CN103533947A - 用于治疗和预防感染的植物提取物 - Google Patents

Abstract

公开了包含地榆植物提取物和至少一种附加的植物提取物的组合物，所述附加的植物提取物选自臭椿植物提取物，五倍子植物提取物，光果甘草植物提取物，掌叶大黄植物提取物和黄芩植物提取物。还公开了包含臭椿植物提取物或臭椿酮的组合物。

Description

用于治疗和预防感染的植物提取物

发明领域和背景

本发明在其一些实施方案中涉及植物提取物，且更具体地、但不仅仅涉及所述植物提取物用于治疗或预防感染包括慢性炎症性疾病的继发性感染的用途。

特应性皮炎（AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其终生患病率儿童为10-20％，成年人为1-3％。该病的发病率似乎在增加，特别是在发达国家。 AD与皮肤对环境诱因的过度反应有关，上述环境诱因对正常的非特异反应个体是无害的，典型的AD为皮肤瘙痒，湿疹样病变，干燥症（干性皮肤），以及苔癣化的皮肤（皮肤增厚和皮肤疤痕）。 AD通常并发皮损反复感染细菌，病毒和真菌病原体（如85-90％的AD患者中发生金黄色葡萄球菌定植）。目前可用于AD患者的继发性感染治疗不能治愈皮肤疾病，但可控制其症状的严重程度和持续时间。这些治疗主要包括治疗继发性感染的抗生素，局部用皮质类固醇激素，以及局部用钙调磷酸酶抑制剂（免疫抑制剂）。由于其潜在的副作用，故不建议长期使用这些治疗方法，尤其是对年幼的儿童。

对AD潜在的生物学机制知之甚少。几种类型的细胞，包括免疫和表皮细胞似乎被涉及，其包括T淋巴细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，朗格汉斯细胞和角质形成细胞，也涉及到其他因素，包括细胞因子和IgE。许多早期的学术和临床报道提出了一些不同的致病机制。一种可能的机制是一种免疫缺陷，其涉及与朗格汉斯细胞相互租用的TH2细胞升高，导致白细胞介素IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13的生成增加。这导致了IgE水平增加和γ-干扰素水平下降。另一种理论涉及角质层的屏障功能缺陷，导致抗原进入，结果产生各种炎性细胞因子。

最近有人提出，AD患者的细菌感染高易感性与先天防御机制的缺陷有关，具体而言就是抗微生物肽（称为β-防御素）的低表达。从AD病变的皮肤活检证实了炎症诱导的抗微生物肽的低表达匮乏，从而为AD患者对皮肤感染的敏感性提供了一种可能的解释。

β-防御素，包括人β-防御素（hBDs），是天然的小阳离子两性分子，其参与先天防御机制。在皮肤中，这些肽由角质形成细胞分泌，并在直接杀灭入侵微生物和调节炎症性活动中具有重大作用。这些肽破坏目标微生物的膜或穿透微生物膜，干扰细胞内功能。它们还可以显示其他作用，如调节炎性和免疫反应，化学趋化免疫或炎性细胞至伤口或感染/炎症部位，加速血管生成和促进伤口愈合。

人β-防御素3（hBD-3）除了对革兰氏阴性生物体的活性外还显示对金黄色葡萄球菌和其他革兰氏阳性菌的强有力的杀伤活性。此外，hBD-3的抗微生物活性在生理盐水浓度下保持。因此，表皮中产生的内源性hBD-3可提供一种抗微生物屏蔽以保护皮肤组织对抗病原体如金黄色葡萄球菌的细菌侵袭。

β-防御素表达（包括人β-防御素-2（hBD-2）和人β-防御素3（hBD-3）表达）的调节是一个复杂的机制；微生物、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或干扰素-γ（IFN-γ）升高它们的表达，肥大细胞和2型辅助性T细胞产生的细胞因子（特别是IL-4和IL-13）则下调它们的表达。

利用初级角质形成细胞的体外研究表明，IL-4和IL-13的细胞因子表达抑制β-防御素的表达[Albanesi C.等人, J. Immunol. (2007) 179(2): 984-992]。这种逆相关在人类皮肤活检中也得到证实[Nomura I.等人, J. Immunol. (2003) 171(6), 3262-3269]。

之前已经描述了可抑制由肥大细胞和2型辅助细胞诱导的IL-4和/或IL-13的表达的几种草药提取物。这些草药提取物包括Gammi-Danguieumja药方（地黄，朝鲜当归等） [Na HJ.等人., Inflammation (2004) 28, 291-297]，黄酮类化合物（Avanin，木犀草素，芹菜素，漆黄素等）[Kawai, M.等人, Allergology International (2007) 56:113-123]，臭椿（Ailanthus altissima）（EAa）[Hua Jin, M.等人, Biol Pham Bult (2006) 29: 884-888]，光果甘草（Glycyrrhiza glabra L. ）（甘草）[Ram A等人, Int Immunopharacol. (2006) 6(9):1468-77]，黑升麻（Cimicifuga raceomosa）[Kim CD等人, Immunopharmacol Immunotoxicol (2004) 26: 299-308]和黑升麻[Kim CD et al., 同上文]。

本领域中之前已描述了具有抗炎和抗过敏特性的草药。这些草药包括中药中已知用于治疗湿疹和皮肤疼痛的地榆（Sanguisorba officinalis）以及之前描述的具有抗炎特性的水飞蓟（Silybum marianum）。

美国专利No. 6235287公开了二萜类化合物以及含有至少一种这种二萜的植物杧果姜（Curcuma amada）的提取物或浓缩物用作药物用于免疫调节、用于减轻疼痛、以及用于治疗或预防过敏性疾病和自身免疫性紊乱。

美国专利Nos. 6566405和7252845公开了组合物，所述组合物含有存在于并且可优选来源于植物高良姜（Alpinia galanga）（姜科）的芳族化合物和萜类化合物。这些组合物显示对免疫调节的协同效应并且显著抑制过敏反应。因此，6566405预期所述组合物用于治疗或预防IgE介导的过敏性反应和病症，如哮喘、过敏性鼻炎、局部湿疹或过敏症，及自身免疫性疾病，如克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，类风湿关节炎或牛皮癣，以及用于减轻疼痛的用途。

美国专利No. 5466452公开了一种用于治疗皮肤疾病如湿疹和牛皮癣的药用草药组合物。具体来说，5466452教导通过水蒸气蒸馏和煎煮，然后处理提取物以降低多糖和/或糖含量来制备一种或多种可提供抗炎剂、肾上腺皮质激动剂和皮质醇保护剂的草药提取物（例如委陵菜（Potentilla chinensis），地黄（Rehmannia glutinosa），白芍/赤芍（Radix paeoniae lactiflorae/veitchii），狭叶白鲜（Dictamnus augustifolia），甘草（Glycyrrhiza uralensis），防风（Ledebouriella sesloides），蒺藜（Tribulus terrestris），淡竹叶（Lopatheri gracile），荆芥（Schizonepeta tenuifolia），三叶木通（Akebia trifoliata）的提取物）。

美国专利No. 6676975公开了用于治疗湿疹和牛皮癣的中草药组合物。具体而言，6676975涉及适合用于治疗特应性疾病，非特应性湿疹或牛皮癣的物质。该物质可从冻干的煎煮混合物提取而得，所述煎煮混合物包括以下中草药：防风（Radix Ledebouriella）、蒺藜（Fructus Tribuli）、委陵菜（Herba Potentilla chinensis）、小木通（Caulis Clematis armandii）、地黄（Radix Rehmannia）、甘草（Radix Glycyrrhiza）、赤芍（Radix Paeonia rubra）、白鲜皮（Cortex Dictamni radicis）、淡竹叶（Herba Lopatheri）和荆芥穗（Spica Schizonepetae）。

美国专利No. 7,211,567公开了一种用于预防和治疗I型过敏（包括特应性皮炎）的组合物。7,211,567中教导的制备组合物所需的紫云英苷（astragalin）可从任何含紫云英苷的植物例如臭椿（Ailanthus altissima）中获得。

其他背景技术包括美国专利Nos. 6,143,498，6329340，6335318，6,420,116，6911577和7,223,840和美国专利申请Nos. 20060147442，20070104722和20060036083。

发明概述

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含地榆（Sanguisorbae officinalis）植物提取物和至少一种附加的植物提取物的组合物，所述附加的植物提取物选自臭椿植物提取物，五倍子（Galla rhois gallnut）植物提取物，光果甘草（Glycyrrhiza Glabra）植物提取物，掌叶大黄（Rheum palmatum）植物提取物和黄芩（Scutellaria baicalensis）植物提取物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供在需要其的受试者中治疗和/或预防特应性皮炎（AD）的方法，该方法包括给予所述受试者治疗有效量的包含地榆植物提取物和臭椿植物提取物的组合物，从而治疗和/或预防受试者的感染。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含地榆植物提取物和臭椿植物提取物的组合物用于治疗和/或预防需要其的受试者中的特应性皮炎（AD）的用途。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含植物提取物的组合物，其中所述植物选自五倍子，前胡（Peucedanum praeruptorum）和黑升麻（Cimicifuga raceomosa）。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含臭椿植物提取物和至少一种附加的植物提取物的组合物，所述附加的植物提取物选自五倍子植物提取物，光果甘草植物提取物，掌叶大黄植物提取物和黄芩植物提取物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供包含浓度至少约0.01％的臭椿酮（ailanthone）和化妆用或药学上可接受的载体的组合物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供治疗和/或预防需要其的受试者中的感染的方法，该方法包括给予所述受试者治疗有效量的本发明的组合物，从而治疗和/或预防所述受试者的感染。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供本发明的组合物用于治疗和/或预防需要其的受试者中的感染的用途。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种递送系统，其包括一个涂药器和包含在其中的本发明的组合物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种单位剂型，其包含浓度约0.5~2％重量/重量的地榆植物提取物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种单位剂型，其包含浓度约0.5~2％重量/重量的臭椿植物提取物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种单位剂型，其包含浓度约0.5~2％重量/重量的光果甘草植物提取物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种单位剂型，其包含浓度约0.5~2％重量/重量的五倍子植物提取物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种单位剂型，其包含浓度约0.5~2％重量/重量的地榆植物提取物，浓度约0.5~2％重量/重量的臭椿植物提取物，及浓度约0.5~2％重量/重量的光果甘草植物提取物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种单位剂型，其包含浓度约0.5~2％重量/重量的地榆植物提取物，浓度约0.5~2％重量/重量的臭椿植物提取物，及浓度约0.5~2％重量/重量的五倍子植物提取物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种单位剂型，其选自局部、口服、肺部或眼部单位剂型，包含浓度至少约0.01％重量/重量的臭椿酮。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供用于治疗和/或预防感染的组合物的制备方法，该方法包括：（a）在植物中加1－10倍体积的水以制备植物提取物；及（b）使用大孔树脂减少该植物提取物中的有机盐和/或重金属和/或淀粉的量，使得该植物提取物中存在的活性成分的含量提高。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种识别具有炎性调节剂性能的试剂的方法，所述方法包括：（a）使该试剂与细胞接触；及（b）测定人β-防御素在该细胞中的分泌，其中所述接触后β-防御素分泌的上调表明所述试剂具有炎性调节剂的性能。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种化妆品载体，其包含掌叶大黄根提取物，蛇床子（Cnidium Monnieri）果实提取物，黄芩根提取物和甘草酸二钾。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种化妆品组合物，其包含地榆植物提取物，臭椿植物提取物，掌叶大黄根提取物, 蛇床子果实提取物, 黄芩根提取物和甘草酸二钾。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物，臭椿植物提取物和 光果甘草植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物，臭椿植物提取物和五倍子植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和臭椿植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和五倍子植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和光果甘草植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和掌叶大黄植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和黄芩植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物进一步包含地榆植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物进一步包含选自五倍子植物提取物，光果甘草植物提取物，掌叶大黄根提取物, 蛇床子果实提取物和黄芩根提取物的植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物进一步包含甘草酸二钾。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物配制用于局部，眼部，口服或肺部给药。

根据本发明的一些实施方案，臭椿酮的浓度为约0.01~1％。

根据本发明的一些实施方案，臭椿酮的浓度为约0.01~5％。

根据本发明的一些实施方案，所述地榆提取物和所述至少一种附加的植物提取物配制在一个复合制剂（co-formulation）中。

根据本发明的一些实施方案，所述地榆提取物和所述至少一种附加的植物提取物配制在不同的制剂中。

根据本发明的一些实施方案，所述各植物提取物在所述组合物中的浓度为0.01~10％。

根据本发明的一些实施方案，所述各植物提取物在所述组合物中的浓度为0.5~2％。

根据本发明的一些实施方案，所述各植物提取物在所述组合物中的浓度为1％。

根据本发明的一些实施方案，所述植物提取物在所述组合物中的浓度为0.01~10％。

根据本发明的一些实施方案，所述植物提取物在所述组合物中的浓度为0.5~2％。

根据本发明的一些实施方案，所述植物提取物在所述组合物中的浓度为1％。

根据本发明的一些实施方案，所述臭椿植物提取物包含至少约0.01％的臭椿酮。

根据本发明的一些实施方案，所述臭椿植物提取物由臭椿根（Ailanthi radicis）植物提取物组成。

根据本发明的一些实施方案，所述臭椿根植物提取物是极性提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述极性提取物使用选自丁醇和乙醇的极性溶剂提取。

根据本发明的一些实施方案，所述臭椿根植物提取物应用高效液相色谱法（HPLC）进一步纯化。

根据本发明的一些实施方案，所述植物提取物包括水性植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述水性植物提取物利用树脂层析法进一步纯化。

根据本发明的一些实施方案，所述树脂层析法包括大孔树脂。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物不包含β-防御素。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物是药物组合物并且包含药学上可接受的载体或稀释剂。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物是化妆品组合物并且包含化妆用可接受的载体或稀释剂。

根据本发明的一些实施方案，所述化妆用可接受的载体或稀释剂以选自霜剂，凝胶剂，喷雾剂，乳液（lotion），软膏，油剂，洗剂（wash），洗发剂，肥皂和喷雾剂的形式配制。

根据本发明的一些实施方案，所述感染继发于慢性炎症。

根据本发明的一些实施方案，所述感染与疾病相关联，所述疾病选自特应性疾病，接触性皮炎，钱币状皮炎，放射性皮炎，烧伤，非特应性湿疹，压疮，眼炎症性疾病，呼吸系统炎症性疾病，哮喘，胃肠道疾病和口腔感染性疾病。

根据本发明的一些实施方案，所述受试者是人。

根据本发明的一些实施方案，所述治疗有效量用于下调所述受试者细胞中Th2型细胞因子的分泌。

根据本发明的一些实施方案，所述Th2型细胞因子选自IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13。

根据本发明的一些实施方案，所述治疗有效量用于上调所述受试者细胞中人β-防御素的表达。

根据本发明的一些实施方案，所述治疗有效量包括抗微生物活性。

根据本发明的一些实施方案，所述涂药器的形式选自胶布绷带（adhesive bandage），非粘性绷带（non-adhesive bandage），擦布（wipe），纱布和衬垫（pad）。

根据本发明的一些实施方案，所述单位剂型进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的臭椿植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述单位剂型进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的光果甘草植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述单位剂型进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的五倍子植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述单位剂型进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的掌叶大黄植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述单位剂型进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的黄芩植物提取物。

根据本发明的一些实施方案，所述植物提取物的浓度为1％重量/重量。

根据本发明的一些实施方案，所述臭椿酮的浓度为约0.01~1％重量/重量。

根据本发明的一些实施方案，所述单位剂型的形式选自胶布绷带，非粘性绷带，擦布，纱布和衬垫。

根据本发明的一些实施方案，所述组合物，递送系统或单位剂型进一步包含选自细胞外基质组分，生长因子，激素，血管生成因子，凝血因子，细胞因子抑制剂，趋化因子抑制剂，酶，神经递质，维生素，碳水化合物，离子，铁螯合剂，脂肪酸，抗微生物剂，抗生素，类固醇和氨基酸的因子。

根据本发明的一些实施方案，所述给药长期进行。

根据本发明的一些实施方案，所述给药一天至少一次进行。

根据本发明的一些实施方案，所述给药进行达至少21天。

根据本发明的一些实施方案，所述植物选自臭椿，五倍子，前胡，光果甘草，黑升麻，水飞蓟，地榆，掌叶大黄和黄芩。

根据本发明的一些实施方案，所述臭椿由臭椿根组成。

根据本发明的一些实施方案，所述活性成分选自臭椿酮，苦楝素（mersosin），川楝素（toosendanin），人参总皂苷，没食子酸，甘草苷（liquiritin），白花前胡甲素（praeruptorin A），鞣酸和水飞蓟宾。

根据本发明的一些实施方案，所述植物包括臭椿，所述活性成分包括臭椿酮。

根据本发明的一些实施方案，所述试剂包含植物提取物或其活性成分。

根据本发明的一些实施方案，所述细胞包括角质形成细胞。

根据本发明的一些实施方案，所述化妆品组合物进一步包含保湿剂和润肤剂。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明涉及领域内的技术人员所通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些类似或相同的方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案，但是示例性方法和/或材料描述如下。在发生冲突的情况下，将由本专利说明书（包括定义）支配。此外，所述材料，方法和示例仅是说明性的，而不是为了必须的限制。

附图简述

在此仅通过实施例参照附图对本发明的一些实施方案进行描述。现在具体参考详细附图，应强调的是，详细情况通过实施例的方式示出并且目的是对本发明实施方案的说明性讨论。在这方面，伴有附图的描述使得本领域技术人员显而易见本发明的实施方案可如何实施。

图中：

图1为描绘人β-防御素3与含有连续稀释的cDNAs 的GAPDH的标准曲线的的线图。

图2为描绘利用未处理的HaCaT角质形成细胞进行的人β-防御素3的实时PCR分析（n =3）的线图。

图3A-D为描绘通过MTS检测测定的细胞活力百分比的曲线图。KU812细胞用草药提取物（1％，0.1％或0.01％，如图所示）培养24小时。漆黄素在浓度为100，10和1μM时测定。在490nm处读取平板，并以未处理细胞（100％活力）的百分比±SD计算细胞活力。测试物质的鉴定如下面表1中所示。

