ES2620389T3 - Formulaciones tópicas de co-enzima Q10 y tratamiento de dolor, fatiga y heridas - Google Patents

Abstract

Una composición tópica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de entre 0,001% y 60% (p/p) de CoQ10; liposomas y un vehículo farmacéuticamente aceptable para uso en un método de aceleración de la curación de una herida profunda de grosos parcial, en donde la composición se administra tópicamente una vez al día en la zona de la herida profunda de grosor parcial.

Description

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obtener la viscosidad deseada (habitualmente de aproximadamente 50 cps, 0,05 Pa·s, a aproximadamente 10.000 cps, 10 Pa·s) y/o la concentración de los demás componentes. El vehículo de administración tópica preferiblemente tiene una viscosidad de al menos aproximadamente 30 centipoises (0,03 Pa·s).

También se pueden usar otros potenciadores de penetración cutánea transdérmicos conocidos para facilitar la administración de CoQ10. Como ejemplo ilustrativo están los sulfóxidos tales como el dimetilsulfóxido (DMSO) y similares; las amidas cíclicas tales como 1-dodecilazacicloheptan-2-ona (AzoneTM, una marca registrada de Nelson Research, Inc.) y similares; las amidas tales como N,N-dimetil acetamida (DMA), N,N-dietil toluamida, N,N-dimetil formamida, N,N-dimetil octamida, N,N-dimetil decamida, y similares; derivados de pirrolidona tales como N-metil-2pirrolidona, 2-pirrolidona, ácido 2-pirrolidona-5-carboxílico, N-(2-hidroxietil)-2-pirrolidona o los ésteres de ácido graso de la misma, 1-lauril-4-metoxicarbonil-2-pirrolidona, N-seboalquilpirrolidonas, y similares; polioles tales como propilen glicol, etilen glicol, polietilen glicol, dipropilen glicol, glicerol, hexanotriol, y similares; ácidos grasos lineales y ramificados tales como oleico, linoleico, láurico, valérico, heptanoico, caproico, mirístico, isovalérico, neopentanoico, trimetil hexanoico, isoesteárico, y similares; alcoholes tales como etanol, propanol, butanol, octanol, de oleilo, de estearilo, de linoleilo, y similares; tensioactivos aniónicos tales como laurato sódico, lauril sulfato sódico, y similares; tensioactivos catiónicos tales como cloruro de benzalconio, cloruro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, y similares; tensioactivos no iónicos tales como polioxietilen éteres propoxilados, p.ej., Poloxamer 231, Poloxamer 182, Poloxamer 184, y similares, los ácidos grasos etoxilados, p.ej., Tween 20, Myrj 45, y similares, los derivados de sorbitan, p.ej., Tween 40, Tween 60, Tween 80, Span 60, y similares, los alcoholes etoxilados, p.ej., polioxietileno (4) lauril éter (Brij 30), polioxietileno (2) oleil éter (Brij 93), y similares, lecitina y derivados de lecitina, y similares; los terpenos tales como D-limoneno, α-pineno, β-careno, α-terpinol, carbol, carvona, mentona, óxido de limoneno, óxido de α-pineno, aceite de eucalipto, y similares.

También son adecuados como potenciadores de la penetración cutánea los ácidos y ésteres orgánicos tales como ácido salicílico, metil salicilato, ácido cítrico, ácido succínico, y similares.

Cantidades efectivas

Las composiciones descritas antes se administran preferiblemente a un sujeto en una cantidad efectiva. Una cantidad efectiva es aquella cantidad que es capaz de producir un resultado deseable en un animal o célula tratados. Como es bien conocido en la práctica médica y veterinaria, la dosis para un animal cualquiera depende de muchos factores, que incluyen el tamaño particular del animal, el área de superficie corporal, la edad, la composición particular a administrar, el momento y la ruta de administración, la salud general, y otros fármacos que estén siendo administrados concurrentemente. Es de esperar que una dosis apropiada para la administración tópica de las composiciones de la invención esté en el rango de aproximadamente 0,1 – 2,50 mg de CoQ10/kg de peso corporal (p.ej., 10 – 500 mg para sujetos que pesen entre 50 kg y 136 kg (110 a 300lbs)). Una cantidad efectiva para uso con una célula en cultivo también variará, pero puede determinarse fácilmente de forma empírica (por ejemplo, añadiendo concentraciones variables a la célula y seleccionando la concentración que mejor alcanza el resultado deseado). Es de esperar que una concentración apropiada esté en el rango de aproximadamente 1 – 250 µM.

Afecciones/trastornos

En una realización descrita, las composiciones de la invención, es decir, que comprende Coenzima Q10 como ingrediente activo, se usan para tratar fatiga muscular y musculo esquelética, para acelerar la curación de heridas, para proporcionar una mejor curación de herida, para tratar dolores tales como el dolor articular, la fatiga general, y similares. Sin pretender establecer ninguna teoría, se cree que las composiciones aumentan el nivel de ATP en una célula.

