScienCell，目录号4651-b)使软骨细胞血清饥饿。将细胞在37℃/5% CO₂下孵育24小时。

用IL-1β预处理

使用IL-1β (Sigma，目录号SRP3083)和ScienCell的基础软骨细胞培养基制备10ng/mL IL-1β预处理物。吸出旧培养基，并且对于24孔板用500 µL预处理溶液代替，而对于96孔板用100 μL预处理溶液代替。使用几个重复作为对照，并且不用10 ng/mL IL-1β预处理。相反，将新鲜的基础软骨细胞培养基加入到细胞中。将细胞在37℃/5% CO₂下孵育另外的24小时。

细胞的处理

使用以1M或50 mg/mL的浓度储存在DMSO和Sciencell的基础软骨细胞培养基中的植物提取物制备处理物。50 µg/mL Piascledine300和100 ng/mL BMP-2蛋白(Sigma，目录号SRP6155-10UG)用作阳性对照。所有处理物都使用VWR真空过滤单元(VWR，目录号10040-460)过滤，并使IL-1β浓度达到10 ng/mL (未处理的对照除外)。媒介物处理仅由的基础软骨细胞培养基和10 ng/mL IL-1β组成。从每个孔中吸出旧培养基，并对24孔板用500 μL处理物代替，而对96孔板用100 μL处理物代替。所有处理一式三份地应用。将细胞在37℃/5%CO₂下孵育72小时。

RNA提取和RT-PCR

在72小时处理暴露后，从24孔板中吸出培养基，并使用Qiagen的RNeasy试剂盒(Qiagen，目录号74104)和QIAshredder试剂盒(Qiagen，目录号79656)裂解细胞。最初将350μL具有1% β-巯基乙醇的RLT缓冲液加入到每个孔中，然后将裂解物混合物转移至QIAshredder柱以完成裂解步骤。根据制造商的说明书完成RNA提取程序的剩余部分。使用SuperScript IV First-Strand合成系统(Life Technologies，目录号18091200)根据制造商的说明进行RT-PCR。

cDNA定量和稀释

使用Qubit ssDNA测定试剂盒(Life Technologies，目录号Q10212)根据制造商的说明书定量cDNA。用dH₂O将每个cDNA样品稀释至2.5 ng/mL。

qPCR

在dH₂O将以下引物(Life Technologies，目录号A15612)稀释至8 µM：

Col2A1

F: AGACTTGCGTCTACCCCAATC R: GCAGGCGTAGGAAGGTCATC

ACAN

F: CACGATGCCTTTCACCACGAC R: TGCGGGTCAACAGTGCCTATC

Sox-9

F: GCTCTGGAGACTTCTGAACGA R: CCGTTCTTCACCGACTTCCT

TGFb1

F: GCAAGTGGACATCAACGGGT R: TCCGTGGAGCTGAAGCAATA

MMP-3

F: TGGACAAAGGATACAACAGGGAC R: ATCTTGAGACAGGCGGAACC

MMP-13

F: AACGCCAGACAAATGTGACCC R: TCCGCATCAACCTGCTGAGG

ADAMTS4

F: GCAACGTCAAGGCTCCTCTT R: CTCCACAAATCTACTCAGTGAAGCA

GAPDH

F: CAAGGCTGAGAACGGGAAGC R: AGGGGGCAGAGATGATGACC

每个qPCR反应由400 nM正向引物、400 nM反向引物、1 ng/μL cDNA组成，并用PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix (Applid Biosystems，目录号A25742)使总体积为24 μL。将10 μL每种反应物一式两份铺板于96孔反应板(Applid Biosystems，目录号4366932)上，并根据以下循环条件在Applid Biosystems StepOnePlus Real-Time PCRSystem上运行：50℃/2分钟；95℃/2分钟；40×[95℃/15秒-60℃/1分钟]。

细胞生存力

在72小时处理暴露后，将20 μL CellTiter 96® AQ_ueous One Solution CellProliferation Assay (Promega，目录号G3580)加入到96孔板中的每个孔中。100 μL的基础软骨细胞培养基用作空白。轻轻拍击板以混合溶液，并将软骨细胞在37℃/5% CO₂下孵育30分钟。孵育后，在492 nm下测量每个孔的吸光度。

实施例22. 用山姜属、木兰属、地肤属、胡椒属/胡椒以及山姜属和胡椒的组合的提取物处理的人软骨细胞中的合成代谢和分解代谢基因表达

25 μg/mL木兰属提取物导致显著减少分解代谢MMP-3和MMP-13的表达，合成代谢基因表达变化有限且不显著。这些数据指示，木兰属提取物通过在细胞外IL-1β存在下干扰升高的分解代谢基因表达而对抗细胞退化。与木兰属提取物相似，在10 μg/mL下，山姜属提取物显著减少MMP-13基因表达，同时显著上调SOX-9、ACAN和COL2A1。富集的地肤属提取物显著上调合成代谢ACAN、Sox-9和TGFβ1基因表达，同时对分解代谢标志物的下调作用较小。胡椒提取物具有相似的作用，引起COL2A1、ACAN、SOX-9和TGFβ1的上调，而不显著影响分解代谢标志物。山姜属:胡椒的组合显示MMP-13抑制的显著协同作用，同时还表现出ADAMTS4降低，并且TGFβ1保持增加。

表14：用山姜属、木兰属和地肤属的提取物孵育的人软骨细胞中合成代谢和分解代谢基因表达的倍数变化

总之，木兰属提取物可以有助于下调分解代谢稳态，地肤属和胡椒提取物两者都可以上调软骨细胞的合成代谢途径的基因表达，并且单独的和与胡椒提取物组合的山姜属可以显示两种活性。

实施例23. 用IL-1处理大鼠软骨细胞的分子生物学程序和TGF-β1基因表达的定量

制备细胞

从幼小大鼠的膝盖软骨分离用于单层培养的软骨细胞，并如下培养：将3周龄的Sprague Dawley大鼠安乐死，并收集它们的后肢。使用无菌手术刀刀片从软骨下骨切割膝盖软骨。在无血清Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中用胶原酶消化软骨削片。一旦消化，将细胞悬浮液离心以获得细胞沉淀物。将该沉淀物重悬于含有10% FBS的DMEM中，并计数细胞。然后将细胞以10,000个细胞/cm²的密度铺板在组织培养塑料上。然后在培养基(DMEM/FCS-10%，补充有HEPES (25mM))中在单层中扩增分离的软骨细胞，直到传代1，并在-80℃下冷冻。在所述实验中使用解冻的软骨细胞。

在第-1天接种软骨细胞，并在12孔板中在单层中培养24小时。处理(包括IL-1β)在第0天开始，并且进行3天。

进行以下17种处理或对照条件：

-未处理的细胞(在增殖培养基中培养)

-IL-1β处理的细胞

-IL-1β处理的细胞+媒介物

-IL-1β处理的细胞+BMP-2 (100 ng/mL)

-IL-1β处理的细胞+山姜属(25 μg/mL)

-IL-1β处理的细胞+胡椒(25 μg/mL)

-IL-1β处理的细胞+木兰属(25 μg/mL)

-IL-1β处理的细胞+地肤属(100 μg/mL)

所有处理和对照均一式三份进行。发现100 μg/mL的地肤属提取物是无毒的，并在该浓度下测试。由于细胞毒性，山姜属、胡椒和木兰属的提取物以25 μg/mL测试。裂解软骨细胞，并使用NucleoSpinR RNA II试剂盒(Macherey Nagel)纯化总RNA。

细胞的处理

使用以100 mg/mL的浓度储存在DMSO中并在培养基中稀释的植物提取物制备处理物。100 ng/mL BMP-2 蛋白质(RandD Systems，目录号355-BM-010)用作阳性对照。所有处理物均达到10 ng/mL的IL-1β浓度(未处理的对照除外)。媒介物处理仅由软骨细胞培养基、0.1% DMSO和10 ng/mL IL-1β组成。所有处理一式三份地应用。将细胞在37℃/5% CO₂下孵育72小时。

RNA提取和RT-PCR

裂解软骨细胞，并使用NucleoSpin R RNA II试剂盒(Macherey Nagel)纯化总RNA。使用M-MLV RT (Life Technologies)逆转录1微克总RNA。使用SuperScript IVFirst-Strand Synthesis System (Life Technologies，目录号18091200)根据制造商的说明书进行RT-PCR。

qPCR

使用以下引物：

TGFb1

F: CCCCTGGAAAGGGCTCAACAC R: TCCAACCCAGGTCCTTCCTAAAGTC

RPL19

F: TGCCGGAAGAACACCTTG R: GCAGGATCCTCATCCTTCG

β-肌动蛋白

F: CCAACCGTGAAAAGATGACC R: ACCAGAGGCATACAGGGACA

每个qPCR反应由5 µL iQ^TM SYBR Green Supermix (Biorad，ref 1708882)、0.6 µL正向引物(5 µM)、0.6 µL反向引物(5 µM)、1.8 µL H2O和2 µL cDNA (5 µg/μL)组成。

实施例24. 在独立试验中用山姜属、胡椒、木兰属和地肤属的提取物处理的大鼠软骨细胞中的TGF-β1基因表达

25 μg/mL木兰属提取物和100 μg/mL地肤属提取物导致显著增加合成代谢TGF-β1的表达，而山姜属和胡椒提取物没有显著作用。在本研究中，使用原代大鼠软骨细胞，在处理的同时加入IL-1β，并且没有预处理。在这些条件下，清楚的是，木兰属和地肤属提取物通过上调TGF-β1 (是软骨形成基因表达的调节剂)而有助于软骨形成。

表15. 在用地肤属、胡椒、木兰属和山姜属的提取物孵育的人软骨细胞中合成代谢和分解代谢基因表达的倍数变化

总之，木兰属提取物可以有助于下调人软骨细胞中的分解代谢基因和上调大鼠软骨细胞中的TGF-β1，而山姜属和地肤属提取物两者可以上调人软骨细胞的合成代谢基因表达同时下调分解代谢基因。地肤属提取物还显示上调大鼠软骨细胞中的TGF-β1基因表达，巩固其作为软骨细胞稳态中的合成代谢效应物的作用。

实施例25. 动物和圈养

大鼠购自USDA批准的供应商。Sprague Dawley大鼠在8周龄时购买，在到达时适应一周，然后随机分配到它们各自的组中。将大鼠(3只/笼)圈养在聚丙烯笼中，并通过它们尾部的数字单独的鉴定。每个笼子用金属丝棒盖和过滤的顶部(Allentown, NJ, USA)覆盖。每个单独的笼子都具有笼子卡片，以指示项目编号、测试制品、剂量水平、组和动物编号用于识别。使用Harlan T7087软玉米芯垫料，并且每周更换至少两次。给动物提供随意饮用的新鲜水和啮齿动物食物# T2018 (Harlan Teklad, 370W, Kent, WA, USA)，并在12小时的光-暗循环中圈养在温度受制的室(22.2℃)中。所有动物实验都根据与实验动物护理和使用指南一致的机构指南进行。

实施例26. 骨软骨缺陷(OCD)模型原理

多年来，已经引入各种体内模型用于软骨缺陷的治疗。其中，微骨折技术是通过利用身体自身的愈合潜能在修复过程中用于刺激骨髓的少数方法之一。该技术通过为新组织形成提供合适的环境来增强软骨表面重修。在模型诱导时，股骨软骨下骨板的暴露的承重表面将用精密钻头钻孔，直到脂肪滴和血液从微骨折的孔出来进入膝盖。这种骨髓“超级凝块(super clot)”为来自骨髓的身体自身的骨髓细胞(间充质干细胞)提供了最佳环境，以分化成适当的关节软骨样细胞系，所述细胞系进而生产细胞外基质，最终成熟为稳定的修复组织。

愈合过程在延长的时期内发生，其中术后管理对于更快和成功的恢复起关键作用。具有合成代谢活性的用于关节护理的天然膳食补充剂实际上可以通过增强身体的软骨再生过程来帮助更快的恢复。

在我们的实验室中，我们开发了改进的微骨折诱导的体内损伤模型，并评价在模型诱导后每天口服给药6周后，200 mg/kg的山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物对于其的合成代谢(软骨合成、更新、重建)活性。200 mg/kg口服剂量的Piascledine (鳄梨/大豆不皂化物)用作阳性对照。Piascledine (鳄梨/大豆不皂化物)是由制造商作为OA疾病调节剂推销的膳食补充剂，其具有在临床前体外和体内模型中证明的分解代谢和合成代谢作用。据报道，它具有已知通过抑制基质金属蛋白酶的释放和活性以及通过增加这些分解代谢酶的组织抑制剂来防止软骨退化的性质。其软骨修复活性也表明是抑制炎性细胞因子的结果(Christiansen等人，2015；Goudarzi等人，2018)。

实施例27. OCD模型诱导和给药

研究包括分成5组的总共55只大鼠(N=11/组)。另外五只大鼠用于钻头尺寸确定和模型优化。测试了0.35、0.6、0.9、1.35和2 mm的钻头尺寸，并选择1.35 mm的钻头。在模型诱导前，大鼠通过口服途径每天接受各自的剂量，持续2周。组包括：G1=正常对照，G2=OCD模型媒介物对照，G3=Piascledine (200 mg/kg)，和G4=AP (200 mg/kg)和G5=AMK (200 mg/kg)。

在诱导前处理开始的那天，每组的平均体重为357.3±16.4g。选择年老的大鼠用于本研究以使自发恢复的干扰最小化。在诱导前，每天给大鼠管饲以10 ml/kg/大鼠悬浮的新鲜制备的各自的材料，持续2周。将各动物的溶液中的样品涡旋以维持测试材料的均匀性。在诱导当天，在体重的基线测量(368.7±4.4 g)之后，在异氟烷镇静的大鼠的左后膝上制作小切口，并暴露股骨的承重表面上的软骨下骨。然后使用钻头(1.35 mm)在暴露的表面上使用手指旋转小心地诱导改进的微骨折钻孔，直到血液可见，作为除了正常对照组中的大鼠之外的所有组的骨髓充分渗透的指征，所述正常对照组遵循相同的外科手术程序而不钻孔。使用4-0包被的vicryl可吸收缝线缝合关节囊和皮肤，并将动物放回它们的笼中以从麻醉中恢复。

表16. 骨软骨缺陷模型(OCD)的研究组

组	N	剂量(mg/kg)
			对照+媒介物	11	0
OCD+媒介物	11	0
			OCD+Piascledine	11	200
OCD+AP	11	200
			OCD+AMK	11	200

诱导后，继续口服治疗6周。在第6周，使用平衡测痛仪监测大鼠的疼痛敏感性，以进行承重测量。在研究结束时，收集血清用于生物标志物分析。在尸检时，解剖出股胫关节，以双盲方式编码，用福尔马林保存并送至Nationwide Histology以用于受影响结构的组织病理学分析。对所有组的每只大鼠的关节组织进行拍照。由第三方认证的病理学家对盲化组织进行组织病理学分析，作为本研究的终点测量。

实施例28. 承重作为OCD模型中疼痛敏感性的量度

使用平衡测痛仪测量用在实施例14和15中产生的山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物治疗的OCD大鼠相对于媒介物和阳性对照的承重。在该方法中，大鼠将其体重转移到正常(未受影响的)腿上，以缓解由外科手术腿体重诱导的疼痛。在本研究中，预期大鼠在右腿上放置更多的重量。随着愈合的进展，体重分布可能变化，以反映“关节炎”在每条腿的愈合速度和疼痛耐受性方面的稳态。在所有组中，对每只大鼠的左腿进行手术。除了正常对照(NC)组(其经历相同的手术程序而不钻孔)外，所有大鼠都在左腿上接受钻孔。