图4A-G为描绘KU812细胞中IL-13的表达被草药提取物抑制的曲线图。按照下文实施例1中所述用草药提取物处理KU812细胞，并且随后测定细胞培养上清液的IL-13表达。数值表示为IL-13的平均浓度（pg/ml）±SD。图4A测试物质：1-光果甘草；2-防风（Saposhnikovia divaricata）；3-雷公藤根（Radix Tripterygii wilfordii）；4-黑升麻；5-青葙（Celosia argentea）；6-黄连。测定浓度：浓度1 - 1％（样品6 - 0.05％），浓度2 - 0.1％（样品6 - 0.01％），浓度3 - 0.01%（样品6 - 0.001％）；图4B测试物质：7-丹参（Salviae miltiorrhizae）；8-三白草叶（Saururus Chinensis leaves）；9-金盏花（Calendula officinalis）；10-龙胆（Gentiana）；11-水薄荷（Mentha aquatica L）；12-蒲公英（Taraxacum officinale）。测定浓度：浓度1 - 1％（样品10 - 0.1％），浓度2 - 0.1％（样品10 - 0.01％），浓度3 - 0.01%（样品10 - 0.001％）；图4C测试物质：13-地肤子果实（Broom Cypress Fruit）；14-知母（Anemarrhena asphodeloides）；15-银柴胡（Stellaria dichotoma L. var. Lanceolata Root）；16-黄花贝母（Fritillaria verticillata）；17-水飞蓟（Silybum marianum）；18-葛枣猕猴桃（Actinidia polygama）。测定浓度：浓度1 - 1％（样品15 - 0.1％），浓度2 - 0.1％（样品15 - 0.01％），浓度3 - 0.01%（样品15 - 0.001％）；图4D测试物质：19-黄柏（Phellodendron）；20-无患子（Sapindus mukurossi）；21-苦参根（Radix Sophora flavescents）；22-地榆（Sanguisorba officinalis）；23-蛇床子果实（Fructus Cnidii）；24-山茶（Camelia japonica）。测定浓度：浓度1 - 1％（样品19 - 0.05％，样品20 - 0.01％，样品21 - 0.5％），浓度2 - 0.1％（样品19 - 0.01％，样品20 - 0.005％），浓度3 - 0.01%（样品19，20 - 0.001％）。图4E测试物质：25-黄芩（Scutellaria baicalensis）；26-掌叶大黄（Rheum palmatum）；27-菊花（Chrysanthemum）；28-马齿苋（Portulaca）；A-牡丹皮（Peony Bark）；B-当归（Angelica sinensis）。测定浓度：浓度1 - 1％（样品27和28 - 0.1％），浓度2 - 0.1％（样品27和28 – 0.5％），浓度3 - 0.01%。图4F测试物质：C-膜荚黄芪（Astragalus membranaceus）；D-吴茱萸（Evodia rutaecarpa）；E-虎杖（Polygonum cuspidatum）；F-阔叶麦冬（Liriope platyphylla）；G-土茯苓（Smilacis glabrae）；H-姜黄（Curcuma longa）。测定浓度：浓度1 - 1%（样品D和H - 0.1％，样品E和F - 0.5％），浓度2 - 0.1％（样品D - 0.05％，样品H - 0.01％），浓度3 - 0.01％（样品H - 0.001％）。图4G测试物质：I-青黛（Indigo）；J-海南大风子种子（Semen Hydnocarpi hainanensi）。测定浓度：I和J - 1％，0.1％和0.01％。漆黄素：100μm，10μM和1μM。

图5为描绘引起hBD-3表达显著增加的第136和137号草药提取物的线图（见箭头）。

图6为描绘引起hBD-3表达显著增加的第171号草药提取物的线图。

图7为描绘引起hBD-3表达显著增加的第194号草药提取物的线图。

图8为描绘引起hBD-3表达显著增加的第232和246号草药提取物的线图。

图9为描绘引起hBD-3表达显著增加的第362号草药提取物的线图。

图10为描绘六种草药提取物（如所示）对hBD-3表达的刺激作用的条形图。

图11为描绘用热水（HW），50％EtOH和50％MtOH提取的草药（如所示）对hBD-3刺激作用的比较的条形图。

图12为描绘通过MTS检测测定的细胞活力百分比的条形图。KU812细胞用草药提取物（0.3％）培养24小时。在490nm处读取平板，并以未处理的细胞（100％活力）的百分比±SD计算细胞活力。值得注意的是，样品4和B – 测试物质可能已与MTS溶液发生反应。显微镜检查没有显示任何细胞过度增殖或细胞毒性的迹象。测试物质鉴定如下：1. 光果甘草；2. 黑升麻；3. 水飞蓟；4. 地榆；A. 臭椿；B. 五倍子；C. 前胡。

图13为描绘KU812细胞中IL-13表达被草药提取物抑制的条形图。按照下文实施例1中所述用草药提取物（0.3%）处理KU812细胞，并且随后测定细胞培养上清液的IL-13释放。数值表示为IL-13的平均浓度（pg/ml）±SD。测试物质鉴定如下：1. 光果甘草；2. 黑升麻；3. 水飞蓟；4. 地榆；A. 臭椿；B. 五倍子；C. 前胡。

图14 A-E为描绘通过RT-PCR测定的草药提取物对人β-防御素3 （hBD-3）的刺激作用的曲线图。测定各草药提取物对β-防御素的刺激作用[图14A-D：图14A显示光果甘草（No.1）对hBD3表达的直接作用；图14B显示黑升麻(No.2)对hBD3表达的直接作用；图14C显示水飞蓟(No.3)对hBD3表达的直接作用；图14D显示地榆(No. 4) 对hBD3表达的直接作用]；图14E汇总草药提取物对hBD-3表达的刺激作用的结果。测试物质鉴定如下：1. 光果甘草；2. 黑升麻；3. 水飞蓟；4. 地榆。

图15A-C为描绘草药提取物之间的协同效应的条形图。测定草药提取物对IL-13抑制的协同效应（KU812细胞，ELISA）（图15A）或对β-防御素3的刺激作用（HaCaT细胞，RT-PCR）（图15B-C）。用1%臭椿根皮（图15B）或用（1％）五倍子（图15C）测定四种草药提取物的协同效应。图15A测试物质鉴定如下：1. 光果甘草；2. 黑升麻；3. 水飞蓟；4. 地榆。图15B测试物质鉴定如下：1%臭椿和0.3%的：1. 光果甘草；2. 黑升麻；3.水飞蓟；4. 地榆。图15C 测试物质鉴定如下：1%五倍子和0.3% 的：1. 光果甘草；2. 黑升麻；3. 水飞蓟；4. 地榆。

图16为描绘树脂层析处理前（A-C）和处理后（1-3）草药提取物的IL-13抑制活性的条形图。测定0.3%的草药提取物对IL-13的抑制能力。经层析优化前后的测试物质分别鉴定为：A，1-臭椿；B，2-五倍子；C，3-前胡。

图17A-B为描绘五倍子提取物(No. 232)的抗微生物活性的照片。图17A描绘对耐氨苄青霉素大肠杆菌的抗微生物活性；图17B描绘对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。

图18为描绘载体（由菱形表示）和治疗物（包含地榆和臭椿的组合物，由方块表示）治疗对象中SCORAD随时间减少（在第0，7，14和21天评估）的线图。

图19为描绘SCORAD组分（范围，强度和主观症状）对载体治疗组（第7，14及21天）中总得分的影响的线图。

图20为描绘SCORAD组分（范围，强度和主观症状）对治疗组（包含地榆和臭椿的组合物，在第7，14及21天）中总得分的影响的线图。

图21为描绘载体组和治疗组之间强度随时间衰减的比较的线图（在第0，7，14和21天评估）。

图22为描绘载体组和治疗组之间主观症状评分随时间降低的比较的线图（在第0，7，14和21天评估）。

图23为描绘载体组中具有改善症状的患者的百分比的条形图（第7，14及21天）。

图24为描绘治疗组中具有改善症状的患者的百分比的条形图（第7，14及21天）。

图25为描绘经21天治疗后，治疗组和载体组中具有改善症状的患者的百分比的条形图。

图26为描绘载体组中瘙痒和失眠减少的条形图（第7，14和21天）。

图27为描绘治疗组中瘙痒和失眠减少的条形图（第7，14和21天）。

图28为描绘在21天后，载体组和治疗组中对瘙痒和失眠的主观评价的改善的条形图。

图29为描绘在21天后，载体组和治疗组中重度和非重度AD的SCORAD减少的条形图。

图30为描绘载体组和治疗组中皮肤水合作用和经表皮失水（TEWL）的条形图。

图31为说明臭椿根的连续分级分离的流程图。

图32A-E为描绘臭椿根的水提取物，正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物对HaCaT细胞的人β-防御素3和GAPDH（内参基因）的影响的线图。图32A描绘10µl水（对照）对DEF3和GAPDH的表达的影响；图32B描绘10µl臭椿根水提取物对DEF3和GAPDH的表达的影响；图32C描绘10µl DMSO（对照）对DEF3和GAPDH的表达的影响；图32D描绘 10µl臭椿根乙酸乙酯提取物对DEF3和GAPDH的表达的影响；图32E描绘10µl臭椿根正丁醇提取物对DEF3和GAPDH的表达的影响。

图33为由臭椿根正丁醇提取物的梯度HPCL获得的色谱图。

图34为描绘分别用25个馏分治疗后的DEF3表达的实时PCR分析的线图。

图35是来自臭椿根提取物的DEF3-刺激化合物的NMR谱图。

图36是来自臭椿根提取物的DEF3-刺激化合物的NMR谱图。

图37是来自臭椿根提取物的DEF3-刺激化合物的NMR谱图。

图38是来自臭椿根提取物的DEF3-刺激化合物的NMR谱图。

图39A-B为来自臭椿根提取物的DEF3-刺激化合物臭椿酮的结构说明。

具体实施方式

本发明在其一些实施方案中涉及植物提取物，且更具体地、但不仅仅涉及所述植物提取物用于治疗或预防感染包括慢性炎症性疾病的继发性感染的用途。

参照附图和所附描述，可以更好地理解本发明的原理和操作。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应了解的是本发明的应用并不一定限于以下描述中所述或实施例中所例举的细节。本发明可以是其他实施方案或可以以各种方式实践或实施。还应了解的是，本文所采用的措辞和术语用于描述目的，不应该被认为是限制性的。

当本发明付诸实践时，本发明人开发了以草药提取物为基础的组合物用于治疗或预防感染，包括用于慢性炎症性疾病的继发性感染如特应性皮炎（AD）的治疗，并且所述组合物长期应用是安全的。具体而言，本发明人确定了抗炎草药提取物，该提取物具有对β-防御素表达的刺激活性，同时显示对T辅助细胞2（Th2）细胞因子的抑制作用。

如下文和以下实施例部分所示，本发明人首次显示了草药提取物作为β-防御素刺激物和作为IL-13生成抑制剂的双重作用。本发明人特别显示了获自于地榆(Sanguisorbae officinalis)，臭椿(Ailanthus altissima)，五倍子(Galla rhois gallnut)，光果甘草(Glycyrrhiza Glabra)，前胡(Peucedanum praeruptorum)和黑升麻(Cimicifuga raceomosa)的提取物可有效上调β-防御素表达同时下调IL-13的分泌（见实施例3-4和6-7，见下文）。本发明人还显示了地榆和臭椿或五倍子对刺激β-防御素和抑制IL-13生成的协同效应（见实施例8，见下文）。此外，本发明人显示了五倍子对金黄色葡萄球菌和耐氨苄青霉素大肠杆菌的抗菌作用（参见实施例9，见下文）。本发明人还在临床试验中例证了包含地榆根提取物，臭椿提取物和一种新配制的化妆品载体的化妆品组合物对特应性皮炎的治疗效率（见实施例10，见下文）。临床试验结果显示，在用包含地榆根提取物，臭椿提取物(治疗组)和载体治疗的患有轻到重度特应性皮炎的受试者中，客观和主观参数的强度（见图21-22）、以及各个症状的强度和遭受症状的患者的数目（见表15和图25）方面具有显著改善。特别是在患有重度特应性皮炎（SCORAD>50，见图29）的受试者中，显示了治疗组（42％）相对于载体组（21％）的优越活性。与载体组相比，表征重度特应性皮炎的症状，如水肿（50％vs.27％），渗出（86％vs.39％），表皮脱落（53％vs.23％）和苔癣样硬化（53％vs.28％）在治疗组中得到了较高程度的改善（表15）。

上述结果清楚地表明了治疗组对AD症状，特别是对与重度AD和继发性感染有关的症状的优异效果。之前已表明，金黄色葡萄球菌的密度可以达到10⁷个菌落形成单位/cm²，而无感染的临床症状[参见例如Goh等人，Int J Dermatol. (1997) 36(9):653-7]。因此，尽管临床试验任一组的受试者中未观察到感染的临床症状，细菌定植最有可能至少存在于重症患者(SCORAD >50)中。总之，目前的结果证明，加在载体乳液中的两种草药提取物（即地榆和臭椿）能够通过刺激β-防御素和通过抑制IL-13来治疗AD的继发性感染。这种上调β-防御素和下调IL-13的能力提供了用于治疗感染例如与慢性炎症有关的那些（正如AD）的平台技术。

本发明人还鉴定了臭椿内（也就是其皮或根皮，即臭椿根中）对β-防御素3（DEF3）的表达负责的活性成分为臭椿酮（参见实施例11和图39A-B，见下文）。综合而言，这些结果证实了这些草药提取物及其组合用于治疗和预防感染的治疗和美容价值。

因此，根据本发明的一个方面，提供治疗和/或预防需要其的受试者中的感染的方法，该方法包括给予所述受试者治疗有效量的包含如下所列的植物提取物或其活性成分的各组合物，从而治疗和/或预防所述受试者的感染。

术语“治疗”是指抑制，防止或阻止病理状态（疾病，障碍或病症）的发展和/或导致病理状态的减少，缓解或消退。本领域技术人员将理解，可以使用各种方法和检测以评估病理状态的发展，类似地，各种方法和检测可用于评估病理状态的减少，缓解或消退。

本文所用的术语“感染”是指其中病原微生物引起后续的组织炎症或损害的任何身体部分或组织的病理医学状态。可用本组合物治疗的感染性疾病的实例包括，但不限于，慢性感染性疾病，亚急性感染性疾病，急性感染性疾病，病毒性疾病，细菌性疾病，原生动物疾病，寄生虫病，真菌病，支原体疾病和朊病毒疾病。

根据本发明的一个实施方案，所述感染由革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌和/或其他病原微生物引起，包括但不限于，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），大肠杆菌(E. coli)，化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)（例如多重耐药性金黄色葡萄球菌），屎肠球菌(Enterococcus faecium)（例如耐万古霉素屎肠球菌）或白假丝酵母菌(yeast Candida albicans)。

根据本发明的一个实施方案，所述感染是皮肤感染（例如皮肤伤口）。可用本组合物治疗的皮肤感染的例子包括但不限于，由例如金黄色葡萄球菌或链球菌引起的皮肤细菌感染，由例如单纯疱疹病毒或带状疱疹病毒引起的皮肤病毒感染，皮肤真菌感染和皮肤酵母菌感染。

根据一个具体实施方案，本发明考虑感染伤口（如以特应性皮炎的继发性感染的形式出现的那些）的处理。

本文所用的术语“伤口”泛指以任一种方式（例如，伤口被传染性生物侵扰）引起且具有各种特征的皮肤和皮下组织以及内部脏器的损伤。示例性的例子包括，但不限于，挫伤，擦伤，烧伤，晒伤，切口伤口，切除伤口，手术创伤，坏死性筋膜炎，溃疡，静脉淤滞性溃疡，糖尿病溃疡，褥疮溃疡，口疮性溃疡，压疮，病变，疤痕，斑秃，皮炎，变应性接触性皮炎，特应性皮炎，结肠炎，化妆品皮炎，尿布皮炎，出汗障碍性皮炎，牛皮癣，湿疹，红斑，疣，肛门疣，血管瘤，樱桃状血管瘤，脚气，非典型痣，基底细胞癌，贝特曼紫癜，大疱性类天疱疮，念珠菌，耳轮软骨皮炎，克拉克痣（Clark’s nevus），唇疱疹，湿疣，囊肿，毛囊角化病，皮肤纤维瘤，盘状红斑狼疮，钱币状湿疹，特应性湿疹，汗疱湿疹，手部湿疹，多形性结节性红斑，福代斯症（Fordyce’s Condition），项部疤痕疙瘩性毛囊炎，毛囊炎，环状肉芽肿，Grover病，热疹，单纯疱疹，带状疱疹（shingles），化脓性汗腺炎，荨麻疹，多汗症，鱼鳞病，脓疱病，毛发角化病，瘢痕疙瘩，角化棘皮瘤，扁平苔藓，扁平苔藓样角化症，慢性单纯性苔藓，硬化性苔癣，淋巴瘤样丘疹病，皮肤狼疮，莱姆病，线状苔藓，黏液囊肿，蕈样肉芽肿，接触传染性软疣，痣，指甲真菌，糖尿病脂性渐进性环死，钱币状皮炎，甲分裂，甲癣，苔藓样糠疹，玫瑰糠疹，毛发红糠疹，跖疣，毒藤皮炎，毒橡皮炎，汗疱疹，须部假性毛囊炎，肛门瘙痒和白色糠疹。

根据伤口的深度，伤口通常分为四个等级之一：（i）I级：限于上皮的伤口；（ⅱ）II级：延伸到真皮的伤口；（ⅲ）III级：延伸到皮下组织的伤口；及（iv）IV级（或全深层性伤口（full-thickness wounds））：其中骨头暴露（例如，骨压力点，如大转子或骶骨）的伤口。

本文所用术语“部分皮层受损伤口（partial thickness wound）”是指包括I-III级的伤口；部分皮层受损伤口的例子包括烧伤，压疮，静脉淤滞性溃疡和糖尿病溃疡。

本文所用术语“深伤口”意在包括III级和IV级伤口。

本文所用术语“慢性伤口”是指三十天内未愈合的伤口。

涉及伤口的术语“愈合”是指例如通过瘢痕形成来修复伤口的过程。

在一个具体实施方案中，本发明的一些实施方案的组合物促进，即加速愈合过程。

如本文所用，术语“预防”是指使受试者免于发生疾病，障碍或病症。在某些情况下，受试者可能处于患病风险中，但尚未确诊为患有疾病。

根据本发明的这一方面，可被治疗的典型受试者包括哺乳动物，如人或家畜，包括但不限于，需要治疗或预防传染性疾病的任何年龄段的、雄性或雌性的马（即equine），牛，山羊，绵羊，猪，狗，猫，骆驼，羊驼，美洲驼和牦牛。

本发明预期治疗所有类型的感染，包括原发性感染和作为炎症性疾病（例如，慢性炎症性疾病）结果而出现的继发性感染。

如本文所用，短语“慢性炎症性疾病”是指以持续炎症为特征的任何医学病症。

炎症相关的医学病症的例子包括，但不限于，过敏性疾病，炎症性呼吸系统疾病，炎症性肺部疾病，自身免疫性疾病，炎症性恶性疾病，炎症性移植相关疾病，炎性退行性疾病，炎性损伤，炎症性口腔疾病，眼部炎症，炎症性皮肤疾病，与超敏反应相关的疾病，炎症性心血管疾病，炎症性腺病，炎症性胃肠道疾病，炎症性皮肤疾病，炎症性肝病，炎症性神经系统疾病，炎症性肌肉骨骼疾病，炎症性肾病，炎症性全身性疾病，炎症性结缔组织疾病，炎症性肿瘤，坏死，和/或炎症性植入物相关的疾病。

过敏性疾病的例子包括，但不限于，哮喘，荨麻疹，风疹，花粉过敏，尘螨过敏，毒液过敏，化妆品过敏，乳胶过敏，化学物质过敏，药物过敏，昆虫叮咬过敏，动物毛屑过敏，带刺植物过敏，毒藤过敏，过敏性休克，过敏反应，过敏性气道炎症和食物过敏。

炎症性肺部疾病的例子包括，但不限于，哮喘，过敏性哮喘，肺气肿，慢性阻塞性肺疾病和支气管炎。

炎症性呼吸系统疾病的例子包括，但不限于，急性呼吸道感染（由例如肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumonia）引起）。

眼部炎症的例子包括，但不限于，隐形眼镜接触（由例如铜绿假单胞菌引起的角膜炎）。

炎症性口腔疾病的例子包括，但不限于，溃疡性病变。

超敏反应的例子包括，但不限于，I型超敏反应，II型超敏反应，Ⅲ型超敏反应，Ⅳ型超敏反应，速发型超敏反应，抗体介导的超敏反应，免疫复合物介导的超敏反应，T淋巴细胞介导的超敏反应，迟发型超敏反应，辅助性T淋巴细胞介导的超敏反应，细胞毒性T淋巴细胞介导的超敏反应，TH1淋巴细胞介导的超敏反应，和TH2淋巴细胞介导的超敏反应。

