PT789584E

PT789584E - Aplicacao de superoxido-dismutase (sod) em liposomas

Info

Publication number: PT789584E
Application number: PT95938419T
Authority: PT
Inventors: Hermann Katinger; Morola Vorauer-Uhl; Eckhard Furnschlief
Original assignee: Polymun Scient Immunbio Forsch
Priority date: 1994-11-04
Filing date: 1995-11-06
Publication date: 2002-03-28
Also published as: EP0789584A1; CA2204493A1; AU690377B2; MX9703184A; US6312720B1; NZ296098A; DE59509624D1; EP0789584B1; ATE205723T1; AU3981695A; WO1996014083A1; ES2163530T3; BR9509590A; CA2204493C; US5942245A

Description

DESCRIÇÃO "APLICAÇÃO DE SUPERÓXIDO-DISMUTASE (SOD) EM LIPOSOMAS" [0001] A presente invenção refere-se à utilização de superóxido-dismutase (SOD) , de preferência SOD humana recombinante, em liposomas, para a preparação de uma composição farmacêutica, conforme o caso numa mistura com ácido hialurónico e/ou pelo menos um suporte fisiologicamente aceitável e/ου, conforme o caso, outros aditivos, para aplicação terapêutica e/ou profilática contra altas concentrações de radicais superóxido e/ou danos causados por estes.

[0002] Os radicais superóxido são formas transientes extraordinariamente reactivas da molécula de oxigénio natural e podem, devido a esta propriedade, causar danos irreversiveis em compostos orgânicos nas células do corpo humano. Como protecção contra este perigoso efeito dos radicais superóxido as células dispõem de um enzima que é capaz de transformar rapidamente estes radicais superóxido em peróxido. de hidrogénio (H202) , rapidamente metabolizável e menos tóxico. (0 2 [C^r + 2H+ S°D > H202 + 02 [0003] Em seguida ocorre normalmente a decomposição do mesmo assim ainda tóxico peróxido de hidrogénio, através do enzima catalase, nos componentes inofensivos água e oxigénio. 01) 2 H202 --atala— > 2 H20 + 02 0 enzima superóxido-dismutase (SOD) encontra-se tanto no corpo humano e animal como ainda em plantas e provavelmente em todos 1 -^=-7 os microorganismos que entram em contacto directo com o oxigénio (bactérias aeróbias e fungos). Nas células dos organismos superiores (eucariotes) existem principalmente dois tipos desta SOD: uma SOD contendo manganês, que está localizada nas mitocôndrias e é muito semelhante à SOD bacteriana, e uma segunda que se encontra livre no citosol e contém átomos de cobre e zinco.

[0004] No que se seque, salvo indicação em contrário, deve entender-se pela designação SOD principalmente a Cu,Zn-S0D, excluindo a de eritrócitos de sangue de vaca, bem como a Mn-SOD bacteriana ou mitocondrial e/ou a Fe-SOD, e ainda a Cu,Zn-S0D recombinante humana (rhSOD).

[0005] A superóxido-dismutase é já conhecida sob o nome de orgoteina desde 1939, mas a actividade de dismutase só foi descoberta e descrita em 1969 por McCord e Fridovich. A sua utilização prática foi muito limitada no passado, em especial devido ao curto tempo de vida ou à baixa disponibilidade biológica da proteína sob condições naturais, o que se reflecte naturalmente de forma negativa na frequência dos intervalos de dosagem, nas doses terapêuticas a escolher e nos custos que daí advêm.

[0006] A SOD mais investigada e utilizada foi até agora a Cu,Zn-SOD de eritrócitos de sangue de vaca. Após se terem verificado na aplicação terapêutica clínica de SOD de sangue de vaca, principalmente contra doenças ar rítmicas, efeitos secundários-graves e por vezes mortais, foram proibidos por exemplo na Áustria preparados com SOD de sangue de vaca. Uma saída para esta situação consiste principalmente na preparação de SOD recombinante humana, como se descreve por exemplo na AT 397.812 (Polymum Scientific, 1994).

[0007] Para controlar melhor o curto tempo de vida ou a baixa disponibilidade biológica da SOD, recorre-se entre outras 2 \ \ “7 possibilidades à incorporação de moléculas de SOD em liposomas (Senga et al. 1990, Transplant. Proc. 22:2025).

[0008] Os primeiros ensaios de aplicação diziam respeito ao tratamento de inflamações e estados inflamatórios da pele. Entretanto, foi descrita na literatura também a utilização em osteoartrite e artrite reumática (Hartmannn et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:7142; Bannister et al. 1987, Criticai Rev. Biochem., 22:111). Descreve-se também - em especial no âmbito da medicina - que a SOD é capaz de melhorar a capacidade de armazenamento de órgãos destinados a ser posteriormente transplantados (Olson et al. 1988, Transplant. Proc. 20:961), tendo também já sido mencionada uma aplicação na conservação de alimentos (WO 85/01503).

[0009] O objectivo primário da presente invenção é pôr à disposição preparações farmacêuticas, que consigam levar a SOD, de preferência a rhSOD integrada em liposomas protectores, às zonas do corpo a tratar, de um modo fácil, eficaz e com uma melhor biodisponibilidade. Em especial, conseguiu-se de acordo com a invenção, apesar do preconceito geral ainda existente por parte dos especialistas, aplicar com sucesso SOD integrada em liposomas, em queimaduras e escaldadelas, bem corno em lesões causadas por radiações, provocadas por exemplo por radiação UV ou radiação ionizante, em particular através de aplicação externa. No caso da exposição à radiação é possível para além da aplicação terapêutica também urna utilização profilática, por exemplo em conjunto com um agente protector filtrante ou absorvente da radiação.

[0010] Um segundo objectivo é pôr à disposição uma composição farmacêutica à base de SOD em liposomas, que supere os inconvenientes referidos do estado da técnica, abrindo assim áreas de aplicação adicionais, em especial no campo da cosmética. 3 \ [0011] É tamtaérn um objectivo da presente invenção conseguir levar a SOD, de preferência a rhSOD incorporada em liposomas protectores, de uma maneira fácil, eficaz e com uma melhor capacidade de conservação bem como com um efeito de duração mais prolongada, aos materiais orgânicos a tratar, por exemplo tecidos vegetais ou animais, órgãos, transplantes de órgãos ou tecidos, preparados cosméticos de base orgânica e/ou alimentos.

[0012] Um objectivo especial da presente invenção é o aproveitamento do efeito sinergistico de uma mistura de ácido hialurónico e SOD. O ácido hialurónico é desde há pouco conhecido na área da especialidade também pelas suas propriedades como "captor de radicais" e a sua utilização no tratamento de feridas tem sido repetidamente descrita (Arngen, ¥0 9214480, 1992). Também a utilização de ácido hialurónico juntamente com "Colony Stimulating Factor" (CSF) ou "Platelet Derived Growth Factor" (PDGF) para acelerar a cicatrização de feridas foi descrita na literatura (Zymogenetics, US 5128321, 1992) , tal como o emprego de ácido hialurónico como aditivo em cosméticos e preparados tarmacêuticos (Shiseido, ¥0 9104270, 1991).