表17. 对于用AMK和AP组合物治疗的OCD大鼠，相对于媒介物和阳性对照，作为疼痛敏感性量度的承重

如在表17中所见，大鼠将其体重转移到对侧爪(不进行手术的正常右腿)以缓解疼痛。随着时间的推移，大鼠逐渐开始在左腿上放置更多的重量，使得右腿承载更少的重量。在第6周，与媒介物组(仍然非常偏爱它们的右腿)相比，在用山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物治疗的大鼠的右腿和左腿之间存在统计学上显著的重量分布。当与媒介物治疗组相比时，用AMK和AP组合物治疗的大鼠在承重上分别显示59.9%和51.5%的改进。与正常对照大鼠相比，媒介物治疗的OCD大鼠在右腿上放置的重量增加6倍。阳性对照Piascledine显示45.6%的改进。

实施例29. 在 OCD模型中软骨再生标志物的组织病理学分析

根据Nationwide Histology的方案进行苏木精和曙红(HE)和番红O绿染色。通过视觉观察膝盖上的钻孔来证实模型的诱导(图3)。这也在以后通过组织病理学发现证实，其显示正常的外观和用于组织评价给出的评分。每个标本经历3个HE切片和另外3个番红O染色切片，其中每个块体具有相同的取向以穿过钻孔。据称，更全面的定量组织学评分系统(例如Sellers方法)可以在软骨修复的不同程度之间产生更高的辨别力，导致关节软骨修复的病理生理状况中的增强的敏感性和特异性。因此，我们建议病理学家使Sellers评价方法适应这项研究，并将数据制成表格，如在表18和19中所见。

如在表19和图3和4中所见，与媒介物治疗组相比，用AP组合物治疗的大鼠在以下方面显示统计学上显著的改进：1.相对于正常相邻软骨的表面填充缺损，2.修复的组织与周围关节软骨的整合，3.基质染色，和4.细胞形态。当与媒介物治疗的疾病模型大鼠相比时，发现这些改进分别是48.9%、73.5%、28.7%和50.5%。当与媒介物组相比时，对于表面构造和潮标(tidemark)的形成，亦观察到显著性的强烈趋势，分别为37.7% (p=0.07)和32.3%(p=0.07)。类似地，与媒介物治疗组相比，用AMK组合物治疗的大鼠在以下方面显示统计学上显著的改进：1.修复组织与周围关节软骨的整合，2.用番红O-固绿基质染色，3.细胞形态，4.表面的构造和潮标的形成。当与媒介物治疗的疾病模型大鼠相比时，发现这些改进分别是62.5%、33.0%、47.9%、44.3%和43.2%。另一方面，当与媒介物治疗的疾病模型相比时，阳性对照Piascledine在修复组织与周围关节软骨的整合(相对于媒介物治疗的OCD模型，改进62.5%)和表面构造(相对于媒介物治疗的OCD模型，改进35.7%)显示统计学上显著的改进。图3显示OCD大鼠在治疗6周后的钻孔部位的图像，显示不同口服治疗组的愈合进展的显著差异。

组织病理学结果清楚地证明，用山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物口服治疗OCD大鼠后，受损关节软骨的合成代谢变化和关节结构完整性的改进。例如但不限于AP和AMK组合物的天然膳食补充剂通过调节软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和关节表型来增加合成代谢活性。事实上，这些补充剂通过增强身体的软骨再生过程，有助于受损软骨的更快恢复和关节结构完整性的改进。特定的再生、更新、重建和再生长功能与以下相关，但不限于，相对于正常相邻软骨的表面填充缺陷、将修复组织与周围关节软骨整合、再生细胞外基质、改进细胞形态、更新整个缺陷内的构造、再生表面结构、增加新软骨下骨的百分比和增强潮标的形成。图4显示OCD大鼠软骨下骨在钻孔部位的番红O染色。黑色圆圈指示代表性动物组织病理学载玻片的钻孔部位。

表18. 来自治疗组的Sellers软骨再生参数

A-

B-相对于正常相邻软骨的表面填充缺陷，

C-修复组织与周围关节软骨的整合，

D-用番红O-固绿的基质染色，

D-细胞形态，

E-整个缺陷内的构造，

F-表面构造，

G-新的软骨下骨的百分比，

H-潮标的形成。

表19：根据组织病理学分析的Sellers方法的软骨修复评分

OrthP, Zurakowski D, Wincheringer D, Madry H. Reliability,reproducibility, and validation of five major histological scoring systemsfor experimental articular cartilage repair in the rabbit model. TissueEngPart C Methods. 2012年5月;18(5):329-39。

实施例30. 通过Sellers软骨再生组织病理学分析方法测量的来自OCD模型的组织的加速愈合

我们还通过将A到H的愈合过程中观察到的总体参数变化加起来分析来自组织病理学的数据。发现当用山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物 (实施例14和15)每天200 mg/kg持续6周治疗大鼠时，比起媒介物治疗组中的OCD大鼠，愈合分别增加40.5%和40.4% (表20)。如在该数据总结中所见，清楚明显的是，诱导了OCD模型，并且观察到作为AMK和AP口服治疗结果的愈合(并因此软骨修复、再生、更新、重建)的显著改进。为了比较，与媒介物治疗的OCD大鼠相比，Piascledine组仅显示10.9%更快的愈合过程。

表20. 根据Sellers组织病理学分析，软骨的加速愈合

实施例31. TGF-β1作为OCD大鼠中软骨合成的合成代谢调节剂

对于在实施例27-29中说明的OCD研究的生物标志物分析，在尸检时收集每只动物的心脏血液。将血液以3000 rpm旋转15分钟。从每只大鼠中分离约700-800 μL血清。将样品保持在-80℃直至使用。使用得自RandD Systems的Rat TGF-β1 Quantikine ELISA试剂盒(产品号：MB100B)如下测量大鼠血清中TGF-β1的存在：血清中的潜伏TGF-β1用1 N HCl活化，然后用1.2 N NaOH/0.5 M HEPES中和。将活化的血清稀释60倍，并加入到包被有TGF-β1抗体的微板中(血清的最终稀释因子为90)。在室温下2小时后，血清中的TGF-β1结合到板，并彻底洗涤板。将酶缀合的TGF-β1抗体加入到板中，并使其在室温下结合2小时。重复洗涤，并将酶底物加入到板中。在室温下显影30分钟后，加入终止溶液，并在450 nm下读取吸光度。基于TGF-β1标准曲线的吸光度读数计算TGF-β1的浓度。

如在下表21中所见，与媒介物治疗的OCD模型或正常对照大鼠相比，AP治疗组中TGF-β1的血清水平存在统计学上显著的增加。相对于正常对照组和媒介物治疗的OCD组，发现AP组合物的这些增加分别是19.5%和17.1%，而AMK组合物的增加分别是9.5%和7.3%。与媒介物治疗组相比，AMK治疗组中TGF-β1的增加不显著。

表21. 在用山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物治疗的OCD大鼠中作为软骨合成的合成代谢调节剂的TGF-β1

在合成代谢生物标志物中，发现在AP和AMK组合物治疗的大鼠中软骨合成的最相关的指标之一TGF-β1升高到这样的点，其中对于AP组，与媒介物治疗的OCD大鼠相比，该增加是统计学上显著的。大量的公开数据支持这样的事实，即已知该合成代谢因子参与软骨稳态的维持和通过软骨细胞刺激软骨修复过程。虽然TGF-β1在健康软骨中的水平高，但在患有OA的患者中其表达低。在患有关节炎的实验动物中，将TGF-β1注射到膝盖中增加蛋白聚糖的水平，同时保护免受软骨损失等，表明其在关节软骨的细胞外基质组分的重建和稳态中的重要性(van Beuningen等人，1994；Verdier等人，2003；Glansbeek等人，1998)。因此，在我们的研究中观察到的这些显著变化证明通过山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物将平衡向合成代谢方向倾斜，这可能与调节软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和受损关节的表型相关，其治疗作用比在媒介物治疗的OCD组中观察到的自发恢复快得多。

实施例32. 在角叉菜胶诱导的爪水肿模型中，单独的山姜属、胡椒、木兰属和地肤属提取物的症状缓解功能

大鼠中角叉菜胶诱导的爪水肿用于评价单独的山姜属、胡椒、木兰属和地肤属提取物的抗炎和抗疼痛活性。脚底内注射100 μl角叉菜胶后一小时，口服给予SpragueDawley (SD)大鼠(N=5/组) 300 mg/kg的山姜属、胡椒、木兰属和地肤属提取物。在T0 (角叉菜胶之前)和角叉菜胶之后2、4和6小时监测疼痛敏感性和爪水肿。作为阳性对照的布洛芬以150 mg/kg使用。如在下表22中所见，对于用来自山姜属、木兰属、地肤属和胡椒的提取物治疗的大鼠，分别观察到百分比降低的范围，例如爪水肿降低26.1-37.3%、7.5-33.2%、1-14.7%和17.9-32.3%，并且疼痛敏感性降低21.2-33.8%、15.3-27.1%、18-26.3%和23.2-33.2%。除了在地肤属治疗后5小时的爪水肿测量之外，所有治疗组均显示疼痛和炎症的统计学上显著减少。

表22. 用山姜属:胡椒属/胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物治疗的角叉菜胶大鼠的爪水肿降低和疼痛敏感性降低

实施例33. 角叉菜胶诱导的爪水肿模型中的先导组合物发现研究

角叉菜胶诱导的爪水肿模型用于评价天然组合物的抗炎和抗疼痛活性，所述天然组合物是来自山姜属和木兰属的单独的植物提取物以1:1 (150:150 mg/kg)、1:2 (100:200 mg/kg)、2:1 (200:100 mg/kg)、1:4 (60:240 mg/kg)和4:1 (240:60 mg/kg)的共混比的组合。以300 mg/kg的相同剂量口服给予大鼠组合物。如在下表23中所见，对于所有这些药用植物组合的测试比率，都观察到对疼痛和炎症的显著抑制。当用1:2比率的山姜属:木兰属治疗大鼠时，发现相对于其它比率，轻微较高的抑制。当与媒介物治疗的疾病模型相比时，1:2比率的山姜属和木兰属组合在治疗后1小时、3小时和5小时，分别显示疼痛降低36.7%、33.3%和29.3%并且炎症降低37.2%、34.5%和29.3%。在本研究中，我们观察到，当与以相同剂量给药的每个单独的植物相比时(与来自以上实施例32的数据相比)，以该特定比率组合这两种药用植物提取物产生对疼痛和炎症的更高抑制(在治疗后的第一小时和5小时)。结果是，我们选择例如但不限于1:2比率的山姜属与木兰属组合物用于更多随后的研究。

表23. 各种比率的山姜属/木兰属提取物的抗疼痛和抗炎活性

实施例34. 在角叉菜胶诱导的爪水肿模型中大高良姜和地肤的组合的抗疼痛和抗炎活性

角叉菜胶诱导的爪水肿模型用于评价山姜属和地肤属提取物的抗炎和抗疼痛活性，所述提取物以1:1 (150:150 mg/kg)、1:2 (100:200 mg/kg)、2:1 (200:100 mg/kg)、1:4 (60:240 mg/kg)和4:1 (240:60 mg/kg)的比率组合。口服给予大鼠组合物，总量为300mg/kg。如在下表24中所见，对于这些药用植物的所有测试的比率，观察到对疼痛和炎症的显著抑制。当用1:1山姜属:地肤属比率测试大鼠时发现相对于其它比率轻微更高的抑制，随后是4:1山姜属:地肤属比率。当与媒介物治疗的疾病模型相比时，治疗后1小时、3小时和5小时，1:1比率的山姜属和地肤属提取物的组合分别显示25.0%、27.6%和25.7%的疼痛降低和26.4%、30.9%和30.6%的炎症降低。类似地，当与媒介物治疗的疾病模型相比时，治疗后1小时、3小时和5小时，4:1比率的山姜属和地肤属提取物组合分别显示20.4%、26.9%和26.3%的疼痛降低和24.1%、30.7%和29.1%的炎症降低。

表24. 各种比率的山姜属和地肤属提取物的抗疼痛和抗炎活性

实施例35. 组合物AMK (山姜属、木兰属和地肤属)的症状缓解作用

在本实施例中，我们证明，但不限于，向山姜属:木兰属组合物中加入第三组分进一步增加组合物的功效。选择如在实施例22和24中证明的对软骨细胞具有合成代谢和分解代谢调节活性两者的地肤提取物作为第三组分，并在接下来的实施例中所示的角叉菜胶诱导的大鼠爪水肿模型中评价。角叉菜胶诱导的爪水肿在此再次用于评价与地肤属以4:1、2:1和1:1的比率共混的AM (1:2)，最终剂量为300 mg/kg。虽然加入地肤属似乎在所有比率下都促进AM的功效，但当向AM中以2:1比率(即2A:4M:3K)加入地肤属时，抗疼痛和抗炎活性有统计学上显著的增加。当与媒介物治疗的疾病模型相比时，在治疗后1小时、3小时和5小时，分别存在40.8%、45.2%和33.1%的疼痛降低和42.1%、37.8%和36.0%的炎症降低。这些抑制高于单独的提取物以及山姜属和木兰属组合。在该剂量下，最有效的组合物的最终比率确定为2A:4M:3K。

表25. 各种比率的AM和地肤属的抗疼痛和抗炎活性

实施例36. 在角叉菜胶诱导的大鼠爪水肿模型中，山姜属:木兰属:地肤属(AMK)组合物在减少疼痛和炎症中的协同活性

在本实施例中，在角叉菜胶大鼠爪水肿模型上进一步证明组合山姜属、木兰属和地肤属得到AMK (分别是2:4:3比率)的优点。按照每种成分分别在300 mg/kg的AMK中的量对大鼠管饲这些成分，以确定植物提取物是否协同作用。对于2:4:3比率的AMK，对大鼠给药67 mg/kg的山姜属提取物、133mg/kg的木兰属提取物和100mg/kg的地肤属提取物。将300mg/kg的组合的组合物的疼痛和炎症抑制百分比与单独提取物的剂量进行相比，以使用Colby方程找出组合中潜在的累加、拮抗或协同作用。

表26：在角叉菜胶诱导的大鼠爪水肿模型中，山姜属、木兰属和地肤属提取物的组合在减少疼痛和炎症中的协同活性

Colby协同作用方程，对于预期的=A-C+B

为了使这些植物提取物的共混具有出乎意料的协同作用，观察到的抑制需要大于计算的预期值。如在表26中所见，在每个监测的时间点观察到的功效实际上大于预期值，表明这些药用植物提取物在减少疼痛和炎症方面的协同作用。尽管先前报道的研究指示这些草药的潜在的抗炎活性，但它们中没有一种草药以本专利呈现的标准化共混物放在一起，且具有所描述的效力。