炎症性心血管疾病的例子包括，但不限于，闭塞性疾病，动脉粥样硬化，心肌梗塞，血栓形成，韦格纳肉芽肿病，多发性大动脉炎（Takayasu’s arteritis），川崎综合征，抗因子VIII自身免疫性疾病，坏死性小血管炎，显微镜下多血管炎，Churg-Strauss综合征，寡免疫局灶性坏死性肾小球肾炎，新月体性肾小球肾炎，抗磷脂综合征，抗体诱导的心衰，血小板减少性紫癜，自身免疫性溶血性贫血，心脏自身免疫性疾病，恰加斯病(Chagas’s disease)，和抗辅助性T淋巴细胞自身免疫性疾病。

炎症性腺病的例子包括，但不限于，胰腺疾病和I型糖尿病。

炎症性胃肠疾病的例子包括，但不限于，结肠炎，回肠炎，克罗恩病，慢性炎症性肠道疾病，炎症性肠综合征，慢性炎症性肠疾病，腹腔疾病，溃疡，胃溃疡，消化性溃疡，口腔溃疡，鼻咽部溃疡，食管溃疡，十二指肠溃疡和胃肠道溃疡。

炎症性皮肤病的例子包括，但不限于，痤疮，自身免疫性大疱性皮肤病，寻常性天疱疮，大疱性类天疱疮，落叶型天疱疮，接触性皮炎和药疹。

炎症性肝病的例子包括，但不限于，自身免疫性肝炎，肝硬化和胆汁性肝硬化。

炎症性神经系统疾病的例子包括，但不限于，多发性硬化症，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病和重症肌无力。

炎症性结缔组织病的例子包括，但不限于，自身免疫性肌炎，原发性干燥综合症，平滑肌自身免疫性疾病，肌炎，肌腱炎，韧带炎症，软骨炎，关节炎症，滑膜炎症，腕管综合症，关节炎，类风湿关节炎，骨关节炎，强直性脊柱炎，骨骼炎症，自身免疫性耳病和自身免疫性内耳疾病。

炎症性肾病的例子包括，但不限于，自身免疫性间质性肾炎和/或肾癌。

炎症性全身性疾病的例子包括，但不限于，系统性红斑狼疮，系统性硬化症，感染性休克，中毒性休克综合征，和恶病质。

炎症性移植相关疾病的例子包括，但不限于，移植物排斥，慢性移植物排斥，亚急性移植物排斥，急性移植物排斥，超急性移植物排斥和移植物抗宿主病。

炎性肿瘤的例子包括，但不限于，恶性肿瘤，良性肿瘤，实体肿瘤，转移瘤和非实体肿瘤。

炎症性损伤的例子包括，但不限于，擦伤，瘀伤，割伤，刺伤，撕裂伤，冲击伤，脑震荡，挫伤，热烧伤，冻伤，化学烧伤，晒伤，干燥，辐射烧伤，放射性烧伤，烟雾吸入，肌肉撕裂，肌肉拉伤，肌腱撕裂，肌腱拉伤，韧带拉伤，韧带撕裂，过度伸展，软骨撕裂，骨折，神经压迫和枪伤。

炎症性皮肤病的例子包括，但不限于，皮肤湿疹，皮肤溃疡，褥/压疮，损伤，皮炎（如特应性皮炎，职业性皮炎），毒藤，痤疮，酒渣鼻和荨麻疹。

根据本发明的一个实施方案，所述慢性炎症性疾病是特应性疾病、接触性皮炎、钱币状皮炎、辐射性皮炎、烧伤、非特应性湿疹、压疮、哮喘、癌症、眼部炎症性疾病、呼吸道感染、口腔感染性疾病、过敏性气管炎症、炎症性肠病（IBD）、克罗恩病或溃疡性结肠炎。

根据本发明的一个具体实施方案，所述慢性炎症性疾病是特应性皮炎（AD）。

无论何种适应症，向所述受试者给予治疗有效量的包含植物提取物的组合物或包含其的单位剂型。

如本文所用，术语“植物提取物”是指从植物或其任何部分可获得的任何提取物。通常植物提取物包含其一种或多种活性成分。

因此，所述植物提取物可获自植物的果实、果皮或果壳、种子、皮、叶、根、根茎、根皮或茎或其组合。

本发明的植物提取物通常获自臭椿(Ailanthus altissima)、黑升麻 (Cimicifuga raceomosa)、五倍子(Galla rhois gallnut)、光果甘草(Glycyrrhiza Glabra (Licorice))、前胡(Peucedanum praeruptorum)、地榆(Sanguisorbae officinalis)、水飞蓟(Silybum marianum)、防风(Saposhnikovia divaricata)、雷公藤根(Radix Tripterygii wilfordii)、青葙(Celosia argentea)、黄连根(Coptis Root)、丹参根(Radix Salviae miltiorrhizae)、三白草(Saururus Chinensis (例如叶))、金盏花(Calendula officinalis)、龙胆(Gentiana)、水薄荷(Mentha aquatica L)、蒲公英根/药用蒲公英(Dandelion Root/Taraxacum officinale)、地肤子果实(Broom Cypress Fruit)、知母(Anemarrhena asphodeloides)、银柴胡根(Stellaria dichotoma L. var. lanceolata. Root)、黄花贝母(Fritillaria verticillata)、葛枣猕猴桃(Actinidia polygama)、黄柏(Phellodendronamurense)、无患子(Sapindus mukurossi­)、苦参根(Radix Sophora flarescents)、蛇床子(Cnidium monnieri)、山茶(Camelia japonica)、黄芩(Scutellaria baicalensis)、掌叶大黄(Rheum palmatum)、野菊花(Chrysanthemum indicum)、马齿苋(Portulacaoleracea)、牡丹皮(Peony Bark)、当归(Angelica sinensis)、膜荚黄芪根(Astragalus membranaceus Root)、吴茱萸果实(Evodia rutaecarpa fruit)、虎杖(Polygonum cuspidatum)、土茯苓根茎(Smilax glabra rhizoma)、姜黄(Curcuma longa)、青黛(Indigo naturalis)、海南大风子种子(Semen Hydnocarpi hainanensi)、雷公藤(Tripterygii wilfordii)、丹参(Salviae miltiorrhizae)、山茶(Camelia japonica)、黄芩(Scutellaria baicalensis)、掌叶大黄(Rheum palmatum)、牡丹(Peonia suffruticasa)、覆盆子(Rubi fructus)、灵香草(Lysimachiae foenumgraeci herba)、臭椿根皮(Ailanthi radicis cortex)、前胡根(Peucedani radix)、诃子果实(Terminariae fructus)、黄连根茎(Coptidis rhizome)和合欢皮(Albizziae cortex)植物。

根据本发明的一个实施方案，所述植物提取物是水性提取物、亲水性提取物、非极性提取物或极性提取物。

根据本发明的一个实施方案，所述植物提取物获自地榆。

根据一个具体实施方案，所述植物提取物获自地榆根。

根据本发明的一个实施方案，所述植物提取物获自臭椿。

根据一个实施方案，所述植物提取物获自臭椿的皮或根皮（即臭椿皮）。因此，根据另一实施方案，所述臭椿植物提取物由臭椿根植物提取物组成。

根据本发明的一个实施方案，所述植物提取物获自五倍子。

根据本发明的一个实施方案，所述植物提取物获自光果甘草。

根据本发明的一个实施方案，所述植物提取物获自掌叶大黄。

根据一个具体实施方案，所述植物提取物获自掌叶大黄根。

根据本发明的一个实施方案，所述植物提取物获自黄芩。

根据一个具体实施方案，所述植物提取物获自黄芩根。

根据本发明的一个实施方案，所述植物提取物获自前胡。

根据本发明的一个实施方案，所述植物提取物获自黑升麻。

也可考虑某些组合。这样的组合在下边列出。

所述植物提取物可被进一步处理来提纯那些活性成分，如具有抗感染活性的那些。测定抗菌活性或杀菌活性的方法在本领域中是众所周知的，包括但不限于，纸片扩散法，平板扩散法，肉汤稀释法和琼脂稀释抗微生物检测（其中一些列于下文和随后的实施例部分中）。本发明的植物提取物中存在的活性成分包括，但不限于，臭椿酮、苦楝素、川楝素、人参总皂苷、没食子酸、甘草苷、白花前胡甲素、鞣酸和水飞蓟宾。活性成分可由植物提取物纯化而来或经合成后使用。可通过上述检测方法测定浓度，并且以下提供的臭椿酮的具体范围可用于其他活性成分。

根据一个实施方案，植物提取物中的所述活性成分为臭椿酮。

如本文所用，术语“臭椿酮”或11β,20-环氧-1β,11α,12α-三羟基苦树烷-3,13(21)-二烯-2,16-二酮涉及“天堂树”（日文名“"Shinju"或"Niwaurushi"；臭椿，苦木科）树皮中含有的化合物和其衍生物（如美国专利Nos. 4,665,201和4,774,342中所述，通过引用在此并入）。本术语涉及天然存在（植物提纯的）或合成的化合物。

根据一个实施方案，当所述植物包括臭椿（Ailanthi altissima）时，所述活性成分包括臭椿酮。

根据另一实施方案，所述臭椿植物提取物包含至少约0.01％，至少约0.05％，至少约0.1％，至少约0.25％，至少约0.5％，至少约1％，至少约2.5％或至少约5％的臭椿酮。

各活性成分的具体预期范围如上所述（例如，臭椿酮包括0.01-5％，0.05-2.5％，0.05-1％，0.01-1％）。

根据一个实施方案，包含臭椿酮的组合物不含有臭椿材料，如纤维素，蛋白质和其他次生代谢产物。

植物提取物通常分为极性和非极性提取物以及亲水性和疏水性提取物。

因此，可使用极性溶剂对植物提取物进行纯化（即极性提取物），所述极性溶剂例如，而不限于，乙醇（乙醇），丁醇（丁醇），甲醇，水或丙醇。本发明的极性提取物可包含任何百分比的极性溶剂，包括例如1 - 10％的极性溶剂，10 - 20％的极性溶剂，20 - 30％的极性溶剂，30 - 40％的极性溶剂，40 - 50％的极性溶剂，50 - 60％的极性溶剂，70 - 80％的极性溶剂，80 - 90％的极性溶剂和90 - 100％的极性溶剂。

或者，可使用非极性溶剂对植物提取物进行纯化（即非极性提取物），所述非极性溶剂例如，而不限于，异辛烷。本发明的非极性提取物可包含任何百分比的非极性溶剂，包括例如1 - 10％的非极性溶剂，10 - 20％的非极性溶剂，20 - 30％的非极性溶剂，30 - 40％非极性溶剂，40 - 50％的非极性溶剂，50 - 60％的非极性溶剂，70 - 80％的非极性溶剂，80 - 90％非极性溶剂和90 - 100％的非极性溶剂。

通常，疏水性分子往往为非极性，因此更倾向溶于其他中性分子和非极性溶剂，另一方面，亲水性分子往往为极性并且溶于水和其他极性物质。因此，本发明的植物提取物可以通过本领域中已知的任何方法制备，包括极性提取物，例如水（水性）提取物或醇提取物（例如，丁醇，乙醇，甲醇，己烷，水-醇，参见例如Swanson RL等人, 2004, Biol. Bull. 206: 161-72）或非极性提取物（例如，异辛烷，参见例如Ng LK和Hupe M. 2003, J. Chromatogr A. 1011: 213-9; Diwanay S, 等人, 2004, J. Ethnopharmacol. 90: 49-55）。

不考虑所用的提取溶剂，植物提取物通常如下制备：将植物样品（例如，叶，种子）连同少量液体（例如，10ml水、乙醇或有机溶剂/2g植物样品）一起置于研钵中并用研杵彻底研磨样品。当植物样品完全被磨碎时，通过离心，过滤，离子交换层析等从磨碎的植物材料中分离植物提取物，如有需要进一步处理收集的液体（通过浓缩柱等），可通过亲和色谱法，质谱法等从该提取物中分离活性成分。

根据本发明的一些实施方案，用于获取臭椿根植物提取物的示例性方法包括将干燥的植物样品（例如，臭椿的皮或根皮）置于沸水中（例如达3小时），然后任选在-60℃下减压冻干该热水提取物。接着，可将冻干提取物用极性提取溶剂例如水、乙酸乙酯（EtOAc）或丁醇（n-BuOH）再次溶解。然后，如有需要，收集的植物提取物可被进一步处理（通过浓缩柱等），可通过例如高效液相色谱法（HPLC）等从该提取物中分离活性成分。

根据一个具体实施方案，本发明的植物提取物是水性提取物。为了获得纯化的植物提取物（例如，植物提取物中的有机盐和/或重金属和/或淀粉的水平降低），该水性植物提取物通常利用树脂层析例如大孔树脂或其它层析法进一步纯化。

因此，根据另一实施方案，提供用于治疗和/或预防感染的组合物的制备方法，所述方法包括：（a）将植物加入1-10倍体积的水中以制备植物提取物；及（b）利用大孔树脂减少植物提取物中的有机盐和/或重金属和/或淀粉的量，使得植物提取物中存在的活性成分的含量提高。

本发明的植物提取物也可从各种商业来源，例如，从Crodarom (Crodarom SAS, Chanac, France)获得。

本发明的组合物可包含一种植物提取物或可包含几种植物提取物。

因此，根据本发明的一个实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和至少一种附加的植物提取物，所述附加的植物提取物选自臭椿植物提取物，五倍子植物提取物和光果甘草植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含水性植物提取物，其中所述植物选自五倍子，前胡和黑升麻。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物，臭椿植物提取物和光果甘草植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物，臭椿植物提取物和五倍子植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和臭椿植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和五倍子植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和光果甘草植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和掌叶大黄植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含地榆植物提取物和黄芩植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含臭椿植物提取物和至少一种附加的植物提取物，所述附加的植物提取物选自五倍子植物提取物、光果甘草植物提取物、掌叶大黄植物提取物和黄芩植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含臭椿植物提取物和五倍子植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含臭椿植物提取物和光果甘草植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含臭椿植物提取物和掌叶大黄植物提取物。

根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含臭椿植物提取物和黄芩植物提取物。

应理解的是，所述组合物内的各植物提取物的浓度可以变化。因此，所述组合物内各植物提取物的浓度可在约0.01％至10％，0.05至9％，0.1至8％，0.15％至7％，0.2％至6％，约0.25至5％，约0.3至4％，约0.4至3％，约0.5至2％，约1至2％，或约0.1至1％的范围内。

根据一个具体实施方案，所述组合物内的所述植物提取物的浓度为约0.5至2％。根据另一个具体实施方案，所述组合物内的所述植物提取物的浓度为约1％。

根据本发明的另一个方面，提供包含浓度至少约0.01％的臭椿酮和化妆用或药学上可接受的载体的组合物。

根据一个实施方案，所述包含臭椿酮的组合物进一步包含地榆植物提取物。例如以本文所述的范围。

根据一个实施方案，所述包含臭椿酮的组合物进一步包含附加的植物提取物，例如五倍子植物提取物，光果甘草植物提取物，掌叶大黄根提取物，蛇床子果实提取物和黄芩根提取物。

根据一个实施方案，所述包含臭椿酮的组合物进一步包含甘草酸二钾。

应理解的是，所述组合物中臭椿酮的浓度可以变化。因此，所述组合物中臭椿酮的浓度可在约0.01至10％，约0.01％至7％，约0.01至5％，约0.01至3％，约0.01至2％，约0.01％至1％ ，约0.01％至0.5％，约0.01至0.3％，约0.01至0.2％或约0.01至0.1％的范围内。

根据一个实施方案，本发明的组合物可配制用于局部，口服，眼部或肺部（例如，用于吸入）给药。其他制剂在下文描述，且在本发明的范围之内。

本发明的组合物可原样或以药物或化妆品组合物的形式给予所述受试者。

本文所用的“药物或化妆品组合物”是指本文所述的活性成分与其他化学组分，如生理上适合的载体和赋形剂的制剂。所述组合物的目的是便于将活性成分（例如，植物提取物）给予受试者。

本文所用的术语“活性成分”是指引起预期生物效应（即，用于治疗或预防感染）的植物提取物组合物。

在下文中，可互换使用的短语“生理可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不对所述受试者产生显著刺激并且不消除所给予的活性成分的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包括在这些短语中。

本文中，术语“赋形剂”是指添加到组合物（药物组合物或化妆品组合物）中以进一步便于本发明有效成分的给药的惰性物质。

用于药物配制和给药的技术可见于“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版本，其通过引用在此并入。

本发明的各组合物可包括复合制剂或不同组合物（例如，两种制剂，三种制剂等）中的植物提取物。当不是复合配制时，植物提取物组合物的给药可同时或依次进行。

在任何情况下，该组合物可配制用于多种类型的给药。

适合的给药途径可包括例如口服、直肠、经粘膜，特别是经鼻、肠道或肠道外输送，包括肌内，皮下和髓内注射以及鞘内，直接心室内，心内，例如至右或左心室腔，至总冠状动脉，静脉内，腹腔内，鼻内或眼内注射。

或者，可以以局部而非全身的方式给予所述组合物，例如，通过将包括活性成分（例如，植物提取物）和生理上可接受的载体的组合物直接注入患者的组织区域（例如注入围绕感染皮肤的健康皮肤中）。

所述组合物的适合的给药途径可例如包括眼部（例如，向眼睛），局部（例如，向角质组织，如皮肤，头发，指甲，头皮），经皮，皮下，肺部和口服（例如，经口）给药。

根据一个实施方案，本发明的组合物经局部，肺部（例如，通过吸入），口服或眼部给药。

本文所用短语“口服给药”是指本发明的组合物经口给药，例如以液体，溶液，片剂，胶囊或酏剂的形式。

本文所用短语“皮肤给药”是指将本发明的组合物施用或涂布于身体表面，即皮肤，头皮，头发，指甲等上，优选受感染的表面上。

本文所用短语“透皮给药”是指透过皮肤给予本发明的组合物而用于全身给药（例如，经由透皮贴剂或通过透皮植入物）。透皮给药通常在邻近感染的部位起效，然而，透皮给药可以在本领域普通技术人员认为合适的任何解剖位置实施。

本文所用短语“皮下给药”是指在皮肤下（即完全埋在皮肤内，例如经由皮下植入物）给予本发明的组合物。皮下给药通常在邻近感染的部位起效，然而，皮下给药可以在本领域普通技术人员认为合适的任何解剖位置实施。

本发明的组合物可通过本领域中熟知的工艺生产，例如，通过常规混合，溶解，制粒，糖衣丸制备，磨细，乳化，胶囊化，包埋或冻干过程。

根据本发明一些实施方案使用的组合物因此可以以常规的方式使用一种或多种生理上可接受的载体（包括赋形剂和助剂）配制，所述载体可促进活性成分加工成可化妆用或药用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。

对于注射剂，该组合物的活性成分可被配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液如汉克氏溶液，林格氏溶液或生理盐缓冲液中。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合于透过所述屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。

对于口服给药，该组合物可通过将活性化合物与本领域中公知的载体（例如药学上可接受的载体）结合而容易地配制。这样的载体可使该组合物配制成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体制剂，凝胶剂，糖浆剂，浆液，混悬剂等用于患者口服摄取。用于口服的药理学制剂可使用固体赋形剂制备，任选将所得混合物研磨，并且如果需要，加入适合的助剂后，加工颗粒混合物以得到片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂为，特别是填充剂，例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如，玉米淀粉，小麦淀粉，米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，西黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。如有需要，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。