El ATP es una molécula de nucleótido que tiene tres moléculas de fosfato unidas a un grupo 5-hidroxilo en una ribosa de adenosina, que tiene el nombre formal de adenosina 5’-trifosfato. El ATP es un compuesto presente ampliamente en cualquier tejido u organismo vivo, incluyendo los músculos de animales o las células de levadura.

El ATP tiene dos enlaces de fosfato de alta energía por molécula, dando lugar por ello a una energía libre de aproximadamente 7,3 kcal/mol cuando se hidroliza cerca de pH neutro y convirtiéndose en adenosina difosfato. De esta manera, la energía producida en la hidrólisis de ATP permite la síntesis de ácido nucleico, así como diversos metabolismos que incluyen el metabolismo de proteínas, el metabolismo de carbohidratos y/o el metabolismo de lípidos. Un compuesto que tiene un enlace de éster de fosfato proporcionado por ATP entrará en un “estado activado” para contribuir a varias reacciones de síntesis.

El ATP es la molécula de producción de energía esencial para cada célula del cuerpo. También se encuentran compuestos ricos en fosfato similares en cada organismo con compuestos relacionados con ATP que suministran toda la energía celular. En 1982, Chaudry y la “Yale Medical School” publicaron resultados que mostraban que el ATP estaba presente en fluidos intracelulares e intersticiales, sugiriendo de este modo que la enorme importancia biológica del ATP.

El ATP y su producto de degradación adenosina también están implicados inherentemente en una serie de procesos extracelulares como el de la contracción muscular, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, algunos de estos procesos extracelulares incluyen la neurotransmisión, la función cardíaca, la función plaquetaria, la

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vasodilatación y el metabolismo hepático de glucógeno. Como puede apreciarse, estas funciones biológicas adicionales han dado lugar a diversas aplicaciones clínicas del ATP y la adenosina. Por ejemplo, las aplicaciones clínicas pueden incluir aplicaciones de ATP y adenosina como anestésico neuropático e isquémico, un agente hipotensivo para trauma o hipertensión inducida por trauma, tal como la hipertensión pulmonar, una hipoglucemia moderada en la diabetes de tipo II y al menos evidencias preliminares de que el ATP puede ser útil como terapia de ayuda en el tratamiento de cáncer con radiación.

El ATP y compuesto relacionados han sido investigados de manera intensiva para posibles usos de fármacos (véase Daly, J. Med. Chem., 25: 197, (1982)). Las más extendidas de estas aplicaciones son en diversos tratamientos cardíacos que incluyen la prevención de lesión por reperfusión tras isquemia cardiaca o apoplejía, y el tratamiento de la hipertensión (véase Jacobson, et al., J. Med. Chem., 35, 407-422 (1992)), así como el tratamiento de taquicardia supra ventricular paroxismal (véase Pantely, et al., Circulation, 82, 1854 (1990)).

Específicamente con respecto al resultado en humanos, la división de ATP para formar adenosina difosfato (ADP) tiene una importancia crítica en el funcionamiento de los músculos, ya que es la reacción que suministra directamente energía a la miosina y la actina para facilitar la contracción muscular normal. En muchos casos, este requisito se cumple mediante la reconstitución real del ATP según se usa, más que almacenando una cantidad grande de ATP en el músculo. Sin embargo, en condiciones excepcionalmente demandantes tales como una actuación atlética intensa o determinados estados de deficiencia por una nutrición inadecuada o por efecto de diversas enfermedades, la disponibilidad de ATP podría ser una etapa limitante en el resultado de actuación muscular óptimo.

La importancia de las composiciones de la presente invención se puede observar a través de las amplias aplicaciones de dichas composiciones:

Curación de heridas: Según el método de la invención, la(s) composición(es) descrita(s) en la presente memoria se aplica a tejido con heridas en cantidad suficiente para aumentar la velocidad de curación del tejido. Estos compuestos pueden acelerar de forma significativa la velocidad de curación a niveles nanomoleculares in vivo. Para cualquier agente activo dado, la concentración óptima para una formulación dada puede determinarse fácilmente de forma empírica usando una experimentación rutinaria. En general, una cantidad de agente activo adecuada para su uso según la presente invención oscila entre aproximadamente 0,001 µg y aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal.