实施例37. 使用角叉菜胶诱导的爪水肿模型的AP组合物发现研究

角叉菜胶诱导的爪水肿模型用于评价山姜属和胡椒属/胡椒提取物的抗炎和抗疼痛活性，所述提取物以1:1 (150:150 mg/kg)、1:2 (100:200 mg/kg)、2:1 (200:100 mg/kg)、1:4 (60:240 mg/kg)和4:1 (240:60 mg/kg)的比率组合。口服给予大鼠组合物，总量为300 mg/kg。如在下表27中所见，对于这些药用植物的所有测试的比率，都观察到了对疼痛和炎症的显著抑制。当用1:2山姜属:胡椒属/胡椒比率测试大鼠时，发现相对于其它比率轻微更高的抑制。当与媒介物治疗的疾病模型相比时，以1:2比率组合的山姜属和胡椒属/胡椒提取物在治疗后1小时、3小时和5小时分别显示42.4%、44.3%和34.7%疼痛降低和39.2%、43.4%和33.7%炎症降低。选择该组合物用于剂量-反应和协同作用研究。

表27. 各种比率的山姜属和胡椒的抗疼痛和抗炎活性

实施例38. 选择的AP组合物的剂量-反应研究

当以300 mg/kg口服给予大鼠时，由于其在1:2比率下的炎症和疼痛的抑制，从先前体内实验选择组合物AP作为先导组合物。在此，我们评价该组合在100、200和300 mg/kg下给药的角叉菜胶诱导的大鼠爪水肿模型中的剂量-反应作用。如在下表28中所见，观察到组合物对炎症和疼痛的剂量相关抑制。对于组合物，在300 mg/kg下观察到最高的抗炎活性，随后是200 mg/kg和100 mg/kg。在治疗后1小时、3小时和5小时分别观察到42.8%、43.5%和32.0%的炎抑制症和44.8%、44.4%和34.7%的疼痛抑制。

表28. 组合物AP的抗疼痛和抗炎活性的剂量响应

实施例39. 在组合物AP中先导提取物的协同作用确定

在角叉菜胶大鼠爪水肿模型中评价山姜属与胡椒组合用于AP(1:2比率)的优点。按照以300 mg/kg AP呈现每种成分，对大鼠管饲每种成分。对于1:2比率的AP，将100 mg/kg的山姜属和200 mg/kg的胡椒提取物给予大鼠。将300 mg/kg组合物对疼痛和炎症的抑制百分比与单独的提取物的剂量进行相比，使用Colby方程(Colby 1967)找出组合的潜在的累加、拮抗或协同作用。为了使这些植物提取物的共混具有出乎意料的协同作用，观察到的抑制需要大于计算值。

表29. 在1A2P组合中山姜属和胡椒的出乎意料的协同活性

Colby协同作用方程，对于预期的：(X+Y)-XY/100

如在表29中所见，在每个监测的时间点观察到的功效实际上大于预期值，表明这些植物提取物在减少疼痛和炎症方面的出乎意料的协同活性。

实施例40. 在胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠模型中，通过组合物山姜属:木兰属:地肤属(AMK)刺激软骨合成和抑制软骨退化

已经描述了骨、软骨和滑膜的若干生物标志物，并且已经研究了患有OA的患者中它们的变化，以提供干预的功效、疾病预后、诊断和进展(Garnero等人，2000)。软骨损失被认为是由于OA患者中修复过程降低和退化活性增加的组合导致的软骨稳态向分解代谢方向的失衡所致。由于软骨修复能力有限，并且由于II型胶原是软骨基质中最丰富的蛋白质，评估II型胶原合成和退化似乎是评估OA干预的功效的可行的方法。例如，来自患有OA的患者和健康对照的软骨组织显示II型胶原的合成改变和退化增加两者(Nelson等人，1998；Billinghurst等人，1997)。

因此，使用两种生物标志物(每种都解决关节软骨(特别是II型胶原)的合成或退化)可以用作工具以更好地预测OA进展或OA治疗的功效。该方法与关节软骨稳态的合成代谢和分解代谢过程两者结合。在软骨发育期间，II型胶原合成为具有N-和C-前肽末端的前胶原，并且由于可变RNA剪接的结果，II型前胶原以两种形式(A型和B型)产生。在分泌时和在将II型胶原结合到ECM中之前，前肽中的任一种从滑液释放到血液循环中可以用于确定软骨合成或再生或重建的速率。另一方面，II型胶原的尿C-端肽(uCTX-II)是软骨退化的主要标志物。II型胶原的尿C-末端端肽(uCTX-II)迄今为止已经被研究得最多，并且经常被提及和验证为软骨退化的生物标志物，其可以用于诊断、确定疾病的严重性或疾病进展的程度、预后和监测治疗功效的目的(Oesterggaard等人，2006)。在临床研究中，高水平的uCTX-II是关节破坏风险增加的良好预测物(Garnero等人，2001)。

我们使用两种主要生物标志物(uCTX-II和PIIANP)来确定在胶原诱导的大鼠关节炎模型中口服给予新组合物山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)的软骨退化稳态(并因此分解代谢活性)和软骨重建(并因此合成代谢活性)作用。以前，Garnero等人测量了这些标志物[II型胶原合成和退化：分别是IIA型前胶原的N-前肽(PIIANP)和尿CTX-II]，并将它们与OA患者的放射照片和关节镜检查的发现相关联。他们的发现显示，PIIANP的血清水平低而CTX-II尿水平高的患者具有OA进展的相对风险，经放射照相术风险为2.9，而经关节镜检查风险为9.3 (Garnero等人，2002)。他们解释了他们观察到这些患者在胶原合成和退化之间具有解偶联作用，这更倾向于OA的进展。

表30. II型胶原合成和退化预测OA干预的功效。

采用他们的方法，我们分别使用来自PIIANP和uCTX-II的数据计算用于软骨合成和退化的Z因子。为了使干预驱使OA分解代谢进展朝向合成代谢或再生活性，Z评分值必须接近零。如在下表30中所见，AMK的再生Z评分值(AMK：-0.59±0.20相对于CIA：-1.39±0.23，显示来自AMK的更少受损重建功能)和退化Z-评分值(AMK：-0.07±0.45相对于CIA：1.59±0.31，显示来自AMK的更少退化) (表30)与媒介物治疗的疾病组(CIA组)显著不同。相对于媒介物治疗的CIA大鼠，发现对于AMK和氨甲蝶呤治疗的动物，通过诱导软骨合成和防止其退化而驱动OA进展朝向常态的这些改进分别是82.6%和56.4%。

实施例41. 胶原诱导的关节炎模型诱导和AMK治疗

雄性Sprague Dawley大鼠(7-8周龄，n=40)购自Charles River LaboratoriesInc. (Wilmington, MA, USA)，并在到达时适应两周，然后随机分配到它们各自的治疗组：G1=正常对照(−) (n=10/组)，G2=胶原诱导的关节炎(CIA)+媒介物(0.5%羧甲基纤维素) (n=10/组)，G3=CIA+氨甲蝶呤(+) (75 µg/kg) (n=10/组)，和G4=CIA+AMK (+) (200 mg/kg)(n=10/组)。在模型诱导前两周开始治疗，然后持续另外的三周。来自牛鼻中隔的II型胶原(Lot # 845)和不完全弗氏佐剂(IFA) (Lot # SLBR0642v)分别购自Elastin ProductsCompany (Owensville, MI, USA)和Sigma (St. Louise, MO, USA)。将所有材料保持在制造商推荐的合适的温度下。制备时，称取60 mg胶原，并在具有磁力搅拌器的60 mL大小的烧瓶中，加入到预先冷却的15 mL 0.1M乙酸中，产生4 mg/mL浓度(Brand等人，2003；Rosloniec等人，2001)。

通过在4℃下轻轻搅拌过夜将混合物溶解。第二天早晨，用等体积的IFA (15 mL)使溶解的胶原乳化，以实现2 mg/mL胶原的最终浓度。然后，使用配有26 G针头的1 mL注射器，在大鼠尾部基底的两个部位，用400 μL乳化的胶原皮内引发用异氟烷镇静的大鼠。将溶解的混合物保持在冰桶中，并在各组注射时进行搅拌以保持均匀的稠度。在第七天，以100μL/大鼠/部位用2 mg/mL II型胶原(用等体积的不完全佐剂乳化)的加强剂量接种大鼠。

在研究过程期间监测临床发现，例如关节炎严重性指数、爪厚度、踝直径(使用Digital Absolute，型号#PK-0505CPX, Mitutoyo Corporation, Kawasaki, Japan)和疼痛敏感性(使用Randall Salitto, IITC Life Science Inc., Woodland Hills, CA,USA)。在模型诱导后治疗三周后，使用代谢笼从过夜禁食的大鼠收集尿。在尸检时，从每只动物收集心脏血清和滑液灌洗液(将100 μL盐水注射到关节腔内并吸回到注射器)用于生物标志物和踝关节组织病理学。

使用线性梯形法则计算第9-21天的曲线下面积(AUC)。抑制%={(治疗的平均值-CIA+的平均值)/(对照的平均值-CIA的平均值)}*100。

实施例42. 在CIA模型中通过组合物AMK降低大鼠的关节炎严重性指数

在研究的持续时间，大鼠继续显示疾病的缓慢进展。从数据中可见，用氨甲蝶呤和AMK治疗的大鼠从第12天开始显示统计学上显著抑制关节炎严重性，并且在研究的持续时间持续这种显著性(表31)。

在研究结束时，对于用媒介物、氨甲蝶呤和AMK治疗的大鼠，观察到的平均严重性评分分别是3.75±0.32、1.78±0.79和1.95±1.17。它证明AMK和氨甲蝶呤治疗的作用和效力的明显区别。当计算关节炎严重性曲线下面积时，对于阳性对照氨甲蝶呤和AMK治疗分别观察到具有统计学显著性的62.55% (p=0.04)和51.35% (p=0.04)的降低百分比(表31)。

实施例43. 通过组合物AMK降低CIA大鼠的踝直径，指示其抗关节炎活性

与严重性评分一致，用氨甲蝶呤和AMK治疗的大鼠从第12天开始显示踝直径的统计学上显著减少，并且在研究的持续时间保持该显著性(表32)。当考虑第9-21天的曲线下面积时，这些组显示踝宽度的统计学上显著减少。对于用氨甲蝶呤和AMK治疗的大鼠，分别观察到具有统计学显著性的踝直径65.94%和55.84%的降低百分比(表32)。

实施例44. 通过组合物AMK降低CIA大鼠的爪厚度，指示其抗关节炎活性

与严重性评分和踝直径一致，用氨甲蝶呤和AMK治疗的大鼠从第12天开始显示爪肿胀的统计学上显著减少；在研究的持续时间保持该显著性(表33)。当考虑肿胀曲线下总面积(第12天至第21天)时，与媒介物治疗的CIA组相比，氨甲蝶呤和AMK组分别显示爪水肿在统计学上显著减少(71.7%和64.3%) (表34)。

实施例45. 用组合物山姜属:木兰属:地肤属(AMK)治疗的CIA大鼠的关节炎指数、踝直径和爪厚度响应曲线下面积(AUC)

如在上表34中所见，当与媒介物治疗的CIA大鼠相比时，在研究时期的过程期间，用AP治疗的大鼠在爪厚度、踝直径和关节炎严重性指数方面分别显示64.23%、55.8%和51.4%抑制。这些降低在每个参数中超过50%，并且对于每个参数是统计学上显著的，指示组合物AMK在减少关节炎相关的症状中的效力。相比之下，氨甲蝶呤治疗的大鼠在爪厚度、踝直径和关节炎严重指数方面分别显示71.7%、65.9%和62.6%减少。

实施例46. 在CIA大鼠中，通过组合物山姜属:木兰属:地肤属(AMK)减少压迫诱导的疼痛，指示其症状缓解活性

在引发日、加强日和第12、14、16、19和21天，使用附着于电子监测器的Randall-Salitto探针评估对压力的反应作为疼痛敏感性的量度。在这些天监测左和右后腿两者，并将它们的平均值用于数据分析。相对于媒介物治疗的CIA大鼠的变化被报道为这些天的疼痛耐受性。在疾病模型中，在氨甲蝶呤组中观察到大鼠最高的疼痛耐受性，随后是AMK组(表35)。在第12、14、16、19和21天，氨甲蝶呤分别降低6.8%、13.5%、28.2%、40.8%和43.9%，而AMK分别降低6.9%、17.5%、23.2%、32.4%和39.0%，这些降低从第12天起是统计学上显著的，并且在研究的持续时间保持显著，除了氨甲蝶呤组的第14天，此时降低不是统计学上显著的。

表31. 在CIA模型中用AMK治疗的大鼠的关节炎严重性指数的变化：

表32. 用山姜属:木兰属:地肤属(AMK)治疗的CIA大鼠的踝宽度变化

表33. 在CIA大鼠中，山姜属:木兰属:地肤属(AMK)的爪厚度变化作为抗关节炎作用的量度

表34. 用山姜属:木兰属:地肤属(AMK)治疗的CIA大鼠的响应曲线下面积

表35. 在CIA大鼠中山姜属:木兰属:地肤属(AMK)的抗疼痛活性

实施例47. 在CIA大鼠中通过组合物山姜属:木兰属:地肤属(AMK)降低促炎细胞因子和基质降解酶

使用得自R&D Systems的大鼠IL-1β、TNF-α和IL-6 Quantikine ELISA试剂盒(产品号：对于IL-1β为RLB00，对于TNF-α为RTA00，并且对于IL-6为R6000B)如下测量分解代谢细胞因子IL-1β、TNF-α或IL-6的存在：将稀释的血清加入到包被有多克隆IL-1β、TNF-α或IL-6抗体的微板中，并使其在室温下结合2小时。彻底洗涤微板以去除未结合的血清，然后加入多克隆酶缀合的IL-1β、TNF-α或IL-6抗体，并使其在室温下结合2小时。重复洗涤，加入酶底物，并将板在室温下显影30分钟。加入终止溶液后，在450 nm下读取吸光度，乘以稀释因子，并基于IL-1β/TNF-α/IL-6标准曲线的吸光度读数计算IL-1β/TNF-α/IL-6的浓度。

使用得自Mybiosource的大鼠基质金属蛋白酶13 (MMP-13) ELISA试剂盒(对于MMP-13，产品号：MBS702112)如下测量软骨降解酶MMP-13的存在：将血清加入到包被有MMP-13抗体的微板中，并使其在37℃下结合2小时。去除样品，然后加入生物素-缀合的MMP-13抗体，并使其在37℃下结合1小时。彻底洗涤微板，并且加入抗生物素蛋白缀合的辣根过氧化物酶，并使其在37℃下结合1小时。然后加入酶底物，并将板在37℃下显影30分钟。加入终止溶液后，在450 nm下读取吸光度，乘以稀释因子，并基于MMP-13标准曲线的吸光度读数计算MMP-13的浓度。

分解代谢细胞因子的产生增加是胶原诱导的关节炎病理的组成部分。当与媒介物治疗的CIA组相比时，用AMK组合物治疗的大鼠显示血清IL-1β水平统计学上显著减少(表36)。类似地，对于用AMK或氨甲蝶呤治疗的CIA大鼠，观察到血清TNF-α和IL-6水平显著减少。如在表36中描述的，与正常对照相比，对于媒介物治疗的CIA组，观察到血清分解代谢细胞因子IL-1β和IL-6水平显著增加。当与媒介物治疗的患病大鼠相比时，AMK治疗的大鼠显示血清IL-1β (67.4%抑制，与患病对照相比)、IL-6 (60.2%抑制，与患病对照相比)和TNF-α(75.5%抑制，与患病对照相比)水平的统计学上显著减少(表36)。当与媒介物治疗的患病大鼠相比时，氨甲蝶呤治疗的大鼠显示降低的血清IL-1β (71.5%抑制，与患病对照相比)、IL-6 (78.6%抑制，与患病对照相比)和TNF-α (86.2%抑制，与患病对照相比)水平(表36)。本实施例清楚地证明，天然AMK组合物能够减少关节炎动物的分解代谢过程。

