CN102086451B - 一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组织工程种子细胞的培养方法。皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，该方法包括以下的步骤：①在生物反应器加入大孔微载体，水化及灭菌后加入培养基50～100ml成纤维细胞培养基，加入成纤维细胞个进行培养；②待成纤维细胞贴附于微载体上后生长接近微载体表面积的50％时，抑制成纤维细胞的增殖，静置后倾去培养液；③将上述得到的载体无菌无钙镁PBS冲洗后，加入表皮细胞培养基及表皮细胞，继续搅拌培养，直至细胞长满载体，即可获得皮肤组织工程种子细胞。本发明培养的细胞量及功能都能明显增加，减少了细胞的损伤，细胞可以直接用作组织工程皮肤构建的种子细胞，效果优于表皮细胞悬液及表皮细胞膜片。

Description

一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法

技术领域

本发明涉及一种组织工程种子细胞的培养方法，具体地说涉及一种用于构建组织工程皮肤或直接应用于烧伤及慢性溃疡的治疗的种子细胞培养方法。

背景技术

在烧伤及慢性溃伤口的治疗中，组织工程的方法一直扮演着重要的角色。正常伤口愈合的过程中，表皮细胞起着重要的作用，因此在创伤愈合过程中利用合适的方法将表皮细胞递呈到伤口处，是促进创伤愈合及诱导局部皮肤再生的重要方法。在组织工程中使用的方法中有培养的表皮细胞膜片、表皮细胞悬液、以及使用表皮细胞和/或成纤维细胞等与支架材料复合的组织工程皮肤等方法。1975年Rheinwald和Green(Rheinwald JG，Green H：Serial cultivation ofstrains of human epidermal keratinocytes：the formation of keratinizing coloniesfrom single cells.Cell 1975，6(3)：331-343.)利用3T3成纤维细胞作为滋养层，建立了表皮细胞培养技术后，1981年，O’Connor等应用此方法在体外培养出适于移植的人自体表皮细胞膜片，成功地修复2例烧伤后的肉芽创面。随后Limat等取自体毛囊外根鞘细胞(含毛囊干细胞)体外培养后移植到小腿溃疡创面，80％的患者在2～3周内创面由与周边皮肤相似的新生表皮覆盖。此后许多国家都有使用表皮细胞膜片治疗烧伤创面及慢性溃疡性伤口的成功报道，2008年基于表皮细胞膜片的产品Epicel通过了美国FDA的批准用于烧伤创面的治疗。这些表皮膜片使用成功的案例都说明表皮细胞在皮肤缺损的治疗中具有非常重要的作用，但是由于细胞膜片的缺乏真皮基质，伤口愈合质量不佳。

使用表皮细胞悬液的方法也是在组织工程中常用的治疗烧伤及慢性溃疡的方法，这种表皮细胞悬液可以是通过取自体的小块皮肤，经过胰酶消化后为经过进一步培养的表皮细胞悬液，具有代表性的商品是ReCell，Gravante G(Gravante G，Di Fede MC，Araco A，Grimaldi M，De Angelis B，Arpino A，CervelliV，Montone A：A randomized trial comparing ReCell system of epidermal cellsdelivery versus classic skin grafts for the treatment of deep partial thicknessburns.Burns 2007，33(8)：966-972.)使用经过ReCell处理的表皮细胞悬液对烧伤创面进行治疗，并与自体皮片移植作为对照，结果发现，表皮细胞悬液的窗口愈合速度不及自体皮片移植，但取皮处没有留下术后疼痛，总体的皮肤植入情况两组相似。另一种产品CellSpray则是将表皮细胞进行一段时间的扩增，一般为五天的时间，在将扩增后的表皮细胞悬液喷洒于创面，用于烧伤的治疗。Schlabe J(Schlabe J，Johnen C，Schwartlander R，Moser V，Hartmann B，Gerlach JC，Kuntscher MV：Isolation and culture of different epidermal and dermal cell typesfrom human scalp suitable for the development of a therapeutical cell spray.Burns 2008，34(3)：376-384.)将培养的表皮细胞膜片消化成单细胞悬液对烧伤创面进行治疗，也收到了良好的效果。这种细胞悬液用于治疗烧伤创面的成功进一步表明了角质细胞在伤口愈合中的关键作用。