Las composiciones de la invención pueden comprender un hidrogel. Como apreciarán los especialistas en la técnica, los hidrogeles son entramados macromoleculares que absorben agua y se hinchan de esta forma, pero sin disolverse en agua. Es decir, los hidrogeles contienen grupos funcionales hidrofílicos que proporcionan la absorción de agua, pero los hidrogeles comprenden polímeros reticulados que dan lugar a insolubilidad acuosa. Generalmente, entonces, los hidrogeles comprenden polímeros hidrofílicos reticulados tales como poliuretano, un alcohol de polivinilo, un ácido poliacrílico, un polioxietileno, una polivinilpirrolidona, un poli(hidroxietil metacrilato) (poli(HEMA)),

o un copolímero o una mezcla de los mismos.

Si la composición se va a aplicar como un líquido, se puede emplear cualquier tipo de medio de aplicación que permita el influjo de los agentes activos en el tejido a lo largo de un periodo de tiempo. Por ejemplo, se podría aplicar una disolución acuosa al tejido de la herida a través de una venda o tira, o se podría formular una disolución de tal modo que se pudiera obtener una perfusión programada (usando, p.ej., liposomas, pomadas, micelas, etc.). Los métodos de producción de dichas formulaciones con los compuestos de la presente invención son evidentes para los especialistas en la técnica. Si las composiciones deben administrarse en forma líquida, preferiblemente se emplea una disolución matricial o micelar con el agente activo presente en un rango de concentraciones de entre 1 ng/mL y 5.000 µg/mL, entre 10 y 500 µg/mL o entre 30 y 500 µg/mL. Un rango de concentración preferido que es conveniente será de al menos 30 µg/mL. Una disolución matricial particular es un polímero semi-sólido de polietilen glicol de la marca comercial HYDRON de Hydro Med Sciences, New Brunswick, N.J. Otra disolución preferida es una disolución micelar vendida con el nombre comercial de PLURONICS F108 de BASF, Ludwigshafen, Alemania. En condiciones de temperatura ambiente, esta disolución es líquida, pero cuando se aplica a un tejido cálido la disolución forma un gel que permite la infusión de agente activo en el tejido de la herida a lo largo de un periodo de varios días. Otras formulaciones preferidas incluyen preparaciones de carboximetil celulosa, preparaciones cristaloides (p.ej., salino, disolución de lactato de Ringer, salino tamponado con fosfato, etc.), viscoelásticos, polietilen glicoles, polipropilen glicoles y coberturas para heridas (p.ej., vendajes, etc.).

Los efectos de curación de los compuestos de la presente invención pueden proporcionarse en una variedad de ejemplos. La loción, crema, pomada, etc. puede aplicarse tópicamente a la superficie del tejido herido en el tratamiento de úlceras, lesiones, heridas, úlceras diabéticas, quemaduras, traumas, úlceras de estasis, afecciones periodontales, laceraciones y otras afecciones. Adicionalmente, se puede tratar un tejido intraperitoneal herido como el resultante de una cirugía invasiva con una composición según la presente invención para acelerar la curación. Por ejemplo, después de la eliminación quirúrgica de una sección de colon o de otro tejido, el plano quirúrgico se puede recubrir con una disolución de agente activo antes de cerrar la zona quirúrgica a fin de acelerar la perfusión capilar interna y la curación. Además, la velocidad de curación localizada puede aumentarse mediante una administración subdérmica de agente activo por inyección o de otro modo.

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incluyen tensión, respuesta a articulación inflamada o subluxada, cambios artríticos, postura incorrecta o hábitos del trabajo, trauma, enfermedad sistémica y patología adyacente.

Las composiciones de la presente invención pueden usarse para tratar el dolor producido por lesiones de tipo deportivo. Dichas lesiones deportivas incluyen, aunque sin limitación, hematomas, moratones, esguinces (p.ej., esguince de tobillo), espasmos musculares (p.ej., músculos estirados), desgarros parciales de tendón, tendinitis, bursitis, miositis, artritis traumática y post-inserción de dislocación de articulación. Para tratar el dolor asociado a lesiones deportivas, las presentes composiciones se aplicarían en el área de dolor como se ha descrito en la presente memoria. Las presentes composiciones pueden usarse en combinación con técnicas de terapia de lesiones deportivas tales como la fisioterapia, la acupuntura, el entrenamiento con peso, las técnicas de bio-retroalimentación, entre otras.

Las presentes composiciones también pueden usarse en el tratamiento de dolores propios de ciudadanos de edad avanzada. Gran parte del dolor óseo, articular o muscular que experimentan los mayores es resultado de una combinación de fuentes. Algunas de dichas fuentes son conocidas, otras no. En determinados casos, dicho dolor es una consecuencia natural de las enfermedades producidas por el proceso de envejecimiento, que incluyen dolor acompañado de una disminución de la función motora, atrofia, cambios de dieta, entre otros. Por consiguiente, el tratamiento del dolor en mayores es difícil. A menudo, los mayores requieren tomar múltiples medicaciones al día a fin de controlar de forma efectiva su dolor. Esto genera desventajas significativas a los mayores, tales como efectos secundarios de las medicaciones, reacciones adversas al mezclar las medicaciones, así como un coste excesivo y un esfuerzo excesivo para mantener el régimen de medicación requerido a diario.