Em contrapartida, não está até agora descrita surpreendentemente - uma combinação de ácido hialurónico e SOD, em especial uma mistura de ácido hialurónico e SOD incorporada em liposomas. Até que ponto isto é ou foi um preconceito dos especialistas, não pode ser actualmente confirmado com precisão. Em todo o caso, verificou-se surpreendentemente, no decorrer das experiências que levaram inclusivamente à presente invenção, que o ácido hialurónico apoia e reforça de maneira quase ideal o efeito da SOD, mesmo da SOD incorporada em liposomas.

[0013] As queimaduras e as escaldadelas e/ou uma dose de radiação ionizante ou UV prejudicial à saúde induzem, entre outros efeitos, uma reacção do tipo em cascata, que é responsável por exemplo pela "pós-queimadura" (= aumento das 4

lesões necróticas) de 2o e principalmente de 3o grau. O problema do tratamento imediato usual das feridas por queimadura e de lesões por irradiação, consiste na prática em que não existe qualquer meio de aplicação local para além da terapia imediata com água fria, que se possa utilizar como terapêutico imediato para evitar os fenómenos de pós-queimadura. Não é conhecido nem se espera actualmente qualquer efeito vantajoso curativo, neste sentido, das pomadas ou geles para queimaduras contendo gorduras ou isentos de gorduras. É por isso mais do que surpreendente que a 30D em liposomas não tenha sido aplicada até agora para o tratamento imediato externo local de feridas - excepto na forma de injecções directamente na ferida - quer em medicina veterinária quer em medicina humana, tanto mais que a SOD em liposomas já é conhecida há mais de 5 anos (JO3101626, 1989).

[0014] Encontra-se aliás também descrito na literatura que a utilização de SOD para auxiliar a cicatrização de feridas ou a sobrevivência de ratinhos Balb/C com queimaduras ou infecções induzidas artificialmente, não teve qualquer sucesso de cura significativo (Fang et al., The Journal of Trauma, Vol. 30, N° 4: 453-456, 1990).

[0015] Apesar destas desvantagens do estado da técnica e do possível preconceito dos especialistas em relação a ingredientes activos incorporados em liposomas para aplicação tópica, em especial externa, no corpo ou à superfície do corpo, é grato aos inventores terem conseguido inesperadamente, de acordo com a invenção, aplicar SOD em liposomas com sucesso contra lesões térmicas ou induzidas por radiações na pele ou nos tecidos.

[0016] As seguintes considerações desempenharam um papel importante: através do próprio trauma, mesmo no caso de queimaduras solares intensas, cai maioritariamente ou mesmo totalmente a barreira da camada de epiderme, isto é antes do desenvolvimento de uma formação de edema havia a possibilidade 5 juou&It da libertação óptima do ingrediente activo no sentido da derme esclerótica e subcutânea sob o corium, em especial no caso de uma aplicação precoce de SOB, de preferência rhSOD, em liposomas.

[0017] O sucesso extraordinário no tratamento tópico externo das referidas lesões de tecidos é possivelmente também de atribuir ao facto de devido à lesão dos tecidos se formarem macrofagos reforçados, os quais no exercício da sua função protectora imunológica (defesa contra a infecção, remoção de fragmentos celulares) entram em contacto com os liposomas, dissolvendo a sua camada lipídica e libertando assim o respectivo conteúdo -as moléculas de SOD - podendo estas desenvolver de novo a sua actividade de degradação do superóxido protegendo assim também os tecidos.

[0018] No decorrer das experiências que levaram finalmente à presente invenção, pôde ainda verificar-se surpreendentemente que, graças à inclusão de moléculas de SOD em liposomas, se prolongou não só a respectiva conservação e biodisponibilidade, como também se pôde reduzir por um factcr até cerca de 10 a concentração de SOD necessária para obter o efeito -pretendido -em relação a composições de SOD sem liposomas - sem ter de levar em conta perdas de eficácia. Além disso, por meio da forma de administração liposomal, consegue-se também uma dosagem do ingrediente activo f isiologicamente rnais conveniente no local onde é necessária, o que tem naturalmente uma influência muito vantajosa sobre a quantidade e/ou a frequência da dosagem os custos dai decorrentes. Este efeito vantajoso da dosagem fisiologicamente mais conveniente da SOD incorporada em liposomas no local, verifica-se também quando se emprega em inflamações e processos inflamatórios à superfície do corpo e no interior do corpo, bem como em processos para melhorar a conservação de materiais orgânicos. 6

[0019] Existem aliás também suposições de que possivelmente não é só o efeito enzimático directo da proteína SOD que é decisivo para o sucesso da cura. Conhece-se de outros enzimas, por exemplo citocroma A, histona, lisozima, ribonuclease, que eles apresentam por exemplo propriedades adicionais na forma dimérica, que aumentam consideravelmente as dos respectivos monómeros, ampliando deste modo vantajosamente o espectro de acção e área de aplicação correspondente das proteínas diméricas em relação aos monómeros (Bartholenys and Zenebergh, Eur. J. Câncer, Vol. 1 c XJ, 1979, 85-91).

[0020] Utilizando ácido hiaiurónico numa mistura com SOD, em especial rhSOD, com ou sem liposomas, verificou-se surpreendentemente que se obtém um efeito sinergístico, no sentido em que, em particular por aplicação externa, se forma um novo tecido claramente mais liso e mais elástico, em comparação com uma ferida de queimadura tratada com SOD sem ácido hiaiurónico. Este efeito pôde também verificar-se no caso de feridas inflamadas à superfície do corpo. O ácido hiaiurónico actua neste caso, em mistura com SOD liposomal, tanto como captor de radicais de acção sinergística, como também como veículo farmacêutico aceitável.

[0021] No âmbito das experiências que estão na base da presente invenção, verificou-se além disso surpreendentemente que quando se utiliza urna preparação de ácido hiaiurónico numa mistura com SOD, em especial rhSOD em liposomas, se obtém um efeito sinergístico de onde resulta uma conservação significativamente mais prolongada ou uma maior duração da acção da própria composição, em comparação com o tratamento corri SOD sem ácido hiaiurónico, e assim também uma mais longa duração dos materiais tratados; este efeito revela-se particularmente quando a SOD se encontra livre na preparação, isto é, sem estar incorporada em liposomas. Tanto a SOD como o ácido hiaiurónico isoladamente se 7 revelaram, sob este ponto de vista, claramente inferiores a uma mistura de ambos os componentes.

[0022] Este efeito sinergístic.o de uma mistura de SOD e ácido hialurónico deve-se provavelmente ao facto de o ácido hialurónico proteger a camada fosfolipídica dos liposomas e/ou a sensível molécula de SOD da acção de agentes lesivos, isto é principalmente onidantes, externos, e também ao facto de após a inactivação da SOD contribuir ainda, mesmo embora pouco, para o combate ao radical superóxido.

[0023] A presente invenção abrange várias formas de execução diferentes da aplicação de SOD, em especial rhSOD em liposomas, Com ou sem acido hiaiuromoo e, conforme o caso, em combinação com veículos e/ou ouuros aditivoo, para a preparação de composições farmacêuticas contra uma série de indicações.