糖衣丸芯具有适合的包衣。为此目的，可使用浓缩糖溶液，其可任选含有阿拉伯胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆凝胶，聚乙二醇，二氧化钛，涂膜溶液（lacqure solution）和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以添加到片剂或糖衣丸包衣中以识别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可用于口服的组合物包括由明胶制成的推入适配式胶囊（push-fit capsules）以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。推入适配式胶囊可含有与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可溶于或悬浮于合适的液体如脂肪油，液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可添加稳定剂。所有口服给药的制剂应为适合所选给药途径的剂量。

对于口腔给药，所述组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于经鼻吸入给药，根据本发明的一些实施方案使用的活性成分可以气雾剂的形式方便地递送，其通过使用适宜的推进剂，如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷或二氧化碳，由加压的包装或喷雾器提供。对加压的气雾剂而言，可通过提供阀门来递送经计量的量以确定剂量单位。可配制在分配器中使用的例如明胶胶囊和筒，以含有化合物和合适的粉基(如乳糖或淀粉) 的混合粉末。

本文所述的组合物可配制用于肠胃外给药，例如，通过推注或连续输注。注射用制剂可以以单位剂型提供，例如在安瓿中或在任选添加有防腐剂的多剂量容器中。该组合物可以是油性或水性媒介物（vehicles）中的混悬剂，溶液或乳剂，并且可以含有配制剂，如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外给药的组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，活性成分的混悬剂可制备为适当的油基或水基注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油如麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加悬浮剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠，山梨醇或右旋糖苷。任选地，该混悬剂也可含有合适的稳定剂或使活性成分溶解度增加以使得能够制备高浓度溶液的试剂。

或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适的媒介物，例如，无菌、无热原的水基溶液复溶（constitution）。

本发明的一些实施方案中的组合物还可利用例如常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯，配制为直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂(retention enemas)。

适合用于本发明的一些实施方案背景中的组合物包括其中含有可实现预期目的的有效量的活性成分的组合物。

本文所用短语“治疗有效量”是指有效预防或治疗感染的活性成分（即植物提取物组合物或其活性成分，如上所述）的量。本发明的组合物的治疗有效量也可有效下调受试者细胞（如嗜碱性细胞，参见例如以下实施例部分的实施例3和6）中Th2型细胞因子（如IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13等）的分泌。本发明的组合物的治疗有效量还可有效上调（例如刺激）受试者细胞（如角质形成细胞，参见例如以下实施例部分的实施例4和7）中人β-防御素（如人β-防御素3）的表达。此外，本发明的组合物的治疗有效量可包括抗菌活性（例如，抗金黄色葡萄球菌和耐氨苄青霉素的大肠杆菌，参见例如以下实施例部分的实施例9）。

根据一个实施方案，臭椿酮的治疗有效量包含的浓度为至少约0.01％，至少约0.05％，至少约0.1％，至少约0.25％，至少约0.5％，至少约1％，至少约2.5％，或至少约5％，或在约0.01％至10％，约0.01％至7％，约0.01％至5％，约0.01％至3％，约0.01％至2％，约0.01％至1％，约0.01％至0.5％，约0.01％至0.3％，约0.01％至0.2％或约0.01％至0.1％的范围内。

治疗有效量的确定完全在本领域技术人员能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

对于本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可通过体外试验初步评估。例如，可通过例如PCR（例如实时PCR）测定细胞（如表达β-防御素的角质形成细胞细胞系）中人β-防御素上调后（即增加）的表达来体外评估治疗有效量。或者，可通过例如采用抗体（如IL-13特异性单克隆抗体）测定来自细胞（如分泌IL-13的嗜碱性细胞系）的Th2型细胞因子（如IL-13）下调后（即减少）的分泌来体外评估治疗有效量。

此外，剂量可以在组织培养体系（例如离体体系）或在动物模型中配制，以达到所需的浓度或滴度。此信息可用于更准确地确定在人类中的有用效剂量。例如，可通过测定在给予组合物前后受炎症状态影响的受试者中的炎症水平[例如通过验血如全血细胞计数（CBC），通过观察皮肤伤口等] 来体内评估治疗有效量。

本文所述的活性成分的毒性和疗效可通过在体外，在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。从这些体外、细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制订用于人类的剂量范围。剂量可根据所用剂型和所用给药途径而有所不同。确切的制剂、给药途径和剂量可以由医生个人根据患者病情来选择（参见例如Fingl, E.等人，(1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Ch. 1, p.1）。

根据病情的严重程度（例如，感染的面积，深度和程度）和受试者对治疗的反应，给药可以是单次或多次给予，疗程持续数日至数周、数月或数年，或直至有效治愈或实现感染减轻。或者，给予该组合物以预防有感染风险的受试者（例如，患有慢性炎症性疾病的受试者）出现感染。可较长时间（例如，数日、数周、数月或数年）给予该组合物以预防感染发生。

根据本发明的一个实施方案，至少每天一次给予本发明的组合物。根据另一实施方案，一天两次，一天三次或更多次给予该组合物。

根据本发明的一个实施方案，给药长期进行。

根据另一个实施方案，给药进行达至少约10天，12天，14天，16天，18天，21天，24天，27天，30天，60天，90天或更多天。

当然，组合物的给药量将取决于所治疗的受试者，病痛的严重程度，给药方式，处方医师的判断等。

本发明的组合物可配制为单位剂型。以这种形式，制剂被细分为含有例如用于单次给药的适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂（所述包装含有制剂的分离量），例如，安瓿，分药器，胶布绷带，非粘性绷带，擦布，婴儿擦布，纱布，衬垫和卫生垫。

根据本发明的教导，单位剂型可包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的地榆植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可进一步包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的臭椿植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可进一步包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的光果甘草植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可进一步包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的五倍子植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可进一步包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的掌叶大黄植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可进一步包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的黄芩植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的臭椿植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的光果甘草植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的五倍子植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的地榆植物提取物，浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的臭椿植物提取物和浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的光果甘草植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可包含浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的地榆植物提取物，浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的臭椿植物提取物和浓度约0.5-5%重量/重量，约0.5-2%重量/重量或根据一个具体实施方案约1%重量/重量的五倍子植物提取物。

根据本发明的教导，单位剂型可包括选自局部，口服，肺部或眼部单位剂型的单位剂型，上述单位剂型包含浓度至少约0.01％重量/重量，约0.01-1％重量/重量，约0.01-2％重量/重量，约0.01-3％重量/重量，约0.01-4％重量/重量或约0.01-5％重量/重量的臭椿酮。

单位剂量制剂中活性化合物的量可根据特定的应用变化或调整。

如果需要，本发明的组合物可在包装或分配装置中提供，例如FDA 批准的药盒，其可含有一种或多种包含活性成分的单位剂型。所述包装可包括，例如金属或塑料薄膜，如泡罩包装。所述包装或分配装置可以附有给药说明书。所述包装或分配装置也可附有由调控药品生产、使用或销售的政府机构规定形式的公告，该公告反映了该机构批准的人用或兽用给药的该组合物的形式。例如，这样的公告可以包括美国食品和药品管理局对于处方药批准的标志或者是已批准的产品说明书。如上面进一步详细说明的，还可以制备包含配制在药学上可接受的载体中的本发明制剂的组合物，将其放置在合适的容器中，并标记用于所示病症的治疗。

由于本发明的组合物用于体内，该组合物优选具有高纯度且基本上无潜在有害的污染物，例如，至少National Food（NF）级，通常至少为分析级，并且优选至少药用级。如果给定化合物必须在使用前合成，那么所述合成或后续的纯化应优选产生这样的产品，其基本不含在合成或纯化过程中所用的任何潜在污染有毒试剂。

其他因子可包含在本发明的组合物（即，上文所述的植物提取物）内。这些包括，但不限于，细胞外基质组分（如玻连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白，弹性蛋白），生长因子（如FGF 1, FGF 2, IGF 1, IGF 2, PDGF, EGF, KGF, HGF, VEGF, SDF-1, GM-CSF, CSF, G-CSF, TGFα, TGFβ, NGF和ECGF），生长因子[如促红细胞生成素，成纤维细胞生长因子，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）]，激素类（如胰岛素，生长激素（GH），CRH，瘦素，催乳素和TSH），血管生成因子（如血管生长素和血管生成素），凝血和抗凝血因子[如，因子I，因子XIII，组织因子，钙，vWF，蛋白C，蛋白S，蛋白Z，纤连蛋白，抗凝血酶，肝素，纤溶酶原，低分子量肝素（Clixan），高分子量激肽原（HMWK），激肽释放酶原, 纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI1），纤溶酶原激活物抑制剂-2（PAI2），尿激酶，血栓调节蛋白，组织纤溶酶原激活剂（tPA），α2-抗血纤维蛋白溶酶和蛋白Z-相关的蛋白酶抑制剂（ZPI）]，细胞因子抑制剂（如环孢霉素A，α-2-巨球蛋白，喷他脒，己酮可可碱，地塞米松），趋化因子抑制剂（如肽3，NR58.3-14-3），酶（如糖苷内切酶，外切糖苷酶，核酸内切酶，核酸外切酶，肽酶，脂肪酶，氧化酶，脱羧酶，水化酶，软骨素酶，软骨素酶ABC，软骨素酶AC，透明质酸酶，角质素酶，类肝素酶，乙酰肝素酶剪接变异，胶原酶，胰蛋白酶，过氧化氢酶），神经递质，神经肽（如P物质），维生素类（如，D-生物素，氯化胆碱，叶酸，肌醇，烟酰胺，D-泛酸，钙盐，盐酸吡哆醛，盐酸吡哆辛，核黄素，盐酸硫胺素，维生素B12，维生素E，维生素C，维生素D，维生素B1-6，维生素K，维生素A和维生素PP），碳水化合物（如，单/二/多糖，包括葡萄糖，甘露糖，麦芽糖和果糖），离子，螯合剂（如铁螯合剂，钙螯合剂），抗氧化剂（如，维生素E，Quarcetin ，超氧化物清除剂，超氧化物歧化酶，过氧化氢清除剂，自由基清除剂，铁清除剂），脂肪酸（如，甘油三酯，磷脂，胆固醇，游离脂肪酸和非游离脂肪酸，脂肪醇，亚油酸，油酸和硫辛酸），抗生素（如青霉素类，头孢菌素类和四环素类），氨基酸（如，必需的和非必需的（A-Z），尤其是谷氨酰胺和精氨酸），盐（如，prurivat盐和硫酸盐），硫酸盐（如硫酸钙），类固醇（如，雄激素，雌激素，孕激素，糖皮质激素和盐皮质激素），镇痛剂，麻醉剂，抗细菌剂，抗酵母剂，抗真菌剂，抗病毒剂，益生菌剂， 抗原生动物剂（anti-protozal agent），止痒剂，抗皮炎剂，止吐剂，抗炎剂，抗角化剂（anti-hyperkeratolyic agent），止汗剂，抗脂溢性剂，抗组胺剂，缺氧诱导因子（如HIF-1 α和β和HIF-2），儿茶酚胺（如肾上腺素和去甲肾上腺素），核苷和核苷酸（如，嘌呤类和嘧啶类），前列腺素（如前列腺素E2），白三烯，促红细胞生成素（如，血小板生成素），蛋白聚糖（如硫酸乙酰肝素，硫酸角质素），羟基磷灰石类[如羟基磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)]，结合珠蛋白（Hp1-1，Hp2-2和Hp1-2），超氧化物歧化酶（如SOD 1/2/3），氮氧化物，一氧化氮供体（如硝普盐，Sigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国），谷胱甘肽过氧化物酶，保湿化合物（如血管加压素），细胞（如血小板），细胞培养基（如M199，DMEM/F12，RPMI，Iscovs），血清（如人血，胎小牛血清，胎牛血清），缓冲液（如，HEPES，碳酸氢钠），洗涤剂（如吐温），消毒剂，草药，水果提取物，蔬菜提取物（如白菜，黄瓜），花提取物，其他植物提取物，黄酮类（如石榴汁），香料，叶（如绿茶，洋甘菊），多酚（如，红葡萄酒），蜂蜜，凝集素，微粒，纳米颗粒（脂质体），胶束，碳酸钙（CaCO3，如沉淀的碳酸钙，研磨/粉碎的碳酸钙，albacar，PCC，GCC），方解石，石灰石，碎大理石，石灰石粉，石灰和白垩（如白垩粉，香槟白垩，滑石粉）。

根据一个具体实施方案，本发明的组合物不包含β-防御素。

本制剂还可包含含有氢，烷基，芳基，卤基，羟基，烷氧基，烷基氨基，二烷基氨基，酰基，羧基，脲基，磺酰胺基，氨酰基，酰胺基，胺基，硝基，有机硒化合物，烃和环烃的成分，物质，元素与材料。

本制剂可与一些物质结合，如过氧化苯，血管收缩剂，血管舒张剂，水杨酸，视黄酸，壬二酸，乳酸，羟基乙酸，pyreuric酸，鞣酸，苯亚甲基樟脑（benzlidenecamphor）及其衍生物，αhydroxyis，表面活性剂。

本发明的一些实施方案的组合物可与聚乙二醇（如PEG，SE-PEG）形成生物共轭结合物，这可保持活性成分（即本发明的植物提取物组合物）的稳定性（如，抗蛋白酶活性）和/或溶解度（例如在生物流体如血液，消化液中），同时保留其生物活性和延长其半衰期。

除本文公开的药学有效量外，本发明的这个方面的组合物中还包括皮肤病学上或化妆用可接受的载体。

短语“皮肤病学上可接受的载体或稀释剂”或“化妆用可接受的载体或稀释剂”是指这样的载体，其适于在皮肤即角质组织上局部施用，具有良好的美学特性，与本发明的活性剂及任何其他组分相容，并且用于哺乳动物安全无毒。

应理解的是，本发明的载体（如，化妆用可接受的载体，药学上可接受的载体）可包含用于治疗医学病症（如，特应性皮炎）的成分（如植物提取物）。

因此，本发明的一些实施方案的载体包含至少一种植物提取物。

根据一个实施方案，所述载体内的所述植物提取物包含掌叶大黄根提取物，蛇床子果实提取物和/或黄芩根提取物。

根据一个实施方案，所述载体可进一步包含甘草酸二钾。

根据一个实施方案，所述化妆品载体包含掌叶大黄根提取物，蛇床子果实提取物，黄芩根提取物和甘草酸二钾。

为增强活性成分（如，本发明的植物提取物）的经皮吸收，可在药物或化妆品组合物中添加多种试剂中的一种或多种，包括但不限于二甲亚砜，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，表面活性剂，氮酮，醇，丙酮，丙二醇和聚乙二醇。

本发明组合物中所用的载体可以是各种各样的形式。这些形式包括乳剂载体，包括但不限于，水包油型，油包水型，水包油包水型和硅酮包水包油乳剂，霜剂，软膏，水溶液，乳液（lotion），肥皂，糊剂，乳剂，凝胶，喷雾或气雾剂。

根据本发明的乳剂通常含有药学有效量的本文所公开的试剂和脂质或油。脂质和油类可以来源于动物，植物或石油，并且可以是天然或合成的（即人造的）。例如，在版布给Dickert等人的美国专利No. 3,755,560，1973年8月28日；颁布给Dixon等人的美国专利No. 4,421,769，1983年12月20日；及McCutcheon's Detergents and Emulsifiers，北美版，第317-324页（1986）中描述了合适的乳化剂的例子，其各自的全部内容通过引用完全并入。

该乳剂也可含有消泡剂以使施用于角质组织时的起泡最小化。消泡剂包括高分子量硅酮和本领域中公知用于这种用途的其他物质。

取决于所需的产品形式，合适的乳剂可具有宽范围的粘度。

如下面进一步描述的，本发明的组合物可以以药物或化妆品工业中用于皮肤施用的各种形式中的任何一种形式配制，包括溶液，乳液，喷雾剂，霜剂，软膏，药膏（salves），凝胶，油剂，洗剂，洗发剂，调理剂（conditioners）等。

本发明的药物或化妆品组合物可配制具有足够的粘性，使得停留在所治疗的皮肤区域上，不易蒸发，和/或不易用水冲洗除去，而是在肥皂，清洁剂和/或洗发水的辅助下可除去。

制备具此性质的组合物的方法是本领域技术人员众所周知的，且详细描述于Remington's Pharmaceutical Sciences，1990 (同上)；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第6版，Williams & Wilkins (1995)中。

本发明的组合物，包括但不限于乳液和霜剂，可包括皮肤病学上或化妆用可接受的保湿剂和/或润肤剂。如本文所用，“润肤剂”是指可用于防止或缓解干燥，以及保护皮肤的物质。各种合适的润肤剂是已知的并可用于本发明。例如，参见Sagarin，Cosmetics, Science and Technology，第2版，第1卷，第3243页（1972），其中包含了大量适合作为润肤剂的物质的例子，其通过引用完全并入本文。一个示例性的润肤剂是甘油。其他可使用的润肤剂包括但不限于烃油和蜡，如矿物油、矿脂等，植物和动物油和脂肪，如橄榄油、棕榈油、蓖麻油、玉米油、大豆油等，以及羊毛脂及其衍生物，如羊毛脂、羊毛脂油、羊毛脂蜡、羊毛脂醇等。其他的润肤剂包括具有10至20个碳原子的脂肪酸，如肉豆蔻酸，硬脂酸，异硬脂酸，棕榈酸等的酯，如肉豆蔻酸甲酯，肉豆蔻酸丙酯，肉豆蔻酸丁酯，硬脂酸丙酯，异硬脂酸丙酯，棕榈酸丙酯等。其他的润肤剂包括具有10至20个碳原子的脂肪酸，包括硬脂酸，肉豆蔻酸，月桂酸，异硬脂酸，棕榈酸等。润肤剂也包括具有10至20个碳原子的脂肪醇类，如，如鲸蜡醇，十四烷醇，月桂醇，异硬脂醇，硬脂醇等。

根据一个实施方案，本发明的化妆品组合物包含地榆植物提取物，臭椿植物提取物，掌叶大黄根提取物，蛇床子果实提取物，黄芩根提取物和甘草酸二钾。

根据一个实施方案，所述化妆品组合物进一步包含保湿剂和润肤剂。

本发明的组合物还可包括例如为了使组合物富集香味和皮肤营养因子而加入的附加组分。

在合理的医学判断范围内选择这些组分以适合用于人类角质组织上而不引起毒性，不相容性，不稳定性，过敏反应等。此外，只要它们不是难以接受地改变本发明的活性化合物的益处，那这些任选的组分是有用的。

CTFA Cosmetic Ingredient Handbook，第二版（1992）描述了各种常用于皮肤护理工业的非限制性的化妆品成分，其适合用于本发明的组合物。这些成分类别的例子包括：研磨剂，吸收剂，美学组分如香精、色素、着色剂（colorings）/着色剂（colorant），精油，皮肤增感剂，收敛剂等（如，丁香油，薄荷醇，樟脑，桉树油，丁香酚，乳酸薄荷酯，金缕梅馏出物），抗痤疮剂，防结块剂，消泡剂，抗微生物剂（如，丁基氨基甲酸碘丙酯），抗氧化剂，粘合剂，生物添加剂，缓冲剂，填充剂，螯合剂，化学添加剂，着色剂，化妆品收敛剂，化妆品抗微生物剂，变性剂，药物收敛剂，外用止痛剂，成膜剂或用于辅助组合物的成膜性和直接性的材料，例如，聚合物（如，二十碳烯和乙烯基吡咯烷酮的共聚物），遮光剂，pH调节剂，推进剂，还原剂，多价螯合剂，皮肤调节剂（如，保湿剂，包括混杂的和封闭的），肌肤舒缓剂和/或愈合剂（如，泛醇及衍生物（如乙基泛醇），芦荟，泛酸和其衍生物，尿囊素，红没药醇及甘草酸二钾），皮肤治疗剂，增稠剂，和维生素及其衍生物。