Por tanto, el uso de las presentes composiciones para tratar dolor óseo, articular o muscular en mayores puede ser efectivo para minimizar la cantidad de medicación de tratamiento del dolor que ya toman, o que tendrían que tomar en el futuro. Asimismo, el dolor en mayores contribuye a depresión, inactividad e inmovilidad en este grupo de edad. La disminución del dolor resultante del uso de las presentes composiciones daría como resultado una mayor independencia, un aumento de la actividad, socialización, apetito y sentido general de bienestar en un paciente de edad avanzada.

Adicionalmente, las composiciones de la presente invención pueden utilizarse como adjunto a la fisioterapia. Generalmente, la fisioterapia implica tratamientos o metodologías pasivas y activas para fortalecer y/o curar músculos, tendones, huesos y articulaciones. Las desventajas de la fisioterapia incluyen el dolor y la incomodidad para el paciente. Las formulaciones de la presente invención pueden usarse para tratar dicho dolor. Por ejemplo, la presente formulación se puede aplicar al área del dolor (tal como se describe en la presente memoria) antes, durante y/o después del tratamiento de fisioterapia.

Las presentes composiciones también pueden usarse para tratar el dolor asociado a tejido inmovilizado. El tratamiento de músculos, huesos, tendones y articulaciones dañados a menudo requiere que los tejidos sean inmovilizados durante periodo de tiempo largo. En estas circunstancias, el tejido se mantiene inmovilizado mediante una variedad de dispositivos que incluyen, aunque sin limitación, rodilleras/coderas, cabestrillos, escayolas, vendas y tablillas. A menudo, cuando se retira el dispositivo y después, el paciente experimenta dolor muscular, óseo, de tendón y/o articular en el área inmovilizada o alrededor de ella. La presente formulación se puede usar para tratar dicho dolor aplicando la formulación al área de dolor del modo descrito en la presente memoria.

La TENS o estimulación electro-nerviosa transcutánea se caracteriza por una corriente sensorial de alto voltaje y se usa para bloquear el dolor. Las presentes composiciones pueden usarse en combinación con la estimulación neuromuscular eléctrica para aumentar la eficacia del tratamiento del dolor. Por ejemplo, antes o después del tratamiento con estimulación neuromuscular eléctrica, la presente composición puede aplicarse al área afectada en el modo descrito en la presente memoria.

La presente composición también puede usarse en combinación con inyecciones locales o de otro tipo de un anestésico, tal como lidocaína (con y sin esteroides). Por ejemplo, se puede inyectar una aguja que contenga lidocaína (con o sin esteroides) en la piel que recubre el área del dolor. Dicho área de la piel puede anestesiarse adicionalmente aplicando la presente composición en el sitio de inyección, o alrededor de él, antes o después de la inyección.

Adicionalmente, la presente composición se puede usar en combinación con analgésicos o anti-inflamatorios orales (p.ej., NSAIDS e inhibidores de Cox-2) para aliviar el dolor. Cuando se usa de este modo, por ejemplo, la composición de la presente memoria puede proporcionar un efecto de alivio del dolor potenciado y/o aditivo.

La presente composición también puede usarse en combinación con dispositivos de tratamiento con calor que incluyen, aunque sin limitación, sistemas calientes tales como mantas calefactoras o toallas calientes. Dichos dispositivos también pueden incluir diatermia que es un tratamiento con calor de tejidos profundos, en donde la temperatura de los tejidos lesionados es elevada mediante corrientes de alta frecuencia, ondas de ultrasonidos o radiación microondas. La diatermia se usa para reducir el dolor, aliviar espasmos musculares, reducir contracturas de tejido blando, resolver inflamación y promover la curación. Las presentes composiciones se pueden usar en combinación con sistemas calientes o diatermia para proporcionar un efecto de alivio potenciado y/o aditivo.

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Además, la presente composición puede usarse en combinación con agentes de tipo morfina, tales como codeína, opiáceos, oxi-contina, Percocet, Demorol y Vicadina. Cuando se usa de este modo, por ejemplo, los agentes de tipo morfina, junto con cualquiera de las formulaciones de la presente invención, pueden lograr un efecto analgésico que de otro modo requeriría una mayor dosis de opioides pero con menores efectos secundarios.

Adicionalmente, la presente composición puede usarse en combinación con técnicas de bio-retroalimentación. La bio-retroalimentación es una técnica útil para lograr una reducción del estrés, reducir la ansiedad y aliviar síntomas psicosomáticos mediante la monitorización y el control de determinados procesos fisiológicos. El uso de técnicas de bio-retroalimentación en combinación con las composiciones de la presente memoria puede permitir que el paciente alcance una mayor reducción del dolor que a través del uso de dichas técnicas.