[0024] Uma forma de execução ou uma característica da invenção refere-se á utilização de SOD, em eSpec±al S0D recombinante humana (rhSOD) em liposomas, conforme 0 caso numa mistura com ácido hialurónico e/ou um veículo iisiologicaríiente aceitável, bem como, conforme o caso, outros aditivos usuais para formulações qalénicas, para a prepar-,-.* , ~ · ai-«*çao de composiçoes farmacêuticas contra queimaduras, escaldarj„ Ί

Ut;J-a3 e lesões causadas por radiações, em especial as causadas ρθΓ raj_og yy [0025] Numa forma de execução de acordo orn a invenção formula- se por exemplo rhSOD incorporada em lipOC! 1 * ^mas, em que o veiculo eventualrnente adicionado é pobre em gotdur^ . ou isento de gordura e é originário do grupo dos hidrogeles θΓΓΤ-. „ .

Lyaiacos e inorgânicos, sendo directamente aplicada sobre a feriru j -ι-ua qa queimadura. Para -es c0m queimaduras do -ndos de situações de ;ormulaçâo em especial Q9ua ou na neve, tenham sofrido queimaduras solares em grandes localmente. δ além de uma aplicação clínica em pacientç segundo ou terceiro grau, por exemplo v-j acidente, pode também aplicar-se uma tal rc a pessoas que, em banhos de sol na áreas ou limitadas

[0026] No caso de feridas de queimaduras revelou-se particularmente vantajoso quando se aplicam os liposomas contendo SOD na forma liquida por pulverização a partir de uma embalagem de spray sobre o local ferido. Evita-se assim o contacto directo da ferida com os dedos ou com outro dispositivo de aplicação, por exemplo um gel, reduzindo-se desse modo o perigo de uma infecção adicional.

[0G27] Numa outra forma de execução, aplica-se a SOD incorporada em liposomas, eventualmente com ácido hialurónico e/ou outros aditivos, de preferência sobre pensos para feridas esterilizados e/ou coberturas para feridas, para se obter deste modo um meio rapidamente disponível e facilmente manuseável para o tratamento efectivo e/ou auto-tratamento de feridas de queimaduras de pequena ou média dimensão ou de queimaduras da pele, directamente no local do acontecimento. A vantagem especial desta forma de aplicação consiste no modo simples da própria aplicação, podendo mesmo ser efectuada com segurança por pessoas sem preparação médica, por exemplo pelos pais de crianças que tenham queimado os dedos no fogão ou que se tenham escaldado com água quente.

[0028] Um aspecto particular da presente invenção é a utilização de SOD, em especial de rhSOD em liposomas, para a preparação de composições destinadas a aplicar antes, durante ou após uma exposição a radiação. Para uma aplicação terapêutica, isto é logo após uma dose de radiação excessiva, por exemplo no caso de uma queimadura solar, aconselha-se para amenizar as consequências do efeito da radiação a aplicação das composições de SOD de acordo com a invenção, de preferência rhSOD em liposomas, conforme o caso numa mistura com pelo menos um veiculo fisiologicamente aceitável e/ou ácido hialurónico, bem como conforme o caso outros aditivos, na forma de emulsões, suspensões, soluções, loções ou pomadas ou geles sempre de baixa viscosidade. 9

ÍXjSQ-, [0029] Particularmente vantajosas são as composições que, por meio de um dispositivo de pulverização, por exemplo um spray, se podem aplicar sobre as partes lesadas da pele. Por um lado, evita-se deste modo o contacto directo e assim uma possível infecção da pele lesada pelos dedos possivelmente conspurcados ou por outros meios de aplicação da composição e, por outro lado, poupa-se deste modo uma aplicação mais ou menos dolorosa por fricção de, por exemplo, um gel de alta viscosidade.

[0030] Para aplicação profilática e ao mesmo tempo terapêutica, antes e durante uma exposição a radiação, são principalmente adequadas todas as composições de acordo com a invenção que contêm para além de SOD e, conforme o caso, ácido hialurónico, também ainda pelo menos um agente protector filtrante ou absorvente da radiação, de preferência um filtro de luz ou absorvedor de UV, em especial um filtro de UVB. Além disso, podem ainda estar presentes outras substâncias, principalmente factores de cuidados da pele.

[0031] Devido à presença da SOD e, conforme o caso, ácido hialurónico, para além de substâncias usuais filtrantes da luz, podem minorar-se consideravelmente as consequências desagradáveis de uma queimadura solar. Tais preparados de protecção solar de acção profilática e terapêutica podem aplicar-se vantajosamente em qualquer tipo de queimadura solar, na praia, na montanha, no mar, na pista de ski ou num solário. Em particular, pessoas com pele sensível e qualquer tipo de pele, que não bronzeiam sob a acção dos raios UV, têm muito a ganhar com esta forma de aplicação da presente invenção.

[0032] Uma outra forma de execução refere-se à preparação de composições para aplicação terapêutica e/ou profilática em inflamação agudas e crónicas e processos inflamatórios, em doenças reumáticas, em especial em inflamações reumáticas das articulações e/ou osteoartrite, sendo ainda aplicável com sucesso em inflamações das vias respiratórias, em especial 10

bronquite, choque pulmonar (Aeute Respiratory Distress Syndrone, ARDS), enfizema e outros processos inflamatórios. Em especial na área da aplicação cosmética para tratamento profilático e/ou terapêutico de inflamações locais da pele, como por exemplo furúnculos ou acne, que como é conhecido para muitas pessoas constituem uma limitação cosmética apreciável, abrem-se assim possibilidades muito prometedoras.

[0033] Numa forma de execução de acordo com a invenção formula-se por exemplo rhSOD incorporada em liposomas na torma de gel para feridas esterilizado, em que o veiculo eventualmente incorporado é pobre em gordura ou isento de gordura e pertence ao grupo dos hidrogeles orgânicos e inorgânicos, sendo directamente aplicada no local inflamado. Um i^eiculo pobre ou isento em gordura é antes de mais uma vantagem no caso de feridas inflamadas abertas, uma vez que concentrações extremamente elevadas de lipidos na zona da fenda podem levar à formação de produtos de degradação tóxicos. 0 ácido hialurónico é aplicável com especial vantagem em tais composições, quer corno veiculo isolado quer em mistura com peio menos um outro veiculo da categoria anteriormente referida. Além disso, podem estar também contidos nas composições de acordo com a invenção outros aditivos adequados, como por exemplo os que são habituais para formulações galénicas. pensos [0034] Nas inflamações superficiais revelou-se também como particularmente vantajoso aplicar os liposomas contendo SOD na forma liquida, por pulverização a partir de um dispositivo de spray ou semelhante, sobre a região inflamada. Evita-se assim o contacto directo da ferida com os dedos ou com outro meio de aplicação da composição, reduzindo-se desse modo o perigo de uma infecção adicional. Era determinados casos pode contudo ser também vantajoso empregar pelo menos uma das composições de acordo com a invenção sobre coberturas para feridas eventualmente esterilizadas, por exemplo cornpL essas, 11

adesivos e semelhantes. Tais coberturas para feridas assim preparadas são bem adequadas para um tratamento simples e rápido, mesmo para o auto-tratamento, por exemplo em feridas inflamadas e/ou inflamações reumáticas das articulações.