表皮细胞向创面递呈的另一种方法是所谓的组织工程皮肤的构建方法，这种方法考虑了皮肤的天然结构---真皮的因素，利用真皮支架材料复合表皮细胞及成成纤维细胞等，制成含细胞的组织工程皮肤，此处所用的细胞则被称为组织工程皮肤种子细胞。此类组织工程皮肤中具有代表性的产品有OrCel和Apligraf，这种组织工程皮肤有两层：下层为混合有成纤维细胞的凝胶层，上层为表皮细胞层，经过一段时间的浸没式培养后改为气液界面培养，可以促进上层的表皮细胞复层化。其它的构建方法是将角质细胞复合于预先制备的真皮支架上，再进行浸没及气液界面的培养，如Horch RE(Horch RE，Bannasch H，StarkGB：Cultured human keratinocytes as a single cell suspension in fibrin gluecombined with preserved dermal grafts enhance skin reconstitution in athymicmice full-thickness wounds.European Journal of Plastic Surgery 1999，22(5-6)：237-243.)报道了将无血清法培养的角质细胞与纤维蛋白胶混合与脱细胞真皮支架复合用于治疗裸鼠全层皮肤缺损的治疗并取得了良好的效果。BannaschH(Bannasch H，Unterberg T，Fohn M，Weyand B，Horch RE，Stark GB：Culturedkeratinocytes in fibrin with decellularised dermis close porcine full-thicknesswounds in a single step.Burns 2008，34(7)：1015-1021.)用类似的方法一次性治愈了猪的全层皮肤缺损的伤口，与先前的使用真皮支架(Integra)先覆盖伤口，等伤口肉芽组织形成后再进行二次植皮或移植表皮细胞膜片的方法相比，这种方法具有更好的应用价值。

其它的递呈方法还包括将表皮细胞与微球复合的递呈方法，最近GustafsonCJ(Gustafson CJ，Birgisson A，Junker J，Huss F，Salemark L，Johnson H，Kratz G：Employing human keratinocytes cultured on macroporous gelatin spheres totreat full thickness-wounds：an in vivo study on athymic rats.Burns 2007，33(6)：726-735.)使用多孔明胶微球作为表皮细胞的递呈方式，治愈了裸鼠的全层皮肤缺损的伤口；Liu JY(Liu JY，Hafner J，Dragieva G，Seifert B，Burg G：Autologous cultured keratinocytes on porcine gelatin microbeads effectively healchronic venous leg ulcers.Wound Repair Regen 2004，12(2)：148-156.)则使用了商业化的Cultisper明胶微球携带角质细胞对小腿的慢性溃疡进行了治疗，取得了良好的效果。

用于组织工程皮肤构建及大面积烧伤治疗的表皮细胞的培养一直是一个难题，原因在于表皮细胞在体外的培养过程中生长缓慢而且很容易分化而失去增殖的能力，尤其是在无血清培养中更是如此，在含有血清及滋养层细胞的表皮细胞膜片培养方式中，表皮可以获得较快的生长速度及倍增次数，表明血清及滋养层细胞在表皮细胞的增殖及控制分化方面的重要作用，血清中含有对细胞生长有重要作用的多种营养因子，可促进细胞的增殖，但单独加入血清又可以促使表皮细胞的终末分化，其中，血清中的钙离子是促使表皮细胞分化的一个重要因素，而加入滋养层细胞以后，不仅可以控制表皮细胞的分化，而且还可以促进表皮细胞的贴壁。在基于明胶微球的创面治疗中，以往的方法是将明胶微球直接涂敷于创面，然后用敷料覆盖，此方法可明显造成涂布的细胞不均匀，而且直接的敷料覆盖也可造成表皮细胞的损伤。

同时，与细胞的递呈相比，表皮细胞的体外扩增要困难的多，表皮细胞在体外的生长比较缓慢，尤其是在无血清及滋养细胞的条件下，其生长周期更慢，一般需要3周以上；而且传代次数较少，一般的表皮细胞无血清培养仅能传代3～5次，在对大面积烧伤的创面进行治疗时，由于皮源的缺乏及创面覆盖的急迫性，可移植的表皮细胞的来源问题也就成了最为重要的问题。表皮细胞属于贴壁依赖性细胞，基于表皮细胞膜片的培养方法由于需要对表皮细胞进行不断地消化、传代，使其培养过程中存在细胞的丢失及培养周期的延长。在使用生物反应器的方法对其进行扩增时需要结合微载体培养技术，但是由于表皮细胞属于终末分化的细胞，而在使用微载体培养表皮细胞时，由于表皮细胞的贴壁能力较低，抗剪切能力差及培养过程中很快终末分化等因素，使得扩增的结果并不令人满意。而目前的角质细胞的递呈方法多为喷雾、涂抹的方法，没有考虑与能促进创面愈合的材料结合。