Las presentes composiciones también pueden usarse en combinación con terapia de acupuntura. La terapia de acupuntura generalmente implica insertar agujas muy pequeñas en determinados puntos específicos de la superficie del cuerpo. La acupuntura ha demostrado su eficacia en la reducción del dolor. La acupuntura también puede ser útil para el tratamiento de la osteoartritis, el dolor lumbar, el síndrome de túnel carpiano, la fibromialgia y otras afecciones que producen dolor crónico. Las composiciones de la presente memoria pueden proporcionar un efecto de alivio potenciado y/o aditivo cuando se usan en combinación con la acupuntura.

El dolor asociado al cáncer es una de las formas de dolor más severas. Dicho dolor puede exacerbarse aún más por los tratamientos del cáncer, que incluyen la terapia de radiación y la quimioterapia. Las presentes composiciones pueden usarse para tratar el dolor asociado al cáncer en músculos, huesos y articulaciones. Las presentes composiciones también pueden usarse en combinación con tratamientos disponibles actualmente para dicho dolor para proporcionar un efecto de alivio potenciado y/o aditivo.

La utilización de las presentes composiciones para reducir el dolor en pacientes con cáncer produciría, por ejemplo, un mejor humor y motivación en el paciente, así como un alivio del dolor del propio cáncer y del dolor generado por los tratamientos de terapia continuada contra el cáncer del paciente. Asimismo, cuando es tratado de este modo, el paciente puede experimentar una movilidad mejorada, aumentando así las posibilidades del paciente de llevar a cabo con éxito las actividades diarias y mejorando el bienestar general del paciente. Mediante el uso de las composiciones de la presente memoria, el paciente también puede experimentar una mayor flexibilidad a la hora de ir y venir a las sesiones de tratamiento del cáncer.

Kits

(realización descrita)

En una realización preferida, la invención proporciona kits que comprenden composiciones de CoQ10 para el tratamiento de heridas, dolor, fatiga y similares. Las preparaciones transdérmicas, orales e intravenosas de 2,3dimetoxi-5-metil-6-decaprenil-1,4-benzoquinona (coenzima Q-10) comprenden, entre otros, agentes auxiliares, una cantidad efectiva de tensioactivo pulmonar y/o en combinación con liposomas.

En una realización preferida, las composiciones de CoQ10 pueden comprender además CoQ10, liposomas y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición comprende entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 60% (p/p) de Coenzima Q10.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, no a modo de limitación. Aunque se han proporcionado ejemplos específicos, la descripción anterior es ilustrativa y no restrictiva. Una cualquiera, o más de una, de las características de las realizaciones descritas previamente se pueden combinar de cualquier manera con una o más características de otras realizaciones cualesquiera de la presente invención. Además, para los especialistas en la técnica serán evidentes muchas variaciones de la invención tras revisar la especificación.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 (realización descrita)

: un estudio in vitro para evaluar su efecto sobre la proliferación de células de músculo liso y sobre la producción de ATP del ingrediente activo Q10

La composición es una formulación tópica que contiene liposomas de fosfolípido que encapsulan el productor de energía intracelular, la Coenzima Q10 (Q10). Los datos muestran una correlación directa entre la Q10 usada en nuestra formulación tópica y la producción de energía.

Hemos investigado el efecto de la Q10 sobre la producción de ATP en células de músculo liso aórticas humanas (HASMC). Esta línea celular fue elegida para el estudio en base a su capacidad para producir ATP en niveles detectables por el ensayo de ATP de Luciferina-Luciferasa. También estudiamos el efecto de la composición que comprende entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 60% (p/p) de Coenzima Q10 sobre la proliferación de células musculares. Los datos muestran que la Q10 suministra ATP a las células musculares en proliferación.

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Las células musculares lisas aórticas humanas (HASMC) fueron obtenidas en la “American Type Culture Collection” (ATCC, Richmond, VA) a P16 en un crio-vial. Medio 231, tripsina-EDTA, inhibidor de tripsina definido, DTI, disolución PSA (penicilina, estreptomicina y anfotericina B) y SMGS fueron todos obtenidos en Cascade BiologicsTM (Portland, OR). D-(+)-glucosa, coenzima Q10, hidroxitolueno butilado (BHT), fosfato sódico, glicerol, y ácido tricloroacético (TCA) fueron obtenidos en Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO). Phospholipon 90 (95% de fosfolípidos) fue obtenido en American Lechitin Company (Oxford, CT). Triglicérido de cadena media (MCT) fue obtenido en Johnson & Johnson (Evansville, IN). El kit de ensayo de ATP fue obtenido en Calbiochem® (San Diego, CA) y la placa de cultivo de 6 pocillos y de 75 cm2 fueron obtenidas en Corning® (Atlanta, GA).