类似地，当与正常对照大鼠相比时，对于媒介物治疗的关节炎患病大鼠，观察到血清MMP-13水平的显著增加。如在表36中所见，与媒介物治疗的CIA大鼠相比，用AMK治疗的CIA大鼠显示分解代谢软骨降解酶MMP-13水平统计学上显著减少。相对于CIA治疗的大鼠，AMK治疗的CIA大鼠对于MMP-13的这种81.4%抑制经计算在统计学上是显著的。对于阳性药物对照氨甲蝶呤治疗的大鼠，尽管它不是统计学上显著的，血清MMP-13水平有显著减少(78.6%，与媒介物治疗的CIA大鼠相比)。

表36. 在CIA大鼠中，山姜属:木兰属:地肤属(AMK)对促炎细胞因子的作用

实施例48. 在CIA大鼠中，山姜属:木兰属:地肤属(AMK)的减少的软骨退化和增加的软骨再生/重建活性

使用得自Mybiosource的Rat CTX-II ELISA试剂盒(产品号：MBS2880519)如下测量软骨退化生物标志物uCTX-II的存在：将稀释的尿加入到包被有CTX-II抗体的微板中，并使其在37℃下结合2小时。然后加入针对CTX-II的生物素缀合的抗体，并使其在37℃下结合来自大鼠尿的CTX-II达1小时。彻底洗涤微板以去除未结合的尿和抗体，然后加入酶缀合的抗生物素蛋白抗体以结合生物素缀合的抗体，用于特异性检测。使抗生物素蛋白抗体在37℃下结合1小时。重复洗涤，加入酶底物，并使板在37℃下显影30分钟。加入终止溶液后，在450 nm下读取吸光度，乘以稀释因子，并且基于CTX-II标准曲线的吸光度读数计算CTX-II的浓度。使用得自R&D Systems的肌酸酐参数测定试剂盒(产品号：KGE005)如下将CTX-II量标准化为尿中肌酸酐的量：将尿1:20稀释，与碱性苦味酸盐(5份0.13%苦味酸:1份1 NNaOH)在微板中混合，并在室温下孵育30分钟。在492 nm下读取吸光度，并且基于肌酐标准曲线的吸光度读数计算尿中的肌酸酐量。

使用得自Mybiosource的IIA型大鼠前胶原N-Prop (PIIANP) ELISA试剂盒(产品号：MBS9399069)如下测量软骨再生/重建生物标志物PIIANP的存在：将滑液加入到包被有PIIANP抗体以及HRP缀合的PIIANP抗体的微板中，并使其在37℃下结合一小时。彻底洗涤微板，并加入生色团溶液，并使其在37℃下结合15分钟。加入终止溶液后，在450 nm下读取吸光度，并基于PIIANP标准曲线的吸光度读数计算PIIANP的浓度。

在关节炎疾病模型和治疗组两者中都观察到显著的尿CTX-II水平变化。如在表37中提供的，与正常对照动物相比，对于媒介物治疗的CIA组，观察到尿CTX-II水平统计学上显著的增加，证实患病动物的分解代谢过程增加。较高水平的尿CTX-II是软骨退化的体征，其被组合物AMK显著抑制。与媒介物治疗的患病CIA大鼠相比，用AMK治疗避免软骨的显著退化(抑制至多36.7%)。与CIA相比，阳性对照氨甲蝶呤显示26.4%的软骨退化生物标志物抑制，p=0.06。

类似地，通过测量软骨合成/再生/重建生物标志物滑液PIIANP证实AMK组合物的合成代谢作用。如在下表37中所见，当与媒介物治疗的CIA大鼠相比时，对于用AMK治疗的大鼠，观察到滑液PIIANP的统计学上显著的增加。当与媒介物治疗的CIA大鼠相比时，该AMK治疗组的大鼠显示软骨合成/再生/重建生物标志物滑液PIIANP增加79.4%。与媒介物治疗的CIA大鼠相比，氨甲蝶呤治疗的大鼠显示软骨修复增加69.8%。相反，媒介物治疗的CIA大鼠经历PIIANP水平减少超过19倍，指示相对于修复，关节炎动物更多朝向软骨退化转变。

表37. 在CIA大鼠中，AMK的抗分解代谢和合成代谢活性

实施例49. 用山姜属:木兰属:地肤属(AMK)治疗的CIA大鼠的组织病理学发现

对于组织病理学检查，将踝关节保持在10%福尔马林中72 小时。然后用Calci-Clear Rapid将固定的标本脱钙一天半，并包埋在石蜡中。在关节矢状面的内侧和外侧截面获得标准化的5 μm系列切片，并用苏木精和曙红(HE)和番红O-固绿染色，以能够评价蛋白聚糖含量。使用改进的Mankin系统(Mankin等人，1971)对由疾病进展和/或治疗功效引起的关节组织的结构和细胞改变进行评分。组织学分析在Nationwide Histology进行，并由认证的病理学家检查载玻片。

组织病理学数据与关节炎的严重性评分一致。当与正常对照大鼠相比时，媒介物治疗的大鼠显示严重的滑膜炎、显著的软骨退化、滑液增生、关节翳形成和骨侵蚀(图5，表38)。与正常对照相比，对于媒介物治疗的CIA大鼠，这些变化分别反映为软骨退化、GAG损失、骨侵蚀和炎症增加3.3倍、3.8倍、4.7倍和24.2倍。相反，用AMK治疗的大鼠具有几乎正常的形态，其中基质完整性的改变最小，关节软骨表面更光滑，单核细胞浸润和滑液增生水平低，以及关节骨损伤减少。与媒介物治疗的CIA大鼠相比，发现组合物AMK的软骨保护(并因此抗分解代谢活性)为65.1%，其中基质完整性维持61.9%。与生物标志物数据(分解代谢细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6减少)一致，当与媒介物治疗的CIA大鼠相比时，组合物AMK治疗的大鼠中炎症减少88.2%。对于用AMK组合物治疗的CIA大鼠，骨侵蚀也有73.1%的减少。与媒介物治疗的CIA大鼠相比，对于每个监测的参数这些变化都是统计学上显著的。

表38. 用山姜属:木兰属:地肤属(AMK)治疗的CIA大鼠的组织病理学发现

图5显示来自用AMK和MTX治疗的CIA诱导大鼠的踝关节的组织病理学图像(HE a-d和番红O e-f)。a和e-正常对照，b和f-CIA+媒介物，c和g-CIA+MTX，d和h-CIA+AMK。

根据本文本主题中如实施例40-49所述CIA模型的山姜属:木兰属:地肤属(AMK)功效结果的记载，在CIA模型中进行AMK的剂量-反应研究，以推断FDA建议的最佳人等效剂量转化(http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm)。在该FDA的行业指南中，对于大鼠剂量(以mg/kg表示)转换为人，提出了0.16的转换因子(即，大鼠剂量(以mg/kg表示)乘以0.16=人等效剂量(以mg/kg表示)。因此，在该CIA研究中，以40、60、80和120 mg/kg/天的AMK口服剂量给予大鼠5周。这些剂量将为平均70kg成人提供448、672、896和1344 mg/天的人等效剂量。我们相信，这种剂量-反应研究的结果将为将来的人类临床试验剂量确定提供基础。

实施例50. 第二胶原诱导的关节炎模型诱导和AP治疗

雄性Sprague Dawley大鼠(7-8周龄，n=40)购自Charles River LaboratoriesInc. (Wilmington, MA, USA)，并在到达时适应两周，然后随机分配到它们各自的治疗组：G1=正常对照(−) (n=10/组)，G2=胶原诱导的关节炎(CIA)+媒介物(0.5%羧甲基纤维素) (n=10/组)，G3=CIA+氨甲蝶呤(+) (0.5 mg/kg) (n=10/组)，和G4=CIA+AP (+) (200 mg/kg)(n=10/组)。在模型诱导前两周开始治疗，然后持续另外的三周。来自牛鼻中隔的II型胶原(Lot # 845)和不完全弗氏佐剂(IFA) (Lot # SLBR0642v)分别购自ElastinProductsCompany (Owensville, MI, USA)和Sigma (St. Louise, MO, USA)。将所有材料保持在制造商推荐的合适的温度下。制备时，称取60 mg胶原，并在具有磁力搅拌器的60 mL大小的烧瓶中加入到预先冷却的15 mL 0.1M乙酸中，产生4 mg/mL浓度(Brand等人，2003；Rosloniec等人，2001)。通过在4℃下轻轻搅拌过夜将混合物溶解。第二天早晨，用等体积的IFA (15mL)使溶解的胶原乳化，以实现2 mg/mL胶原的最终浓度。然后，使用配有26 G针头的1 mL注射器，在大鼠尾部基底的两个部位，用400 μL乳化的胶原皮内引发用异氟烷镇静的大鼠。将溶解的混合物保持在冰桶中，并在各组注射时进行搅拌以保持均匀的稠度。在第七天，以100 μL/大鼠/部位用2 mg/mL II型胶原(用等体积的不完全佐剂乳化)的加强剂量接种大鼠。

实施例51. 在CIA大鼠中，通过组合物AP降低关节炎严重性指数

在研究的持续时间，大鼠继续显示疾病的缓慢进展。如下面的数据中所见，用两个治疗组(例如氨甲蝶呤和AP)治疗的大鼠从第12天开始显示统计学上显著抑制关节炎严重性，并且在研究的持续时间持续这种显著性(表39)。

在研究结束时，对于用媒介物、氨甲蝶呤和AP治疗的大鼠，分别观察到平均严重性评分是3.5±0.42、1.1±0.17和2.0±0.89。这些值证明AP和药物治疗相对于媒介物治疗的疾病模型的明确作用和效力。当计算关节炎严重性曲线下面积时，从阳性药物对照氨甲蝶呤和AP治疗分别观察到具有统计学显著性的78.8% (p=0.002)和54.9% (p=0.02)的百分比减少。(表39)。

实施例52. 在CIA大鼠中，通过组合物AP降低踝直径

对于用氨甲蝶呤和AP治疗的大鼠，观察到踝直径有统计学上显著减少，直到在诱导后第16天(表40)。此后，仅氨甲蝶呤组显示踝直径的统计学上显著减少。当考虑第9-20天的曲线下面积时，仅氨甲蝶呤组显示踝宽度统计学上显著减少(即93.6%)。对于AUC，对于AP治疗的CIA大鼠，观察到踝直径统计学上非显著(60.6%)减少(表40)。

表40. 用AP组合物治疗的CIA大鼠的踝直径变化

表39. 在CIA模型中用AP治疗的大鼠的关节炎严重性指数的变化：

实施例53. 在CIA大鼠中，通过组合物AP降低爪厚度

与严重性评分和踝直径一致，用氨甲蝶呤和AP治疗的大鼠从第12天开始显示爪肿胀的统计学上显著减少，并且在研究的持续时间保持这种显著性(表41)。然而，当考虑这种减少的肿胀曲线下总面积(第7天至第20天)时，与媒介物治疗的CIA组相比，仅氨甲蝶呤组的大鼠显示爪水肿统计学上显著(93.8%)的减少(表41)。与媒介物治疗的CIA大鼠相比，对于用AP组合物治疗的大鼠，观察到P值为0.058的爪水肿69.3%的降低百分比(表41)。

表41. 对于用组合物AP治疗的CIA大鼠的爪厚度的变化

实施例54. 用组合物AP治疗的CIA大鼠的关节炎指数、踝直径和爪厚度响应曲线下面积(AUC)

如下表42中所见，当与媒介物治疗的CIA大鼠相比时，在研究过程期间用AP治疗的大鼠的爪厚度、踝直径和关节炎严重性指数分别显示69.3%、60.7%和54.9%的抑制。对于每个参数，这些减少超过50%，指示组合物AP在减少关节炎相关的症状中的显著性。相比之下，氨甲蝶呤治疗的大鼠在爪厚度、踝直径和关节炎严重指数方面分别显示93.8%、93.6%和78.8%减少。

实施例55. 在CIA大鼠中，通过组合物AP减少压迫诱导的疼痛，指示其症状缓解活性

在引发日、加强日和第12、14、16、18和20天，使用附着于电子监测器的Randall-Salitto探针测量对压力的反应作为疼痛敏感性的量度。在这些天监测左和右后腿两者，并将它们的平均值用于数据分析。相对于媒介物治疗的CIA大鼠的变化被报道为这些天的疼痛耐受性。在氨甲蝶呤组中对于大鼠观察到最高的疼痛耐受性(在第20天，69.4%改进)，随后是AP (在第18天，31.5%改进) (表43)。当与媒介物治疗的CIA大鼠相比时，两组从第12天起在所有时间点，该疼痛敏感性降低都是统计学上显著的(表43)。与媒介物治疗的CIA大鼠相比，用组合物AP治疗的大鼠显示疼痛敏感性降低8.25-31.5%的范围。在相同的持续时间内，氨甲蝶呤组显示疼痛敏感性降低8.39-69.4%。

实施例56.在CIA大鼠中，通过组合物山姜属:胡椒(AP)的分解代谢细胞因子、基质降解酶和软骨合成生物标志物变化

在研究完成时，从每只动物收集来自心脏穿刺的血液。将血液以3000 rpm旋转15分钟。从每只大鼠中分离约700-800 μL血清。将样品保持在-80℃直至使用。

使用得自R&D Systems的Rat IL-6/TNF-α Quantikine ELISA试剂盒如下测量分解代谢细胞因子IL-6/TNF-α的存在：将未稀释的血清加入到包被有多克隆IL-6/TNF-α抗体的微板中，并使其在室温下结合2小时。彻底洗涤微板以去除未结合的血清，然后加入多克隆酶缀合的IL-6/TNF-α抗体，并使其在室温下结合2小时。重复洗涤，加入酶底物，并将板在室温下显影30分钟。加入终止溶液后，在450 nm下读取吸光度，并基于IL-6/TNF-α标准曲线的吸光度读数计算IL-6/TNF-α的浓度。

表42：用山姜属:胡椒(AP)治疗的CIA大鼠的响应曲线下面积

表43：在CIA大鼠中，山姜属:胡椒(AP)的抗疼痛活性

使用得自Mybiosource的大鼠基质金属蛋白酶13 (MMP-13) ELISA试剂盒(产品号：MBS702112)如下测量软骨降解酶MMP-13的存在：将未稀释的血清加入到包被有MMP-13抗体的微板中，并使其在37℃下结合2小时。去除样品，然后加入生物素-缀合的MMP-13抗体，并使其在37℃下结合1小时。彻底洗涤微板，并且加入抗生物素蛋白缀合的辣根过氧化物酶，并使其在37℃下结合1小时。然后加入酶底物，并将板在37℃下显影30分钟。加入终止溶液后，在450 nm下读取吸光度，并基于MMP-13标准曲线的吸光度读数计算MMP-13的浓度。