发明内容

为了解决上述的存在的技术缺陷，本发明的目的是提供一种组织工程中所用的表皮细胞扩增的方法。该方法表皮细胞能获得最大速度的增殖，培养后的表皮细胞微载体复合物可用作构建组织工程皮肤的种子细胞，也可直接递呈于创面，可以加快创面的愈合。

为了实现上述的目的，本发明的皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，该方法包括以下的步骤：①在生物反应器加入0.5～2g大孔微载体，水化及灭菌后加入培养基50～100ml成纤维细胞培养基，加入成纤维细胞1×10⁶～10×10⁶个进行培养；②待成纤维细胞贴附于微载体上后生长接近微载体表面积的50％时，抑制成纤维细胞的增殖，静置后倾去培养液；③将上述得到的载体无菌无钙镁PBS冲洗后，加入表皮细胞培养基50～100ml及1×10⁶～10×10⁶个表皮细胞，继续搅拌培养，直至细胞长满载体，即可获得皮肤组织工程种子细胞。

作为优选，所述的表皮细胞为角质细胞，同时含有黑素细胞及表皮内所含其它细胞的混合；优选的为表皮干细胞。

作为一种获取方法，所述的表皮细胞的获取方法如下：

①选取小块健康皮肤，置于4℃的无菌PBS液中，用含有青霉素及链霉素PBS液反复冲洗后，剪除皮下脂肪组织，将皮肤置于碘伏或70～75％重量百分比浓度的酒精中消毒后，无钙、镁的PBS冲洗三遍，在无菌的培养皿中将皮肤切成小块，再置入0.5％重量百分比浓度中性蛋白酶中，4℃过夜；

②将经中性蛋白酶消化的皮肤置于培养皿中，加PBS以防止干燥，将表皮自真皮分离，37℃下将表皮置入0.25％重量百分比浓度胰酶和0.02％重量百分比浓度EDTA的混合液中消化15min，并不时摇动；

③加入与胰酶等体积的含10％重量百分比FCS的DMEM液终止消化，离心，重悬细胞，用细胞筛网过滤细胞悬液，即可得到表皮细胞。

作为优选，所述的成纤维细胞为人成纤维细胞或者经过增殖抑制的小鼠3T3细胞。作为优选，所述的成纤维细胞的获取方法采用上述的方法获取的真皮，通过0.05％胶原酶I 37℃消化4h，获得成纤维细胞。

作为优选，所述的健康皮肤选自患者自身健康皮肤或异体健康皮肤。作为再优选，患者自身健康皮肤选用创面附近的皮肤，异体健康皮肤选用包皮环切术的包皮或整形术后余下的皮肤。

作为优选，所述的微载体为商品化的可降解大孔微载体，或者是使用可生物降解的材料，通过乳化-凝聚等方法并加用致孔剂制备的可生物降解的微载体。

作为优选，抑制成纤维细胞的增殖的方法选用加入丝裂霉素C 10×10^-6/L或者通过亚致死量的Gamma辐照。

作为优选，表皮细胞培养基为DMEM/F12重量比为3∶1的溶液，培养基中还包括以下的成份：

FCS  10～20％重量百分比                氢化考的松5ng/mL

霍乱毒素10^-10mol/L                     胰岛素5ng/mL

三碘甲状腺原氨酸2×10^-7mol/L           腺嘌呤1.8×10^-4mol/L

青霉素100IU/ml                         链霉素100IU/ml

两性霉素B 0.25ug/ml                    hEGF    10ng/ml

转铁蛋白5ug/ml                        谷氨酸5ug/ml。

本发明具有临床应用的表皮细胞膜片培养方法的优点，即使用含血清的培养基，并使用滋养层细胞，有利于表皮细胞生长，但在细胞扩增的过程中使用了微载体，使得培养面积大大增加，使培养的细胞量及功能都能明显增加；其次，本发明还结合了大孔微载体及生物反应器培养的优势，其中大孔的微载体可以使细胞长入至载体的内部，使细胞在搅拌时受到的剪切力较少，调整丝裂霉素C的用量还可以使载体内部少量成纤维细胞的仍具有增殖能力，不仅对表皮细胞的生长不造成影响，还可以加速表皮的生长，而且在培养的过程中不需要再次消化，减少了细胞的损伤；再次，因为明胶是变性的胶原，携带有细胞的明胶微载体构成了一个真皮再生单位，可以直接用作组织工程皮肤构建的种子细胞，尤其可以直接用于烧伤创面及慢性溃疡的治疗，效果优于表皮细胞悬液及表皮细胞膜片。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