如上所述，本发明的组合物可直接施用于皮肤。或者，它可以通过本领域中已知的各种透皮药物递送系统（例如以定时释放（time released）方式将组合物释放至皮肤的透皮贴剂）经由正常皮肤施用而递送。本领域已知的其他药物递送系统包括加压气雾剂瓶，离子导入或超声波导入。离子导入被用来增加皮肤通透性和促进透皮给药。美国专利Nos. 5,667,487和5,658,247公开了一种离子超声装置，其适用于超声-离子电渗疗法介导的治疗剂转运穿过皮肤。可选地，或另外地，脂质体或胶束也可用作递送工具。

应当理解，本发明的组合物可以与目前实行的其他疗法组合使用，其他疗法例如，但不限于，光线/光照疗法（例如，炎症性皮炎的光照疗法）和抗生素疗法（例如，局部或全身）。

根据本发明的另一个实施方案，提供一种识别具有炎性调节剂性能的试剂的方法，所述方法包括：（a）使该试剂与细胞接触；及（b）测定人β-防御素在细胞中的分泌，其中所述接触后β-防御素分泌的上调表明该试剂具有炎性调节剂的性能。

根据一个实施方案，所述试剂包含植物提取物或其活性成分。

如本文所用，术语“上调”是指RNA和/或蛋白质的水平增加，或引起细胞中β-防御素分泌增加的细胞中人β-防御素的DNA拷贝数。

通常，人β-防御素的水平相对于未用植物提取物处理的细胞中的人β-防御素的水平增加。未用植物提取物处理的细胞中人β-防御素的水平的测定优选与升高的表达的测定一起进行。

应当理解，根据本发明的教导，任何自然表达人β-防御素或经遗传改造表达β-防御素的细胞可用于测定人β-防御素（例如人β-防御素3，β-防御素2或β-防御素1）表达的上调（即增加）。

根据一个具体的实施方案，所述细胞为上皮细胞（如角质形成细胞）。

依据本发明的教导，可使用本领域已知的用于检测人β-防御素多核苷酸或多肽表达的任何方法。

因此，例如，可使用一些RNA检测方法，如Northern印迹分析，反转录PCR（RT-PCR）[例如，半定量RT-PCR，使用如Light CyclerTM（Roche）的定量RT-PCR]，RNA原位杂交（RNA-ISH），原位RT-PCR染色和寡核苷酸微阵列分析[例如使用Affymetrix微阵列（Affymetrix®, Santa Clara, CA）]。

根据一个具体的实施方案，利用实时PCR测定细胞中人β-防御素的分泌。

或者，可利用人β-防御素特异性抗体经由形成免疫复合物 [即，存在于生物样品中的人β-防御素抗原（人β-防御素的氨基酸序列）与人β-防御素特异性抗体形成的复合物]，例如通过ELISA或通过Western印迹分析，检测人β-防御素氨基酸序列（即人β-防御素蛋白）的存在和/或水平。

本文所用的术语“约”是指±10%。

术语“包含（comprises）”，“包含（comprising）”，“包括（includes）”，“包括（including）”，“具有”及它们的同根词是指“包括但不限于”。

术语“由……组成”是指“包括且限于”。

术语“基本由……组成”是指所述组合物、方法或结构可包含另外的成分、步骤和/或部分，但是仅限于这些另外的成分、步骤和/或部分不会实质性改变所要求的组合物、方法或结构的基本特征和新颖性特征。

除非上下文清楚地另行规定，如本文所用的单数形式“一种（a）”、“一种（an）”和“所述（the）”包括复数指代。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包含其混合物。

遍及本申请，本发明的各种实施方案可能以一定范围的格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对本发明范围的一种死板的限制。因此，某一范围的描述应认为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围1至6的描述应认为已具体公开了例如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等的子范围，以及该范围内的各个数值，例如1，2，3，4，5和6。无论范围的广度，本说明均适用。

无论何时本文指出数值范围，意在包括所指范围内的任何引用数字（分数或整数）。短语“……之间”——在第一个所示数字和第二个所示数字之间与短语“……至……”——第一个所示数字“至”第二个所示数字，在本文可互换使用，并且意在包括第一个和第二个所示数字以及它们之间的所有分数和整数。

本文所用术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和步骤，包括，但不限于那些已知的，或者易由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者从已知的方式、手段、技术和步骤发展而来的方式、手段、技术和步骤。

可以理解的是，为了清楚起见在不同的实施方案的内容中描述的本发明的某些特征也可以在单个的实施方案中组合提供。反之，为了简洁起见在单个实施方案的内容中提供的本发明的各种特征也可单独地或以任何合适的子组合的形式或适当地在本发明的任何其他所述实施方案中提供。各种实施方案的内容中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非所述实施方案在没有这些要素时不可操作。

如上文所述以及如以下权利要求部分要求的本发明的各种实施方案和方面可在以下的实施例中找到实验性支持。

实施例

现在参考以下实施例，其与上面的描述一起以非限制方式对本发明进行说明。

一般而言，本文使用的术语和本发明利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook等人, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" I-III卷，Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel等人, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson等人, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren等人(eds)，"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；美国专利Nos. 4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所描述的方法学；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", I-III卷，Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology"，I-III卷，Coligan J. E., ed. (1994); Stites等人(eds), "Basic and Clinical Immunology" (第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell和Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)；在专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定法，参见，例如，美国专利Nos. 3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D.和Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D.和Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)和"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak等人, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；所有这些文献都通过引用并入如同在本文全部列出。其它一般性参考文献提供在本文各处。其中的程序被认为是本领域熟知的，并为方便读者而提供。包含在其中的所有信息都通过引用并入本文。

实施例 1

适合评价 IL-13 抑制的体外模型的开发

物质及实验步骤

KU812细胞的培养

将KU812细胞（人嗜碱性细胞，ATCC CRL-2099™）用含10%胎牛血清（FBS），50 μg/ml庆大霉素和50 μg/ml两性霉素B或青链霉素的RPMI接种于培养瓶。接种的细胞在37 + 2℃及5 + 1 % CO₂下培养，每个星期更换培养基2-3次，直至细胞生长至足够数量。

（测试物质的）提取工艺

根据质量检测（原料的分选和鉴定，重金属分析，农药残留检查和活性成分含量分析）选择草药。

切片的草药材用10倍体积的水匀浆混匀，并在80℃搅拌下提取2小时。用相同的步骤重复提取3次，并将三次提取物混合在一起。收集匀浆产物，通过400目的筛网过滤，浓缩（80℃，0.1MPa），然后以10000转/分钟离心20分钟。

通过大孔树脂纯化提取物，然后浓缩至所需体积。根据质量标准进行提取物的质量检测（自然属性，相对密度，pH值，重金属分析，微生物检测，活性成分含量测定）。

测试物质的细胞毒性预筛— MTS 检测

为了用于检测，将细胞在100μl不含酚红的细胞培养基中接种于96孔板（每个孔大约0.1-0.2 x 10⁶个细胞）。接着，将在细胞培养基中制备的2倍终浓度的测试物质（1000μl）加入各孔使培养物的终体积达到200μl。将培养板于37 + 2℃和5 + 1% CO₂下培养24小时。培养后，向各孔添加20μl的20:1的MTS：PMS溶液（Promega），再次将培养板放入培养箱培养另外4小时。随后用酶标仪在490nm处对培养板进行读数。

IL-13释放检测

在用于IL-13释放检测之前，将KU812细胞在不含FBS的RPMI培养基中培养2天。经2天培养后，用含FBS的RPMI进行IL-13检测。

将KU812细胞在100μl RPMI中接种于96孔板（每孔约0.2-0.3 x 10⁶个细胞）。随后，将在细胞培养基中制备的2倍终浓度的测试物质（100μl）加入各孔，并将细胞在37 + 2℃及5 + 1 % CO₂下培养约6小时。经过此预处理期后，将10μl含PMA和离子霉素的浓缩原液加入各孔（培养物中PMA的终浓度为20ng/ml，离子霉素的终浓度为1μM），随后培养板于37 + 2℃和5 + 1 % CO₂下培养过夜。然后测定细胞培养上清液的IL-13。

IL-13 ELISA（RayBiotech）

制备一系列的标准品（0-40pg/ml）并将100μl的各标准品分配到96孔板中的2个孔中（重复）。随后，将25μl的各细胞培养上清液样品和100μl的稀释剂B添加到另外的孔中（样品用稀释剂B进行稀释以使其IL-13的水平处于标准曲线的范围内），并将培养板在室温下培养2.5小时。培养后，培养板用洗涤缓冲液洗涤3次。最后一次洗涤液除去后，加入100μl生物素结合的检测抗体。培养板室温培养1小时后，如上所述再次洗涤培养板。然后，向各孔中加入HRP-链霉抗生物素蛋白（100μl）并将培养板在室温下培养45分钟。最后一次洗涤液除去后，向各孔中加入100μl底物溶液（过氧化氢+四甲基联苯胺作为显色剂）。一旦发生足够量的显色，向各孔加入50μl的终止溶液（2N硫酸）并将培养板在460nm处读数。

计算

细胞活力检测（ MTS 检测）

测定未用测试物质处理的培养孔的平均吸光度并用于表示100%的细胞活力（未处理）。该数值然后用于测定用测试物质处理的培养孔的活力（处理），利用以下公式：（（处理）/(未处理)）x 100。

IL-13 ELISA 分析

对于IL-13的ELISA检测，利用已知标准品的吸光度数值生成标准曲线。然后通过该标准曲线确定未知样品的数值。

结果

开发基于细胞的检测方法

本发明人采用KU812人嗜碱性培养模型来评估草药提取物对IL-13释放施加影响的能力。在本文所用的检测系统中，将KU812细胞用测试物质进行约6小时的预处理，随后在测试物质仍然存在的情况下，用豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol myristate acetate, PMA）和钙离子载体离子霉素刺激细胞。加入PMA和离子霉素后，将细胞培养过夜。第二天测定细胞培养上清液的IL-13释放。

免疫细胞作为模型： KU812 嗜碱性细胞

许多类型的细胞，如T细胞、肥大细胞和嗜碱性细胞，可产生细胞因子IL-4和IL-13。虽然一直认为IL-4仅来源于CD4+T细胞，但最近的体外研究已清楚地表明培养物中由外周血白细胞产生的IL-4和IL-13的绝大部分来源于人嗜碱性细胞[Higa S.等人，J Allergy Clin Immunol (2003)111(6): 1299-1306]。也有越来越多的证据证实了嗜碱性细胞在特应性疾病，如支气管哮喘、特应性皮炎和过敏性鼻炎的发病机制中的作用。

嗜碱性细胞是外周血白细胞中的一小部分，其含有可用嗜碱性染料染色的细胞质颗粒。嗜碱性细胞和肥大细胞共有一些生化和功能特性，如，IgE高亲和力受体的表达，以及激活后释放组胺和其他介质的能力。尽管它们可发现于炎症组织，但成熟的嗜碱性细胞通常可见于循环系统。另一方面，肥大细胞只发现于组织中。

肥大细胞和嗜碱性细胞与特异性抗原的交联导致炎症介质和细胞因子（如与IgE生成、TH2分化和过敏性炎症相关的关键分子IL-4、IL-13及IL-5）的释放。

依托这一信息，本发明人决定采用KU812细胞，一种构建于嗜碱性白血病急病期患者的人嗜碱性细胞系。

KU812 的分化

KU812细胞是未成熟的嗜碱性细胞的前体细胞，其也可作为嗜碱性细胞分化的模型。KU812细胞的分化可诱导一些变化，包括组胺总含量增加、细胞造粒增加，以及IgE高亲和力受体的表达。

已显示不同的因子可将KU812细胞系分化为嗜碱性细胞样细胞[Nilsson G.等人, Immunology (1994) 81: 73-78; Fukuda T.等人, Blood (1987) 70: 612]。多种细胞因子可诱导其分化为嗜碱性细胞样细胞，包括TNF-α、IL-6、IL-3和IL-4。当用丁酸钠与来自人T细胞系Mo.3的条件培养基的组合培养KU812细胞时，观察到分化。此外，来源于特应性个体的培养的外周血单核细胞（PBMC）的条件培养基也可诱导KU812细胞的分化。存在于条件培养基上清液且负责该效应的因子仍未被鉴定。也已经表明，在无血清条件下，KU812细胞在不存在外源性因子时可经历分化。

本发明人用KU812人嗜碱性细胞作为模型细胞来寻找可抑制IL-13表达的草药。在他们试图校准可用于分析的合适的系统的过程中，本发明人发现，在无血清条件下2天后，可能由于细胞的分化，KU812细胞表达了更高水平的IL-13。因此本发明人决定，在添加刺激物和草药提取物前采用无血清条件。

细胞因子

防御素（hBD）由人皮肤角质形成细胞在受到损伤或发生炎症时产生，并且由肥大细胞、嗜碱性细胞和2型辅助细胞产生的细胞因子下调。公认AD病变与IL-4和IL-13的表达增加有关[Albanesi C.等人, J. Immunol. (2007) 179(2): 984 – 992]。细胞因子可抑制hBD-2和hBD-3 mRNA的表达[Albanesi C. 等人，同上]。因此，IL-4和IL-13可认为是防御素在这些病变中低表达的原因。为了进一步了解防御素的表达，本发明人测试了草药提取物对KU812人嗜碱性细胞中IL-4和IL-13表达水平的抑制作用。

由于IL-13的功能和IL-4的功能有相当大的重叠，因此抑制IL-13的组分通常也会抑制IL-4的表达。因此，本发明人决定用KU812细胞测试草药提取物对IL-4表达的抑制作用。用PMA和离子霉素刺激后，发明人测定出IL-4的极少量表达（数据未显示）。文献调查表明，一些由促发因子（priming factor）（如IL-3）采用的信号，更有利于IL-13而非IL-4的产生[Higa 等人, J Allergy Clin Immunol (2003) 111(6): 1299-1306]。因此，本发明人仅通过测定IL-13的表达继续本实验。

阳性对照

本发明人选用两种底物作为阳性对照：漆黄素和地塞米松。以前证实漆黄素可抑制A23187刺激的KU812细胞诱导IL-4、IL-13和IL-5mRNA表达[Higa 等人(2003), 同上]。在本结果中，漆黄素的抑制是显著的，但是其抑制百分比相对较低。因此，发明人加入地塞米松作为阳性对照，其表现出高的，并且显著的抑制百分比。以前已证实，地塞米松可能通过抑制T细胞和嗜碱性细胞产生IL-4和IL-13，从而减缓炎症并抑制免疫系统[Shimizu 等人, Clin Exp Allergy (1998) 28(4): 497-503]。

实施例 2

利用表皮细胞（角质形成细胞： HaCaT 细胞）筛查草药提取物对β - 防御素表达的刺激活性

物质及实验步骤

角质形成细胞细胞系（ HaCaT ）

利用角质形成细胞细胞系。用含10% FBS（GIBCO）和抗生素（GIBCO）的DMEM（GIBCO）将HaCaT细胞接种于75 T培养瓶。将细胞在5％CO₂和37℃下培养，当细胞融合（生长表面对培养板表面的百分比）达到约90%时更换培养基。为了筛查提取物，将提取物（0.3ml）加入培养的HaCaT细胞（约90至95％融合）的上清液并将细胞培养48小时。

人β - 防御素 3 表达的实时 PCR 分析

总 RNA 的分离

根据生产商的建议用TRIZO（Invitrogen Life Technologies公司）分离总RNA。RNA用乙醇沉淀，并重新悬浮于焦碳酸二乙酯水。将HaCaT细胞的RNA重新纯化一次以得到足够纯度的RNA。用分光光度计测定RNA浓度，并且只有在通过琼脂糖凝胶电泳确证RNA的完整性后，才将得到的总RNA转化为总cDNA。

实时 PCR 分析

根据生产商的说明书，用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）由200ng纯化的RNA合成cDNA。用AB Taqman MasterMix（Applied Biosystems, Part No. 4369016，USA）分析人β-防御素3表达和GAPDH表达。人β-防御素3和GAPDH的引物为登记造册的用于Taqman基因表达分析的引物。

在ABI实时PCR7500（Applied Biosystems）中进行扩增40个循环（95℃, 30 s），随后进行另外的循环（58℃, 30 s）。数据用实时PCR系统软件进行分析。调整GAPDH表达的实时PCR（GAPDH的归一化），计算各提取物的相对表达。在各实时PCR实验中确证由稀释100倍、10倍和1倍的cDNA得到的表达标准（参见图1）。用未处理的HaCaT细胞进行的对照试验显示，使用HaCaT细胞进行的该实时PCR非常灵敏和可靠（参见图2）。

提取工艺

根据质量检测（原料的分选和鉴定，重金属分析，农药残留检查和活性成分含量分析）选择草药。

切片的草药材用10倍体积的水匀浆混匀，并在80℃搅拌下提取2小时。用相同的步骤重复提取3次，并将三次提取物混合在一起。收集匀浆产物，通过400目的筛网过滤，浓缩（80℃，0.1MPa），然后以10000转/分钟离心20分钟。

通过大孔树脂纯化提取物，然后浓缩至所需体积。根据质量标准进行提取物的质量检测（自然属性，相对密度，pH值，重金属分析，微生物检测，活性成分含量测定）。

结果

基于以前的科学报告（其表明人β-防御素，特别是亚型2和3，在人皮肤中充当重要的抗微生物屏障），本发明对人β-防御素的刺激进行了检测。特应性皮炎患者皮肤中β-防御素的表达减少导致特应性皮炎相关微生物，如金黄色葡萄球菌的异常定植。虽然两种亚型的表达减少与特应性皮炎相关，但最近的一些科学报告显示，人β-防御素亚型3在特应性皮炎的病理中起着主要作用。人β-防御素亚型3显示了广谱抗微生物活性，并且其本身在生理浓度下具有抗金黄色葡萄球菌的很强的活性[Harder 等人, Nature (1997) 387: 861; Harder 等人, J Biol Chem (2001) 276: 5707-13]，然而hBD-2需要LL-37的存在来杀灭金黄色葡萄球菌[Xuejun Chenba 等人, J. Dermatol. Science (2005) 40(2), 123-132]。

实施例 3

利用 KU812 嗜碱性细胞筛查草药提取物对 IL-13 的抑制

物质及实验步骤

见上文的实施例1。

结果

MTS 结果

利用不同的草药提取物（参见下表1）建立测试物质的安全浓度范围以用于IL-13的抑制检测。进行MTS检测的结果呈现于图3A-D。这些数值表示相对于对照（未处理）的活力百分比。这些结果用于建立IL-13抑制检测中所用的测试物质的安全浓度范围。测试物质的鉴定如表1所示。