[0035] Numa outra forma de execução da presente invenção formula-se a SOD incorporada em liposomas, em especial rhSOD, juntamente com ácido hialurónico e, conforme o caso, com pelo menos um veiculo adicional pobre ou isento em gordura, em especial do grupo dos hidrogeles orgânicos e inorgânicos e, conforme o caso, outros aditivos, na forma de solução iniectável, e aplica-se com sucesso em indicações reumatológicas e/ou ortopédicas, por exemplo inflamações reumáticas das articulações ou osteoartrite. A .injecção pode efectuar-se tanto directamente na articulação (intra-articular) ou na região do corpo atingidas, ou ainda por outras vias parenterais, de preferência por via intravenosa. [0035] Numa determinada extensão, podem também conseguir-se alívios de queixas reumático-artríticas por tratamento externo, por exemplo através de uma aplicação externa, também de acordo com a invenção, de SOD em liposomas, em especial em mistura com ácido hialurónico. Neste caso, podem formular-se e aplicar-se os ingredientes activos tanto na forma de pomadas ou geles, sempre em mistura com aditivos, de preferência veículos pobres ou isentos em gorduras, em especial do grupo dos hidrogeles orgânicos ou inorgânicos, como também na forma de sprays ou tinturas. Aditivos adequados, como os usuais nas formulações gaiénicas de fármacos, podem também estar contidos nas composições. Em muitos casos, pode ainda procurar-se um apoio complementar de um a administração oral de SOD liposomal na forrna de comprimidos, cápsulas, drageias, pós, etc.

[0037] Numa outra forma de execução puderam diminuir-se ou reprimir-se cora sucesso determinados fenómenos degenerativos como enfizema, em especial enfizema da pele, pela aplicação de 12 "*7

acordo com a invenção de SOD em liposomas, conforme o caso numa mistura com ácido hialurónico e/ou pelo menos com um veiculo fisiologicamente aceitável. Possivelmente, para além do puro efeito enzimático da SOD, desempenham também aqui um papel sinergistico efeitos adicionais estimulantes da fagocitose dos agregados de SOD nos liposomas.

[0038] 0 mesmo se verifica em relação à aplicação terapêutica com sucesso das composições farmacêuticas da presente invenção em inflamações das vias respiratórias e dos pulmões, como por exemplo bronquite, choque pulmonar (ARDS) e enfizema pulmonar. Neste caso, revelou-se em especial como particularmente bem adequada a aplicação por inalação de uma solução ou emulsão de SOD incorporada em liposomas.

[0039] A utilização das composições de SOD liposomal é muito bem sucedida em especial na área das perturbações cosméticas. Pequenas inflamações locais, furúnculos, acne e manifestações análogas são eficazmente tratáveis pela aplicação de acordo com a invenção de composições contendo SOD, em especial na forma de pomadas, geles, cremes ou em forma liquida por pulverização. Por aplicação repetida, de preferência regularmente,· pode também conseguir-se um certo efeito profilático no que respeita ao aparecimento de novas inflamações da pele, por exemplo furúnculos. Provavelmente, isto tem também a ver com uma activaçâo dos mecanismos de fagocitose possivelmente desencadeada ou estimulada pelos agregados de SOD.

[0040] Utilizando uma mistura de SOD liposomal e ácido hialurónico consegue-se ainda a cura das inflamações com neo-formação de um tecido mais elástico e principairaente mais lis o em comparação com as composições isentas de ácido hialurónico. Especialmente para aplicações cosméticas em locais do corpo visíveis, por exemplo no rosto, isto é uma 'vantagem considerável. 13

[0041] As composições de acordo com a invenção da presente invenção são em geral mais eficazes quando a SOD, conforme o caso de utilização e o tipo de aplicação, se encontra numa concentração de > 0,01¾ em peso, em especial de 0,U1 a 5% em peso, e o ácido hialurónico conforme o caso adicionalmente presente numa concentração de > 0,05% em peso, em especial de 0,1 a 5% em peso, em relação à composição final pronta a aplicar. Para aplicações tópicas revelou-se mais adequada uma quantidade de 0,01 a 1 mg de SOD/cm2 de área de lesão ou área de corpo. As aplicações orais ou parenterais, pelo contrário, efectuam-se com vantagem com doses de SOD de 0,5 a 50 mg/kg de peso corporal, sendo mais conveniente para uma administração repetida de SOD no âmbito de uma terapia uma dose de 0,5 a 10 mg/kg*dia.

[0042] A presente invenção refere-se ainda à utilização de SOD para a preparação de composições que se podem empregar para melhorar a conservação de vários materiais orgânicos, de preferência biogénicos, bem corno a um processo para melhorar a conservação de tais materiais orgânicos na utilização das composições de acordo com a invenção.

[0043] Basicamente, pode preparar-se a SOD de acordo com a presente invenção, de preferência rhSOD em liposornas, na forma de uma solução ou emulsão aquosa, com e sem ácido hialurónico, e empregar-se directamente para fins de conservação. Sm vários casos pode contudo ser vantajosa a mistura de uma ou mais substâncias de suporte adequadas e/ou outros aditivos usuais para preparações galénicas, para possibilitar ou facilitar por exemplo uma determinada forma de aplicação desejada.

Essencial para a utilização, de acordo com a invenção, das composições, por exemplo no âmbito de um processo para melhorar a conservação dos materiais orgânicos de acordo com a presente invenção, é contudo que os materiais orgânicos sejam postos em 14 contacto pelo menos parcialmente com pelo menos uma das composições aqui descritas.

[0044] Numa forma de execução da presente invenção coloca-se a SOD incorporada em liposomas, em especial rhSOD, numa solução tampão adequada, para com ela tratar para fins de conservação órgãos ou tecidos orgânicos, que foram removidos de um dador para fins de transplantação, durante o período de tempo entre a recolha e a reimplantação. Revelou-se significativa neste caso uma composição com um teor em SOD de 0,1 a 1% em peso. O tratamento de conservação de órgãos ou tecidos efectua-se melhor primeiro por uma lavagem do órgão em causa, por meio de métodos usuais de conservação de órgãos, em especial por injecção ou infusão da composição liquida no órgão, por exemplo um coração, um rim, um figado, etc., e de preferência seguida por imersão ou, melhor ainda, colocação do órgão ou tecido ern causa num banho, que contém também SOD liposomal quer no mesmo tampão quer num outro tampão análogo. Consegue-se deste modo, por um lado prolongar consideravelmente c período de tempo de armazenamento intermédio e, por outro lado, minorar possíveis lesões dos órgãos ou dos tecidos após a reimplantação.

[0045] Verificou-se felizmente que neste caso, por mistura de ácido hialurónico, por exemplo em concentrações de cerca de 0,05 a 2,5% em peso, à emulsão de SOD liposomal e tampão, se pode obter um efeito sinergístico adicional do tipo anteriormente descrito.

[0046] Numa outra forma de execução aplica-se SOD liposomal numa composição líquida - com ou sem ácido hialurónico - a alimentos, por exemplo por meio de dispositivos de pulverização ou sprays ou outros. Em especial, carnes que se estragam facilmente e ainda lacticinios de toda a espécie, bem como frutas e legumes, podem ser decisivamente melhorados no que respeita à sua conservação por esta medida simples e fácil de executar. A SOD 15 incorporada em iiposomas funciona neste caso quase como antioxidante.

[0047] Também banhos de imersão, que contêm pelo menos uma das composições de acordo com a invenção e nos quais os materiais orgânicos, por exemplo diferentes alimentos, se mergulham ou se colocam durante o período de tempo pretendido, são apropriados para pôr em contacto os ingredientes aetivos SOD e, conforme o caso, ácido hialurónico, com os materiais orgânicos.