1.表皮细胞的分离及培养

优选患者自身的一小块健康皮肤；也可以是来源于异体的健康皮肤，如包皮环切术的包皮，整形术后余下的皮肤等。在用于治疗慢性溃疡性创面时，优选使用创面附近的皮肤，以获得更好的效果；如使用包皮，优选年龄在2～10岁之间的小儿包皮环切术后的包皮。取下后的皮肤需立即置于4℃的无菌PBS液中，用含有青霉素及链霉素PBS液反复冲洗后，剪除皮下脂肪组织，将皮肤置于碘伏或70～75％酒精中消毒后，无钙、镁PBS冲洗三遍，在无菌的培养皿中将皮肤切成小块，约5mm×5mm，再置入0.5％中性蛋白酶中，4℃过夜。

将经中性蛋白酶消化的皮肤置于培养皿中，加少量的PBS以防止干燥，用无菌镊子将表皮自真皮分离，37℃下将表皮置入0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1v/v)中消化15min，并不时摇动；加与胰酶等体积的DMEM液(含10％FCS)终止消化，666g离心5min，重悬细胞，用细胞筛网(40～200目)过滤细胞悬液，计数及用台盼蓝判断细胞活力，即可得到表皮细胞。其真皮层可通过0.05％胶原酶I 37℃消化4h，获得真皮成纤维细胞。

2.表皮细胞的扩增

使用可降解的明胶制备的大孔微载体，并选择合适的生物反应器，优选旋转瓶，也可以是其它动力的生物反应器，在旋转瓶加入0.5至2g微载体，水化及灭菌后加入培养基50～100ml成纤维细胞培养基(DMEM+10～15％FCS)，加入成纤维细胞1～10×10⁶进行培养，待成纤维细胞贴附于微载体上后生长接近微载体表面积的50％时，加入丝裂霉素C 10×10^-6/L过夜，静置后倾去含有丝裂霉素C的培养液，无菌无钙镁PBS冲洗两遍后，加入表皮细胞培养基50～100ml(Rheinwald和Green)及表皮细胞(1～10×10⁶个)，继续搅拌培养，开始的搅拌速度要慢，逐渐增加搅拌的速度，培养5天左右换液一次，直至细胞长满载体或应用(10～15天)，这种培养方式比单纯的大孔明胶微载体培养的细胞量可以提高2～5倍，足以满足用于构建组织工程皮肤及用于烧伤及慢性溃疡治疗的要求。

本实施例的表皮细胞培养基为DMEM/F12重量比为3∶1的溶液，培养基中还包括以下的成份：

FCS  15％重量百分比             氢化考的松5ng/mL

霍乱毒素10^-10mol/L              胰岛素5ng/mL

三碘甲状腺原氨酸2×10^-7mol/L    腺嘌呤1.8×10^-4mol/L

青霉素100IU/ml                  链霉素100IU/ml

两性霉素B 0.25ug/ml             hEGF      10ng/ml

转铁蛋白5ug/ml                  谷氨酸5ug/ml。

Claims (3)

1.一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

①在生物反应器加入0.5～2g大孔微载体，水化及灭菌后加入50~100ml成纤维细胞培养基，成纤维细胞培养基采用DMEM+10~15%FCS，加入成纤维细胞1×10⁶~10×10⁶个进行培养；所述的微载体为使用可降解的明胶制备的大孔微载体；

②待成纤维细胞贴附于微载体上后生长接近微载体表面积的50%时，抑制成纤维细胞的增殖，抑制成纤维细胞的增殖的方法选用加入丝裂霉素C，静置后倾去培养液；

③将上述得到的载体无菌无钙镁PBS冲洗后，加入表皮细胞培养基50~100ml及1×10⁶~10×10⁶个表皮细胞，所述的表皮细胞培养基为DMEM/F12重量比为3:1的溶液；继续搅拌培养，直至细胞长满载体，即可获得皮肤组织工程种子细胞；所述的表皮细胞培养基中还包括以下的成份：

FCS   10~20%重量百分比          氢化考的松  5 ng/mL

霍乱毒素    10^-10mol/L             胰岛素      5ng/mL

三碘甲状腺原氨酸   2×10^-7mol/L    腺嘌呤      1.8×10^-4mol/L

青霉素     100  IU/ml            链霉素      100IU/ml    

两性霉素B   0.25 ug/ml           hEGF       10 ng/ml     

转铁蛋白     5ug/ml              谷氨酸      5ug/ml。

2.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于：表皮细胞为角质细胞，同时含有黑素细胞及表皮内所含其它细胞的混合。

3.根据权利要求1所述的一种皮肤组织工程种子细胞的扩增方法，其特征在于：成纤维细胞为人成纤维细胞或者经过增殖抑制的小鼠3T3细胞。