使用得自Mybiosource的IIA型大鼠前胶原N-Prop (PIIANP) ELISA试剂盒(产品号：MBS9399069)如下测量软骨再生生物标志物PIIANP的存在：将未稀释的血清加入到包被有PIIANP抗体以及HRP缀合的PIIANP抗体的微板中，并使其在37℃下结合一小时。彻底洗涤微板，并加入生色团溶液，并使其在37℃下结合15分钟。加入终止溶液后，在450 nm下读取吸光度，并基于PIIANP标准曲线的吸光度读数计算PIIANP的浓度。

当与媒介物治疗的CIA大鼠相比时，以200 mg/kg口服给予组合物AP持续3周，显著减少血清分解代谢生物标志物IL-6、TNF-α和MMP-13水平。与媒介物治疗的CIA大鼠组相比，在IL-6中观察到作为组合物AP治疗结果的促炎和分解代谢细胞因子的最显著抑制，其减少58.7%。对于AP治疗的大鼠，基质降解酶MMP-13减少43.5%补充了这种减少。IL-6和MMP-13数据似乎是对于AP治疗大鼠在临床测量和组织病理学发现方面在活体研究中的观察结果的真实反映。阳性药物对照氨甲蝶呤治疗的大鼠经历血清中IL-6和TNF-α的量显著减少。

与对照组相比，对于用媒介物治疗的CIA大鼠，观察到血清软骨再生生物标志物PIIANP统计学上显著减少(p=0.0017) (表44)。阳性对照氨甲蝶呤的血清PIIANP显著增加(47%，p=0.0017，与CIA+媒介物相比)。以200 mg/kg口服给予AP持续3周，显示血清软骨再生生物标志物PIIANP增加(即18%)，但该增加不显著。这些结果指示，AP治疗仍然使关节炎大鼠的进展朝向软骨再生/重建转变，尽管程度低于药物对照。这显示AP和药物治疗有助于逆转胶原退化表型，这是该关节炎动物模型的特征。

表44：在CIA大鼠中，通过山姜属:胡椒(AP)下调的分解代谢途径

实施例57. 在CIA大鼠中，通过组合物山姜属:胡椒(AP)的组织病理学读数变化

在尸检时，小心地解剖开踝关节，固定在10%缓冲福尔马林中，并送到NationwideHistology(Veradale, WA, USA)用于进一步的组织病理学分析。然后用Calci-clearRapid将固定的标本脱钙一天半，并包埋在石蜡中。从每只大鼠获得标准化的5 μm系列切片，并用苏木精和曙红(HE)和番红O-固绿染色，以能够评价蛋白聚糖含量。使用改进的Mankin系统(Mankin等人，1981)对关节组件的结构和细胞改变进行评分，作为疾病进展和/或治疗功效的指征。组织学分析由经认证的病理学家在Nationwide Histology进行。

组织病理学数据与关节炎的严重性评分一致。当与正常对照大鼠相比时，媒介物治疗的CIA大鼠显示严重的滑膜炎、显著的软骨退化、滑液增生、关节翳形成和骨侵蚀(图5和表45)。与正常对照相比，对于媒介物治疗的CIA大鼠，这些变化分别反映为软骨退化、GAG损失、骨侵蚀和炎症增加17.9倍、7.9倍、181倍和52.7倍。相反，用氨甲蝶呤治疗的大鼠具有几乎正常的形态，其中基质完整性改变最小，关节软骨表面更光滑，单核细胞浸润和滑液增生水平低，以及关节骨损伤减少(表45)。类似地，与用媒介物治疗的CIA大鼠相比，用AP组合物治疗的大鼠也显示软骨破坏、炎症严重性、骨侵蚀和GAG损失的统计学上显著减少。与媒介物治疗的CIA大鼠相比，发现组合物AP的软骨保护(并因此抗分解代谢活性)为57.7%，其中基质完整性维持47.5%。与生物标志物数据(例如分解代谢的TNF-α和IL-6减少)一致，与媒介物治疗的CIA大鼠相比，炎症减少67.0%。对于用AP组合物治疗的CIA大鼠，骨侵蚀也减少61.0%。与媒介物治疗的CIA大鼠相比，对于每个监测的参数，来自AP治疗的这些变化都是统计学上显著的。

表45. 用组合物山姜属:胡椒(AP)治疗的CIA大鼠的组织病理学发现

图6显示用AP治疗的CIA大鼠的HE和番红O染色组织学(HE染色(40x)：a=正常对照+媒介物，b=CIA+媒介物，c=CIA+氨甲蝶呤，d=CIA+AP，番红O染色(40x)：e=正常对照+媒介物，f=CIA+媒介物，g=CIA+氨甲蝶呤，h=CIA+AP，C=软骨，SB=软骨下骨，I=炎症)

实施例58. 山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)在胶原诱导的关节炎(CIA)中的软骨保护和症状缓解活性暗示

大鼠中的CIA模型是最常研究的RA的自身免疫模型，其具有类似于人类中免疫介导的多关节炎的若干病理学特征(Miyoshi等人，2018)。其在免疫和疾病表现之间的短持续时间使得该模型对于治疗功效评价是可行的。接种异源II型胶原(CII)后，大鼠对抗原产生体液和细胞应答两者(Brand等人，2003)。这种敏化随后导致宿主动物攻击其自身的II型胶原，II型胶原主要存在于关节软骨中，并因此导致侵蚀性或非侵蚀性关节破坏。疾病的病理生理学是高度协调和复杂的。在诱导后，大鼠经历炎性疼痛和肿胀、软骨退化、滑液增生、关节翳形成、单核细胞浸润、畸形和不动。

在本文所述的CIA研究中，大鼠在引发后第9天开始显示关节炎的病征体征，随后在第19-21天严重性逐渐增加接近平台期。这些症状通过免疫抑制剂氨甲蝶呤以及新的天然组合物山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)的口服治疗而减轻。当与媒介物治疗的患病大鼠相比时，所有治疗组(氨甲蝶呤、AP和AMK)显示关节炎严重性、肿胀、踝宽度和疼痛敏感性的可测量的缓解。当在从第10天到第21天的研究持续时间将关节炎严重性、爪厚度和踝直径的数据合并在一起(其中观察到可见的关节炎体征)时，用氨甲蝶呤、AMK和AP治疗的CIA大鼠在所有主要的关节炎体征中显示统计学上显著减少，表明它们用于关节炎症状缓解的应用。

分解代谢TNF-α和IL-1β是参与关节炎的起始和进展的两种主要细胞因子(Kapoor等人，2011)，主要通过(a)抑制软骨细胞的合成代谢活性，导致下调细胞外基质组分生物合成(Saklatvala等人，1986；Goldring等人，1994)；(b)诱导另外的分解代谢细胞因子(例如IL-6)、趋化因子和细胞外基质降解酶(MMP和聚集蛋白聚糖酶) (Lefebvre等人，1990；Guerne等人，1990)；(c)抑制宿主的抗氧化活性(Mathy-Hartert等人，2008)；和(d)诱导反应性氧物质(Lepetsos等人，2016)。

这些过程促进维持关节炎的分解代谢过程，指示为关节炎患者的慢性炎症和永久性关节破坏。例如，当将IL-lβ注射到大鼠的膝关节中引起关节炎症和显著的蛋白聚糖消耗(Chandrasekhar等人，1992；Bolon等人，2004)时，其阻断逆转了分解代谢过程(Joosten等人，1999；Kobayashi等人，2005；van de Loo等人，1992)。除了直接参与分解代谢炎症过程和软骨退化之外，IL-6水平的失调还与类风湿性关节炎病理学相关的常见临床表现有关，例如发热、疲劳和体重减轻(Wei等人，2015)。因此，在疾病进展的各个阶段调节这些分解代谢促炎细胞因子可以使关节炎的平衡转移而远离分解代谢过程，同时减轻与关节炎相关的症状和/或帮助改变疾病。在该CIA研究和上述其它实施例中观察到的山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)对于软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和关节炎表型的调节可能部分是由于抑制这些关键的分解代谢促炎细胞因子。

补充AMK三周，导致基础基质蛋白水解酶(例如MMP-13)水平的显著减少。随着聚集蛋白聚糖的分解，胶原的降解是关节炎的主要特征或表型。已知促炎细胞因子(例如TNF-α、IL-1β和IL-6)通过级联分解代谢事件在关节软骨中的软骨基质退化中起重要作用，所述分解代谢事件导致刺激聚集蛋白聚糖酶和基质金属蛋白酶产生(Kapoor等人，2011)。在疾病病理学过程期间，主要组织相容性复合物将这些片段呈递给T细胞，并促进大量炎性细胞因子(例如IL-1β和IL-6)的活化和释放，这进而增加软骨细胞和滑液成纤维细胞中其它MMP的表达水平。结果，这些分解代谢过程导致关节炎表型，其中胶原酶活性增加，并且关节炎症恶化。已经发现MMP-13在类风湿性关节炎和骨关节炎病例的软骨侵蚀部位的水平升高(Rose等人，2016)。以前的研究显示OA患者的血液和滑液中的这些MMP水平高于健康人，并且该水平与软骨损伤的程度一致(Yamanaka等人，2000；Galil等人，2016)。事实上，分泌到滑液中的MMP可以直接退化软骨和骨组成，导致周围关节结构的损伤增强(Ma等人，2015)。在我们的研究中，AMK和AP显著抑制MMP-13水平，这提供保护软骨免于退化、改进疼痛缓解和抑制关节炎表型。在本研究中观察到的MMP的减少可以部分地通过(a)治疗材料在减少分解代谢促炎细胞因子中的作用和/或(b)治疗材料直接抑制这些基质降解酶表达的活性来解释。

II型胶原的尿C-末端端肽(uCTX-II)迄今为止被研究最多，并且经常被称为软骨退化的生物标志物，其可以用于诊断、确定疾病的严重性或疾病进展的程度、预后和监测治疗功效的目的(Oestergaard等人，2006)。在临床研究中，高水平的uCTX-II是关节破坏风险增加的良好预测物(Garnero等人，2001)。关节软骨的退化和损失是关节炎的基本表型，由此CTX-II水平的增加与爪肿胀和关节炎严重性的时间过程直接相关，这由关节间隙变窄和总软骨体积的损失来指示。我们的结果与以前的报道(Oestergaard等人，2006；Siebuhr等人，2012)一致。在目前的研究中，证实了山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK)对减少爪肿胀、爪厚度、关节炎严重性和促炎细胞因子和基质降解酶的减少的有益作用，用AP和AMK治疗的大鼠显示uCTX-II水平显著减少。这些发现指示软骨保护活性是AP和AMK的主要功能之一，表明它们在调节软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和关节炎表型中的用途。

与症状和生物标志物一起，关节软骨、滑膜和软骨下骨的组织病理学分析已经用于评价关节炎疾病进展和治疗干预的结果(Chen等人，2017)。在这些CIA研究中，观察到用AMK、AP和氨甲蝶呤治疗的大鼠关节结构完整性的维持有显著改进。这些作用在组织病理学数据中得到证明，表现为软骨细胞的有限损失、退化或坏死、更光滑的关节软骨表面、细胞内基质的更深和均匀的染色、以及接近软骨下骨的正常轮廓。计算以下组织病理学严重性评分的量级变化：1.软骨退化，2.骨损伤，3.炎症，和4.基质完整性，并且发现当与媒介物治疗的CIA大鼠相比时，对于每种结果，AMK和AP治疗分别导致65.1%和57.7%、73.1%和61.0%、8.2%和67.0%、61.9%和47.5%的抑制。

总之，在这些CIA研究中，口服给药的AMK和AP产生(a)减少的分解代谢炎症，这由减少的关节炎指数、爪厚度、爪水肿和减少的分解代谢细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)反映；(b)疼痛敏感性降低；(c)软骨保护活性增加和维持关节结构，由较低的uCTX-II和软骨降解酶(MMP-13)指示，和(d)软骨合成和修复的改进(如PIIANP水平增加所记载的)。AMK和AP的这些性质表明它们作为替代的天然疗法通过维持软骨的正常稳态和增强关节炎的合成代谢表型而用于关节炎管理的潜在应用。

实施例59. 单碘乙酸盐(MIA)诱导的实验骨关节炎模型诱导和AMK治疗

在大鼠中MIA诱导的OA疾病模型是最常用于模拟人OA的标准化的模型(Lee等人，2014)。该模型包括将MIA接种到股胫关节袋中，该袋在同侧肢体中诱导疼痛反应，伴有进行性软骨退化。关节内注射MIA通过抑制甘油醛-3-磷酸酶脱氢酶来破坏软骨细胞糖酵解，并导致软骨细胞死亡、新血管形成、软骨下骨坏死和塌陷以及炎症(Guzman等人，2003)。这些表型特征使得该模型对于评价化合物的抗炎、止痛和/或潜在的疾病缓解活性非常有吸引力，因为它与人OA具有相似的疾病病理学。结果是，我们选择这种经验证的体内模型来研究口服给药6周后AMK在减轻疼痛敏感性、调节关节组织表型和维持关节结构完整性方面的作用。

治疗在MIA注射前一周开始。将动物随机分成五组，每组10只大鼠：G1=正常，G2=媒介物(0.5% CMC-Na溶液)，G3=双氯芬酸(10 mg/kg，Lot # W08B043，Ward Hill，MA)，G4=AMK(100 mg/kg)和G5=AMK (300 mg/kg)，用各自的治疗口服管饲。在诱导当天，在治疗后一小时，用26 G针头将0.8 mg MIA (Lot # A0352046，Acros Organics，New Jersey，USA)在50μL盐水溶液中注射到异氟烷(Lot #B66H15A，Piramal Enterprise Ltd. AndhraPradesh，印度)麻醉的大鼠左股胫(膝)关节的关节内袋。给正常对照大鼠注射等体积的盐水。作为疼痛敏感性的量度，使用Randall-Salitto Anesthesiometer (IITC, USA)每周一次测量作为施加到受影响关节的恒定压力的结果的缩爪阈值(paw withdrawal threshold)，并且治疗持续6周。每周一次测量体重以计算每组的各自的周剂量。在研究结束时使用代谢笼收集尿。收集血液样品以分离血清用于生物标志物分析。在尸检时，用CO₂使动物窒息，并小心地解剖开股胫关节，固定在10%缓冲福尔马林中，并送到Nationwide Histology(Veradale,WA, USA)用于进一步的组织病理学分析。然后用Calci-clear Rapid将固定的标本脱钙一天半，并包埋在石蜡中。在矢状面的内侧和外侧中髁水平获得标准化的5 μm系列切片，并用苏木精和曙红(HE)和番红O-固绿染色，以能够评价蛋白聚糖含量。使用改进的Mankin系统(Mankin等人，1981)对关节组件的结构和细胞改变进行评分，作为疾病进展和/或治疗功效的指征。组织学分析由经认证的病理学家在Nationwide Histology进行。

