CN105838666A - 一种细胞培养基及细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞培养基，其包括基础培养基和添加该基础培养基中的生长因子组合物。其中，基础培养基含有0～1％的血清。该生长因子组合物包括人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白。该细胞培养基成本低、能够促进细胞的正常生长，适用于细胞的大规模培养。此外，本发明还公开了采用该细胞培养基进行细胞培养的方法。

Description

一种细胞培养基及细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种细胞培养基及细胞培养方法。
背景技术
目前，动物细胞贴壁生长是细胞培养的基本要求，一直以来在细胞培养中必须要有血清的介入才能保证细胞的正常生长。但是血清对于细胞生长也有不利的一面。成本的高昂，进口血清的采购限制，血清对细胞的负面影响致使人们不断地研究挖掘血清替代品。
曾经的无血清培养基面市之后，引起不小的反响。但是无血清培养基需要对细胞进行专门的训化，需要针对细胞做专门的定制，过程繁琐，成本高居不下，不能有效解决细胞大规模培养的需要。血清培养和无血清培养都成为细胞培养的瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞培养基，此细胞培养基不含有或含低量的血清，其成本低，培养效果好，能适用于细胞的大规模培养。
本发明的另一目的在于提供一种细胞培养方法，该培养方法采用含有生长因子组合物的细胞培养基对细胞进行大规模的培养，培养过程简单、且培养成本低，能够对细胞进行大规模的培养。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种细胞培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基中的生长因子组合物。其中，该基础培养基含有0～1％的血清。该生长因子组合物包括人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白。
其中，人角质细胞生长因子在基础培养基中的浓度为1～100IU/mL，成纤维细胞生长因子在基础培养基中的浓度为10～500pg/mL，集落刺激因子在基础培养基中的浓度为1～100ng/mL，粘连蛋白在基础培养基中的浓度为1～200pg/mL。
一种细胞培养方法，其包括：
添加生长因子组合物至基础培养基中，其中基础培养基含有0～1％的血清；
将待培养的细胞接种至该基础培养基中；
该生长因子组合物包括人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白。其中，人角质细胞生长因子在基础培养基中的浓度为1～100IU/mL，成纤维细胞生长因子在基础培养基中的浓度为10～500pg/mL，集落刺激因子在基础培养基中的浓度为1～100ng/mL，粘连蛋白在基础培养基中的浓度为1～200pg/mL。
本发明提供的细胞培养基及细胞培养方法的有益效果是：相对现有的含血清培养基，本发明提供的细胞培养基通过在基础培养基中添加含有1～100IU/mL人角质细胞生长因子、10～500pg/mL的成纤维细胞生长因子、1～100ng/mL的集落刺激因子以及1～200pg/mL的粘连蛋白的生长因子组合物，来降低血清的使用量或不用添加血清，不仅确保细胞能够正常生长，还降低细胞培养基的成本，能够实现细胞的大规模培养。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的细胞培养基及细胞培养方法进行具体说明。
本发明实施例的细胞培养基包括基础培养基和添加在基础培养基中的生长因子组合物。
该生长因子组合物包括人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白。
在添加了上述生长因子组合物的情况下，该基础培养基中可添加0～10％的血清。也就是说，该基础培养基可不添加血清或添加少量的血清，也可确保细胞正常生长，也能降低成本。
其中，较佳地，血清为FBS即胎牛血清。
其中，人角质细胞生长因子在基础培养基中的浓度为1～100IU/mL，成纤维细胞生长因子在基础培养基中的浓度为10～500pg/mL，集落刺激因子在基础培养基中的浓度为1～100ng/mL，粘连蛋白在基础培养基中的浓度为1～200pg/mL。人角质细胞生长因子能够促进表皮细胞的生长，成纤维细胞生长因子能够促进细胞生长，集落刺激因子促进细胞分化、增殖，粘连蛋白促进细胞贴壁、调节细胞增殖和分化。
添加有上述生长因子组合物的细胞培养基能够适用于各种类型细胞的大规模化培养。如HaCaT细胞即人永生化表皮细胞。
其中，较佳地，生长因子组合物还可以包括表皮生长因子和神经生长因子中的一种或两种的组合。
其中，表皮生长因子在基础培养基中的浓度为5～500IU/mL。
其中，神经生长因子在基础培养基中的浓度为10～500ng/mL。
本发明实施例的细胞培养方法，包括以下步骤。
首先，添加生长因子组合物至基础培养基中，得到细胞培养基。
其中，生长因子组合物包括人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白。
人角质细胞生长因子在基础培养基中的浓度为1～100IU/mL，成纤维细胞生长因子在基础培养基中的浓度为10～500pg/mL，集落刺激因子在基础培养基中的浓度为1～100ng/mL，粘连蛋白在基础培养基中的浓度为1～200pg/mL。
其中，较佳地，人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白在基础培养基中的浓度分别为30～70IU/mL、150～350pg/mL、30～70ng/mL、60～140pg/mL。
其中，更佳地，人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白在基础培养基中的浓度分别为50IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL。
人角质细胞生长因子能够促进表皮细胞的生长，成纤维细胞生长因子能够促进细胞生长，集落刺激因子促进细胞分化、增殖，粘连蛋白促进细胞贴壁、调节细胞增殖和分化。
添加有上述生长因子组合物的细胞培养基能够适用于各种类型细胞的大规模化培养。如HaCaT细胞即人永生化表皮细胞。
此外，生长因子组合物还可以包括表皮生长因子和神经生长因子中的一种或两种的组合。
其中，表皮生长因子在基础培养基中的浓度为5～500IU/mL。表皮生长因子能够促进细胞分裂。
较佳地，表皮生长因子在基础培养基中的浓度为200IU/mL。
神经生长因子在基础培养基中的浓度为10～500ng/mL。神经生长因子能够促进神经细胞的生长、增殖。
较佳地，神经生长因子在基础培养基中的浓度为300ng/mL。
在添加了上述生长因子组合物的情况下，基础培养基中可不用再添加血清，实现对细胞的细胞的无血清培养；当然，针对不同类型的细胞，可再往基础培养基中添加少量的血清，所添加血清的用量与基础培养基的体积比优选为0.5～1％，也可实现细胞的低血清培养。