[0048] Uma outra forma de execução da presente invenção refere-se ao emprego de SOD livre, em especial de rhSOD, ou SOD liposomal, numa mistura com ácido hialurónico e, conforme o caso, pelo menos um outro veículo adequado, para melhorar a conservação de preparados cosméticos de base orgânica, em especial de agentes de cuidados da pele. Os ensaios mostraram que tanto a SOD em Iiposomas isoladaraente como também a SOD livre ou incorporada em Iiposomas numa mistura com ácido hialurónico, é extraordinariamente apropriada como aditivo do material orgânico em preparados cosméticos como pomadas, cremes, geles, óleos, loções, águas, leites e semelhantes, para melhorar a respectiva conservação. Em especial no caso da mistura com ácido hialurónico verifica-se ainda um efeito positivo adicional, no que respeita a um certo aumento da elasticidade e da lisura da pele após aplicação de cosméticos melhorados deste modo.

[0049] A concentração da SOD situa-se neste caso de aplicação de preferência entre 0,1 e 5¾ em peso; o teor em ácido hialurónico eventualmente, presente, pelo contrário, é de preferência de 0,5 a 5% em peso, em relação à composição pronta. Caso, além disso uma ou rnais substâncias veículo devam ser misturadas, estas devera ser de preferência pobres ou isentas em gordura e, conforme o caso, pertencentes ao grupo dos hidrogeles orgânicos e inorgânicos. 16 [0050] Com a finalidade de melhorar a conservação de materiais orgânicos, como por exemplo tecidos t^egetais e animais, transplantados de órgãos, alimentos, em especial carnes e charcutarias facilmente perecíveis, ou cosméticos de base orgânica, revelarara-se significativas concentrações de SOD de 0,1 a 100 mg/kg de material orgânico, [0051] Para ilustrar ainda melhor as possibilidades de aplicação e os modos de acção das composições aqui descritas, apresentam-se a seguir alguns exemplos. Os exemplos destinam-se a uma rnelhor compreensão e de modo algum limitam o conteúdo ou o âmbito da presente invenção.

Exemplo 1: Aplicação era escaldadelas [0052] Dividiram-se 70 coelhos albinos em 7 grupos (A-G). Rapou-se a cada coelho uma área de 5x10 cm sobre o dorso. Após profunda narcotização mergulharam-se os coelhos na área rapada no dorso, isoladamente, numa tina com uma abertura de exactamente 3x5 cm, cheia com água quente a 93,5-95°C, durante exactamente 16 segundos. Dai resultaram escaldadelas de segundo a terceiro grau. As áreas escaldadas foram tratadas de acordo com a Tabela 1 abaixo apresentada e cobriram-se cuidadosamente com pensos esterilizados para feridas com base de alumínio. O penso foi mudado diariamente.

[0053] Os liposomas com rhSOD incorporada foram preparados do seguinte modo: Como método de preparação para a maior parte dos liposomas unilamelares utilizou-se o método de injecção segundo Batzari e Korn (Batzari, S., Korn, E.D. 1973, Biochim. Biophys. Acta 289: 1015-19). Os componentes lipídicos dipalmitoil-sn-glicerofosfocolina (DPPC), colesterina e estearilamina dissolvem-se numa proporção molar de 7:1:2 em etanol a 96%, A concentração lipídica da solução de liposomas é de 10 μιηοΐ/ml. 0 17

volume de etanol escolhe-se de modo que a concentração de etanol na preparação se situe abaixo de 7%. A rhSOD liofilizada dissoive-se em PBS. A concentração de proteínas da fase aquosa é de 10 mg/ml. Temperam-se ambas as soluções a 37°C. Os liposomas produzem-se por injecção contínua da fase etanólica na fase aquosa. Para separar a rhSOD não incorporada ou o etanol filtra-se por diálise a solução de liposomas contra PBS (unidade de ultrafiltração por diálise da firma Amicon; membrana: YM 100). Para a formulação final re-hidrata-se o carfoogel (Carbopol®, polimerizado de ácido acrílico fortemente ácido, com elevado peso molecular, DAB9) em água destilada e ajust3-se o valor de pH a 7,5. A solução de liposomas e o gel re-hidratado misturam-se homogeneamente e armazenam-se a 4°C. O processo total de preparação efectua-se com soluções esterilizadas e em fluxo laminar (banco de espaço puro esterilizado).

[0054] Preparação do gel de rhSOD incorporada em liposomas -ácido hialurónico: re-hidrata-se o ácido hialurónico liofilizado na solução aquosa de liposomas e armazena-se o gel pronto a 4°C.

[0055] Os animais de teste acima mencionados foram eontinuadamente observados por um médico veterinário, não se tendo verificado quaisquer sinais de doença clínica nos animais durante o decorrer do ensaio. Os animais não apresentavam também quaisquer manifestações de dor pós-traumática após acordarem da narcose; apesar disso procedeu-se a uma analgesia pós-traumática por razões de precaução.

[0056] O grupo F manteve-se como grupo de controle, não tratado. Os restantes grupos foram tratados de acordo com o esquema seguinte: 18

Jluj^

Tabela 1

Grupo de teste Húmero de animais Húmeros de identificação Dose e administração A 10 1-10 0,1 mg rnSOD/cnd de lesão, em liposomas; aplicado 2 x no 1° dia B 10 11-20 1 mg rhSOD/cm* de lesão, em gel sem liposomas; aplicado 1 x no 1° dia c 10 21-30 1 mg rhSOD/crrr de lesão; injectado intralesional D 10 31-40 Grupo de controle: gel com liposomas vazios; aplicado 1 x no 1° dia E 10 41-50 Grupo de controle: gel sem liposomas; aplicado 1 x no 1° dia F 10 51-60 Grupo de controle: sem tratamento H 10 61-70 0,1 mg rhSOD em liposomas/crcb de lesão, com ácido nialurónico; aplicado 2 x rio 1° dia [0057] Trataram-se estatisticamente os tamanhos das feridas (planimetria, documentação fotográfica), o estado local fcôr, existência de necroses, sinais de epitelização, contracturas, nascimento de pelos, cutimetria, tecidos de granulação), testes histopatológicos da pele e macroscopia do progresso geral da cura (fotodocumentação).

[0058] Para os parâmetros investigados pôde observar-se uma influência positiva da rhSOD incorporada em liposomas, sobre os processos de cura e regeneração nos animais de teste tratados. O mais nítido foi o efeito da rhSOD 24 horas após o estabelecimento da lesão. Verificou-se assim por exemplo uma diferença significativa entre os grupos de teste no que respeita ao Laiiianhu da lesão, em que nos animais tratados com rhCOD a zona de transição da necrose para a pele envolvente não escaldada foi claramente menos atingida pela escaldadela. Também os testes histológicos confirmaram as observações macroscópicas. O molho;: quadro histopatológico foi encontrado para os grupos de 19

teste A e únicos de quaisquer e G foram G. Histologicamente, os grupos de teste A e G foram os todos os grupos que após 4 semanas não apresentavam necroses residuais. Os resultados gerais dos grupos A os que se indicam a seguir: o tamanho da lesão ficou inalterado após 24 horas, em comparação com os outros grupos de teste; a largura do edema foi claramente reduzida e seguiu-se uma rápida reconstituição; não houve qualquer necrose residual no eorium; o grupo de teste G mostrou ainda uma neo-formação de tecidos mais lisa e elástica, em comparação com todos os restantes grupos de teste.