实施例60. 在MIA诱导的OA模型中组合物AMK的抗疼痛敏感性活性

在模型诱导后一周，证实疼痛(OA的主要基本症状之一)。如在表46中所见，关节内注射MIA而不治疗的大鼠显示疼痛敏感性的进行性增加，如平均疼痛敏感性值中所表现出。与媒介物治疗的正常对照动物相比，关节内0.8 mg/关节MIA的大鼠显示从第1周至第5周的疼痛敏感性分别增加34.6%、37.3%、41.4%、41.9%和42.7%。相反，所有治疗组在所有周内都显示统计学上显著的疼痛敏感性抑制(表46)。对于用300 mg/kg组合物AMK治疗的大鼠，观察到疼痛敏感性的最高抑制。将这些降低与媒介物治疗组相比，并且发现对于以300 mg/kg/天的口服剂量用AMK组合物治疗的大鼠，从第1周至第5周分别是降低21.8%、28.3%、35.0%、39.4%和43.9%。当与媒介物治疗的MIA大鼠相比时，以100 mg/kg给予AMK的大鼠从第1周至第5周经历疼痛敏感性分别降低14.1%、15.9%、22.1%、24.0%和23.5%。在检查的两种剂量的每个数据点观察到的疼痛缓解是统计学上显著的。当与媒介物治疗的MIA大鼠相比时，双氯芬酸(阳性对照)显示从第1周至第5周的疼痛敏感性分别降低19.7%、24.1%、28.3%、30.8%和31.1%。

表46. 用AMK组合物治疗的注射MIA的大鼠的压迫阈值

实施例61. 在MIA诱导的大鼠关节炎模型中通过组合物AMK的软骨保护和促炎细胞因子活性降低

用于检测尿CTX-II和IL-6的ELISA测定描述于上述实施例中。在这种MIA诱导的大鼠关节炎模型中，用300 mg/kg AMK口服治疗的大鼠导致软骨退化生物标志物尿CTX-II和分解代谢细胞因子IL-6统计学上显著减少。当与媒介物治疗的MIA大鼠相比时，发现对于以300 mg/kg的AMK治疗的大鼠，这些减少分别是31.9%和22.5%。在较低剂量的AMK (即100mg/kg)下，血清IL-6有统计学上显著减少。双氯芬酸治疗组(用于该模型的阳性对照)遵循与较低剂量的AMK相似的模式(即IL-6显著减少，而对尿CTX-II没有影响)。

表47. 在MIA模型中AMK治疗后细胞因子和软骨退化标志物的变化

实施例62. 在MIA诱导的OA模型中作为组合物山姜属:木兰属:地肤属(AMK)的结果的改进组织学发现

作为疼痛敏感性降低数据的补充，显示了关节软骨基质完整性的统计学上显著改进，如用组合物AMK在两个剂量下治疗的动物的改良总Mankin评分所反映的。在AMK组中结构异常和纤维血管增殖也显著减少。当评估总体结构异常(软骨增厚或变薄、表面不规则、裂缝损失、退化、溃疡性坏死、严重解体和混乱外观)时，对于用双氯芬酸(10 mg/kg)、AMK(100 mg/kg)和AMK (300 mg/kg)治疗的大鼠，分别观察到41.1%、33.1%和87.0%的降低(表48)。与双氯芬酸组的42.8%相比，用300 mg/kg的AMK治疗的大鼠在分解代谢炎症和炎性细胞浸润方面观察到最高的抑制(72.5%)。

在用AMK和阳性对照药物治疗的MIA大鼠中破骨细胞活性和软骨下骨损伤的程度最小。相反，对于用媒介物治疗的注射MIA的大鼠，观察到不同程度的组织病理学变化，包括关节软骨细胞的细胞退化和解体、细胞内基质的耗尽和塌陷、关节表面不规则、骨赘重塑和软骨下骨的原纤化。MIA大鼠的这些变化与人类OA生物学中最常见的发现相似(Loeser等人，2013)。在番红-O染色中，AMK治疗组的关节软骨揭示染色强度的最小损失，指示其防止软骨退化的能力。例如，对于双氯芬酸(10 mg/kg)、AMK (100 mg/kg)和AMK (300 mg/kg)，基质GAG损失分别观察到34.6%、31.0%和70.7%的降低。用媒介物治疗的没有MIA的正常对照组中的大鼠在所有检查的参数中显示可忽略的变化。在这组大鼠中，胫骨平台和股骨的软骨下骨以及周围关节结构更接近关节软骨的正常结构，表现为完整的。

表48. 对于用山姜属:木兰属:地肤属(AMK)治疗的MIA诱导的大鼠的来自组织病理学发现的改良Mankin评分

实施例63. 对于组合物山姜属:木兰属:地肤属(AMK)，MIA模型结果的显著性及其在OA中的启示

据信，在OA的各个阶段，关节的所有三种主要结构(软骨、软骨下骨和滑膜)都可能参与疾病的病理生理学，这使得单一生物标志物的鉴定复杂化，所述单一生物标志物是在疾病的早期阶段需要立即治疗干预的指示。然而，在所有观察到的主要关节生物标志物中，II型胶原的C末端端肽(CTX-II)迄今为止被研究得最多，并且经常被称为软骨退化的生物标志物，并且可以用于诊断、确定疾病的严重性或疾病进展的程度、预后和监测治疗功效的目的。CTX-II主要由OA中软骨退化期间的基质金属蛋白酶活性产生。已知其在OA患者中与分解代谢/合成代谢稳态和关节软骨退化进展密切相关。在临床前和临床研究两者中都报道了血清、尿或滑液中增加的CTX-II水平与关节软骨退化的直接相关性(Oestergaard等人，2006；Garnero等人，2001)，表明具有降低uCTX-II水平的固有特征的植物提取物通过调节软骨细胞、细胞外基质和关节软骨的稳态，使得关节炎表型朝向降低的分解代谢降解和增加的合成代谢再生和重建变化。

与症状和生物标志物结合，关节软骨、滑膜和软骨下骨的组织病理学分析已经用于评价OA疾病进展或测量治疗干预的结果(Goldring等人，2000)。在本公开中，对于用例如但不限于AMK组合物治疗的大鼠的关节结构完整性保持，观察到显著的改进。这些作用在组织病理学数据中得到证明，表现为软骨细胞的有限损失、退化或坏死、更光滑的关节软骨表面、细胞内基质的更深和均匀的染色、以及接近软骨下骨的正常轮廓。由于明显的原因，这种最小的软骨退化也得到疼痛敏感性显著减少的支持，由此AMK组合物实现疼痛缓解最大化。此外，如尿CTX-II生物标志物数据所证明的，对于用组合物AMK治疗的大鼠，也观察到uCTX-II水平的统计学上显著减少。在人类临床研究中证实了这一论点，在OA患者中尿CTX-II水平与软骨退化和相关疼痛良好一致。例如，发现在进行前交叉韧带重建的受试者中，尿CTX-II浓度升高，并与膝盖疼痛和功能相关。在这些患者中，uCTX-II浓度降低与膝盖疼痛减轻和功能改进相关，提供有意义的预后(Chmielewski等人，2012)。类似地，在对患有膝骨关节炎患者的骨、软骨和滑液组织代谢的生物化学标志物的横截面评价中，发现uCTX-II相应于疾病严重性而显著增加，并与关节间隙变窄的变化相关(Garnero等人，2001)。

考虑OA的多因素性质，以前已经表明，用组合疗法比单独的用任何单一组分，更可能有减缓关节软骨退化进展的能力(Lippiello等人，2000)。从特殊共混比的大高良姜、厚朴、胡椒和地肤得到的生物活性标准化的提取物组合物可以很好地适用于该应用。事实上，当在角叉菜胶诱导的大鼠爪水肿模型中测试配制这两种或三种植物提取物的优点时，从这两种或三种植物提取物的组合观察到减轻疼痛敏感性的出乎意料的协同作用，超过基于将对其每种成分观察到的作用简单地相加的预测的结果。临床和临床前文献检索不能预测将这些植物提取物共混在一起作为本专利中所述组合物的当前公开内容。这表明该组合物在维持关节结构完整性方面的新颖性，如在此再次在该MIA诱导的关节炎模型中由uCTX-II水平降低伴有最小的疼痛敏感性所反映的。我们相信这些药用植物在调节软骨细胞、细胞外基质、关节软骨的稳态和关节炎表型方面可以具有互补作用，这导致防止关节软骨退化和减轻相关症状，这可以转化为改进的关节完整性、活动性和功能。

实施例64. 在热板测试中局部施用的植物提取物的抗疼痛活性

在热接触部位(有害刺激)局部地重复施用抗炎化合物或提取物可以引起外周传入疼痛受体的脱敏，以产生响应时间的延迟。反应时间的较长变化可以解释为施用的化合物的抗伤害性作用。为了评价所制备的植物提取物和组合物是否能够提供抗伤害性活性，使大鼠在其后爪上局部接受配制在2%芦荟凝胶中的5%浓度的口服活性抗炎提取物。在每只爪上施用的制剂以圆周运动按摩皮肤至少60次，直到施用的内容物看起来被吸收。在将动物放置在设定为53℃的预热的热板上之前，每30分钟重复该程序3次。将缩爪潜伏期计算为从将大鼠初始放置在热板上到响应热刺激缩回(或舔或摇动)后爪所经历的时间。当观察到该响应时立即移出动物。将在30秒内没有显示响应的那些动物从加热的板上移出以防止任何组织损伤。

在设定在53℃的热板上测试药用植物提取物的抗疼痛活性。将5%浓度的测试材料以20μl/爪局部施用于Sprague Dawley大鼠的右爪和左爪的后爪(n=10/组)。这些提取物的施用每30分钟进行，总共90分钟。在这90分钟内，大鼠总共接受60 μl/爪的测试制品/大鼠。在5%浓度下，每只大鼠接受3mg/爪的测试制品。由于化合物的溶解度特征，使用两种类型的媒介物，V1=二甲亚砜(DMSO)+丙二醇(PG)+芦荟(2%)，和V2=DMSO+OIL+PG。使用每种测试材料的各自的媒介物确定用于统计学显著性的百分比变化和P值。用于每种材料的媒介物在测试材料旁边的括号中指示。如在下表49中描述的，与媒介物相比，局部给予纯胡椒碱的大鼠的缩爪潜伏期显示增加32.6%。这种抗疼痛活性的增加与对于5%布洛芬(即爪潜伏期增加22.4%，P值为0.018)观察到的相似。这些抗疼痛活性的增加是统计学上显著的。来自乙醇提取物和超临界流体提取物的大高良姜治疗的动物分别显示缩爪潜伏期增加17.1%和32.8%，其中P值为0.063和0.02。辣椒素治疗的大鼠的缩爪潜伏期经历36.7%的减少。当与其各自的媒介物相比时，该百分比变化是统计学上显著的。与各自的媒介物对照相比，接受厚朴局部制剂的那些大鼠显示敏感性增加13.6%。

这些结果指示布洛芬(阳性对照)和大高良姜提取物表现出显著的抗伤害性活性，如在热板测试中增加的缩爪潜伏期所证明的。辣椒素(阴性对照)显著减少缩爪潜伏期，如预期的。大高良姜提取物可以用于各种指征的局部疼痛缓解。

表49：在热板测试中作为药用植物的抗疼痛活性的量度的缩爪阈值

实施例65. AP的7天重复口服急性最大耐受剂量(MTD)研究

特意培育的雄性和雌性CD-1小鼠在8周龄时购自Charles River并用于最大耐受剂量研究。适应后，基于小鼠的体重将它们随机分配到以下各自的组：G1=媒介物对照(0.5%CMC)，G2=500 mg/kg的山姜属+胡椒，和G3=750 mg/kg。每组放置十只小鼠用于本研究。将测试化合物悬浮于0.5% CMC中，并以350 μl/小鼠的体积给予小鼠。媒介物组接受0.5% CMC。在基线时，雄性和雌性小鼠的平均体重分别是36.1±2.5和28.2±2.1克。在管饲之后监测体重，总共4次测量(即基线、挑战后2天、3天和7天)。在这两个研究中，每天在管饲之后监测每组小鼠的身体活动和行为。

表50：用AP治疗7天的小鼠的体重测量

小鼠连续7天接受这些剂量。在任一AP剂量组中没有观察到雌性动物死亡。然而，在750 mg/kg AP组中，在挑战后2天、3天和7天，雄性小鼠中发生3例死亡。在尸检时在死亡动物中观察到胃刺激和出血。在研究结束时，在750 mg/kg和500 mg/kg AP组中存活的雄性没有显著的体重变化(即，媒介物BL=36.5±2.5相对于7dpc=37.6±2.6；500 mg/kg AP BL=35.5±2.8相对于7dpc=36.8±3.8；750 mg/kg AP BL=36.3±2.2相对于35.7±3.7)。相反，对于雌性，在7天每天口服AP治疗后，发现对于500 mg/kg和750 mg/kg AP，距基线的体重变化百分比分别降低5.18%和6.07% (即，媒介物BL=28.1±2.1相对于7dpc=28.8±1.6；500mg/kg AP BL=28.2±2.3相对于7dpc=26.9±2.4；750 mg/kg AP BL=28.2±1.7相对于7dpc=26.7±2.2)。当与媒介物组相比时，这些体重变化是统计学上显著的。

表51：在7天重复每天口服MTD研究中小鼠的体重变化百分比

对于两种性别，在每次管饲后，存活的小鼠身体上表现正常。小鼠继续正常的探索性活动和行为。对于两种性别，这些正常行为在剩余剂量期间持续。这些小鼠在整个治疗持续时间没有显示行为或活动的变化。在尸检时，一旦打开腹腔，就对存活动物的器官进行粗检。没有观察到与正常的肉眼可见(明显可见)的偏差。外观和尸检发现与媒介物组相当。

根据MTD的全球药物倡议(Chapman等人，2013)，在7天每天口服治疗结束时距基线的10%体重减轻将被认为是毒性的警告标志。在本研究结束时，用500 mg/kg和750 mg/kgAP的口服剂量治疗的雄性和雌性CD-1小鼠显示其体重距离基线变化小于10%，而在750 mg/kg组中有3只动物死亡。结果是，我们相信AP组合物的MTD在500-750 mg/kg之间。

实施例66. AMK的7天重复口服急性最大耐受剂量(MTD)研究

特意培育的雄性和雌性CD-1小鼠在8周龄时购自Charles River并用于最大耐受剂量研究。适应后，基于小鼠的体重将它们随机分配到两个实验。第一个实验包括以下组：G1=媒介物对照(5% DMSO+0.5% CMC)，和G2=2000 mg/kg的山姜属:木兰属:地肤属(AMK)。每组放置八只小鼠用于本研究。将测试化合物悬浮于5% DMSO+0.5% CMC中，并以350μl/小鼠的体积给予小鼠。在基线时，雄性和雌性小鼠的平均体重分别是36.7±3.5和30.4±2.5克。在管饲之后监测体重，总共3次测量(即基线、挑战后3天和7天)。在这两个研究中，每天在管饲之后监测每组小鼠的身体活动和行为。

在两个研究中，每天观察雄性和雌性小鼠两者的身体外观和行为，持续7天。每天检查小鼠的身体状况和健康，在整个研究期间没有显示表明毒性或异常的迹象。对于两种性别，在每次管饲后，小鼠身体上都表现正常。小鼠继续正常的探索性活动和行为。对于两种性别，这些正常行为在剩余剂量期间持续。小鼠在整个治疗持续时间没有显示行为或活性的变化。

表52：用AP治疗7天的小鼠的体重测量

如上所见，对于两种性别和治疗组，观察到相似的体重增加模式。对于两种性别，两个治疗组的体重增加速率相似。对于任一组，体重增加没有统计学上显著的差异。在研究的持续时间，每组中的所有小鼠持续保持体重。到第7天结束时，基线与第7天之间体重测量值的差异不显著(即，雄性BL：36.58±4.2相对于第7天：36.96±4.5；雌性BL：30.37±2.0相对于第7天：30.66±1.3)。