表 1: 测试物质的鉴定与分析

测试物质的鉴定	草药名称	pH 值	蒸发后残留物 (%)	总微生物计数
					1	光果甘草(Glycyrrhiza glabra (Licorice))	4.08	13.7	0
2	防风(Saposhnikovia divaricata)	3.29	24.4	0
					3	雷公藤根(Radix Tripterygii wilfordii)	3.51	4.4	0
4	黑升麻(Cimicifuga racemosa)	3.59	8	0
					5	青葙(Celosia argentea)	4.79	2.4	0
6	黄连根(Coptis Root)	3.27	13.3	0
					7	丹参根(Radix Salviae miltiorrhizae)	3.31	31.2	0
8	三白草叶(Saururus Chinensis (Leaves))	2.42	17.2	0
					9	金盏花(Calendula officinalis)	2.97	14.1	0
10	龙胆(Gentiana)	2.36	9	0
					11	水薄荷(Mentha aquatica L)	3.33	7.9	0
12	蒲公英根/药用蒲公英(Dandelion Root/ Taraxacum officinale)	3.31	12.1	0
					13	地肤子果实(Broom Cypress Fruit)	4.02	7.6	0
14	知母(Anemarrhena asphodeloides)	2.57	21.6	0
					15	银柴胡根(Stellaria dichotoma L. var. lanceolata. Root)	3.63	25.5	0
16	黄花贝母(Fritillaria verticillata)	3.68	6.1	0
					17	水飞蓟(Silybum marianum)	3.25	5.6	0
18	葛枣猕猴桃(Actinidia polygama)	4.02	16.7	0
					19	黄柏(Phellodendron)水提取物	5.06	16.34	0
20	无患子(Sapindus mukuross)i­水提取物	5.16	24.9	0
					21	苦参根(Radix Sophora flarescents)水提取物	4.15	22.35	0
22	地榆(Sanguisorba officinalis (DiYu))水提取物	4.02	21.28	0
					23	蛇床子(Fructus Cnidium)	3.86	10.76	0
24	山茶（Camelia japonica）	2.94	25.3	0
					25	黄芩(Scutellaria baicalensis)水提取物	3.54	23.24	0
26	掌叶大黄(Rheum palmatum)水提取物	4.68	21.23	0
					27	菊花(Chrysanthemum)水提取物	3.96	22.49	0
28	马齿苋(Portulaca)水提取物	4.87	26.75	0
					A	牡丹皮(Peony Bark)	2.78	17.9	0
B	当归(Angelica sinensis)	3.06	29.1	0
					C	膜荚黄芪根(Astragalus membranaceus Root)	3.06	22.2	0
D	吴茱萸果实(Evodia rutaecarpa fruit)	3.14	12.4	0
					E	虎杖(Polygonum cuspidatum)	2.94	12.8	0
F	阔叶麦冬(Liriope platyphylla)	2.9	23.6	0
					G	土茯苓根茎(Smilax glabra rhizoma)	2.71	6.9	0
H	姜黄(Curcuma longa)	4.17	5.9	0
					I	青黛(Indigo naturalis)	9.23	0.1
J	海南大风子种子(Semen Hydnocarpi hainanensi)	4.14	2.7	0

IL-13 抑制结果

根据MTS结果（如上呈现）确定测定的测试物质的浓度。进行的IL-13抑制检测的结果呈现于图4A-G并汇总于下面的表2，结果显示一些草药提取物显著减少IL-13释放的量，包括例如光果甘草、黑升麻和水飞蓟。浓度为10 μM的地塞米松用作阳性对照。

总结

本发明人用KU812细胞测试了不同草药提取物对IL-4表达的抑制作用。该研究的目的是确定这些测试物质是否能够抑制受PMA和离子霉素刺激的KU812细胞的IL-13释放。观察到一些草药提取物显著降低IL-13的释放量，包括例如，光果甘草, 黑升麻和水飞蓟。草药提取物对IL-13的抑制百分比呈现于下面的表2。

表 2: 草药提取物对 KU812 细胞中 IL-13 的抑制百分比

草药名称	No.	1 %	0.01 %	0.001 %
					光果甘草(Glycyrrhiza glabra)	1	97.67 %	43.22 %	-
雷公藤(Tripterygii wilfordii)	3	93.9 %	53.34 %	33.2 %
					黑升麻(Cimicifuga racemosa)	4	96.76 %	16.09 %	0.3 %
丹参(Salviae miltiorrhizae)	7	76.58 %	-	-
					水飞蓟(Silybum marianum)	17	98.65 %	10.8 %	1.2 %
地榆(Sanguisorba officinalis)	22	97.5 %	31.9 %	-
					山茶(Camelia japonica)	24	84.2 %	8.85 %	-
黄芩(Scutellaria baicalensis)	25	79 %	-	-
					掌叶大黄(Rheum palmatum)	26	62.26 %	-	-
牡丹(Peonia suffruticasa)	A	76.98 %	-	-
					当归*(Angelica sinensis)	B	18.74 %	-	-
虎杖(Polygonum cuspidatum)	E	18.74 % (浓度 0.5 %)	-	-
					漆黄素**		35.69 %	17.3 %	26.52 %
地塞米松	10 mM	52 %

* 略有减少（不显著）

** 漆黄素在100 μM, 10 μM和1 μM的浓度下。

实施例 4

筛查草药提取物对人β - 防御素 3 的刺激

物质及实验步骤

见上文的实施例2。

结果

本研究中测试了400种草药提取物。当考虑GAPDH归一化前后其直接作用时，其中只有6种草药提取物显示对人β-防御素3（hBD-3）的显著刺激作用。因此，虽然几乎所有测试的草药提取物均未显示对hBD-3表达的显著作用，但6种草药提取物在测定浓度为0.33%时显示出刺激作用，如图5-9所示。

第136和137号草药提取物分别显示573±48％和693±182％的刺激百分比，如图5所示。有趣的是，第136号是生长于中国的覆盆子（Rubi fructus），而第137号是生长于韩国的覆盆子（Rubi fructus）。显示对hBD-3的刺激作用的草药提取物为：灵香草（Lysimachiae foenumgraeci herba）, 臭椿根皮（Ailanthi radicis cortex）, 五倍子（Galla rhois），前胡根（Peucedani radix）, 和合欢皮（Albizziae cortex）（分别为第171号，194号，232号，246号和362号）。汇总的这6种草药提取物对hBD-3的刺激作用和统计值列于下面的表3和图10（对鉴定的6种草药提取物进行3次测试并计算统计平均值）。

表 3: 6 种草药提取物对 hBD-3 表达的刺激作用的汇总

No.	草药名称	第一次测试 (%)	第二次测试 (%)	第三次测试 (%)	平均值 ± 标准偏差	活力
							136(*)	覆盆子(Rubi fructus)	524	575	619	573 ± 48	下降
137(*)	覆盆子(Rubi fructus)	900	559	619	693 ± 182	-
							171	灵香草(Lysimachiae foenumgraeci herba)	831	702	1082	872 ± 193	-
194	臭椿根皮(Ailanthi radicis cortex)	868	1042	1420	1110 ± 282	下降
							232	五倍子(Galla rhois)	1744	1203	1502	1483 ± 271	下降
246	前胡根(Peucedani radix)	2912	1859	1903	2225 ± 596	下降
							362	合欢皮(Albizziae cortex)	853	933	792	859 ± 71	-

(*) 第136号和137号分别是生长于中国和韩国的相同植物。

实施例 5

鉴定的草药提取物的提取工艺优化

材料及实验步骤

草药提取物中活性成分的提取

为了测试通常用于提取的溶剂的影响，本发明人在热水中、50%EtOH中，或者50%MtOH中提取所示的草药源。

结果

比较不同提取溶剂对 hBD-3 刺激的影响

为了确定更加有效的从鉴定的草药提取物中提取活性成分的方法，本发明人比较了使用3种不同的提取溶剂（50%EtOH，50%MtOH，和100%的蒸馏水）的所选草药对hBD-3的刺激。通过将各溶剂的对照组的数值归一化来计算刺激效果。如图11所示，用热水提取的第136号、137号、171号、194号、232号、246号和362号草药提取物对人β-防御素3的刺激最高。其他溶剂（50%EtOH和50%MtOH）显示出相对较高的活性，但比水提取的活性低（65%-95%）。

实施例 6

利用 KU812 嗜碱性细胞筛查具有β - 防御素表达刺激活性的草药提取物作为 IL-13 抑制剂的活性

物质及实验步骤

见上文的实施例1。

结果

最初的体外研究后，本发明人发现10种可抑制IL-13表达的草药提取物（通过ELISA法测定）和6种可刺激β-防御素3表达的草药提取物（通过RT-PCR测定）。

接着，本发明人选用在两个类别中均显示最显著活性的草药提取物。排除可能显示毒性的草药提取物（如雷公藤）或人体应用不明了及没有INCI名称的草药提取物（如诃子（Terminariae Fructus）），尽管这些草药提取物显示出显著的活性。

为了选择最终的草药混合物，本发明人测试了显示IL-13抑制作用的草药提取物刺激β-防御素的能力，以及显示防御素刺激作用的草药提取物抑制IL-13释放的能力。发明人还在两种检测（ELISA和RT-PCR）中测定了草药提取物间的协同效应。选择了7种草药提取物（如下面的表4所述）。

表 4: 草药提取物

显示 IL-13 抑制作用的草药提取物	显示 β- 防御素刺激作用的草药提取物
		光果甘草根（Glycyrrhiza glabra (Licorice) Root）提取物	臭椿（Ailanthus altissima）提取物
黑升麻（Cimicifuga raceomosa (Black cohosh)）	五倍子（Galla rhois gallnut）提取物 (Galla chinensis)
		水飞蓟（Silybum marianum）	前胡（Peucedanum praeruptorum） (前胡根)
地榆（Sanguisorbae officinalis）(地榆根)

MTS 结果

测定在最初的体外研究（见上述实施例4和表4）中显示β-防御素刺激活性的草药提取物在MTS检测中的细胞活力，以评估测试物质用于IL-13抑制检测的安全浓度。进行的MTS检测的结果呈现于图12。数值表示相对于对照（未处理）的活力百分比。

IL-13 抑制结果

测定了在最初体外研究（见上述实施例4和表4）中显示β-防御素刺激活性的草药提取物抑制IL-13释放的能力。进行的IL-13抑制检测的结果呈现于图13，结果显示臭椿（Ailanthus altissima）和五倍子（Galla rhois gallnut）均显示IL-13抑制活性。受试的测试物质的浓度分别对应MTS结果（0.3%）。浓度为10μM的地塞米松用作阳性对照。

总结

本研究的目的是确定已发现的在角质形成细胞中刺激β-防御素表达的测试物质是否也能抑制受PMA和离子霉素刺激的KU812细胞的IL-13释放。草药提取物臭椿和五倍子显示了显著的IL-13抑制活性。

第一项研究中显示IL-13抑制的草药提取物中，光果甘草和地榆同样在该检测中显示出最显著的抑制作用。

实施例 7

筛查具有 IL-13 抑制作用的草药提取物作为人β - 防御素 3 刺激物的活性

物质及实验步骤

见上述实施例2。

结果

当考虑GAPDH归一化前后其直接作用（通过RT-PCR检测）时，在第一项研究（见上述实施例3）中显示显著IL-13抑制的4种草药提取物中，2种提取物同样显示对人β-防御素3（hBD-3）的刺激作用，即水飞蓟（Silybum marianum）和地榆（Sanguisorbae officinalis）。光果甘草（Glycyrrhiza glabra (Licorice)）和黑升麻（Cimicifuga raceomosa）提取物未显示任何显著作用。地榆提取物对β-防御素刺激显示出最显著的刺激作用（图14A-D）。这些数值汇总于如下的图14E和表5。

表 5: 草药提取物对 hBD3 的作用 (GAPDH 归一化处理后 )

测试样品	对照	No. 1	No. 2	No. 3	No. 4
						表达倍数	1	0.072685	0	5.867937	27.43561

测试物质鉴定如下：1. 光果甘草; 2. 黑升麻; 3. 水飞蓟; 4. 地榆。

总结

本研究的目的是确定在第一项研究（见上述实施例3）中发现的可抑制IL-13释放的测试物质是否同样能够刺激β-防御素3在角质形成细胞（HaCaT细胞）中的表达。第一项研究（见上述实施例3）中，4种草药提取物显示可显著减少IL-13的释放量。其中，水飞蓟也显示出对β-防御素3的刺激作用（5.87倍），并且地榆显示出对β-防御素3具有最为显著的刺激作用（27.4倍）。

实施例 8

草药提取物间的协同效应

物质及实验步骤

见上述实施例1和2。

结果

对于IL-13抑制活性通过ELISA、对于防御素-3刺激活性通过RT-PCR，测定草药提取物间的协同效应。

以下草药组合可观察到IL-13释放的减少：1 + 2 + 4 (1.光果甘草；2.黑升麻；4.地榆)和1 + 3 + 4 (1.光果甘草；3. 水飞蓟；4.地榆)——当所用测试物质的总浓度为0.3%时。然而，与各草药提取物单独的抑制相比，未证实有显著的协同效应（图15A）。当测试物质的浓度降低至0.01%时（单独或相互组合），未观察到IL-13释放的显著减少（数据未显示）。

草药提取物对β-防御素3刺激的协同效应显示于图15B和15C。地榆提取物显示出与臭椿（图15B）及五倍子（图15C）的协同效应。

总结

本研究的目的是确定测试物质对IL-13的抑制活性或对β-防御素3的刺激活性是否具有协同活性。测试草药混合物抑制KU812细胞中IL-13释放的能力。这些混合物可抑制IL-13的释放。当测定角质形成细胞HaCaT细胞中β-防御素3表达的刺激时，(1%)臭椿和 (0.33%)地榆显示出协同效应。添加0.33%的地榆提取物可将臭椿的活性提高2倍。（1%）五倍子和（0.33%）地榆也显示出协同效应。通过添加地榆，（1%）五倍子的刺激活性由175%升高至280%。

实施例 9

提取物优化

材料及实验步骤

活性成分的富集 / 树脂层析

如上述实施例2中所述。

抑制

如上述实施例1中所述。

β-防御素刺激

如上述实施例2中所述。

草药提取物的抗微生物活性

利用如前所述的纸片扩散抗微生物检测，筛查草药提取物对金黄色葡萄球菌和耐氨苄青霉素大肠杆菌的抗微生物活性。简言之，将0.2ml（2mg/ml）的25种选定的草药的水提取物载于纸盘上。通过添加浓度为0-50µg/ml的稀释氨苄青霉素确定大肠杆菌抗性。纸盘加载于琼脂平板，该平板具有含有金黄色葡萄球菌和耐氨苄青霉素的大肠杆菌的琼脂覆盖物。通过围绕纸盘出现的透明区域（杀灭区域）检测抗微生物活性。

结果

植物提取物中活性成分的富集

利用大孔树脂富集如本发明所教导的活性成分，其可有效吸收、富集并纯化草药提取物中的活性成分。该过程除去了有机盐和重金属，同时也除去了大量的淀粉，从而改进产品稳定性，延长产品的保质期，并导致更好的提取物活性。使用具有不同多孔结构参数（孔径、孔隙比和比表面积）和不同极性（非极性、弱极性、中极性和强极性）的树脂。

提取物富集——树脂层析

草药提取物的功效主要取决于活性成分的浓度。极度浓缩提取物的商业化生产是一个复杂的过程，其通常导致沉淀物和复杂的标准化。另一方面，树脂层析可导致杂质（蒸发后的残留物）浓度降低以及与治疗相关的活性成分的高含量，其产生高生物学功效及更好的标准化。

因此，本发明人开发了利用大孔树脂的提取方法，用于显示作为IL-13抑制剂和/或作为防御素刺激物的高效力的草药提取物。草药提取物，以及选择作为标记物的它们的活性成分呈现于下面的表6。最初发现可作为IL-13抑制剂的草药提取物已在如上所述的体外研究中用树脂层析优化，并呈现于图14A-E和图15A-C。

表 6: 草药提取物活性成分 ( 标记物 )

草药	标记物 ( 活性成分 )
		臭椿皮（Ailanthus altissima cortex）	臭椿酮, 苦楝, 川楝素
黑升麻（Cimicifuga raceomosa）	人参总皂苷
		五倍子（Galla rhois gallnut）	没食子酸, 鞣酸
光果甘草（Glycyrrhiza glabra）	甘草苷
		前胡（Peucedanum praeruptorum）	白花前胡甲素
地榆（Sanguisorbae officinalis）	鞣酸
		水飞蓟（Silybum marianum）	水飞蓟宾

优化显示作为防御素刺激物和/或作为IL-13抑制剂的高效力的草药提取物。选择各草药提取物的标记物和树脂类型。

提取物优化前后的 IL-13 抑制

最初发现可作为β-防御素刺激物的草药同样用树脂层析进行优化，检测它们抑制IL-13释放的能力，并与优化前提取物的活性相比。用树脂层析优化前后的草药提取物对IL-13的抑制能力的对比呈现于下面的图16和表7。因此，结果表明，树脂层析提高了草药提取物的生物活性（臭椿提取物提高了2倍, 五倍子提取物提高了1.13倍，前胡提取物提高了36倍）。

表 7: 层析优化前后草药提取物 IL-13 抑制活性的对比。根据图 16 标注了提取物的编号 / 字母分类

草药提取物	优化前的 IL-13 抑制百分比	优化后的 IL-13 抑制百分比
			臭椿(Ailanthus altissima)	31.8 % (A)	87 % (1)
五倍子(Galla rhois gallnut)	83 % (B)	93.6 % (2)
			前胡(Peucedanum praeruptorum)	0.8 % (C)	28.8 % (3)

草药提取物的抗微生物活性

进一步筛查了草药提取物对金黄色葡萄球菌和耐氨苄青霉素大肠杆菌的抗菌活性。本发明人利用纸片扩散抗微生物测定来测试25种选定的草药提取物。首先，通过添加浓度为0-50 mg/ml的稀释氨苄青霉素确定大肠杆菌抗性。如所预期的，耐氨苄青霉素大肠杆菌即使经50mg/ml的氨苄青霉素处理也表现出较强的生存。随后，测试金黄色葡萄球菌和耐氨苄青霉素大肠杆菌在草药提取物存在下的生长（见下面的表8和图17A-B）。如表8和图17A-B所示，五倍子和诃子提取物显示较强的抗金黄色葡萄球菌和耐氨苄青霉素大肠杆菌的抗微生物活性，而黄连根茎提取物仅抑制大肠杆菌。

表 8: 草药提取物抗微生物活性的对比

No.	草药名称	抗金黄色葡萄球菌	抗大肠杆菌（耐氨苄青霉素）
				阳性对照	50μg/ml 氨苄青霉素	++++++	+
阳性对照	5μg/ml 氨苄青霉素	++++	-
				阳性对照	0.5μg/ml 氨苄青霉素	++	-
阴性对照	蒸馏水	-	-
				No. 2	诃子(Terminariae Fructus)	++	++
No. 232	五倍子(Galla Rhois)	+	+
				No. 352	黄连根茎(Coptidis Rhizoma)	-	+++

最终的草药混合物

选择表现出作为IL-13抑制剂和/或作为防御素刺激物最显著活性的提取物用于开发最终的产品。

对β-防御素显示显著刺激的草药提取物为：臭椿, 五倍子和前胡。臭椿和五倍子均同样显示显著的IL-13抑制活性。

在最初检测中显示最显著IL-13抑制活性的草药提取物为：光果甘草, 黑升麻, 水飞蓟和地榆。地榆也显示显著的β-防御素3刺激活性，同时显示与臭椿和五倍子提取物的协同效应。