Cultivo de HASMC: el vial se congeló en nitrógeno líquido tras ser recibido y hasta el inicio de un cultivo. El contenido del vial se mezcló con Medio 231 y SMGS tras descongelar en un baño de agua. Los cultivos (P16-P20) se mantuvieron en matraces de cultivo de 75 cm2. Los cultivos se incubaron a 37ºC usando carbonato y Medio 231 tamponado con HEPES (pH 7,4) en condiciones húmedas con un 5% de CO2. El medio se suplementó con SMGS que contenía un 5% de suero, otros suplementos de crecimiento y una disolución PSA 500X.

Preparación de células: aproximadamente a una confluencia del 80%, las células fueron subcultivadas usando tripsina-EDTA para despegar las células e inhibidor de tripsina definido, DTI, para neutralizar la suspensión celular antes de ser centrifugadas a 2500 RPM durante 8 minutos. El sobrenadante fue aspirado y desechado. La partícula celular resultante se suspendió entonces en Medio 231 fresco. Se realizó un recuento de células usando un hemocitómetro antes de sembrar las placas experimentales de 6 pocillos a 200.000 células/pocillo.

Preparación de reactivos: se disolvió Q10 en etanol y la disolución se diluyó con Medio 231 a las concentraciones requeridas. El vehículo usado en la preparación de la composición que comprende entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 60% (p/p) de Coenzima Q10 estaba compuesto por MCT, BHT, glicerol y fosfato sódico tamponado a pH 7,2, y se sometió a ultrasonidos, después se diluyó con Medio 231 hasta las concentraciones experimentales.

Procedimiento experimental: se usó D-(+)-glucosa a 10 mM (Peiro et al., Brit. Jour. of Pharmacology 133: 967-974 (2001)) como sustrato de energía para la producción de ATP. Los pocillos de la placa de 6 pocillos se incubaron con 0-20 µg/mL de CoQ10, 1 µg y 20 µg/mL de CoQ10, o 1 µg y 20 µg/mL del vehículo de Coenzima Q10, todos en Medio 231. Las placas de pocillos fueron incubadas a 37ºC y un 5% de CO2 durante periodos experimentales especificados. El Medio 231 contiene originalmente Glu 4,6 mM, por lo que solo se añaden 5,4 mM al medio (Dr. Gary D. Shipley, Cascade Biologics, Portland, OR).

Recuento celular: las placas de pocillos fueron decantadas para vaciar los pocillos de los reactivos y los residuos fueron aspirados cuidadosamente con un pipeteador electrónico. Se añadieron 0,5 mL de Tripsina-EDTA a cada pocillo durante 5-7 minutos para ayudar en la separación. Tras completar la separación, determinada mediante microscopio, se añadieron 0,5 mL de Medio 231 a la suspensión celular resultante para neutralizar la tripsina. Se tomaron 0,5 mL de dicha suspensión celular para realizar la lectura en un contador celular Coulter.

Ensayo de ATP: tras la incubación, el medio se eliminó y se reemplazó con ácido tricloroacético (TCA) frío (4ºC) al 1% p/v como tampón de lisis. Este tampón produce la inhibición casi instantánea de las ATPasas (Kangas et al., Med Biol 62: 338-343 (1984)). Los pocillos fueron incubados con TCA a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación suave. A continuación se rascaron los pocillos para desalojar las células unidas y para formular una suspensión de lisato celular. Los lisatos de cada pocillo fueron pipeteados arriba y abajo varias veces para formar una suspensión uniforme. Se tomaron muestras de todos los pocillo y se realizó un ensayo de ATP de acuerdo a las instrucciones del fabricante en un luminómetro Berthold® (Bundoora, Australia).

Análisis de datos: los resultados fueron analizados para determinar la significancia estadística mediante ANOVA usando el software SigmaStatTM. Se realizaron comparaciones posthoc usando el test de Dunnett con un valor de alfa de 0,05.

Resultados: Se incubaron células HASM a 37ºC y un 5% de CO2 con 0-20 µg/mL de Coenzima Q10. Las placas de 6 pocillos se incubaron durante 24h en Medio 231. Tras tratamiento con tampón de lisis celular de TCA frío y un rascado suave, las células fueron mezcladas pipeteando. A continuación se tomaron muestras para cuantificación de ATP usando el ensayo de ATP de Luciferina-Luciferasa. (Figura 1; *Significativo comparado con el control, P<0,05, ANOVA de un sentido y test de Dunnett).