表53：在7天重复每天口服MTD研究中小鼠的体重变化百分比

对于AMK治疗的小鼠没有观察到发病率或死亡率。在尸检时，一旦打开腹腔，就对器官进行粗查。没有观察到与正常的肉眼可见(非常明显)的偏差。该组的外观和尸检发现与媒介物组相当。

根据MTD的全球药物倡议(Chapman等人，2013)，在7天每天口服治疗结束时距基线的10%体重减轻将被认为是毒性的警告标志。在本研究结束时，在AMK组中的雄性和雌性CD-1小鼠显示与媒介物组相当且不显著的体重变化。因此，考虑正常的身体活动、行为和尸检发现，结合在第7天结束时体重的维持，可以得出结论，在CD-1小鼠中以2000mg/kg口服给药AMK在7天治疗过程中是耐受的。因此，认为AMK的MTD大于2000 mg/kg。

实施例67. 来自山姜属、胡椒、木兰属和地肤属的单独提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于组合物山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))的组合物的人临床研究

在临床试验例如“双盲随机安慰剂和阳性比较对照试验”中，将评价骨关节炎患者中10-2000 mg/剂量、2-3次/天的专利组合物的功效和安全性。该研究将通过主观问卷，在0-10数字视觉模拟量表(VAS)上评价疼痛严重性的症状缓解，在WOMAC量表上评价疼痛严重性、僵硬和关节功能的变化。在基线和研究结束时将评价症状改进的客观量度，用于评价BIODEX活动范围和六分钟行走距离，并且还包括安全性评价。在治疗之前和之后，还将对血清、滑液和关节组织进行生物标志物测量。根据临床输出的目的，治疗的持续时间为1-12周或6-24个月。

在筛选之前，受试者必须阅读并签署IRB批准的知情同意书表格。研究人群由年龄大于18岁且小于75岁的男性和女性受试者组成，并且通常健康状况良好，如由病史所确定的。具有生育能力的女性受试者在基线时尿妊娠测试必须是阴性的。研究的目的是为了有意义的统计功效而对于每个臂登记至少40名受试者。

试验将如下定义包含标准：18-75岁的男性/女性健康成年人；满足疼痛计入标准；大于6个月的膝关节疼痛病史；内侧或外侧胫股关节线触疼；平均来说，在视觉模拟量表(VAS)上，单侧膝盖疼痛6/10或更大，每周大多数天数干扰功能；骨关节炎的II级或III级Kellgren放射照相变化；并且愿意停止使用除特别用于研究目的的本研究治疗和救援药物所提供的那些以外的所有止痛药(包括非处方[OTC]镇痛药)。

主要客观和安全性评价：

·0-10 cm VAS疼痛严重性的变化

·WOMAC亚量表(0-100)上疼痛严重性、关节僵硬和关节功能的变化，所有亚量表的WOMAC总评分的变化。

·测量用于软骨退化/保护的uCTX-II的生物标志物；合成代谢生物标志物ACAN、Sox-9、PIIANP和TGFβ；来自血清以及滑液的分解代谢细胞因子，例如IL-1、IL-6、TNF-α和MMP-13。对于分解代谢和合成代谢标志物变化，将测量来自滑液、滑膜和软骨的细胞/组织的总体基因表达和蛋白质表达谱。

·还将测量关节间隙变窄和总关节间隙面积，用于最终证明疾病修饰作用。

·患者对治疗的反应的总体评估，医师对治疗改进的反应的总体评估。

·关节功能的变化，如由主动和被动活动范围、6分钟行走测试中行走距离所测量的。QOL：一般健康状态测量，SF-36和特定健康状态测量，WOMAC

·全血计数、化学组和肝功能测试、PT/INR、HCG和AE评估。

数据分析

在本研究中，每组10-200名受试者，随机同样地接受单剂量或多剂量的山姜属、胡椒、木兰属和地肤属的单独提取物和/或这些提取物中2-3种的各种组合(例如但不限于山姜属:胡椒(AP)和山姜属:木兰属:地肤属(AMK))、阳性对照(NTHE或膳食补充剂活性剂)和/或安慰剂。如果在12周研究过程中，来自每个方案群体的损耗率为30%，则每组应存在大约更多可分析的受试者。进行功效分析以确定作用大小(在功效端点的平均12周变化中的产品之间的差异)，其将提供80%的机会来获得p≤0.05的显著结果，其中每组具有总的可分析的受试者。

用于该研究的统计学设计参数是：

·α水平：0.05 (p≤0.05认为是统计学上显著的)

·功效：0.8 (80%的机会获得显著的p值)

·主要零假设：任何补充剂的平均治疗持续时间变化将等于阳性对照和/或安慰剂的相同持续时间

·备选假设：产品间变化不相等

·统计学检验：协方差分析(基于不成对的Student t检验的功效计算)

·样品大小：120名招募的受试者，每个产品组中40名

表54. 研究程序

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Claims

1.用于关节健康的组合物，其包含富含一种或多种苯丙素的山姜属(Alpinia)提取物；富含一种或多种双酚木酚素的木兰属(Magnolia)提取物；和富含一种或多种三萜皂苷的地肤属(Kochia)提取物的组合。

2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中的所述山姜属提取物或木兰属提取物或地肤属提取物在1重量%-98重量%的每种提取物的范围内，其中山姜属:木兰属:地肤属(AMK)的最佳重量比在2:4:3 (22.2%:44.4%:33.3%)或4:3:3 (40%:30%:30%)或5:4:4(38.4%:30.8%:30.8%)。

3. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述山姜属提取物来自大高良姜(Alpinia galanga)，所述木兰属提取物来自厚朴(Magnolia officinalis)，并且地肤属提取物来自地肤(Kochia scoparia)。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述山姜属提取物包含0.01%-99.9%的苯丙素。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述木兰属提取物包含0.01%-99.9%的双酚木酚素。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述地肤属提取物包含0.01%-99.9%的三萜皂苷。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中来自所述山姜属提取物的所述一种或多种苯丙素是1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯、或高良姜乙酸酯、或对羟基肉桂醛、或3,5-二羟基均二苯乙烯或其任意组合。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中来自所述木兰属提取物的所述一种或多种双酚木酚素是厚朴酚或和厚朴酚或其组合。

9. 根据权利要求1所述的组合物，其中来自所述地肤属提取物的所述一种或多种三萜皂苷是Bassiasaponin A；或Bassiasaponin B；或Kochioside A；或Kochioside B；或Kochioside C；或Kochianoside I；或Scoparianos A；或Scoparianoside B；或Scoparianoside C；或苦瓜籽毒蛋白Ic；或Kochianoside I；或Kochianoside II；或Kochianoside III；或Kochianoside IV；或2'-O-吡喃葡萄糖基苦瓜籽毒蛋白Ic；或2'-O-吡喃葡萄糖基苦瓜籽毒蛋白IIc或其组合。

10. 权利要求1所述的组合物，其中所述苯丙素从选自以下的植物物种富集：大高良姜、高良姜(Alpinia officinarum)、凹唇姜(Boesenbergia rotunda)、山柰(Kaempferia galanga)、益智(Alpinia oxyphylla)、Alpinia abundiflora、Alpinia acrostachya、Alpinia caerulea、距花山姜(Alpinia calcarata)、节鞭山姜(Alpinia conchigera)、Alpinia globosa、Alpinia javanica、Alpinia melanocarpa、马来良姜(Alpinia mutica)、黑果山姜(Alpinia nigra)、Alpinia nutans、Alpinia petiolate、红姜(Alpinia purpurata)、Alpinia pyramidata、Alpinia rafflesiana、彩叶姜(Alpinia speciosa)、花叶良姜(Alpinia vittata)、艳山姜(Alpinia zerumbet)、Alpinia zingiberina或其组合。

11. 权利要求1所述的组合物，其中所述双酚木酚素从选自以下的植物物种富集：厚朴、渐尖木兰(Magnolia acuminate)、望春玉兰(Magnolia biondii)、可可木兰(Magnolia coco)、白玉兰(Magnolia denudate)、Magnolia fargesii、Magnolia garrettii、洋玉兰(Magnolia grandiflora)、大叶木兰(Magnolia henryi)、紫花玉兰(Magnolia liliflora)、乌心石舅(Magnolia kachirachirai)、日本辛夷(Magnolia Kobus)、日本厚朴(Magnolia obovata)、皱叶木兰(Magnolia praecocissima)、Magnolia pterocarpa、Magnolia pyramidata、有喙木兰(Magnolia rostrate)、Magnolia salicifolia、天女木兰(Magnolia sieboldii)、二乔玉兰(Magnolia soulangeana)、星状木兰(Magnolia stellate)、弗吉尼亚木兰(Magnolia virginiana)、桦树木质素退化产物、小花老鼠簕(Acanthus ebracteatus)、Aptosimum spinescens、台湾楤木(Aralia bipinnata)、狭叶南洋杉(Araucaria angustifolia)、智利南洋杉(Araucaria araucana)、苦艾(Artemisia absinthium)、大叶芸香(Haplophyllum acutifolium)、大叶芸香(Haplophyllum perforatum)、北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)、Krameria cystisoides、紫苏(Perilla frutescens)、肉桂肉豆蔻(Lawsonia inermis Myristica fragrans) (肉豆蔻(nutmeg))、云南拟单性木兰(Parakmeria yunnanensis)(优选属名木兰属(Magnolia))、日本鳄梨(Persea japonica)、海风藤(Piper futokadsura)、Piper wightii、野生番荔枝(Rollinia mucosa)、Sassafras randaiense、Scrophularia albida-colchica、瑞香狼毒(Stellera chamaejasme)、关东丁香(Syringa velutina)、海南蒲桃(Syzygium cumini)、Talauma gloriensis、Virola elongate、Urbanodendron verrucosum、Wikstroemia sikokiana或其组合。

12. 权利要求1所述的组合物，其中所述三萜皂苷从选自以下的植物物种富集：地肤、Bassia scoparia、狭叶雾冰藜(Bassia angustifolia)、木鳖子(Momordica cochinchinensis)、Bassia dinteri、Bassia eriophora、钩刺雾冰藜(Bassia hyssopifolia)、Bassia indica、Bassia laniflora、棉藜(Bassia lasiantha)、Bassia littorea、Bassia muricata、尖翅地肤(Bassia odontoptera)、兜藜(Bassia pilosa)、Bassia prostrata、Bassia salsoloides、Bassia stellaris、天山雾冰藜(Bassia tianschanica)、Bassia tomentosa、Bassia villosissima或其组合。

13.权利要求1所述的组合物，其中所述苯丙素、双酚木酚素和三萜皂苷从选自以下的植物部分富集：叶、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、小枝、块茎、根、根茎、根皮、树皮表面、嫩枝、籽、果实、雄蕊群、雌蕊群、花萼、雄蕊、花瓣、萼片、心皮(雌芯)、花或其任意组合。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中的所述山姜属提取物、所述木兰属提取物和所述地肤属提取物用任何合适的溶剂提取，包括CO₂超临界流体、水、甲醇、乙醇、醇、水-混合溶剂或其组合。

15.根据权利要求1所述的组合物，其中一种或多种苯丙素；一种或多种双酚木酚素；和一种或多种三萜皂苷通过溶剂分配、沉淀、蒸馏、蒸发、具有硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺和CG161树脂的柱色谱单独地或组合富集。

16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含药学上或营养学上可接受的活性剂、佐剂、载体、稀释剂或赋形剂，其中所述药物或营养制剂包含约0.1重量百分比(重量%)至约99.9重量%的来自所述3-提取物组合物的活性化合物。

17. 权利要求16所述的组合物，其中所述活性剂、佐剂、赋形剂或载体选自以下中的一种或多种：大麻(Cannabis sativa)油或CBD/THC、姜黄提取物或姜黄素、榄仁树提取物、柳树树皮提取物、钩果草根提取物、辣椒提取物或辣椒素、花椒树皮提取物、黄檗树皮提取物、啤酒花提取物、乳香(Boswellia)提取物、桑树(Morus alba)提取物、儿茶(Acacia catechu)提取物、黄芩(Scutellaria baicalensis)提取物、蔷薇果提取物、迷迭香提取物、绿茶提取物、槐属(Sophora)提取物、薄荷或胡椒薄荷提取物、姜或黑姜提取物、绿茶或葡萄籽多酚、补骨脂酚或补骨脂(Psoralea)籽提取物、鱼油、硫酸葡糖胺、盐酸葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、氯化软骨素、硫酸软骨素、甲基磺酰基甲烷(MSM)、透明质酸、未变性或变性的胶原、Ω-3或Ω-6脂肪酸、磷虾油、蛋壳膜(ESM)、γ-亚麻酸、绿唇贻贝(Perna Canaliculus)(绿唇贻贝)、SAMe、不可皂化的鳄梨/大豆(ASU)提取物、柑橘生物类黄酮、金虎尾(Acerola)浓缩物、虾青素、碧萝芷、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B、维生素A、L-赖氨酸、钙、锰、锌、一种或多种矿物氨基酸螯合物、一种或多种氨基酸、硼和甘氨酸硼、二氧化硅、益生菌、樟脑、薄荷醇、钙基盐、二氧化硅、组氨酸、葡糖酸铜、CMC、β-环糊精、纤维素、葡萄糖、盐水、水、油、鲨鱼和牛软骨。

18.根据权利要求1所述的组合物，其中将所述组合物配制成片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊、粉末或颗粒、压缩片剂、丸剂、口香糖、sashay、薄片、棒剂或液体形式、酊剂、气涂敷剂、半固体、半液体、溶液、乳液、乳膏、洗剂、软膏、凝胶基质或类似形式。

19.根据权利要求1所述的方法，其中给药途径选自口服、局部、栓剂、静脉内、皮内、胃内、肌内、腹膜内和静脉内。

20. 根据权利要求1所述的关节健康组合物，其包含用于治疗、管理、促进哺乳动物的关节健康的方法，包括给予0.01 mg/kg至500 mg/kg所述哺乳动物体重的有效量的组合物。

21. 根据权利要求1所述的关节健康组合物，其包含通过减少或控制分解代谢生物标志物TNF-α、IL-1β、IL-6、聚集蛋白聚糖酶和基质金属蛋白酶(MMP)-MMP13、MMP9、MMP3、MMPl、uCTX-II和ADAMTS4；和通过增加或增强或促进合成代谢生物标志物：哺乳动物的SOX9、TGF-β1、ACAN、COL2A1和PIIANP，维持分解代谢/合成代谢生物标志物稳态的方法。

22.根据权利要求1所述的关节健康组合物，其包含用于以下的方法：维持软骨稳态，诱导软骨合成(并因此，合成代谢作用)并抑制退化和分解的分解代谢过程，保护细胞外基质完整性和关节软骨，使软骨退化最小化，减轻软骨分解，并开始或促进或增强软骨合成，软骨更新和软骨重建，修复受损软骨，维持、重建和修复关节组织的细胞外基质，恢复关节结构，维持稳定的血流至关节，通过保护软骨完整性来促进健康关节，平衡合成代谢和分解代谢过程，维持滑液以用于哺乳动物的关节润滑，减少影响哺乳动物的关节健康的酶和促炎细胞因子的作用。