[0059] Num período de tempo de observação de 24 horas pôde verificar-se claramente a influência positiva da rhSOD incorporada em liposornas, embora a dose de rhSOD nos grupos de teste A e G fosse dez vezes inferior à dos grupos de teste B e C, As manifestações pós-queimadura das feridas de escaldadela, bem como especialmente também o edema, regrediram mais rápida e mais nitidamente nos grupos tratados com rhSOD incorporada em liposomas.

Exemplo 2: Aplicação em queimaduras [0060] Efectuou-se um ensaio com produção de queimaduras análogo ao método de M. Choi e H.P. Ehrlich (American Journal of Pathology 142, 1993, 519-529) . Mantiveram-se 40 ratinhos (ratinhos Wistar, machos) de 300 a 350 g de peso corporal em condições padrão. Aos ratinhos anestesiados (anestésico: pentobarbital, i.p.) fizeram-se feridas de queimadura com a forma de um padrão às riscas, com um carimbo aquecido em água a 20 ferver. Para este fira pressionou-se o carimbo durante 30 segundos sobre a pele rapada dos animais. Para obter o padrão desejado sobre a pele construiu-se o carimbo em forma de pente, segundo Choi e Ehrlich (1993) .

[0061] Os ratos foram divididos em 4 grupos de 10 animais cada (Tabela 2).

Tabela 2

Grupo de teste Número de animais Administração 1 X 10 Grupo de controle: sem tratamento 2 10 Gel de suporte com liposomas vazios 3 10 Gel com rhSOD em liposomas 4 10 rhSOD em liposomas com ácido hialurónico em gel se suporte A preparação dos liposomas e dos geles efectuou-se de rnodo análogo ao do exemplo 1. Os ratinhos foram tratados durante um período de 48 horas por seis vezes a intervalos regulares, tèndo-se efectuado o primeiro tratamento poucos minutos após a ocorrência da lesão. A rhSOD incorporada em liposomas aplicou-se numa quantidade de 0,05 mg/cm2; o teor em ácido hialurónico na composição utilizada era de 3% em peso.

Como critérios de avaliação para o efeito potencial utilizaram-se a planimetria e a rnacromorf ologia do padrão de feridas provocadas pelo design do carimbo. Além disso, efectuou-se uma histologia padrão (coloração com hematoxina, eosina e vital; segundo H. Millesi, 1970, Chirurgia Plastica et Reconstructia, Vol. 8, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York) das amostras de tecido. Retiraram-se amostras após 0 h, 25 h, 72 h, 7 dias e 21 dias.

[0062] Nos grupos 3 e 4 manteve-se inalterado o padrão de riscas causado pelo carimbo, isto significa que as riscas queimadas se mantiveram vitais. Nos grupos 1 e 2, pelo contrário, observou-se 21

uma confluência para uma área de ferida mais ou menos unitária. Nos grupos 3 e 4 verificou-se também um quadro histopatológico mais agradável. Mos grupos tratados com rhSOD incorporada em liposomas o padrão das riscas não expostas manteve-se inalterado. As áreas atingidas pela pressão do carimbo foram substituídas por tecido de granulação e cicatriz, maioritariamente isento de necroses. No caso dos grupos 1 e 2 observou-se uma área de cicatriz unitária não granulada, parcialmente com necroses profundas.

Exemplo 3: Aplicação em lesões de irradiação [0063] Sujeitaram-se ratinhos pelados a uma irradiação UV de acordo com a dose de eritema mínima (MED). O ensaio efectuou-se como descrito por B.C. Pence e M.F. r-laylor (B.C. Pence, M.F. Navlor 1993, J. o f Inve s ti g a tive Dermatology 95: 213-16). Aplicou-se uma única dose de radiação UVB (290-320 nrn) de uma lâmpada solar Westinghouse FS-40, de modo que os ratinhos recebessem urna energia total de 0,09 J/cm‘. A dose corresponde ao triplo da MED para receptores caucasianos. Utilizaram-se 40 ratinhos em 4 grupos de 10 animais cada (Tabela 3).

Tabela 3

Grupo de teste Número de animais Admi n is t ração 1 10 Grupo de controle: sem tratamento 2 10 Gel de suporte com liposomas vazios o 10 Gel com rhSOD em liposomas 4 10 rhSOD em liposomas com ácido hialurónico em qel de suporte [0064] Os liposomas e os geles prepararam-se de modo análogo ao do exemplo 1. Aplicou-se o gel imediatamente (2-3 minutos) após a exposição à radiação e depois mais duas vezes a intervalos 22

,lO' regulares de 4 horas. O gel na composição utilizada continha 0,5% em peso de ácido hialurónico, a dose de rhSOD administrada foi de 0,5 mg/cm2 de área corporal irradiada. Como critério de avaliação efectuou-se uma comparação visual de coloração de todos os animais a intervalos de tempo regulares. Testou-se ainda o aparecimento de "sunburn-cells".

[0065] Nos grupos 3 e 4 ocorreu um eritema após 10 minutos, significativamente menor em comparação com o dos grupos 1 e 2. Após 24 horas retiraram-se amostras de tecido e investigaram-se no que respeita às caracteristicas "sunbrun-cells". Nos grupos 3 e 4 não ocorreram "sunbrun-cells", ou ocorreram apenas isoladamente. Conseguiu fazer-se uma correlação entre a intensidade dos vermelhões e a ocorrência de "sunbrun-cells".

Exemplo 4: Comparação de várias formas de aplicação [0066] Dividiram-se 140 ratinhos machos OF1 (outbred) (do Institut fur Versuchstierzucht und -haltung, Himberg, Áustria), todos entre 8 a 10 semanas de idade, de acordo com o principio aleatório, em 14 grupos (A-N). Os ratinhos, sob narcose com éter, foram inoculados por via intranasal c-om 50 fxl de solução PBS, que continha lxl0s PFU/ratinho (= 2-2,5 κ LDS0) do virus de Influenza A/WSN/3J (a seguir designado por WSN) . O tratamento dos ratinhos infectados corn WSN iniciou-se ao 4o dia após a irifecçâo, isto é no inicio da ocorrência de sintomas clínicos da doença de Influenza no ratinho. Os ratos foram tratados uma vez por dia até ao dia 11 após a infecção. Foram tratados por via tópica, subcutânea, intravenosa e intranasal, com preparados que continham rhSOD nos seguintes tipos de vesículas liposomais: a) rhSOD em vesículas unilamelares (SUV) pequenas, tamanho S cerca de 100 nm,

I b) rhSOD em vesículas de injecção (IV), diâmetro < cerca de 200 nm, e c) rhSOD em vesículas multilamelares (MLV), diâmetro < cerca de 500 nm.

[0067] A Tabela 4 mostra a ordem dos ensaios e os resultados obtidos. Para o tratamento tópico aplicou-se um gel de rhSOD lipcsomal sobre o lado ventral do ratinho, em especial na região do peito, untando uma vez por dia. Cobriu-se assim uma zona de pele de cerca de 10 cm2 com uma camada de gel de cerca de 2 mm de espessura. Os dados de concentração na Tabela 4 referem-se à área tratada em cm2. A aplicação intranasal de rhSOD efectuou-se sob narcose dos animais com éter. Administraram-se neste caso 0,05 ml de uma suspensão com rhSOD em IV (1 mg/rnl) por meio de uma micropipeta nos orifícios nasais dos ratinhos.