通过添加了生长因子组合物的基础培养基，实现对细胞的无血清培养或低血培养，将大大地降低血清的使用量，节约培养成本，操作过程简单，实现细胞的大规模培养，其中，较佳地，基础培养基为DMEM培养基或RPMI 1640培养基或M199培养基。
接着，将待培养的细胞按细胞浓度为4～5×104个/mL接种至上述细胞培养基中。
再接着，将接种后的细胞培养基置于37℃、5％CO2的条件下培养48～72小时，得到大量贴壁生长的细胞。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
首先，在培养瓶中加入RPMI 1640培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白在基础培养基中的浓度分别100IU/mL、200pg/mL、70ng/mL、1pg/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例2
首先，在培养瓶中加入M199培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子粘连蛋白以及表皮生长因子。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白以及表皮生长因子在基础培养基中的浓度分别1IU/mL、500pg/mL、50ng/mL、60pg/mL、50IU/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例3
首先，在培养瓶中加入DMEM培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子粘连蛋白以及神经生长因子。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子粘连蛋白以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别30IU/mL、350pg/mL、1ng/mL、100pg/mL、500ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例4
首先，在培养瓶中加入RPMI 1640培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别71IU/mL、10pg/mL、100ng/mL、200pg/mL、500IU/mL、10ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例5
首先，在培养瓶中加入M199培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别50IU/mL、150pg/mL、30ng/mL、140pg/mL、200IU/mL、300ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例6
首先，在培养瓶中加入RPMI 1640培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别100IU/mL、200pg/mL、70ng/mL、1pg/mL、350IU/mL、120ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例7
首先，在培养瓶中加入RPMI 1640培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别1IU/mL、500pg/mL、50ng/mL、60pg/mL、50IU/mL、380ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例8
首先，在培养瓶中加入M199培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别30IU/mL、350pg/mL、1ng/mL、100pg/mL、5IU/mL、500ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例9
首先，在培养瓶中加入DMEM培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子神经生长因子以及1％的FBS。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别50IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL、500IU/mL、300ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物和1％FBS的基础培养基作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例10
首先，在培养瓶中加入RPMI 1640培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别50IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL、200IU/mL、300ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例11
首先，在培养瓶中加入RPMI 1640培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子、神经生长因子以及0.5％FBS。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别50IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL、200IU/mL、300ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物和0.5％的FBS的基础培养基作为实验组，以含10％的肽牛血清的基础培养基作为对照组，观察HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。
结果显示，培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异。
实施例12
第一次传代培养
首先，在培养瓶中加入RPMI 1640培养基，并往基础培养基中添加人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子、神经生长因子。
控制人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子、粘连蛋白、表皮生长因子以及神经生长因子在基础培养基中的浓度分别50IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL、200IU/mL、300ng/mL。