因此，本发明教导的最终草药混合物包括：臭椿，地榆，光果甘草和黑升麻。

分析验证（ CoA ）

对含有最终混合物的草药提取物进行了分析验证（CoA）。草药提取物的主要特性呈现于下面的表9。

所述CoA表示各草药提取物在利用大孔树脂层析优化后的活性成分（标记物）值、蒸发后残留物值和pH值。所有草药提取物的重金属值≤ 20 ppm。对各草药提取物进行微生物检测，菌落总数< 10²/g，霉菌和酵母菌< 10²/g，并且所有受试草药提取物中沙门氏菌和大肠杆菌类显示为阴性。

表 9: 混合物中最终草药提取物的 CoA

测试性质	臭椿	地榆	光果甘草	黑升麻
					特征
- 外观	粘性液体	粘性液体	粘性液体	粘性液体
					- 颜色	暗褐色	暗褐色	暗褐色	暗褐色
- 气味	特征性草药味	特征性草药味	特征性草药味	特征性草药味
					-25℃时的密度，g/ml	1.02	1.04	1.02	1.02
- pH值	6.1	5.4	6.1	5.7
					测试
- 重金属	≤ 20 ppm	< 20 ppm	< 20 ppm	< 20 ppm
					- 蒸发后残留物	14.2 %	26.1 %	18.2 %	19.3 %
HPLC测定	臭椿酮/苦楝素0.75 mg/ml/川楝素 0.01mg/ml	没食子酸0.04 mg/ml/鞣酸62.3 mg/ml	甘草苷4.1 mg/ml	人参总皂苷 51.6 mg/ml
					微生物测试
-菌落总数	< 102 / g	< 10 / g	< 10 / g	< 10 / g
					-酵母菌和霉菌	< 102 / g	< 10 / g	< 10 / g	< 10 / g
- 沙门氏菌	1克时为阴性	1克时为阴性	1克时为阴性	1克时为阴性
					- 大肠杆菌类	1克时为阴性	1克时为阴性	1克时为阴性	1克时为阴性

产品制剂

本发明人开发了含有选定草药提取物混合物的O/W制剂。除了草药提取物的功效，该制剂还开发以湿润特应性皮炎患者相关的干燥皮肤，因此，该制剂还含有润肤剂和保湿剂物质。

该产品指定具有大约5的pH值，该水平与正常皮肤相似。具有正常皮肤pH值的局部用产品维持角质层的完整性，以及脂质层的形成和成熟。pH值在特应性皮炎患者中具有重要作用，尤其是对皮肤屏障功能和金黄色葡萄球菌的定植而言。

实施例 10

临床试验

物质及实验步骤

SCORAD

如先前所述，通过SCORDA指数，一种用于评估湿疹的范围和严重度（特应性皮炎评分）的临床工具，来评价AD的程度[Oranje AP等人, Br J Dermatol. (2007) 157(4):645-8; Oranje AP, Curr Probl Dermatol. (2011) 41:149-55]。皮肤科医生通常在治疗前和治疗后用SCORAD来确定治疗是否有效。

SCORAD的参数为：

范围

为了确定范围，患有湿疹的部位通常在身体绘图上标示阴影。九分法用来计算患病面积（A）占整个身体的百分比，如下：头部和颈部占9%，上肢各占9%，下肢各占18%，躯干前部占18%，背部占18%，生殖器、每个手掌及每只手的手背各占1%。

各面积的得分相加。总面积计为A，其可能的最大值为100%。

强度

选择有代表性的湿疹区域。在该区域中，以下各症状的强度评估为无（0），轻度（1），中度（2）或重度（3），所述症状如下：发红，肿胀，渗出/结痂，抓痕，皮肤增厚（苔藓样硬化）和干燥（在没有炎症的区域实施该评估）。

将强度得分相加在一起得出'B'（最大值为18）。

主观症状

由患者或亲属利用视觉模拟评分分别对主观症状，即发痒和失眠进行评分，其中0表示不发痒（或无失眠），10表示可以想象的最严重的发痒（或失眠）。将这些评分相加得到'C'（最大值为20）。

总评分

个体的SCORAD为A/5 + 7B/2 + C。

临床试验的组成

参与临床试验的受试者（详情参见下文）接受载体或治疗乳液（treatment lotion）的治疗，其中所述载体为包含可减少瘙痒的草药提取物以及可滋润皮肤的保湿剂使得能够治疗轻度和中度AD症状的产品，所述治疗乳液除了载体乳液中所用的成分外还含有两种附加的草药提取物：地榆根提取物和臭椿提取物（在临床试验中使用的示例性治疗乳液配方见表10）。所述载体乳液还含有两种可抑制IL-13的提取物。

表 10 ：示例性身体治疗乳液配方

INCI 名称	INCI 第 9 版页码	CAS No.
			水	1795	7732-18-5
矿脂	12版. 1983	8009-03-8
			甘油	666	56-81-5
牛油果树（牛油树脂）	12版. 365	68920-03-6
			矿物油	12版. 1597	8012-95-1
辛酸/癸酸甘油三酯	252	65381-09-1
			鲸蜡硬脂醇&	12版. 476	8005-44-5
鲸蜡硬脂基葡糖苷	12版. 479	-
			十六烷醇&
乙酸十八酯&	12版. 2663	822-23-1
			乙酸油烯基酯&	12版. 1719	693-80-1
乙酰化羊毛脂醇	12版. 15	61788-49-6
			十六烷醇	12版. 492	36653-82-4
乙基己酸鲸蜡硬脂醇酯	12版. 478	-
			鲸蜡硬脂醇	12版. 476	8005-44-5
甘草酸二钾	545	68797-35-3
			神经酰胺3 &	12版. 461	100403-19-8
神经酰胺6 II &	12版. 462	100403-19-8
			神经酰胺1 &	12版. 460	100403-19-8
植物鞘氨醇&	12版. 2014	544-62-1
			胆固醇&	12版. 523	57-88-5
月桂酰乳酰乳酸钠&	12版. 2546	133557-75-0
			卡波姆&	12版. 429	9003-01-4
黄原胶	12版. 2975	11138-66-2
			硬脂酸甘油酯&	12版. 1080	123-94-4
聚乙二醇100硬脂酸酯	12版. 1944	9004-99-3
			掌叶大黄根提取物	2067	90106-27-7
蛇床子果实提取物	12版. 626	484-12-8
			黄芩根提取物	12版. 2444	94279-99-9
地榆根提取物		84787-71-3
			臭椿提取物		90131-67-2
脱氢乙酸&	12版. 749	520-45-6
			苄醇	12版. 271	100-51-6
蔗糖硬脂酸酯		25168-73-4
			聚二甲基硅氧烷	12版. 814	9006-65-9
十五内酯&	12版.1960	106-02-5
			柠檬酸三乙酯	12版. 2806	77-93-0
黄原胶	12版. 2975	11138-66-2
			山梨酸钾	12版. 2177	590-00-1
维生素E醋酸酯	12版. 2778	58-95-7
			乳酸	12版. 1378	50-21-5
透明质酸	12版. 1177	9004-61-9

受试者

入选标准：

参与本临床试验的入选标准如下：18岁以上的男性和女性；特应性皮炎的诊断必须满足Hanifin标准（至少3个基本特征和至少3个次要特征）；发明人认为特应性皮炎在过去的7天里一直稳定；在过去5天里没有突发新的皮炎；能够至少每天两次（早晚各一次）使用该研究产品达21天；受试者同意在研究期间不改变自己的生活方式（包括他们平时的身体卫生用品（肥皂），每天沐浴和淋浴的次数，用于洗涤衣服的洗衣用洗涤剂和织物柔软剂）；受试者同意在研究期间只使用测试产品，并且受试者愿意签署知情同意书。

排除标准：

本临床试验的排除标准如下：受试者患有可干扰临床评估的其他皮肤疾病/病症，包括感染的特应性皮炎病变；受试者对化妆品或受试配方的任何成分有既往的过敏史；受试者在第0天起的14天内接受过针对特应性皮炎的任何局部或全身的免疫调节剂（如吡美莫司和他克莫司）或类固醇；受试者在第0天起的28天内接受过光线疗法；在试验过程中过长的太阳照射时间；受试者在第0天起的14天内使用过任何实验性治疗；以及孕妇或哺乳期女性。

参与受试是自愿的。发明人向每名参与者提供一份知情同意书。

在研究过程中，受试者接受3次定期诊所访视：

1. 筛选评估/基准（第0天）

2. 随访—第7天，第14天

3. 完成访视—第21天

（由于患者的实际情况，允许±2天的灵活性）。

在第7天、14天及21天（±2天），受试者返回诊所进行评估。进行如下评估：范围、水肿、红斑、瘙痒、苔藓样硬化、渗出、失眠和干燥。基于这些检测，计算SCORAD，并且进行继发感染评估。

在第一次和最后一次访视中，进行TEWL和皮肤水化测试。

按照国际标准进行该研究，其符合“良好药品临床试验规范（good clinical practice）”（GCP）的相关规则。

对所有患者告知目的、方法、预期疗效、潜在危害和数据保密。也会告知受试者他们可随时拒绝参加受试。

患者评价

主要疗效判定指标：

SCORAD包括分级的AD症状：范围，水肿，渗出，表皮脱落，苔藓样硬化，红斑，瘙痒，干燥和失眠 [时间范围：第0天，第7天，第14天和第21天]。

次要疗效判定指标

1. TEWL和水化测试[时间范围：第0天和第21天]

2. 继发性感染的数量和分级

3. 不良事件的数量[时间范围：第0天，第7天，第14天和第21天]。

结果

基线人口统计学和 AD 特征

共50例受试者参与本研究（即两项研究同时进行，包括30例用治疗乳液治疗的受试者和20例用载体乳液治疗的受试者，见下表11中的总结）。30例受试者以治疗乳液治疗及20例受试者以载体乳液治疗达21天。两组的平均年龄接近。虽然两组之间存在性别差异（表11），但通过SCORAD测定的两组中的基线AD严重度是相似的（下表12）。此外，两组中具有严重症状(SCORAD>50)的AD患者的亚群比例也是相同的（载体组为25％，治疗组为26.7％）（见下表12）。

表 11 ：两组的人口统计学特征

特征	对照 ( 载体组 )	治疗 ( 治疗组 )
			数目	20	30
年龄, y (SD)	45 (13)	48 (15)
			女性, No. (%)	5 (25)	28 (93)
男性, No. (%)	15 (75)	2 (7)

表 12 ：基线 SCORAD 值

AD 严重度	对照 ( 载体组 )	治疗 ( 治疗组 )
			总 SCORAD
受试者数	20	30
			SCORAD (SD)	41 (12)	42 (12)
轻度至中度 SCORAD < 50
			受试者数(%)	15 (75 %)	22 (73.3 %)
SCORAD (SD)	33 (9)	37 (9)
			重度 SCORAD > 50
受试者数(%)	5 (25 %)	8 (26.7 %)
			SCORAD (SD)	53 (3)	57 (4)

SCORAD结果分析

与基线值相比，在第14天和21天的载体组和治疗组的SCORAD之间观察到显著差异（二者P＜0.001）（见图18），表明两种制剂可有效减少AD出现。

两组间的SCORAD未发现整体性差异。3周后，治疗组的平均得分比载体组稍低（P=0.087）。然而，如下所示，对各个参数的进一步分析揭示了显著的变化。

SCORAD主要组分的分析

分别检测在一段时间内使总SCORAD显著减小的载体组和治疗组中SCORAD的主要组分（范围，强度，主观症状）（分别见图19和20）。

图19中的图形展示了在研究过程中载体组中范围参数的稳定性。此组分不会影响SCORAD总分的变化。另一方面，与基线相比，在第14天和第21天的强度和主观参数的变化是高度显著的（分别为P <0.001和p<0.01）。

在治疗组中得到同样的结果（见图20）。范围参数对SCORAD总分值的变化没有贡献。与基线相比，在第14天和第21天，强度和主观参数显著降低（二者P <0.001）。

强度参数为6种AD症状的总和。强度参数的整体差异，尤其是，在第21天的两组间的差异是高度显著的（图21，p<0.01）。

相反，在两组间，在由受试者评估的瘙痒和失眠症状的得分总和构成的主观参数方面未观察到差异（图22）。

综合这些结果表明，与其基线相比，在第14天和第21天，各组中强度和主观参数的变化是高度显著的。在研究过程中，两组中的范围保持稳定，从而减少了SCORAD总分的显著下降。尽管未发现范围参数的显著变化，但如强度参数降低所显示的，在各测定区域中的病变严重程度显著降低。

21天后两组之间的比较揭示，经治疗身体乳液治疗后强度更显著降低（治疗组的52％对载体组的32％，图21）。主观参数的相对减少方面未观察到显著差异（治疗组的55％对载体组的42％，图22）。

强度各个组分分析

各个强度组分（红斑，水肿，渗出，表皮脱落，苔藓样硬化和干燥）更高分辨率的分析显示两组中相当比例的AD患者经历了症状的显著改善。该分析仅以从经历上述症状的受试者采集的数据为基础进行。如结果所示，在70％以上的患者中，轻-中度AD的两种常见症状，红斑和干燥，已得到改善（图23）。

渗出、表皮脱落、苔藓样硬化和干燥的得分差异与第21天的基线显著不同（见下表13，P <0.01）。在第14天，红斑的得分也显着改善（P<0.02）。

表 13 ：载体组中各个症状的得分（平均值 % ）变化

	红斑	水肿	渗出	表皮脱落	苔藓样硬化	干燥
							第 7 天	0%	0%	-3%	3%	3%	2%
第 14 天	18% P<0.02	27%	17%	25%	15%	13%
							第 21 天	34% P<0.001	27%	39% P<0.01	23% P<0.001	28% P<0.001	34% P<0.001

治疗身体乳液比载体身体乳液更有效，在21天后，显著减少了70％以上的患者的所有症状（图24）。

有趣的是，在93%的受试者中，与继发性感染相关的渗出症状改善了86%（见下图24和下表14）。除了仅在第21天显著不同的水肿之外（P <0.02），所有的症状的第14天（对基线）与第21天（对基线）之间的得分差异是非常显著的（P <0.001）。

表 14 ：治疗组中各个症状的得分（平均值 % ）变化

红斑

水肿

渗出

表皮脱落

苔藓样硬化

干燥

第 7 天

0%

2%

16%

0%

3%

1

第 14 天

27% P<0.001

23%

52% P<0.001

22% P<0.008

22% P<0.003

26% P<0.001

第 21 天

37% P<0.001

50% P<0.02

86% P<0.001

53% P<0.02

53% P<0.001

40% P<0.001

载体组和治疗组之间的比较揭示了治疗身体乳液在减轻AD症状严重度方面的效果极为优异。如本发明人评估的，明显更多数目的AD患者经历了AD症状的改善（图25）。

与载体组相应的情况相比，治疗组显示出对渗出相当高程度的改善（见下表15）。

表 15 ： 21 天治疗后载体组与治疗组之间症状强度变化的比较

	红斑	水肿	渗出	表皮脱落	苔藓样硬化	干燥
							载体组	34%	27%	39%	23%	28%	34%
治疗组	37%	50%	86%	53%	53%	40%
							P<	NS	0.02	0.001	0.003	0.03	NS

因此，经过21天治疗后，治疗身体乳液与载体组相比，在水肿（50％对27％），渗出（86％对39％），表皮脱落（53％对23％）和苔癣样硬化（53％与28％）的强度减轻方面显示出最显著的益处（见表15）。

主观个体组分分析

分析仅以从表示经历过这些症状的受试者处采集的数据为基础进行。

观察到载体身体乳液引起瘙痒显著减少（P <0.001），同时不影响患者的失眠（在基线非常低（平均值= 1.6））（见图26）。

在治疗组中，瘙痒和失眠均显著减少（见图27，P <0.001）。此外，与载体组相比，失眠的基线平均得分较高（平均值=2.6）。

比较时，未发现21天后两组之间发痒和失眠减少间的显著性（见图28）。尽管在治疗组失眠有较高的平均下降，但是小样本的大小对达到显著性差异有限制作用。

因为治疗组和载体治疗组均显示显著减少瘙痒而两组之间无任何显著变化，因此乳液减轻瘙痒的能力被视为主要是基于载体活性。

对重度 AD 的治疗效果

在首次访视（baseline visit）中，在具有重度（SCORAD>50）和非重度（轻度至中度，SCORAD<50）症状表现的AD受试者的亚群中分析SCORAD的变化。

当比较乳液在治疗轻度至中度（SCORAD<50）AD患者的有效性时，治疗身体乳液的疗效比载体高35％（46％对34％），同时治疗身体乳液在治疗通常伴有继发性感染的重度AD（SCORAD>50）时，疗效比所述载体高50％（42％对21％，见图29）。

综合来看，结果清楚地显示了治疗身体乳液对AD症状，尤其是对重度AD和继发性感染相关的症状具有优异的效果。

保湿水平

保湿水平是乳液提供机械屏障以及保持皮肤水分的能力的指标。其通过2种方法测试：

TEWL-通过皮肤蒸发的测试

皮肤水化-被保留在皮肤内的液体量。

该测试在首次访视和第21天进行。

结果表明，两组中皮肤水分测试在基线和第21天时有显著差异（见图30，p<0.001）。两种乳液在相同程度上改善了皮肤水分。

实施例 11

臭椿根人β - 防御素 3 刺激活性组分表征

在天然产物化学领域的研究中，经典的生物分析指导下的分离（Classical bioassay-guided fractionation）被普遍认为是一个繁琐而艰苦的过程。在过去十年中，随着分析技术包括HPLC耦合活性分析的改进，已开发了一些更为有效的追踪生物和药理活性天然产物的方法。这种使用HPLC的技术被认为是有效的小型化方法，其可直接适用于机制和以细胞为基础的分析。

材料及实验步骤

HaCaT 细胞培养：在37.0℃和5％CO₂下，在含有10％胎牛血清（FBS）和抗生素/抗真菌剂（青霉素G，链霉素，两性霉素B）的DEMD培养基中培养人角质形成细胞（HaCaT）。

臭椿根提取物的制备 ：将干燥臭椿根用沸水提取3小时，将热水提取物在-60℃下减压冻干。冻干提取物悬浮于水中，并用乙酸乙酯（EtOAc），丁醇（n-BuOH）依次分段。所有的提取物都在-20℃储存。

实时 PCR 分析

根据生产商的说明书，用TRIzol试剂（Invitrogen Life Technologies）从角质形成细胞中提取总RNA。使用SuperScript II 核糖核酸酶H逆转录酶（Invitrogen Life Technologies），用oligo(dT)12-18引物由3微克总RNA合成 cDNA第一链。此外，向反应混合物中加入2 U的核糖核酸酶H，然后将其在37℃培养20分钟，以除去与cDNA互补的RNA。用TaqMan通用PCR预混合液（TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems)进行实时定量PCR。根据生产商的说明书，通过实时PCR系统（型号7500; Applied Biosystems）分析人β-防御素3 mRNA的扩增和检测。人β-防御素3的引物/探针组获自于Applied Biosystems（Assays on-Demand，Hs0015557_m1）。PCR如下进行：初始步骤为50℃持续2 min以及95℃持续10 min，随后，95℃持续15秒以及60℃持续1分钟，共40个循环。为了标准化IL-18 mRNA的浓度，对每个样品的看家基因GAPDH的转录水平进行平行测定，并以GAPDH的转录水平为基础，对IL-18的相对转录水平进行归一化校正。对于GAPDH，发明人采用了预先开发的测定方法（Applied Biosystems）。所有的实时PCR重复实施三次。以相对于未处理对照增加的倍数记录基因表达的变化。