Para administração intravenosa das suspensões de rhSOD (ver Tabela 4) injectou-se na veia da cauda, enquanto que para aplicação subcutânea das mesmas suspensões utilizadas na injecção i.v., se injectou de modo subcutâneo na zona do pescoço e/ou do ombro. O número de casos mortais dos ratinhos não aumentou mais desde o dia 15° após a infecção (período de tempo testado: dia 15 a dia 25 após a infecção), de modo que os ratinhos que sobreviveram ao 15° dia foram considerados como curados da infecção por

Intiuenza.

[0068] A patogénese de uma infecção por Influenza em ratinho é mais uma sobre-reacção da defesa irnunológica do organismo hospedeiro do que um eteito do virus. A formação de actividade nos pulmões e influênc directo respeitante à multiplicação radicais livres de oxigénio em no soro dos ratinhos tern a sua (Oda et al., Science, 1989, 244(4907): 974-6) 24

Tabela 4

Grupo Forma de aplicação e dose Sobreviventes por cada 10 ratinhos A Aplicação tópica de um gel de rhSOD incorporada em SUV; Dose: 0,15 mg de rhSOD/cm2 de área tratada 4 de 10 B Aplicação tópica de um gel de rhSOD incorporada em IV; Dose: 0,15 mg de rhSOD/cm2 de área tratada 4 de 10 C Aplicação tópica de um gel de rhSOD incorporada em MLV; Dose: 0,42 mg de rhSOD/cm2 de área tratada 3 de 10 D Aplicação tópica de um gel com IV sem rhSOD 2 de 10 E Aplicação s.c. de uma suspensão de rhSOD incorporada em SUV; Dose: 0,5 ml; Suspensão: 1 mg de rhSOD/ml 8 de 10 F Aplicação s.c. de uma suspensão de rhSOD incorporada em IV; Dose: 0,5 ml; Suspensão: 1 mg de rhSOD/ml S de 10 G Aplicação s.c. de uma suspensão de rhSOD incorporada em SUV; Dose: 0,5 ml; Suspensão: 1 mg de rhSOD/ml 5 de 10 H .Aplicação s.c. de 0,5 ml de uma suspensão de IV sem rhSOD 1 de 10 I Aplicação i.v. de uma suspensão de rhSOD incorporada em SUV; Dose: 0,5 ml; Suspensão: 1 mg de rhSOD/ml 9 de 10 J Aplicação i.v. de uma suspensão de rhSOD incorporada em IV; Dose: 0,5 ml; Suspensão: 1 mg de rhSOD/rnl 10 de 10 K Aplicação i.v. de uma suspensão de rhSOD incorporada em MLV; Dose: 0,5 ml; Suspensão: 3 mg de rhSOD/ml 4 de 10 L .Aplicação i.v. de 0,5 ml de uma suspensão de IV sem rhSOD 1 de 10 M .Aplicação i.n. de uma suspensão de rhSOD incorporada em IV; Dose: 0,05 ml; Suspensão: 1 mg de rhSOD/ml 8 de 10 M Grupo de controle sem tratamento 1 de 10 25

Resultado: [0069] Os ratinhos que foram tratados por via parenterai (s.c., i.v. e i.n.) com rhSOD em liposomas SUV ou IV, sobreviveram na maior parte dos casos (Grupos E, F, I, J, M) ern comparação com os grupos de controle, que não foram tratados ou que foram tratados apenas cora liposomas sem SOD (Grupos H, L e N) . Verificou-se ainda surpreendentemente que os ratinhos que foram tratados com rhSOD em MLV estavam menos protegidos contra a ínfecção mortal por Influenza, apesar de nestas preparações de liposomas se ter utilizado uma quantidade mais elevada de rnSOD (Grupos C, G e K) . A razão disto assenta provavelmente no tamanho das vesículas (na gama de 500 nrn; para comparação: IV < cerca de 200 nm; SU < cerca de 100 nrn) , na pior distribuição e na menor capacidade de fusão do MLV com as células, como se pôde verificar com base num ensaio de fusão in vitro (ensaio de fusão: incubaram-se células CHO durante a noite com 20 μηιοί de liposomas IV e MLV contendo rhSOD, a rhSOD detectou-se por meio de imunofluorescência após tratamento com 1% de Triton X100).

[0070] O tratamento tópico dos ratinhos infectados com Influenza com gel de rhSOD produziu apenas uma protecção parcial contra as consequências mortais da doença; pelo contrário, esta protecção foi significativa nos grupos que foram tratados com preparações de SUV ou IV (Grupos A e B) . Os resultados mostram que os radicais livres de oxigénio desempenham um papel decisivo no que respeita ao efeito mortal da infecção por Influenza em ratinhos e que a rhSOD, incorporada em pequenas vesículas liposomais (SUV e IV) posoui um potencial terapêutico apreciável em relação a esta infecção virai.

[0071] Os resultados mostram ainda que a rhSOD incorporada era pequenos liposomas (SUV, IV) com um diâmetro à volta de 200 nm nu inferior, vence facilmente as barreiras da pele, mesmo no 26

caso da pele saudável e intacta, e pode penetrar em camadas de tecidos mais profundas, de modo a exercer assim o seu efeito protector em relação a infecções virais na zona dos pulmões (inflamações pulmonares). A rhSOD incorporada em liposomas pode por isso ser utilizada não só para aplicações i.v., s.c. e i.n., mas também na forma de pomadas, geles, cremes ou outras formulações adequadas, conforme o caso em combinação com outros ingredientes activos e/ou inclusivamente outros aditivos, como um terapêutico eficaz para o tratamento de doenças relacionadas com radicais livres de oxigénio, por exemplo inflamações eventualmente de origem microbiana, era especial das vias respiratórias superiores e dos pulmões.

Exemplo 5: Aplicação tópica em Herpes labialis [0072] Num ensaio com seres humanos testou-se rhSOD, incorporada em pequenas vesículas unilamelares ("small unilamellar vesicles", SUV) , com um diâmetro de vesícula à volta de 100 nm ou inferior, contra uma inflamação local da pele na zona da boca causada por borbulhas fibrosas sobre o lábio (herpes labialis). As infecções e as doenças causadas por Herpes são conhecidas por serem difíceis de tratar e muito incómodas para a maior parte das pessoas por elas atingidas, uma vez que provocam frequenternente dores (por exemplo no caso de herpes zoster) , comichão, ardor, suores e/ou efeitos cosméticos desagradáveis, em especial na zona do rosto.

[0073] A preparação de rhSOD liposomal à base de gel de Carbopox5, tinha uma consistência cremosa para a pele e aplicou-se numa concentração à volta de 0,15 mg de rhSOD por cm2 de área a tratar, uma a duas vezes por dia, directamente sobre a zona inflamada. Logo após a primeira aplicação verificou-se num período de poucas horas uma alivio apreciável e logo após 3 dias 8 \ de tratamento foram desaparecendo continuamente os sintomas típicos.

Exemplo 6: Aplicação tópica contra alergias [0074] A mesma preparação de rhSOD do exemplo 5 foi testada num outro ensaio em seres humanos contra reacções alérgicas da pele. Os sintomas da alergia eram olhos avermelhados e inchaços à volta dos olhos e na zona entre os olhos e o nariz, possivelmente como efeitos adicionais de uma alergia dos fenos existentes. Para além das desagradáveis tensões no rosto causadas pelos inchaços e ainda do sofrimento psicológico com isso relacionado, manifestou-se também uma limitação da visão.