23.根据权利要求1所述的关节健康组合物，其包含用于以下的方法：改进关节运动或身体功能，维持关节健康和老年活动性，支持、保护或促进关节舒适，减轻关节疼痛，减少关节摩擦，减轻关节僵硬，改进关节活动范围或灵活性，促进活动性，减少炎症，减少氧化应激，减少和防护关节磨损和撕裂，管理或治疗骨关节炎或类风湿性关节炎，预防骨关节炎或类风湿性关节炎，或逆转骨关节炎或类风湿性关节炎的进展；预防和治疗哺乳动物的幼年型类风湿性关节炎、斯蒂尔病、银屑病关节炎、反应性关节炎、脓毒性关节炎、赖特综合征、贝赫切特综合征或费尔蒂综合征等。

24.用于关节健康的组合物，其包含富含一种或多种苯丙素的山姜属提取物；和富含一种或多种生物碱的胡椒属(Piper)提取物的组合。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物中的所述山姜属提取物和所述胡椒属提取物的重量比为99:1至1:99。

26. 根据权利要求24所述的组合物，其中所述山姜属提取物来自大高良姜，胡椒属提取物来自胡椒(Piper nigrum)。

27.根据权利要求24所述的组合物，其中所述山姜属提取物包含0.01%-99.9%的苯丙素。

28.根据权利要求24所述的组合物，其中所述胡椒属提取物包含0.01%-99.9%的生物碱。

29.根据权利要求24所述的组合物，其中来自所述山姜属提取物的所述一种或多种苯丙素是1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯、或高良姜乙酸酯、或对羟基肉桂醛、或3,5-二羟基均二苯乙烯或其任意组合。

30.根据权利要求24所述的组合物，其中来自所述胡椒属提取物的一种或多种哌啶生物碱是胡椒碱、或胡椒脂碱或异胡椒脂碱、或异胡椒碱、或coumaperine、或Feruperine、或胡椒新碱、或胡椒亭、或Pipersintenamide、或Piperdardine、或荜茇环碱(pipernonaline)、或Pipertipine或其组合。

31. 权利要求24所述的组合物，其中所述苯丙素从选自以下的植物物种富集：大高良姜、高良姜、凹唇姜、山柰、益智、Alpinia abundiflora、Alpinia acrostachya、Alpinia caerulea、距花山姜、节鞭山姜、Alpinia globosa、Alpinia javanica、Alpinia melanocarpa、马来良姜、黑果山姜、Alpinia nutans、Alpinia petiolate、红姜、Alpinia pyramidata、Alpinia rafflesiana、彩叶姜、花叶良姜、艳山姜、Alpinia zingiberina或其组合。

32. 权利要求24所述的组合物，其中一种或多种哌啶生物碱从以下富集：胡椒、荜茇(Piper longum)、Piper amalgo、Piper aurantiacum、Piper chaba、Piper capense、Piper crassinervium、Piper guineense、卡瓦胡椒(Piper methysticum)、Piper novae- hollandiae、Piper peepuloides、Piper ponapense、毛蒟(Piper puberulum)、假荜拔(Piper retrofractum)、Piper sintenense、Piper tuberculatum、山蒟(Piper hancei)、大豆(Glycine max)、Petrosimonia monandra、欧薄荷(Mentha piperata)、silocaulon absimile和细基格孢属(Ulocladium sp)或其组合。

33.权利要求24所述的组合物，其中所述苯丙素和生物碱从选自以下的植物部分富集：叶、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、小枝、块茎、根、根茎、根皮、树皮表面、嫩枝、籽、果实、雄蕊群、雌蕊群、花萼、雄蕊、花瓣、萼片、心皮(雌芯)、花或其任意组合。

34.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物中的所述山姜属提取物、所述胡椒提取物用任何合适的溶剂单独地或组合提取，包括CO₂超临界流体、水、甲醇、乙醇、醇、水-混合溶剂或其组合。

35.根据权利要求24所述的组合物，其中一种或多种苯丙素；一种或多种生物碱通过溶剂分配、沉淀、蒸馏、蒸发、具有硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺、CG161和离子交换树脂的柱色谱单独地或组合富集。

36.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物进一步包含药学上或营养学上可接受的活性剂、佐剂、载体、稀释剂或赋形剂，其中所述药物或营养制剂包含约0.1重量百分比(重量%)至约99.9重量%的来自山姜属和胡椒属提取物组合物的活性化合物。

37.权利要求36所述的组合物，其中所述活性剂或佐剂或赋形剂或载体选自以下中的一种或多种：大麻油或CBD/THC、姜黄提取物或姜黄素、榄仁树提取物、柳树树皮提取物、钩果草根提取物、辣椒提取物或辣椒素、花椒树皮提取物、黄檗树皮提取物、啤酒花提取物、乳香提取物、桑树提取物、儿茶提取物、黄芩提取物、蔷薇果提取物、迷迭香提取物、绿茶提取物、槐属提取物、薄荷或胡椒薄荷提取物、姜或黑姜提取物、绿茶或葡萄籽多酚、补骨脂酚或补骨脂籽提取物、鱼油、硫酸葡糖胺、盐酸葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、氯化软骨素、硫酸软骨素、甲基磺酰基甲烷(MSM)、透明质酸、未变性或变性的胶原、Ω-3或Ω-6脂肪酸、磷虾油、蛋壳膜(ESM)、γ-亚麻酸、绿唇贻贝(绿唇贻贝)、SAMe、不可皂化的鳄梨/大豆(ASU)提取物、柑橘生物类黄酮、金虎尾浓缩物、虾青素、碧萝芷、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B、维生素A、L-赖氨酸、钙、锰、锌、一种或多种矿物氨基酸螯合物、一种或多种氨基酸、硼和甘氨酸硼、二氧化硅、益生菌、樟脑、薄荷醇、钙基盐、二氧化硅、组氨酸、葡糖酸铜、CMC、β-环糊精、纤维素、葡萄糖、盐水、水、油、鲨鱼和牛软骨。

38.根据权利要求24所述的组合物，其中将所述组合物配制成片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊、粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、口香糖、sashay、薄片、棒剂或液体形式、酊剂、气涂敷剂、半固体、半液体、溶液、乳液、乳膏、洗剂、软膏、凝胶基质或类似形式。

39.根据权利要求24所述的方法，其中给药途径选自口服、局部、栓剂、静脉内、皮内、胃内、肌内、腹膜内和静脉内。

40. 根据权利要求24所述的关节健康组合物，其包含用于治疗、管理、促进哺乳动物的关节健康的方法，包括给予0.01 mg/kg至500 mg/kg所述哺乳动物体重的有效量的组合物。

41. 根据权利要求24所述的关节健康组合物，其包含通过减少或控制哺乳动物的分解代谢生物标志物TNF-α、IL-1β、IL-6、聚集蛋白聚糖酶和基质金属蛋白酶(MMP)-MMP13、MMP9、MMP3、MMPl、uCTX-II和ADAMTS4；和通过增强和促进哺乳动物的合成代谢生物标志物：SOX 9、TGF-β1、ACAN、COL2A1和PIIANP，维持分解代谢/合成代谢生物标志物稳态的方法。

42.根据权利要求24所述的关节健康组合物，其包含用于以下的方法：维持软骨稳态，诱导软骨合成(并因此，合成代谢作用)并抑制退化和分解的分解代谢过程，保护细胞外基质完整性和关节软骨，使软骨退化最小化，减轻软骨分解，并开始或促进或增强软骨合成，软骨更新和软骨重建，修复受损软骨，维持、重建和修复关节组织的细胞外基质，恢复关节结构，维持稳定的血流至关节，通过保护软骨完整性来促进健康关节，平衡合成代谢和分解代谢过程，维持滑液以用于哺乳动物的关节润滑，减少影响哺乳动物的关节健康的酶和促炎细胞因子的作用。

43.根据权利要求24所述的关节健康组合物，其包含用于以下的方法：改进关节运动或身体功能，维持关节健康和老年活动性，支持、保护或促进关节舒适，减轻关节疼痛，减少关节摩擦，减轻关节僵硬，改进关节活动范围或灵活性，促进活动性，减少炎症，减少氧化应激，减少和防护关节磨损和撕裂，管理或治疗骨关节炎或类风湿性关节炎，预防骨关节炎或类风湿性关节炎，或逆转骨关节炎或类风湿性关节炎的进展；预防和治疗哺乳动物的幼年型类风湿性关节炎、斯蒂尔病、银屑病关节炎、反应性关节炎、脓毒性关节炎、赖特综合征、贝赫切特综合征或费尔蒂综合征等。

44.用于关节健康的组合物，其包含富含一种或多种苯丙素的山姜属提取物。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述山姜属提取物包含0.01%-99.9%的苯丙素。

46.根据权利要求44所述的组合物，其中来自所述山姜属提取物的所述一种或多种苯丙素是1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯、或高良姜乙酸酯、或对羟基肉桂醛、或3,5-二羟基均二苯乙烯或其任意组合。

47. 权利要求44所述的组合物，其中所述苯丙素从选自以下的植物物种富集：大高良姜、高良姜、凹唇姜、山柰、益智、Alpinia abundiflora、Alpinia acrostachya、Alpinia caerulea、距花山姜、节鞭山姜、Alpinia globosa、Alpinia javanica、Alpinia melanocarpa、马来良姜、黑果山姜、Alpinia nutans、Alpinia petiolate、红姜、Alpinia pyramidata、Alpinia rafflesiana、彩叶姜、花叶良姜、艳山姜、Alpinia zingiberina或其组合。

48.权利要求44所述的组合物，其中所述苯丙素从选自以下的植物部分富集：叶、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、小枝、块茎、根、根茎、根皮、树皮表面、嫩枝、籽、果实、雄蕊群、雌蕊群、花萼、雄蕊、花瓣、萼片、心皮(雌芯)、花或其任意组合。

49.根据权利要求44所述的组合物，其中所述组合物中的所述山姜属提取物用任何合适的溶剂提取，包括CO₂超临界流体、水、甲醇、乙醇、醇、水-混合溶剂或其组合。

50.根据权利要求44所述的组合物，其中一种或多种苯丙素通过溶剂分配、沉淀、蒸馏、蒸发、具有硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺、CG161和离子交换树脂的柱色谱富集。

51.根据权利要求44所述的组合物，其中所述组合物进一步包含药学上或营养学上可接受的活性剂、佐剂、载体、稀释剂或赋形剂，其中所述药物或营养制剂包含约0.1重量百分比(重量%)至约99.9重量%的来自所述山姜属提取物组合物的活性化合物。

52.权利要求51所述的组合物，其中所述活性剂、佐剂、赋形剂或载体选自以下中的一种或多种：大麻油或CBD/THC、姜黄提取物或姜黄素、榄仁树提取物、柳树树皮提取物、钩果草根提取物、辣椒提取物或辣椒素、花椒树皮提取物、黄檗树皮提取物、啤酒花提取物、乳香提取物、桑树提取物、儿茶提取物、黄芩提取物、蔷薇果提取物、迷迭香提取物、绿茶提取物、槐属提取物、薄荷或胡椒薄荷提取物、姜或黑姜提取物、绿茶或葡萄籽多酚、补骨脂酚或补骨脂籽提取物、鱼油、硫酸葡糖胺、盐酸葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、氯化软骨素、硫酸软骨素、甲基磺酰基甲烷(MSM)、透明质酸、未变性或变性的胶原、Ω-3或Ω-6脂肪酸、磷虾油、蛋壳膜(ESM)、γ-亚麻酸、绿唇贻贝(绿唇贻贝)、SAMe、不可皂化的鳄梨/大豆(ASU)提取物、柑橘生物类黄酮、金虎尾浓缩物、虾青素、碧萝芷、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B、维生素A、L-赖氨酸、钙、锰、锌、一种或多种矿物氨基酸螯合物、一种或多种氨基酸、硼和甘氨酸硼、二氧化硅、益生菌、樟脑、薄荷醇、钙基盐、二氧化硅、组氨酸、葡糖酸铜、CMC、β-环糊精、纤维素、葡萄糖、盐水、水、油、鲨鱼和牛软骨。

53.根据权利要求44所述的组合物，其中将所述组合物配制成片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊、粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、口香糖、sashay、薄片、棒剂或液体形式、酊剂、气涂敷剂、半固体、半液体、溶液、乳液、乳膏、洗剂、软膏、凝胶基质或类似形式。

54.根据权利要求44所述的方法，其中给药途径选自口服、局部、栓剂、静脉内、皮内、胃内、肌内、腹膜内和静脉内。

55. 根据权利要求44所述的关节健康组合物，其包含用于治疗、管理、促进哺乳动物的关节健康的方法，包括给予0.01 mg/kg至500 mg/kg所述哺乳动物体重的有效量的组合物。

56. 根据权利要求44所述的关节健康组合物，其包含通过减少或控制分解代谢生物标志物TNF-α、IL-1β、IL-6、聚集蛋白聚糖酶和基质金属蛋白酶(MMP)-MMP13、MMP9、MMP3、MMPl、uCTX-II和ADAMTS4；和通过增强和促进合成代谢生物标志物：哺乳动物的SOX 9、TGF-β1、ACAN、COL2A1和PIIANP，维持分解代谢/合成代谢生物标志物稳态的方法。

57.根据权利要求44所述的关节健康组合物，其包含用于以下的方法：维持软骨稳态，诱导软骨合成(并因此，合成代谢作用)并抑制退化和分解的分解代谢过程，保护细胞外基质完整性和关节软骨，使软骨退化最小化，减轻软骨分解，并开始或促进或增强软骨合成，软骨更新和软骨重建，修复受损软骨，维持、重建和修复关节组织的细胞外基质，恢复关节结构，维持稳定的血流至关节，通过保护软骨完整性来促进健康关节，平衡合成代谢和分解代谢过程，维持滑液以用于哺乳动物的关节润滑，减少影响哺乳动物的关节健康的酶和促炎细胞因子的作用。

58.根据权利要求44所述的关节健康组合物，其包含用于以下的方法：改进关节运动或身体功能，维持关节健康和老年活动性，支持、保护或促进关节舒适，减轻关节疼痛，减少关节摩擦，减轻关节僵硬，改进关节活动范围或灵活性，促进活动性，减少炎症，减少氧化应激，减少和防护关节磨损和撕裂，管理或治疗骨关节炎或类风湿性关节炎，预防骨关节炎或类风湿性关节炎，或逆转骨关节炎或类风湿性关节炎的进展；预防和治疗哺乳动物的幼年型类风湿性关节炎、斯蒂尔病、银屑病关节炎、反应性关节炎、脓毒性关节炎、赖特综合征、贝赫切特综合征或费尔蒂综合征等。

59.根据权利要求1所述的关节健康组合物，其包含用于改进手、肘关节、腕关节、腋关节、胸锁关节、椎关节、颞下颌关节、骶髂关节、髋关节、膝关节和足关节的关节健康的方法。

60.根据权利要求24所述的关节健康组合物，其包含用于改进手、肘关节、腕关节、腋关节、胸锁关节、椎关节、颞下颌关节、骶髂关节、髋关节、膝关节和足关节的关节健康的方法。

61.根据权利要求44所述的关节健康组合物，其包含用于改进手、肘关节、腕关节、腋关节、胸锁关节、椎关节、颞下颌关节、骶髂关节、髋关节、膝关节和足关节的关节健康的方法。