连续分级分离 （ serial fractionation ）：臭椿根的连续分级分离如图31中所述进行。

结果

在草药混合物中，由于其强大的人β-防御素3刺激活性，最初选择臭椿根提取物。因此，本发明人利用传统的分级分离技术和HPLC耦合活性分析以及实时PCR对负责刺激人角质形成细胞细胞系中人β-防御素3（DEF3）的活性组分进行了表征。为了确定活性组分的分子结构，应用了质谱和核磁共振光谱。

步骤 I ：由臭椿根热水提取物制备三种类型的溶剂型馏分

第一步，由臭椿根的热水提取物制备三种提取物，即：1.臭椿根水提取物；2.臭椿根丁醇提取物；和3.臭椿根乙酸乙酯提取物（图32A-E）。冻干所有部分，然后以10 mg/ml的浓度在水中（对臭椿根水提取物而言）和DMSO中（对臭椿根丁醇提取物和乙酸乙酯提取物而言）再溶解。处理之后，将10μl的各提取物以100µg /3ml培养基的终浓度添加至6孔瓶中的HaCaT细胞培养物中达48小时。通过实时PCR分析，与水或DMSO对照组比较人β-防御素3 mRNA的变化。

在下表16中说明所有测试组的GAPDH（作为内控）和DEF3的相对表达变化。当与GAPDH和DEF3之间的相对表达变化比较时，臭椿根的乙酸乙酯提取物和丁醇提取物显著增加表达。

表 16 ：臭椿根热水提取物的溶剂型部分的 DEF3 的相对表达

组	GAPDH 和 DEF3 之间的 ΔCt (DEF3 的 Ct–GAPDH 的 Ct)	与对照组相比的表达变化 ( 倍数 )
			蒸馏水对照	16.57	-
臭椿根水提取物	15.52	2(16.57 – 15.52)
			DMSO对照	17.31	-
臭椿根乙酸乙酯提取物	12.84	2(17.31–12.84)
			臭椿根丁醇提取物	12.8	2(17.31–12.23)

步骤 II ：基于 HPLC 的 25 种来自臭椿根丁醇提取物的馏分

将冻干产品（49克）依次用EtOAc，n-BuOH和H₂O分配。n-BuOH活性提取物（2.1克）于-20℃下保存。对于活性分析，对一部分（177 mg）臭椿根丁醇提取物使用半制备型HPLC以2分钟的规律间隔进行分离，根据以下条件：起始为90％水（含 0.1％HCOOH）/10％MeOH，然后在50分钟内梯度洗脱至40％水（含 0.1％HCOOH）/60％MeOH，流速4.0ml/min，254 nm处紫外检测。收集了共25个馏分（下图33和表17）。

分别收集25个馏分，冻干并以10mg/ml的浓度再溶解于DMSO中。处理之后，将10μl的各提取物以100µg /3ml培养基的终浓度添加至6孔瓶中的HaCaT细胞培养物中达48小时，并通过实时PCR分析，与水或DMSO对照组比较人β-防御素3 mRNA的变化。

表 17 ：基于 HPLC 的 25 种来自臭椿根丁醇提取物的馏分的编号和重量

No.	各馏分的净重
		1	0.4 mg
2	1.6 mg
		3	0.7 mg
4	0.5 mg
		5	0.8 mg
6	0.6 mg
		7	1.7 mg
8	1.9 mg
		9	0.6 mg
10	0.3 mg
		11	0.6 mg
12	0.8 mg
		13	0.8 mg
14	0.9 mg
		15	0.6 mg
16	1.2 mg
		17	0.2 mg
18	0.9 mg
		19	0.9 mg
20	0.6 mg
		21	1.6 mg
22	0.7 mg
		23	0.9 mg
24	0.7 mg
		25	0.3 mg

在图34中说明所有测试组中的GAPDH（作为内控）和DEF3的相对表达变化。当与GAPDH和DEF3之间的相对表达变化比较时，12号馏分显著增加人角质形成细胞细胞系HaCaT中DEF3的表达。

步骤 III ：通过 NMR 和质谱对 12 号馏分进行结构表征

DEF3- 刺激化合物的分离：为了从正丁醇提取物中分离活性化合物，在相同的HPLC条件下利用以上活性分析对该提取物的等分样（1.07g）进行重复分离以得到含有DEF3-刺激化合物的活性馏分。在梯度溶剂系统中进一步纯化该化合物，梯度为：70分钟内由80％水（含0.1％HCOOH）/20％MeOH至70％水（含0.1％HCOOH）/30％MeOH(t_R: 24.70 min, 2.2 mg)。

NMR结构分析：¹H，¹³C和2D-NMR实验使用任一Varian VNMRS 600 MHz NMR波谱仪记录。在连接Varian ProStar HPLC系统的Varian VNMRS 600 MHz NMR波谱仪(¹H: 600.006 MHz)上，使用150μL三重共振微流低温探头进行LC/1H NMR分析。以停流模式与连续流模式采集1D¹H NMR谱。对于停流模式¹H NMR，HPLC法的条件为：起始95％D₂O（含0.1％HCOOH）/5％ACN，随后经35分钟梯度洗脱至35％D₂O（含0.1％HCOOH）/65％ACN（运行总时间为45分钟），流速1.0 ml /min，280nm处UV检测。将样品（50μL）注入SunFire™C18（5 µm, 4.6×150 mm, Waters）反相柱。标准WET1D序列用于HOD，ACN和HCOOH中¹H频率的预饱和。在9 kHz的扫描宽度，33 K时域点，1.82秒采集时间的条件下采集数据。根据探头流通池中的各化合物的相对浓度使用扫描变量（128-512）。¹H NMR谱参照ACN共振（1.96 ppm）。连续流LC-NMR实验在相同的梯度条件下进行，除了流速为0.2ml/min以及总运行时间为180分钟。在色谱洗脱过程中，通过32个各自连续的扫描收集¹H NMR 谱。

¹H NMR谱在δ1.20和2.02显示H-18和H-19(各自3H, s)的两个甲基质子信号，还显示δ6.06的一个烯质子H-3 (1H, br s)和一个环外亚甲基质子H-21 (2H, s)信号。分别在δ4.26 (1H, s), 4.62 (1H, t, 2.4) 和 δ3.89 (1H, s)处观察到三个含氧次甲基质子信号H-1, H-7和H-12。此外，谱图中显示了δ2.91 (H-5), 2.95(H-9)和δ2.84 (H-14)的三个次甲基质子信号以及δ2.27, 2.14 (H-6α和H-6β), 2.65, 3.11 (H-15α 和H-15β)，和δ3.99, 3.49(H-20α 和 H-20β)的三个亚甲基质子信号。分别在δ170.6（H-16）和197.6（H-2）检测到γ-内酯和α，β-不饱和羰基信号。其HMBC谱显示，H-19的一个孤立甲基与C-1，C-5和C-10的3个羰基碳相关联，次甲基质子信号H-14显示与C-10，C-12，C-13，C-15和C-20的碳信号的远程关联。表18详细显示了DEF3-刺激化合物的¹H, ¹³C, COSY和HMBC NMR 数据。图35-38 显示了DEF3-刺激化合物的NMR谱图。基于NMR 结构分析，臭椿根提取物中的DEF3-刺激化合物被鉴定为臭椿酮(图39A-B)。

表 18: DEF3- 刺激化合物的 ¹ H 与 ¹³ C NMR 数据

位置	δC	δH	COSY	HMBC (H→C)
					1	82.8	4.26 (1H, s)	H-19	C-10, 19
2	197.6	-
					3	124.7	6.06 (1H, br s)	H-5, 18	C-1, 5, 18
4	163.5	-
					5	41.8	2.91 (1H, br d, 12.3)	H-3, 6α, 6β, 18
6α	25.3	2.27 (1H, br d, 15.0)	H-5, 7
					6β		2.14 (1H, ddd, 15.0, 12.3, 2.4)	H-5, 7	C-5
7	78.4	4.62 (1H, t, 2.4)	H-6β	C-5, 9
					8	47.0	-
9	43.8	2.95 (1H, s)		C-1, 8, 10, 20
					10	44.4	-
11	108.6	-
					12	79.4	3.89 (1H, s)	H-14	C-10, 11, 13, 14, 21
13	145.1	-
					14	46.5	2.84 (1H, dd, 13.8, 5.4)	H-12, 15α, 15β, 21	C-10, 12, 13, 15, 20
15α	33.9	2.65 (1H, dd, 5.4, 18.6)	H-14, 15β	C-14, 16
					15β		3.11 (1H, dd, 13.8, 18.6)	H-14, 15α	C-13, 14, 16
16	170.6	-
					17	-	-
18	21.2	2.02 (3H, s)	H-3, 5	C-3, 4, 5
					19	8.3	1.20 (3H, s)	H-1	C-1, 5, 10
20α	71.6	3.99 (1H, d, 8.1)	H-20β	C-7, 10, 14
					20β		3.49 (1H, d, 8.1)	H-20α	C-10, 11, 14
21	118.9	5.22 (2H, s)	H-14	C-12, 13, 14, 15

NMR数据在600 (¹H) MHz在MeOH-d₄中观测（δ: ppm, J:Hz）

¹³C NMR数据根据2D NMR实验（包括HSQC和HMBC）推导。

尽管已结合其具体实施方案对本发明进行了描述，显然许多替代方案、修改和变化对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，意图包括落入所附权利要求书的精神和广泛范围之内的所有这些替代方案、修改和变化。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此整体并入该说明书，如同表明各独立出版物，专利或专利申请被具体和独立地通过引用并入本文所达到的相同程度。此外，该申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认此参考文献可作为本发明的现有技术。所用的节标题不应该被解释为必须的限制。

Claims (80)

1.包含地榆植物提取物和至少一种附加的植物提取物的组合物，所述附加的植物提取物选自臭椿植物提取物，五倍子植物提取物，光果甘草植物提取物，掌叶大黄植物提取物和黄芩植物提取物。

2.治疗和/或预防需要其的受试者中的感染的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的包含地榆植物提取物和臭椿植物提取物的组合物，从而治疗和/或预防所述受试者的感染。

3.包含地榆植物提取物和臭椿植物提取物的组合物用于治疗和/或预防需要其的受试者中的特应性皮炎（AD）的用途。

4.包含植物提取物的组合物，其中所述植物选自五倍子，前胡和黑升麻。

5.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述地榆植物提取物，所述臭椿植物提取物和所述光果甘草植物提取物。

6.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述地榆植物提取物，所述臭椿植物提取物和所述五倍子植物提取物。

7.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述地榆植物提取物和所述臭椿植物提取物。

8.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述地榆植物提取物和所述五倍子植物提取物。

9.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述地榆植物提取物和所述光果甘草植物提取物。

10.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述地榆植物提取物和所述掌叶大黄植物提取物。

11.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述地榆植物提取物和所述黄芩植物提取物。

12.包含臭椿植物提取物和至少一种附加的植物提取物的组合物，所述附加的植物提取物选自五倍子植物提取物，光果甘草植物提取物，掌叶大黄植物提取物和黄芩植物提取物。

13.包含浓度至少约0.01％的臭椿酮和化妆用或药学上可接受的载体的组合物。

14.权利要求13的组合物，其中所述组合物进一步包含地榆植物提取物。

15.权利要求13或14的组合物，进一步包含选自五倍子植物提取物，光果甘草植物提取物，掌叶大黄根提取物, 蛇床子果实提取物和黄芩根提取物的植物提取物。

16.权利要求15的组合物，进一步包含甘草酸二钾。

17.权利要求1或4－16中任一项的组合物，配制用于局部，眼部，口服或肺部给药。

18.权利要求13的组合物，其中所述臭椿酮的所述浓度为约0.01－1％。

19.权利要求13的组合物，其中所述臭椿酮的所述浓度为约0.01－5％。

20.权利要求1的组合物，其中所述地榆植物提取物和所述至少一种附加的植物提取物配制在复合制剂中。

21.权利要求1的组合物，其中所述地榆植物提取物和所述至少一种附加的植物提取物配制在不同的制剂中。

22.权利要求1或12的组合物，其中各所述植物提取物在所述组合物中的浓度为0.01－10％。

23.权利要求1或12的组合物，其中各所述植物提取物在所述组合物中的浓度为0.5－2％。

24.权利要求1或12的组合物，其中各所述植物提取物在所述组合物中的浓度为1％。

25.权利要求4的组合物，其中所述植物提取物在所述组合物中的浓度为0.01－10％。

26.权利要求4的组合物，其中所述植物提取物在所述组合物中的浓度为0.5－2％。

27.权利要求4的组合物，其中所述植物提取物在所述组合物中的浓度为1％。

28.权利要求1，5，6，7或12中任一项的组合物，权利要求2的方法，或权利要求3的用途，其中所述臭椿植物提取物包含至少约0.01％的臭椿酮。

29.权利要求1，5，6，7或12中任一项的组合物，权利要求2的方法，或权利要求3的用途，其中所述臭椿植物提取物由臭椿根植物提取物组成。

30.权利要求29的组合物，方法或用途，其中所述臭椿植物提取物是极性提取物。

31.权利要求30的组合物，方法或用途，其中所述极性提取物使用选自丁醇和乙醇的极性溶剂提取。

32.权利要求29的组合物，方法或用途，其中所述臭椿根植物提取物应用高效液相色谱法（HPLC）进一步纯化。

33.权利要求1，4或12的组合物，其中所述植物提取物包括水性植物提取物。

34.权利要求33的组合物，其中所述水性植物提取物利用树脂层析法进一步纯化。

35.权利要求34的组合物，其中所述树脂层析法包括大孔树脂。

36.权利要求1或4－27中任一项的组合物，其中所述组合物不包含β-防御素。

37.权利要求1或4－27中任一项的组合物，其中所述组合物是药物组合物并且包含药学上可接受的载体或稀释剂。

38.权利要求1或4－27中任一项的组合物，其中所述组合物是化妆品组合物并且包含化妆用可接受的载体或稀释剂。

39.权利要求38的组合物，其中所述化妆用可接受的载体或稀释剂以选自霜剂，凝胶剂，喷雾剂，乳液，软膏，油剂，洗剂，洗发剂，肥皂和喷雾剂的形式配制。

40.治疗和/或预防需要其的受试者中的感染的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求1或4－27中任一项的组合物，从而治疗和/或预防所述受试者的感染。

41.权利要求1或4－27中任一项的组合物用于治疗和/或预防需要其的受试者中的感染的用途。

42.权利要求40的方法或权利要求41的用途，其中所述感染继发于慢性炎症。

43.权利要求40的方法或权利要求41的用途，其中所述感染与疾病相关联，所述疾病选自特应性疾病，接触性皮炎，钱币状皮炎，放射性皮炎，烧伤，非特应性湿疹，压疮，眼炎症性疾病，呼吸系统炎症性疾病，哮喘，胃肠道疾病和口腔感染性疾病。

44.权利要求2或40的方法，或权利要求3或41的用途，其中所述受试者是人。

45.权利要求2或40的方法，其中所述治疗有效量用于下调所述受试者细胞中Th2型细胞因子的分泌。

46.权利要求45的方法，其中所述Th2型细胞因子选自IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13。

47.权利要求2或40的方法，其中所述治疗有效量用于上调所述受试者细胞中人β-防御素的表达。

48.权利要求2或40的方法，其中所述治疗有效量包括抗微生物活性。

49.递送系统，其包括涂药器和包含在其中的权利要求1或4－27中任一项的组合物。

50.权利要求49的递送系统，其中所述涂药器的形式选自胶布绷带，非粘性绷带，擦布，纱布和衬垫。

51.单位剂型，其包含浓度约0.5－2％重量/重量的地榆植物提取物。

52.权利要求51的单位剂型，进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的臭椿植物提取物。

53.权利要求51的单位剂型，进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的光果甘草植物提取物。

54.权利要求51的单位剂型，进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的五倍子植物提取物。

55.权利要求51的单位剂型，进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的掌叶大黄植物提取物。

56.权利要求51的单位剂型，进一步包含浓度约0.5~2％重量/重量的黄芩植物提取物。

57.单位剂型，其包含浓度约0.5－2％重量/重量的臭椿植物提取物。

58.单位剂型，其包含浓度约0.5－2％重量/重量的光果甘草植物提取物。

59.单位剂型，其包含浓度约0.5－2％重量/重量的五倍子植物提取物。

60.单位剂型，其包含浓度约0.5~2％重量/重量的地榆植物提取物，浓度约0.5~2％重量/重量的臭椿植物提取物，及浓度约0.5~2％重量/重量的光果甘草植物提取物。

61.单位剂型，其包含浓度约0.5~2％重量/重量的地榆植物提取物，浓度约0.5~2％重量/重量的臭椿植物提取物，及浓度约0.5~2％重量/重量的五倍子植物提取物。

62.权利要求51－61中任一项的单位剂型，其中所述植物提取物的所述浓度为1％重量/重量.。

63.单位剂型，其选自局部、口服、肺部或眼部单位剂型，包含浓度至少约0.01％重量/重量的臭椿酮。

64.权利要求63的单位剂型，其中所述臭椿酮的所述浓度为约0.01~1％重量/重量。

65.权利要求51－64中任一项的单位剂型，其形式选自胶布绷带，非粘性绷带，擦布，纱布和衬垫。

66.权利要求1或4－27中任一项的组合物，权利要求49的递送系统或权利要求51－64中任一项的单位剂型，进一步包含选自细胞外基质组分，生长因子，激素，血管生成因子，凝血因子，细胞因子抑制剂，趋化因子抑制剂，酶，神经递质，维生素，碳水化合物，离子，铁螯合剂，脂肪酸，抗微生物剂，抗生素，类固醇和氨基酸的因子。

67.权利要求2或40中任一项的方法，其中所述给药长期进行。

68.权利要求2或40中任一项的方法，所述给药一天至少一次进行。

69.权利要求2或40中任一项的方法，所述给药进行达至少21天。

70.用于治疗和/或预防感染的组合物的制备方法，所述方法包括：

（a）在植物中加1－10倍体积的水以制备植物提取物；及

（b）使用大孔树脂减少所述植物提取物中的有机盐和/或重金属和/或淀粉的量，使得所述植物提取物中存在的活性成分的含量提高。

71.权利要求70的方法，其中所述植物选自臭椿，五倍子，前胡，光果甘草，黑升麻，水飞蓟，地榆，掌叶大黄和黄芩。

72.权利要求71的方法，其中所述臭椿由臭椿根组成。

73.权利要求70的方法，其中所述活性成分选自臭椿酮，苦楝素，川楝素，人参总皂苷，没食子酸，甘草苷，白花前胡甲素，鞣酸和水飞蓟宾。

74.权利要求71的方法，其中当所述植物包括臭椿时，所述活性成分包括臭椿酮。

75.识别具有炎性调节剂性能的试剂的方法，所述方法包括：

（a）使该试剂与细胞接触；及

（b）测定人β-防御素在该细胞中的分泌，其中所述接触后β-防御素分泌的上调表明所述试剂具有炎性调节剂性能。

76.权利要求75的方法，其中所述试剂包含植物提取物或其活性成分。

77.权利要求75的方法，其中所述细胞包括角质形成细胞。

78.化妆品载体，其包含掌叶大黄根提取物，蛇床子果实提取物，黄芩根提取物和甘草酸二钾。

79.化妆品组合物，其包含地榆植物提取物，臭椿植物提取物，掌叶大黄根提取物, 蛇床子果实提取物, 黄芩根提取物和甘草酸二钾。

80.权利要求79的化妆品组合物，进一步包含保湿剂和润肤剂。

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