En la Figura 2, las células HASM fueron incubadas a 37ºC y con un 5% de CO2 con 0-20 µg/mL de Coenzima Q10, la composición que comprende entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 60% (p/p) de Coenzima Q10, y el vehículo (V) usado en la composición que comprende aproximadamente entre 0,001% y aproximadamente 60% (p/p) de Coenzima Q10. Las placas de 6 pocillos fueron incubadas durante 24 h en Medio 231. Tras el tratamiento con tripsina-EDTA y un rascado suave, las células fueron neutralizadas con Medio 231 y mezcladas mediante pipeteo. A continuación las muestras fueron llevadas a cuantificación con un contador celular Coulter. (*Significativo comparado con el control, P>0,05; ANOVA de un sentido y test de Dunnett).

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Tabla 1

Tratamiento (µg/mL)

Número de células (104) % de diferencia vs. control (24h)

CONTROL

25,7 N/A

1,0

Vehículo 38,5 49,8%

20,0

Vehículo 40,0 55,6%

1,0

Q-10 42,4 65,1%

20,0

Q-10 63,1 145,6%

1,0

Q-Soothe 57,6 124,20%

20,0

Q-Soothe 94,6 268,0%

Figura 3: se incubaron células HASM a 37ºC y 5% de CO2 con 0-20 µg/mL de la composición que comprende entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente 60% (p/p) de Coenzima Q10. Las placas de 6 pocillos fueron incubadas durante 24-60 h en Medio 231. Tras tratamiento con Tripsina-EDTA y un rascado suave, las células fueron neutralizadas con Medio 231 y se mezclaron mediante pipeteo. A continuación las muestras fueron llevadas a cuantificación con un contador celular Coulter. (*Significativo comparado con el control, P>0,05; ANOVA de un sentido y test de Dunnett).

Estos resultados indican que la Coenzima Q10 tiene un efecto estimulante en la producción de ATP en HASMC. Los datos indican una correlación entre una concentración incrementada de Q10 y niveles más altos de producción de ATP celular en dichas células. Evaluamos adicionalmente el efecto de Q10 en la proliferación de HASMC. Tal como se presente en la Figura 2, la incubación con las composiciones dio lugar a niveles más altos de proliferación en comparación con el vehículo o el control.

Considerados conjuntamente, los datos sugieren que la administración de Q10 a células musculares lisas aórticas humanas aumenta la producción de ATP e implica que el vehículo de fosfolípidos es efectivo para administrar Q10 exógena a las células. Teniendo en cuenta lo anterior, una formulación tópica de Q10 sería capaz de facilitar la administración de Q10 a la vasculatura dérmica subyacente y de activar la producción de ATP. Además, la Q10 es un potente antioxidante y también actuaría como captador de radicales libres, y reduciría el estrés oxidativo relacionado con músculos fatigados y articulaciones doloridas.

Ejemplo 2: Examinar el efecto de la composición en la curación de heridas profundas de grosor parcial

El objetivo de este estudio fue examinar el efecto de la composición de CoQ10 en la curación de heridas profundas de grosor parcial en un modelo porcino.

Animales experimentales: se usó un modelo porcino para nuestra investigación experimental debido a las similitudes morfológicas entre la piel de cerdo y la piel humana. Se mantuvieron alojadas dos cerdas jóvenes libres de patógenos específicos (SPF: Ken-O-Kaw Farms, Windsor, IL) con un peso de 25-30 kg durante dos semanas antes de iniciar el experimento. Estos animales fueron alimentados con una dieta basal ad libitum y fueron alojados individualmente en nuestras instalaciones de animales (cumpliendo los requisitos de la “American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care” [AAALAC]) con una temperatura controlada (19-21ºC) y una iluminación controlada (12h/12h Luz-Oscuridad).

Los protocolos de animales experimentales usados para este estudio fueron aprobados por la “University of Miami Institutional Animal Care and Use Committe” y todos los procedimientos siguieron las guías federales para el cuidado y el uso de animales de laboratorio (Departamento de Sanidad y Servicios Humanos de los EE.UU., Departamento de Agricultura de EE.UU.). Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con el Departamento de Dermatología de la Universidad de Miami y según los procedimientos de operación estándar de cirugía cutánea (Cutaneous Surgery Standard Operating Procedure, SOPs). Los animales fueron monitorizados diariamente para determinar cualquier signo observable de dolor o incomodidad. A fin de ayudar a minimizar las posibles incomodidades, se administró un analgésico buprenorfina, 0,03 mg/kg (inyectable Buprenex; Reckitt Benckiser Hull, Inglaterra) a cada animal el primer día, y cada tres días después de eso, en condiciones de anestesia; durante todo el experimento se usó un sistema transdérmico de fentanilo: 25 µg/h (Duragesic; Alza Corp. Mountain View, CA).