接着，将HaCaT细胞接按细胞浓度5×104个/mL接种至培养瓶中。
然后，将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，培养72小时后，进行第二次传代培养。
第二次传代培养
取第一次传代培养后的HaCaT细胞，经消化、离心后，按1:3的比例接种至含有新鲜的无血清培养基的培养瓶中。
将接种后的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
以上述添加了生长因子组合物的基础培养基(0％的FBS)作为实验组，以含10％的FBS的基础培养基(未添加生长因子组合物)作为对照组，观察经过第一次传代培养后的HaCaT细胞在两组培养基中的生长情况。结果显示，第二次传代培养72h后，实验组培养的HaCaT细胞的汇合度在90～95％，实验组的HaCaT细胞能够正常贴壁生长，与对照组培养的HaCaT细胞的汇合度无明显差异，表明该细胞培养方法能够使HaCaT细胞进行正常的传代培养。
综上所述，本发明提供的细胞培养方法采用含有生长因子组合物的基础培养基实现细胞的无血清培养或低血清培养，不仅能够确保正常贴壁生长，在正常的培养时间里达到90～95％的汇合度，而且降低了血清使用量，其成本低、节约了培养成本，适合大规模的细胞培养操作。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的生长因子组合物，其中所述基础培养基含有0～1％的血清，所述生长因子组合物包括人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白，其中，所述人角质细胞生长因子在所述基础培养基中的浓度为1～100IU/mL，所述成纤维细胞生长因子在所述基础培养基中的浓度为10～500pg/mL，所述集落刺激因子在所述基础培养基中的浓度为1～100ng/mL，所述粘连蛋白在所述基础培养基中的浓度为1～200pg/mL。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述生长因子组合物还包括表皮生长因子，所述表皮生长因子在所述基础培养基中的浓度为5～500IU/mL。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其特征在于，所述生长因子组合物还包括神经生长因子，所述神经生长因子在所述基础培养基中的浓度为10～500ng/mL。
4.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述人角质细胞生长因子在所述基础培养基中的浓度为30～70IU/mL，所述成纤维细胞生长因子在所述基础培养基中的浓度为150～350pg/mL，所述集落刺激因子在所述基础培养基中的浓度为30～70ng/mL，所述粘连蛋白在所述基础培养基中的浓度为60～140pg/mL。
5.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM培养基或RPMI 1640培养基或M199培养基。
6.一种细胞培养方法，其特征在于，其包括：
添加生长因子组合物至基础培养基中，得到细胞培养基，其中，基础培养基中含有0～1％的血清；
将待培养的细胞接种至所述细胞培养基中；
其中，所述生长因子组合物包括人角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、集落刺激因子以及粘连蛋白，所述人角质细胞生长因子在所述基础培养基中的浓度为1～100IU/mL，所述成纤维细胞生长因子在所述基础培养基中的浓度为10～500pg/mL，所述集落刺激因子在所述基础培养基中的浓度为1～100ng/mL，所述粘连蛋白在所述基础培养基中的浓度为1～200pg/mL。
7.根据权利要求6所述的细胞培养方法，其特征在于，所述生长因子组合物还包括表皮生长因子，所述表皮生长因子在所述基础培养基中的浓度为5～500IU/mL。
8.根据权利要求6或7所述的细胞培养方法，其特征在于，所述生长因子组合物还包括神经生长因子，所述神经生长因子在所述基础培养基中的浓度为10～500ng/mL。
9.根据权利要求6所述的细胞培养方法，其特征在于，所述细胞为HaCaT细胞。
10.根据权利要求6所述的细胞培养方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM培养基或RPMI 1640培养基或M199培养基。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109983116A (zh) * 2016-11-25 2019-07-05 株式会社日立制作所 细胞培养用培养基、以及使用其的细胞培养装置和细胞培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679948A (zh) * 2007-04-20 2010-03-24 弗劳恩霍芬-格泽尔沙夫特祖尔弗德伦德尔安格万特福施有限公司 细胞培养系统
WO2012090205A2 (en) * 2010-12-28 2012-07-05 Kamedis Ltd. Plant extracts for the treatment and prevention of infections

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679948A (zh) * 2007-04-20 2010-03-24 弗劳恩霍芬-格泽尔沙夫特祖尔弗德伦德尔安格万特福施有限公司 细胞培养系统
WO2012090205A2 (en) * 2010-12-28 2012-07-05 Kamedis Ltd. Plant extracts for the treatment and prevention of infections

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEENI KOIVISTO等: "Different integrins mediate cell spreading, haptotaxis and lateral migration of HaCaT keratinocytes on fibronectin", 《CELL ADHESION AND COMMUNICATION》 *
付小兵等: "成纤维细胞生长因子10对人角朊细胞表达GM-CSF的刺激作用", 《解放军医学杂志》 *
康尔恂等: "质形成细胞生长因子对HaCaT细胞增殖的影响", 《中国麻风皮肤病杂志》 *
王小兵等: "重组人碱性成纤维细胞生长因子对HaCaT细胞增殖的影响", 《山西医科大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109983116A (zh) * 2016-11-25 2019-07-05 株式会社日立制作所 细胞培养用培养基、以及使用其的细胞培养装置和细胞培养方法

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