[0075] O gel de rhSQD aplicou-se, tal como no exemplo 5, numa concentração de cerca de 0,15 mg de rhSOD por cm2 de área a tratar na totalidade da zona do rosto atingida, como um creme para a pele. O resultado foi impressionante: logo após uma única aplicação os inchaços regrediram quase completamente; por razões de segurança, fez-se no dia seguinte uma segunda aplicação de creme, mas não foi necessário raais nenhum tratamento. As queixas foram prsticamente eliminadas.

Exemplo 7: Aplicação contra psoríase [0076] Num outro ensaio, utilizou-se o gel de rhSOD do exemplo 5, num paciente infantil, contra psoríase. Aplicou-se o preparado, tal como no exemplo 5, numa concentração de cerca de 0,15 mg de rhSOD por cm2 de área a tratar, em todas as zonas do corpo atingidas, duas vezes por dia (de manha e à tarde) , como um creme para a peie.

[0077] Resultado: Após três d í 3S de tratamento verificou-se um claro retrocesso dos vermelhões de pele na zona da inflamação, bem como uma diminuição da área de comichão. Esta agradável descoberta mostra que a rhSOD em liposomas, por aplicação tópica externa. se pode empregar também com sucesso em pacientes de psoriase, quando não para a cura da doença, pelo menos para alivio dos sintomas.

Lisboa, 19 de Dezembro de 2001 ^AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de Cu,Zn-SOD recornbinante humana (rhSOD) em liposomas, em mistura com ácido hialurónico, para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação profilática e/ou terapêutica contra concentrações elevadas de radicais superóxido e/ou danos por eles causados, no corpo humano ou em partes deste.
2. Utilização de Cu,Zn-SOD recombinante humana (rhSOD) em liposomas, para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação profilática e/ou terapêutica contra concentrações elevadas de radicais superóKido e/ou danos por eles causados, no corpo humano ou em partes deste.
3. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação -em especial externa - contra lesões da pele ou dos tecidos vizinhos causadas por radiações, em queimaduras, escaldadelas, processos inflamatórios, em especial doenças inflamatórias da peie, bem corno doenças reumáticas.
4 . Utilização de acordo com as r e i vi ndi c a çõ e s 1 ou 2, para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação contra inflamações reumáticas das articulações e/ou osteoartrite.
5. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação contra enfizemas da pele, furúnculos, acne ou inflamações de origem microbiana, em especial causadas por vírus. 1

Ο*
6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação contra inflamações causadas pelo virus da Influenza, era especial na área das vias respiratórias e dos pulmões, ou por virus de herpes, em especial na região da boca e lábios (herpes labialis).
7. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação, de preferência por inalação, contra inflamações das vias respiratórias e dos pulmões, em especial contra bronquite, choque pulmonar (ARDS) e/ou enfizema pulmonar.
8. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a preparação de uma composição farmacêutica para aplicação, de preferência tópica, contra vermelhões e inchaços de pele, em especial de origem alérgica, ou contra psoriase.
9 . U tlli ^ a ção de 30 ordo com uma das r eivindic- ações 1 a 3, caracte ri z a da por a c omposi Ç 3 u conter ainda pelo menos um agente protector filt rante OU absorv ente da radiação, de prefere ncia um fi itro de lu Z OU aos or vedor ln I, em especial um filt ro d le UVB, bem como conforme o caso ou tros factor e f de preferência protectores da pele.
10. Utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a composição farmacêutica se aplicar na forma de emulsões, suspensões, soluções, loções, pomadas, geles ou por pulverização a partir de um spray ou outro dispositivo de pulverização adequado. 2
11. Utilização de Cu,Zn-SOD recombinante humana (rhSOD) em liposomas, em mistura com ácido hialurónico, para a preparação de uma composição cosmética para aplicação externa, em especial como agente de cuidados da pele ou como protector solar.
12. Utilização de Cu,Zn-SOD recombinante humana (rhSOD) em liposomas, conforme o caso em mistura com ácido hialurónico, para a preparação de uma composição para melhorar a conservação de materiais orgânicos.
13. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1, 2 ou 12 para a preparação de uma composição para aplicação em tecidos orgânicos, órgãos e transplantados de órgãos; ou de tecidos.
14. Utilização de acordo com a reivindicação 12 para a preparação de uma composição para aplicação em alimentos, de preferência produtos ds carne e charcutaria facilmente perecíveis, ou em preparados cosméticos de base orgânica, em especial agentes de cuidados da pele, na forma de pomadas, cremes, águas, óleos ou loções.
15. Utilização de acordo com unia das reivindicações anteriores, caracterizada por a rhSOD para aplicações externas se empregar numa dose de 0,01 a 1 mg/cnf de área corporal a tratar, para outras, em especial aplicações orais ou parenterais, numa dose de 0,5 a 50 mg/kg de peso corporal.
16. Utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por na composição estar contido ainda um veículo pobre ou isento de gordura, de preferência do grupo dos hidrogeles orgânicos e inorgânicos.
17. Utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a rb.SOD se encontrar numa concentração maior ou igual a 0,01¾ em peso, ern especial de 0,01 a 5% em peso da composição.
18. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1, 3 a 13, caracterizada por o ácido hialurónico se encontrar numa concentração maior ou igual a 0,05% em peso, em especial de 0,1 a 5% em peso da composição.
19. Utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, com rhSOD em iiposomas, caracterizada por os iiposomas apresentarem um tamanho médio inferior a 600 nm, de preferência inferior a 300 nm, em especial inferior a 150 nm, sendo de preferência unilamelares.
20. Processo para melhorar a conservação de materiais orgânicos, caracterizado por se pôr em contacto pelo menos parcialmente uma composição, que contém Cu,Zn-5QD recombinante hurnana (rhSOD), conforme o caso em Iiposomas, e/ou em mistura cora ácido hialurónico, com o material orgânico.
21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a composição ser liquida e ser pulverizada sobre o material orgânico por meio de um dispositivo de spray adequado, ou por o material orgânico ser mergulhado ou colocado na composição liquida, ou no caso de órgãos e transplantados de órgãos se lavarem estes, segundo métodos usuais de conservação de órgãos, em especial por injecção ou infusão.
22. Processo de acordo corri uma das reivindicações 20 ou 21, caracterizado por o material orgânico compreender tecidos 4 animais ou vegetais, de preferência órgãos, transplantados de órgãos, transplantados de tecidos e/ou alimentos, em especial produtos de carne ou de charcutaria facilmente perecíveis.
23. Processo de acordo com as reivindicações 20 ou 21, caracteri zado por a composição ser adicionada ao material orgânico num preparado cosmético.
24. Processo de acordo com uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado por a rhSOD se encontrar numa concentração maior ou igual a 0,1% em peso, em especial de 0,01 a 5% em peso e, conforme o caso, o ácido hialurónico se encontrar numa concentração maior ou igual a 0,05% em peso, em especial de 0,1 a 5% em peso da composição total.
25. Processo de acordo com uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado por a rhSOD ser aplicada numa quantidade de 0,1 a 100 mg/kg de material orgânico.
26. Composição cosmética ou farmacêutica contendo Cu,Zn-SOD recombinante humana em liposornas em mistura com ácido hialurónico. Lisboa, 19 de Dezembro de 2001

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