Técnica de herida: se pinzó el costado y la parte trasera de los animales experimentales con pinzas de animales estándares en el día del experimento. La piel de ambos costados de cada animal se preparó para la herida lavando con un jabón no antibiótico (barra de jabón Neutrogena; Johnson and Johnson, Los Angeles, CA) y agua estéril. Cada animal fue anestesiado intramuscularmente con tiletamina HCl más zolazepam (1,4 mg/kg) (Telazol; Laderle Parenterals Inc., Carolina, Puerto Rico), xilazina (2,0 mg/kg) (X-jet; Phoenix Scientific Inc., St. Joseph, MO), y atropina (0,04 mg/kg) (Atrojet SA; Phoenix Scientific Inc, St. Joseph, MO) seguido de inhalación con mascarilla de un isoflurano (Isothesia; Abbott Laboratories, Chicago, IL) y combinación con oxígeno.

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grupo tratado con respecto al control. Estos datos sugieren que la Q10 puede ayudar a la curación de heridas y sirven de punto de partida para posteriores investigaciones.

Métodos: se cultivaron fibroblastos neonatales humanos (nFIB) y queratinocitos neonatales humanos (SC-KC) hasta ~90% de confluencia en matraces T-75, momento en el cual fueron tripsinizados y sembrados en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos. Las placas fueron incubadas a 37ºC en condiciones humidificadas y con un 5% de CO2. Tras alcanzar un 90% de nivel de confluencia, se realizó un hueco con forma de cruz en cada pocillo para imitar una herida incisa usando una punta de pipeta P-200. Se cambió el medio para los tratamientos indicados inmediatamente después de la inducción de la cruz, lo cual significó el tiempo 0. Los cultivos celulares fueron examinados y se capturaron imágenes usando un microscopio invertido Zeiss Axiovert 200 con una cámara digital a diversos intervalos de tiempo. Se cuantificó la migración celular con el tiempo y el porcentaje de hueco de “herida” cubierto por las células que habían migrado al área del hueco. El porcentaje de hueco llenado (PGf) se calculó como PGf = (1-At/A0) x100, en donde A(t) es el área de hueco a tiempo t, y A0 es el área de hueco a tiempo 0. Se llevó a cabo un análisis estadístico usando el test de t de student.

Las Figuras 7-10 muestran los resultados obtenidos. La Figura 7 muestra el efecto de Q10 sobre la migración de fibroblastos; la Figura 8 muestra el efecto de Q10 sobre la migración de queratinocitos; la Figura 9 muestra el efecto de Q10 sobre la proliferación de fibroblastos; la Figura 10 muestra el efecto sobre la proliferación de queratinocitos. Estos datos sugieren el uso de la Coenzima Q10 en la curación de heridas, y que la coenzima Q10 potencia la migración y la proliferación de queratinocitos y fibroblastos normales.

La Figura 11 muestra el efecto de la coenzima Q10 sobre la producción de ATP en células musculares lisas aórticas humanas. Las células musculares lisas aórticas humanas (HASMC) fueron incubadas a 37ºC y con un 5% de CO2 con 0-20 µg/mL de Coenzima Q10. Se incubaron placas de 6 pocillos durante 24 h en Medio 231. Tras tratamiento con tampón de lisis celular TCA frío, se llevó a cabo un ensayo de ATP usando el método de Luciferina-Luciferasa. * Significativo comparado con el control, P<0,05 (ANOVA de un sentido y método de Dunnett).

En resumen, los efectos potenciales de la CoQ10 en la curación de heridas incluyen la proliferación y migración celular; un aumento de la demanda de ATP; cambios en el equilibrio prooxidante-antioxidante; cambios en la estabilidad de la membrana celular y de orgánulos; y apoptosis.

Ejemplo 4 (referencia): Composición de CoQ10 – Ensayo clínico

Este ensayo clínico es un estudio IRB doblemente ciego aprobado del departamento Atlético de la Universidad de Miami. La composición de CoQ10 se administra a sujetos con dolor articular o fatiga muscular. Se analizó cada sujeto para determinar mejoras en dolor, fatiga, dolencia y bienestar general. La Figura 12 es un gráfico que muestra una determinación general de los datos obtenidos a partir del estudio clínico del alivio del dolor después del tratamiento con CoQ o con placebo.

Efecto de las composiciones de CoQ10 sobre el alivio de dolor: este ensayo clínico es un estudio IRB doblemente ciego aprobado del departamento Atlético de la Universidad de Miami. La composición de CoQ10 se administra a sujetos con dolor articular o fatiga muscular. Se analizó cada sujeto para determinar mejoras en dolor, fatiga, dolencia y bienestar general. La Figura 13 muestra los datos preliminares del estudio clínico de alivio de dolor después del tratamiento con la composición de CoQ10 o con placebo.

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